Генетические факторы риска невынашивания беременности

Размещено на http://www.allbest.ru/

на правах рукописи

14.00.01. - акушерство и гинекология

03.00.15. - генетика

Автореферат

БЕСПАЛОВА О.Н.

Санкт-Петербург - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта Северо-Западного отделения РАМН

Научные консультанты:

академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Айламазян Эдуард Карпович член-корресподент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Баранов Владислав Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Абрамченко Валерий Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Гайдуков Сергей Николаевич

доктор медицинских наук Ижевская Вера Леонидовна

Ведущее учреждение: Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита состоится «___»____________2009 г. в ____часов на заседании диссертационного совета Д.001.021.01. при НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, дом 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН

Автореферат разослан «___»___________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Кузьминых Татьяна Ульяновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Репродуктивное состояние и деторождение - наиболее значимые показатели здоровья, как индивидуума, так и в целом популяции (Э.К. Айламазян, 1997; В.И. Кулаков, 2002; О.Г. Фролова, 2005). В условиях неблагоприятной демографической ситуации, когда каждые пять лет на 20% уменьшается число женщин, способных родить ребенка, особенно актуально сохранение и развитие беременности у супружеских пар, желающих иметь детей (В.Е. Радзинский и соавт., 2008). По данным коллегии МЗ РФ (2006), ежегодно в нашей стране каждая пятая желанная беременность завершается самопроизвольным абортом.

Причины самопроизвольного прерывания беременности настолько разнообразны, что до сих пор создание единой классификации затруднено. Вопрос о начале и объеме обследования супругов широко дискутируется в литературе. За рубежом общепринята точка зрения, что детальное обследование необходимо начинать после трёх повторных выкидышей, в отечественном акушерстве - рекомендуется после двух, в настоящее время некоторые ученые отмечают необходимость обследования супругов после одного выкидыша (Н.Г. Кошелева, 2002; В.М. Сидельникова, 2005; О.Г. Фролова, 2005). Известно, что риск потери беременности после первого выкидыша составляет 13-17%, после двух самопроизвольных выкидышей риск возрастает в 2 раза и составляет 24%, после трех доходит до 30%, а после четырех - достигает 50% (А.А. Агаджанова, 2003).

В последние годы в зависимости от акушерского анамнеза выделяют две формы невынашивания беременности (НБ): первичное - когда все беременности заканчивались самопроизвольными выкидышами и вторичное - когда в анамнезе наряду с выкидышами, были и/или медицинские аборты, роды, внематочная беременность (S.M. Quensby, 1993; Kenneth J. Ward, 2000; И.Н. Фетисова, 2007).

Одной из ведущих причин НБ ранних сроков принято считать генетический фактор. На протяжении последних 50 лет, понятие «генетические причины НБ» включало в себя только наличие хромосомных аберраций как у супругов с выкидышами в анамнезе, так и у абортусов (J.G. Boue et al., 1970; Н.П. Бочков, 1997; G.M. Surrat, 1990; В.М. Сидельникова, 2005). НБ может быть обусловлено, так и наличием наследственной предрасположенностью. НБ - это мультифакториальное заболевание: результат действия «функционально ослабленных» вариантов (аллелей) множества генов на фоне неблагоприятных внешних и внутренних факторов (В.С. Толмачев, 1986; Г.Р. Мутовин 1997; Иващенко Т.Э. и др., 2007). В мире в настоящее время изучен аллельный полиморфизм более 40 генов, относящихся к генной сети НБ.

Согласно современным представлениям, проблему НБ нельзя решать только во время беременности. Для выяснения причин выкидышей, а также для оценки состояния репродуктивной системы супругов необходимо комплексное обследование (женщин и мужчин) вне беременности. Особую важность приобретают разработки новых высокотехнологических диагностических подходов, направленных на раннее, досимптоматическое выявление супружеских пар высокого риска по НБ (В.С. Баранов, Э.К. Айламазян, 2009).

Целью исследования явилась разработка новых подходов диагностики и профилактики разных форм НБ на основе комплексного клинико-генетического анализа данной патологии, а также создание научной базы для составления генетического паспорта репродуктивного здоровья супружеской пары.

Задачи исследования

1. Изучить динамику изменений анамнестических данных, частоты и структуры гинекологической и экстрагенитальной патологии, характера и частоты осложнений беременности и родов и их исходов для плода у женщин с разным числом выкидышей в анамнезе на протяжении последних 20 лет (ретроспективный мониторинг каждые 5 лет), с учетом первичного и вторичного НБ;

2. Выявить частоту и структуру хромосомной патологии у супружеских пар с разным числом самопроизвольных выкидышей; при первичном и вторичном НБ;

3. В парах с разным числом выкидышей в анамнезе; с первичным и вторичным НБ, изучить особенности аллельного полиморфизма 13 генов: системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1); фолатного обмена (MTHFR, MTRR); факторов свертывания крови (FI, FII, FV); HLA-системы (DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G); факторов роста (VEGF);

4. Изучить особенности аллельного полиморфизма 3-х генов II фазы системы детоксикации GSTT1, GSTМ1 и GSTР1 и гена дисфункции эндотелия NOS3 в плацентах у родильниц с НБ;

5. Выявить связь «функционально ослабленных» аллельных вариантов генов II фазы детоксикации GSTT1, GSTМ1 и GSTР1 с глутатион-S-трансферазной активностью в плацентах женщин с НБ;

6. Проанализировать влияние пола, возраста, числа самопроизвольных выкидышей, генотипа по генам фолатного цикла MTHFR и MTRR на уровень гомоцистеина в крови в парах с НБ;

7. Разработать алгоритм обследования и тактику ведения супружеских пар с разным числом выкидышей в анамнезе, с первичным и вторичным НБ.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые проведен клинический мониторинг - за последние 20 лет (каждые 5 лет: 1983, 1988, 1993, 1999, 2003) по материалам НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Осуществлено комплексное динамическое изучение анамнестических данных, частоты и структуры гинекологической и экстрагенитальной патологии, характера и частоты осложнений беременности и родов, а также и их исходов у женщин с разным числом выкидышей в анамнезе, с учетом первичного и вторичного НБ. Впервые проведен анализ частоты и структуры хромосомной патологии у супружеских пар с разным числом самопроизвольных выкидышей; и при первичном и вторичном НБ. Впервые изучены особенности аллельного полиморфизма 13 генов, контролирующих важнейшие для сохранения беременности метаболические системы: гены системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1); гены, фолатного обмена (MTHFR, MTRR); гены факторов свертывания крови (FI, FII, FV); гены главного комплекса гистосовместимости HLA-системы (DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G); фактора роста (VEGF) в парах с разным числом выкидышей в анамнезе, и выявлена их роль при первичном и вторичном НБ. Впервые установлено целесообразность генетического тестирования аллельного полиморфизма десяти генов (GSTT1, GSTМ1, GSTР1, MTHFR, MTRR, DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G, VEGF) для прогнозирования риска НБ при разном числе выкидышей в анамнезе и восьми генов (GSTT1, GSTМ1, GSTР1, MTHFR, MTRR, DQA1, DQB1, DRB1) для прогнозирования первичного НБ. Впервые установлена корреляция глутатион-S-трансферазной активности с «функционально ослабленными» аллельными вариантами генов II фазы детоксикации GSTT1, GSTМ1, GSTР1 в плацентах женщин с НБ. Впервые проведено сравнение уровня гомоцистеина в крови у женщин и мужчин с учетом числа самопроизвольных выкидышей, в зависимости от генотипа по генам фолатного обмена MTHFR и MTRR.

Практическая значимость работы

Проведенные исследования позволили определить необходимые и эффективные генетические методы комплексной диагностики различных форм НБ, определить группы повышенного риска по НБ на основе генетического тестирования полиморфизма генов; разработать алгоритм генетического обследования и тактику ведения супружеских пар с разным числом выкидышей в анамнезе, с первичным и вторичным НБ.

Основные положения диссертации доложены на на межлабораторных заседаниях в НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН, 2001-2008, Х Международном конгрессе по генетике человека в Вене, Австрия, 2001г., на I Конференции по Превентивной медицине, Виши, Франция, 2001г., на IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, Санкт-Петербург, 2001г., на Научно-практической конференции «Невынашивание беременности и недоношенный ребенок», Петрозаводск, 2002г., на 1-ом Евро-Азиатском конгрессе, Санкт-Петербург, 2004г, на III Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2006г. Результаты работы используются в практике работы акушерского отдела, лаборатории пренатальной диагностики наследственных заболеваний, лаборатории биохимии НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН, в Городском центре профилактики, диагностики и лечения невынашивания беременности, в Медико-Генетическом Центре г.Санкт-Петербурга, в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии Санкт-Петербургского Государственного университета. Клинические наблюдения проводились автором лично в отделении патологии беременности НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель - проф., д.м.н. Аржанова О.Н.). Цитогенетические и молекулярно - генетические исследования проводили в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН с участием автора (руководитель - член-кор. РАМН, проф., д.м.н. Баранов В.С.) В лаборатории биохимии НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель - проф., д.б.н. Арутюнян А.В.) проведено определение глютатион-S-трансферазная активность в плацентах. Исследование уровня гомоцистена в крови проводили в Городском Медико-Генетическом Центре, в Российском НИИ Гематологии и Трансфузиологии, в лаборатории биохимии НИИАГ им.Д.О. Отта СЗО РАМН. Обработка, анализ и интерпретация полученных данных выполнены автором лично.

По теме диссертации опубликованы 41 научная работа, в том числе 7 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.

Материалы и методы исследования

Работа состоит из шести разделов: клинического, клинико-лабораторного, цитогенетического, молекулярно-биологического, биохимического и статистического. Объем выполненных исследований представлен в таблице 1.

Таблица 1 Количество и характер проведенных исследований у супружеских пар с невынашиванием беременности в анамнезе

1. Клиническая часть работы подразделяется на ретроспективную и проспективную. Ретроспективно проанализировано 1425 историй родов женщин с НБ в анамнезе, родивших в НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН за 20 лет в интервале - каждые пять лет: 1983, 1988, 1993, 1998 и 2003 годы. Клинический мониторинг состоял из детального изучения анамнеза, результатов проведенных исследований у пациенток с различными формами НБ до беременности и во время настоящей беременности; изучения особенностей течения беременности и родов, исходов беременностей для матери и плода, данные гистологического обследования плаценты. Проспективный раздел исследований включает анализ данных комплексного обследования 427 супружеских пар с различными формами НБ и 108 женщин без НБ в анамнезе (контрольная группа) в период с 2001 по 2007 годы, у которых было проведено молекулярно-генетическое обследование полиморфных аллелей 13 генов.

Критериями включения явились: для ретроспективного раздела все истории родов женщин с невынашиванием беременности с разным числом выкидышей в анамнезе, начиная с одного самопроизвольного аборта, за период: 1983, 1988, 1993, 1998, 2003 годы. Для проспективного раздела исследования - женщины с выкидышами в анамнезе в возрасте от 18 лет до 45; мужчины из пар с выкидышами в анамнезе в возрасте от 18 до 60 лет; супружеские пары с выкидышами в анамнезе.

Критерии исключения явились: для ретроспективного раздела - женщины, у которых в анамнезе не было самопроизвольных выкидышей; для проспективного раздела исследования- женщины, у которых в анамнезе не было самопроизвольных выкидышей; возраст до 18 лет и старше 45; мужчины из пар без выкидышей в анамнезе; в возрасте до 18 и до 60 лет и старше; супружеские пары без выкидышей в анамнезе. Из контрольной группы были исключены женщины: с НБ; с тяжелой экстрагенитальной патологией; с тяжелым гестозом при течении всех беременностей; без случаев перинатальной смертности и рождения детей с врожденными пороками развития.

2. Клинико-лабораторные обследования проводились всем супружеским парам для выявления возможных причин НБ и включали: клинические, биохимические, микробиологические, иммунологические, инструментальные методы исследования, консультации и осмотр специалистов - эндокринолога, терапевта, генетика, при необходимости иммунолога, андролога, гематолога и других.

3. Цитогенетическое исследование включало кариотипирование обоих супругов с НБ. Хромосомные препараты получали из культуры лимфоцитов периферической крови по стандартной методике (Hungerford, 1965). Хромосомы идентифицировали после дифференцированного окрашивания (С-метод, G-метод).

4. Молекулярно-биологическое исследование. Изучены особенности генетического полиморфизма 14 генов у супругов с НБ. Характеристика исследованных аллельных вариантов генов приведена в таблице 2. Выделение геномной ДНК из ядер лимфоцитов проводили в соответствии с методикой (Sambrook et al., 1989). Изучено 353 образцов ДНК супругов с НБ, 108 образцов ДНК женщин из контрольной группы, 132 образца ДНК плацент, взятых у родильниц с НБ. Всего проанализировано 593 образца ДНК пациентов с и без НБ в анамнезе. Полимеразную цепную реакцию проводили при помощи программируемого термоциклеров «Терцик» (ДНК-технология, Россия).

Для реализации поставленных задач методом репрезентативной выборки был проведен ретроспективный анализ 1425 историй родов женщин с различными формами НБ в анамнезе, родивших в НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (ранее в НИИАГ АМН СССР, НИИАГ АМН РФ) с интервалом каждые 5 лет: в 1983, 1988, 1993, 1998 и 2003 годах. Для детального исследования причин преждевременного прерывания беременности, анализировали НБ в зависимости от числа самопроизвольных выкидышей в анамнезе, и от особенностей акушерского анамнеза (первичное и вторичное). Были выявлены закономерности роста\снижения частоты и структуры причин при разных формах НБ, что послужило основой при составлении групп пациентов с НБ в проспективном исследовании.

Ретроспективный клинический мониторинг пациенток с разным числом выкидышей в анамнезе. 1425 историй родов были разделены на 2 подгруппы: 1 подгруппу составили истории родов 986 женщин с одним самопроизвольным выкидышем в анамнезе. Во 2 группу вошли 439 пациенток с 2 и более повторными выкидышами в анамнезе. В результате изучения историй родов женщин с разным числом выкидышей в период с 1983 по 2003 годы выявлено ряд особенностей (рис.1.). В группах пациенток как с одним выкидышем, так и с двумя и более наблюдается общая тенденция к увеличению частоты возрастных пациенток, аллергических, гинекологических заболеваний (увеличение частоты воспалительных заболеваний матки и придатков, эндометриоза и миомы матки, сочетанной урогенитальной инфекции, гиперандрогенемии различного генеза), экстрагенитальной патологии (увеличение частоты сердечно-сосудистых заболеваний, патологии почек, почти пятикратный рост числа заболеваний щитовидной железы).

Рис. 1. Клинические особенности, выявленные за 20 лет (1983, 1988, 1993, 1998, 2003 годы) у женщин с разным числом выкидышей в анамнезе

В обеих группах за 20 лет отмечен рост частоты бесплодия, числа неразвивающихся беременностей, увеличение частоты выкидышей ранних сроков. Среди пациенток как с одним выкидышем, так и с повторными, выявлено трехкратное увеличение частота преждевременного прерывания повторной беременности от 5% в 1983 году до 15% в 2003 году. В обеих группах наблюдался рост числа новорожденных с гипотрофией разной степени и внутриутробной инфекцией различной этиологии.

Отмечено, что в группе пациенток с повторными выкидышами частота многих показателей (хронические воспалительные заболевания матки и придатков, аномалии развития матки, истмико-цервикальная недостаточность и т.д.) достоверно была выше, чем у женщин с одним выкидышем в анамнезе.

Ретроспективный клинический мониторинг пациенток с первичным и вторичным невынашиванием беременности в анамнезе. На втором этапе работы в зависимости от акушерского анамнеза все 1425 истории родов пациенток с самопроизвольными выкидышами в анамнезе были разделены несколько групп.

Для первичного НБ характерными были: молодой возраст (до 25 лет), нарушения менструальной функции (46,7%), бесплодие (11,4%), гиперпролактинемия и гиперандрогенемия (12,6%); самопроизвольное прерывание беременности у 2/3 женщин до 8 недели беременности; высокая частоа неразвивающихся беременностей в анамнезе (16,6%), угроза раннего выкидыша (65,8%), аномалии родовой деятельности в родах (17,3%)

Особенности вторичного НБ включали: возраст старше 30 лет, самопроизвольные выкидыши на поздних сроках в анамнезе, высокий уровень сочетанной урогенитальной инфекции в анамнезе, высокий процент экстрагенитальной патологии (варикозной болезни, миокардиодистрофии, хронического пиелонефрита, мочекаменной болезни), при настоящей беременности - высокая частота угрозы позднего выкидыша, преждевременных родов и плацентарной недостаточности, в родах - хронической гипоксии плода.

Основными причинами первичного НБ являются эндокринные, инфекционные и анатомические факторы. При вторичном НБ большую роль играют предшествующие выкидышу искусственные аборты, следствием которых и являлись хронические воспалительные заболевания матки и придатков и истимико-цервикальная недостаточность, ведущие к преждевременному прерыванию беременности.

Таким образом, наши исследования подтверждают правомочность разделения НБ на 2 формы - первичное и вторичное.

Проспективный раздел исследований: проанализированы результаты комплексного обследования 427 супружеских пар с различными формами НБ и 108 женщин без НБ в анамнезе (контрольная группа) в период с 2001 по 2007 годы, которым было проведено молекулярно-генетическое обследование полиморфных аллелей 13 генов. В зависимости от наличия и форм НБ пациентки были разделены на 5 групп. I группу (контроля) составили 108 женщин без самопроизвольных выкидышей в анамнезе, родоразрешившихся доношенным живым и здоровым ребенком (без ВПР), которые в анамнезе имели одни и более срочные роды; II группа- 51 женщина с первичным НБ; III группа - 45 женщин с вторичным НБ; IV группа - 117 женщин с первичным привычным НБ; V группу - 106 пациенток с вторичным привычным НБ.

Результаты анализа анамнестических данных, клинико-лабораторных исследований у пациенток с различными формами НБ до беременности и во время настоящей беременности; особенности течения беременности и родов, исходов беременностей для матери и плода, данные гистологического обследования плаценты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Особенности анамнеза, течения и исходов настоящей беременности у женщин с разными формами НБ (M±m)

Примечание: достоверность р<0,05 - *, р<0,01 - **, p<0,001-*** между контролем и каждой из 4-х групп; р<0,05 -, p<0,01-, p<0,001- между 2 и 3 группой; р<0,05 -¦, p<0,01-¦¦, p<0,001-¦¦¦ - между 4 и 5 группами; р<0,05 - ¦, p<0,01-¦¦, p<0,001-¦¦¦ между 2 и 4, 3 и 5 группами в этой и последующих таблицах.

Цитогенетическая характеристика супружеских пар с разными формами НБ в анамнезе

При анализе кариотипов 438 супружеских пар (976 человек) в зависимости от числа самопроизвольных выкидышей, характеристик акушерского анамнеза, сроков самопроизвольного прерывания беременностей и наличия врожденных пороков развития (ВПР) у плодов в анамнезе выявлено, что суммарная частота сбалансированных хромосомных аберраций (СХА) среди всех обследованных супружеских пар с разными формами НБ в анамнезе составила 5,9%; у женщин - 4,5%, у мужчин -1,4%.

Сбалансированные хромосомные перестройки выявлены с частотой 9,9% у супругов с ?3 выкидышами, что достоверно выше чем в парах с одним и двумя выкидышами (3,9% и 2,9%, р<0,05). У супругов с одним единственным выкидышем зарегистрирован достоверно более высокий уровень хромосомных аберраций (3,9%), чем в популяции (0,2%). В парах с вторичным НБ частота СХА была выше, чем в группе с первичным НБ (7,2% и 4,6%). Уровень СХА статистически не отличался в парах с разными сроками прерывания беременности. В парах с НБ и с ВПР у плода отмечена высокая частота сбалансированных хромосомных перестроек (12%).

У 7,1% супружеских пар с ?3 выкидышами один из супругов являлся носителем сбалансированных транслокации (р<0,05), что достоверно выше аналогичных показателей у пар с одним (1,9%) и с двумя выкидышами (2,4%). В парах с вторичным НБ сбалансированные транслокации диагностированы в 2 раза чаще (5,9%), чем с первичным (2,7%). Частота транслокаций у супругов с НБ была на одном уровне вне зависимости от сроков прерывания беременности. У каждой десятой пары с НБ и ВПР плодов были определены сбалансированные транслокации в кариотипе. Инверсии диагностированы в единичных случаях, их частота составила в среднем 1,7%.

У 17,1% супружеских пар с разными формами НБ обнаружены варианты полиморфизма хромосом, связанные с различием размеров и локализацией участков структурного гетерохроматина, что более, чем в 10 раз, превышает популяционный уровень (1,5%).

Варианты полиморфизма хромосом диагностированы примерно с одинаковой частотой - у супругов с единственным выкидышем (19,6%), у пар с 2 (19,5%) и с ?3 выкидышами (13,7%). В семьях, как с первичным, так с и вторичным НБ хромосомные варианты выявлены с одинаковой частотой (у каждой пятой пары). Высокий уровень хромосомного полиморфизма зарегистрирован у супругов с выкидышами на ранних сроках (18,5%) по сравнению с парами с выкидышами на поздних сроках (10,2%, р<0,05). В семьях с повторными выкидышами и ВПР у плодов частота хромосомного полиморфизма составила 14%.

Таким образом, различные формы НБ коррелируют с повышенной частотой диагностированных СХА и хромосомного полиморфизма у супругов. Отмечено, что в каждой четвертой паре с одним выкидышем обнаружены варианты полиморфизма хромосом и СХА. Выявлена прямая корреляция числа самопроизвольных выкидышей в анамнезе от частоты СХА у супругов. Также, обращает на себя внимание высокий уровень СХА (12%) и вариантов полиморфизма хромосом (14%) в парах с НБ и ВПР у плодов. Полученные результаты подтверждают известное положение о необходимости кариотипирования обоих супругов с разными формами НБ в анамнезе.

Тестирование полиморфизма 13 генов у женщин, мужчин и супружеских пар с разными формами НБ

Определены особенности полиморфизма генов пяти метаболических систем:

1. системы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1);

2. фолатного обмена (MTHFR, MTRR);

3. факторы свертывания крови (FI, FII, LV);

4. HLA-системы (DQA1, DQB1, DRB1, HLA-G);

5. факторы роста (VEGF).

Анализ полиморфизма 13 изученных генов в зависимости от числа самопроизвольных выкидышей в анамнезе. Все пары (женщины, мужчины) с самопроизвольными выкидышами были разделены на три группы: в I группу вошли пары с одним выкидышем, во II - с двумя выкидышами и в III - с ?3 выкидышами.

Гены II фазы системы детоксикации GSTM1, GSTT1 и GSTP1. Исследование полиморфизма данных генов выявило значительные различия в распределении частот «функционально ослабленных» генотипов и их сочетаний в зависимости от числа выкидышей у пары (рис.2.). У женщин с ?3 выкидышами отмечено достоверное повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по гену GSTM1 (р<0,01). В тоже время вне зависимости от числа выкидышей у всех женщин выявлено достоверное увеличение частоты сочетанных «неблагоприятных» генотипов по 2 генам системы детоксикации GSTM1 GSTT1 (в 3 раза), по трем генам GSTM1 GSTT1 GSTP1 ( в 5 раз) (р<0,05-0,01).

Рассчитанный коэффициент соотношения шансов показал повышенный риск повторных выкидышей у женщин с генотипами: GSTM1 0\0 (OR=2,02; 95% CI: 1,16-3,53); GSTM1 0\0+GST1T 0\0 (OR=3,32; 95% CI: 1,41-7,83) и GSTM1 0\0+GSTT1 0\0+ GSTP1 A\S (OR=4,34; 95% CI: 1,03-18,23).; а также увеличение риска первого самопроизвольного выкидыша у женщин c генотипами GSTM10\0+ GSTT10\0 (OR=3,23; 95% CI: 1,24-8,35), GSTM1 0\0+GSTT1 0\0+ GSTP1 A\S (OR=4,52; 95% CI: 1,03-19,84); GSTM1 0\0+ GSTT1 0\0+ GSTP1 S\S (OR=9,24; 95% CI: 3,3-25,9).

Рис. 2. Частота «функционально ослабленных» генотипов по генам системы детоксикации GSTM1, GSTT1 и GSTP1 (*-р<0,05, **-р<0,01)

У мужчин из пар с ?3 выкидышами достоверно чаще определялся сочетанные «функционально неблагоприятные» генотипы по трем генам GSTM1 GSTT1 GSTP1 (рис.2.). В группе с ?3 выкидышами достоверно чаще оба супруга совпадали по сочетанию 2-х «функционально ослабленных» генотипов GSTM10\0 GSTT10\0 (9,8%), чем в группах I и II (0% и 1,6%, р<0,05). В парах, где оба супруга - носители генотипов GSTM10\0+GSTT10\0 увеличен риск повторных самопроизвольных выкидышей (OR=10,8; 95% CI: 1,24-93,2).

Гены фолатного цикла MTHFR и MTRR. При анализе полиморфизма генов MTHFR и MTRR выявлены статистически значимые результаты (рис.3.). У женщин с ?3 выкидышами обнаружено достоверное увеличение частоты аллеля Т по сравнению с пациентками с 2 выкидышами (35,1% и 24,2%, р<0,05). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов наличие аллеля 677Т гена MTHFR у женщин увеличивает риск повторных выкидышей (OR=1,74; 95% CI: 1,07-2,83). При этом, в парах с 1 выкидышем у мужчин выявлено достоверное увеличение частоты аллеля 677Т (42,5%) по сравнению с мужчинами из группы III (25%, р<0,05).

Также, у женщин с ?3 выкидышами и у мужчин из пар с 1 выкидышем отмечено значительное увеличение частоты «функционально ослабленного» генотипа Т\Т по гену MTHFR (р<0,05). Согласно коэффициенту соотношения шансов у женщин с генотипом Т/Т увеличен риск повторных выкидышей (OR=3,6; 95% CI: 1,63-7,99), а в парах где мужчина носитель аллели Т увеличен риск первого выкидыша в 3 раза (OR=3,43; 95% CI: 1,27-9,3).

Рис. 3. Частота «функционально ослабленных» генотипов по генам фолатного цикла MTHFR и MTRR (*-р<0,05)

При изучении частот генотипов и аллелей 66A>G полиморфизма второго гена фолатного цикла MTRR между здоровыми женщинами и пациентками с разным количеством самопроизвольных выкидышей выявлено, что частота аллели G достоверно выше во всех группах с выкидышами, чем в контроле (р<0,05). Наличие аллели G по гену MTRR у женщин увеличивает риск как первого выкидыша (OR=1,52; 95% CI: 1,04-1,64), так и повторных (OR=1,71; 95% CI: 1,05-2,79). У пациенток вне зависимости от числа выкидышей зарегистрировано повышение частота «функционально ослабленного» генотипа G\G по гену MTRR (р<0,05). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов генотип G\G гена MTRR у женщин увеличивало риск как одного выкидыша (OR=1,90; 95% CI: 1,02-3,56), так и повторных выкидышей (OR=2,06; 95% CI: 1,0-4,56).

Также, отмечено достоверное увеличение частоты сочетанных «функционально неблагоприятных» генотипов: у женщин с ?3 выкидышами - MTHFR Т\Т+ MTRR G\G; у мужчин из пар с одним выкидышем - MTHFR Т\- + MTRR G\G. При носительстве данных генотипов увеличивается риск первого выкидыша в 4 раза (OR=3,79; 95% CI: 1,64-8,72) и повторных выкидышей в 5 раз (OR=4,96; 95% CI: 1,68-14,6).

Надо отметить, что в парах с ?3 выкидышами достоверно чаще оба супруги совпадали по «функционально ослабленному» генотипу G\G по гену MTRR (р<0,05). Рассчитанный коэффициент соотношения шансов показал увеличенный риск повторных самопроизвольных выкидышей у пар, где оба супруга имеют генотип G\G по гену MTRR (OR=5,8; 95% CI:1,27-26,4).

Гены факторов свертывания крови (FI, FII, FV). Наличие редких аллелей генов факторов свертывания крови (фибриногена, протромбина, фактора V) встречалось в единичных случаях как у женщин, так и у мужчин вне зависимости от числа выкидышей. У женщин с одним выкидышем обнаружено достоверное увеличение частоты «функционально неблагоприятного» генотип G\A по гену FV по сравнению с контролем и другими группами (р<0,05). В группе пациенток с одним выкидышем выявлено увеличение частоты сочетанного «неблагоприятного» генотипа по 3-м генам факторов свертывания крови FI G\A+ FII G\G+ FV G\A (р<0,05). Рассчитанный коэффициент соотношения шансов показал увеличенный риск первого выкидыша у женщин с генотипом FI G\A+ FII G\G+ FV G\A (OR=10,1; 95% CI: 1,12-91,7).

Частота «функционально ослабленного» генотипа G\А по гену FI достоверно больше у мужчин из пар с повторными выкидышами по сравнению с мужчинами из пар с одним выкидышем (р<0,05).

Таким образом, во всей выборке пациентов с НБ выявлено гетерозиготное носительство «функционально неблагоприятных» генотипов по генам свертывания крови FII и FV в единичных лучаях, при этом гомозиготного носительства мутаций в данных генах обнаружено не было.

Гены HLA II класса (DRB1, DQA1, DQB1) и HLA I класса (HLA-G). При анализе полиморфизма по 3-м генам DRB1, DQA1, DQB1 выявлено значительное увеличение частот некоторых аллелей и генотипов отдельно по каждому изученному гену HLA II класса системы главного комплекса гистосовместимости.

У женщин с ?3 выкидышами отмечено значительное увеличение частот аллеля DQB1 303 и генотипа DQВ1 0301\0501 по сравнению с пациентками с одним выкидышем (р<0,05). При наличии аллеля DQB1 303 и генотипа DQВ1 0301\0501 риск повторных выкидышей возрастает (OR=7,0, CL:1,09-45,0) и (OR=9,33, CL:1,03-86,1).

У мужчин из пар с повторными выкидышами обнаружено достоверное увеличение частоты аллелей DQA1 102 и DRB1 10 по сравнению с мужчинами из пар с одним выкидышем (р<0,05). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов риск повторных выкидышей увеличивается в семьях, где мужчина является носителем аллеля DRB1 10 (OR=13, CL:2,32-72,9) и аллеля DQA1 102 (OR=2,97, CL:1,03-8,59). В парах с ?3 выкидышами отмечено достоверное повышение частоты генотипов DQA1 0301\0102 и DQB1 501\501 (р<0,05). В парах, где мужчины были носителями данных генотипов риск повторных выкидышей увеличен (OR=14,5, CL:1,72-123,0) и (OR=12,6, CL:1,43-111,0).

При исследовании частоты супружеских пар, совпадающих по 1, 2 и 3 локусам система HLA II класса (DRB1, DQA1, DQB1) выявлены достоверные различия (рис.4.). У супругов с ?3 выкидышами выявлено значительное повышение частота совпадений аллелей по 2 локусам системы HLA II (р<0,05). В парах, где супруги совпадают по 2 и более локусам, увеличивается риск повторных выкидышей (OR =4,01, CL:1,33-12,1).

У супружеских пар с повторными выкидышами оба супруга в 7 раз чаще совпадали по аллелю DQA1 301 по сравнению с парами с одним выкидышем (р<0,05). При совпадении по аллелю DQA1 301 риск повторных выкидышей увеличивается (OR=5,07, CL:1,26-27,7).

При исследовании полиморфизма гена HLA-G в парах с разным числом выкидышей выявлены некоторые статистически значимые различия, так распределение частоты генотипов у женщин в контроле и в группе с одним выкидышем достоверно отличались (р<0,01). «Функционально неблагоприятный» генотип I\I по гену HLA-G у пациенток с одним выкидышем встречался в 2 раза чаще по сравнению с контролем (22,6% и 12,6%).

У мужчин из пар с ?3 выкидышами выявлено достоверное увеличение частоты «функционально неблагоприятного» аллеля I гена HLA-G по сравнению с мужчинами из пар с одним выкидышем (р<0,05). Рассчитанный коэффициент соотношения шансов показал увеличение риска повторных выкидышей в парах, где мужчина носитель аллеля I по гену HLA-G (OR=2,22, CL:1,03-4,76). Распределение генотипов по данному полиморфизму гена HLA-G у мужчин из пар с ?3 выкидышами и с одним выкидышем достоверно отличалось (р<0,05).

Очевидно, наличие «функционально ослабленного» генотипа I\I по гену HLA-G I класса у женщин увеличивает риск первого выкидыша, а присутствие данного генотипа у мужчин повышает риск повторного самопроизвольного прерывания беременности в парах.

Ген васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGF). При исследовании частот аллелей и генотипов 936 С\Т полиморфизма гена VEGF у женщин с разным числом выкидышей выявлены статистически значимые различия.

У пациенток с ?3 выкидышами обнаружено повышение частоты «функционально неблагоприятных» генотипов С\Т и Т\Т по сравнению со всеми группами (р<0,05). У женщин с генотипами Т\- по гену VEGF увеличен риск повторных самопроизвольных выкидышей (OR=2,4, 95% CI:1,13-5,18).

Исходя их полученных данных, можно предполагать, что, чем больше самопроизвольных выкидышей в анамнезе, тем выше частота «функционально ослабленных» генотипов по изученным генам в супружеских парах.

Анализ полиморфизма 13 изученных генов в зависимости от первичного и вторичного НБ. Все пациенты были разделены на 2 группы. В первую вошли пациентки с первичным НБ. Вторую составили пациенты с вторичным НБ.

Гены II фазы системы детоксикации GSTM1, GSTT1 и GSTP1. У женщин с первичным НБ отмечено повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по одному гену GSTM1 0\0 и сочетанных «функционально неблагоприятных» генотипов по двум (GSTM1 0\0+ GSTT1 0\0) и трем генам GSTM1 0\0+ GSTT1 0\0+ GSTP1 A\S и GSTM 0\0+ GSTT 0\0+ GSTP1 S\S (р<0,05) (рис.5.). У женщин с генотипом GSTM1 0\0 увеличивается риск первичного НБ (OR=1,76; 95% CI: 1,08-2,87).