Коррекция пролиферации кератиноцитов с использованием липосом и её клинико-лабораторная оценка как направление в наружной терапии псориаза

Результаты влияния отдельных липосомальных препаратов на состояние систем СРО и АОЗ культур кератиноцитов больных псориазом.

После воздействия отдельных липосомальных форм на активно пролиферирующие клетки отмечена в целом обратная зависимость изменений системы СРО и АОЗ (табл.5). Аналогично концентрации ДК, достоверно значимо изменялось содержание малонового диальдегида - одного их конечных метаболитов ПОЛ. Однако наиболее высокие концентрации МДА нами были получены в культурах после внесения липосомального селенита натрия. Уровень МДА в 1,8 раза превысил его концентрации над тем, что был в клетках в период активной пролиферации. После воздействия пентоксифиллина уровень МДА увеличился в 1,7 раза, пирроксана в 1,62, а сальбутамола только в 1,26 раза, во всех случаях - (р<0,001). Ни в одном из наблюдений уровень данного показателя не достиг значений группы контроля.

Метаболиты и ряд ферментов антиоксидантной системы, напротив, имели обратную динамику. Так, при внесении в культуры пентоксифиллина и пирроксана концентрации восстановленного глутатиона практически нормализовались до значений 3,73±0,55 и 3,58±0,34 ммоль/г ткани соответственно и не отличались от уровня этого метаболита в здоровой коже, при этом оказавшись ниже концентраций в активно пролиферирующих кератиноцитах в 3 раза (р<0,001).

Аналогичным образом претерпела изменения концентрация сульфгидрильных групп в исследуемых культурах. В кератиноцитах под действием пентоксифиллина она уменьшилась с 34,7±2,34 до 15,87±1,29 ммоль/г ткани, т.е. в 2,2 раза. Следует также отметить, что ни в одном из наблюдений концентрация СГ не снизилась до значений контрольной группы, превышая её в наилучшем случае на 35 %.

Глутатионредуктаза показала наибольшее снижение активности по сравнению с периодом активной пролиферации после применения селенита натрия на 33 %, что соответствовало значениям контрольной группы. Напротив, поведение селен-зависимой глутатионпероксидазы было несколько иным. При внесении в среду пентоксифиллина активность фермента резко возросла на 60 % по сравнению с периодом активной пролиферации и на 50 % по отношению к значениям контрольной группы. Под действием селенита натрия активность фермента претерпела наиболее значимые изменения. Увеличилась на 77 % по отношению к периоду пролиферации и на 66 % превысила значения группы контроля.

Активность супероксиддисмутазы наиболее выражено снижалась после применения пирроксана и пентоксифиллина в культуре кератиноцитов - на 25,3% и 15 % соответственно. Напротив, активность каталазы в культурах клеток имела выраженные тенденции к росту. Внесение липосомальных пентоксифиллина и селенита натрия привело к повышению активности этого гемохромопротеина в 2 и 1,8 раза по сравнению со значениями в период пролиферации и в 1,3 и 1,2 раза по сравнению с культурами, использованными в качестве контрольных соответственно (табл.5).

Общая тенденция в поведении антиокислительной клеточной системы наиболее отчётливо прослеживается в изменениях показателя общей антиокислительной активности. В среднем, уменьшение ОАА по сравнению с периодом наивысшей пролиферативной активности составило 1,7 раза.

Все использованные липосомальные препараты вызвали значительное подавление активности Гл-6ф-ДГ. Так, после введения в культуру активно пролиферирующих клеток пирроксана ее активность снизилась наиболее значительно и составила 58 % от значений контроля. Натрия селенит, сальбутамол и пентоксифилин подавляли активность на 33 %, 35 % и 37 % соответственно. Во всех случаях активность основного фермента пентозофосфатного цикла не отличалась от значений контрольной группы (табл. 5).

Изменения, отмеченные нами в культурах кератиноцитов после применения липосомальных препаратов, обладающих регуляторной активностью на процессы пролиферации и метаболизма, трудно поддаются однозначной трактовке, несмотря на ряд отчётливо прослеживаемых тенденций. Отмечено, что наиболее выраженные изменения, вызывал пентоксифиллин. Неселективный ?-адреноблокатор - пирроксан, отстал от него крайне незначительно. На наш взгляд, это можно объяснить единой концепцией конечного влияния на регуляторные системы клеток через системы вторичных посредников. И тот, и другой препарат являются цАМФ и АТФ сберегающими. Только пентоксифиллин делает это, блокируя фосфодиэстеразы, а пирроксан - прикрывая постсинаптические рецепторы на мембранах клеток. Напротив, сальбутамол - ?-адреномиметик, активирует аделнилатциклазу с последующим синтезом цАМФ из АТФ, что должно приводить к ожидаемым антипролиферативным эффектам, что мы и наблюдали в ряде случаев. Однако из всех наблюдений, изменения, происходящие под влиянием этого соединения, оказались наименее выраженными. Под влиянием сальбутамола значимо увеличивалась концентрация ДК и МДА, а также снижалась активность СОД.

Также отмечено, что полученные изменения подтвердили общую закономерность в поведении системы СРО при псориазе, которая ранее упоминалась в работах отдельных авторов [Хышиктуев Б.С. и соавт., 2000; Шилов В.Н. и соавт., 2000; Шинин В.В. и соавт., 2002]. Активно пролиферирующие псориатические кератиноциты обладают высокой степенью антиокислительной активности, о чём свидетельствует как низкая концентрация продуктов ПОЛ (ДК, МДА), так и высокий уровень метаболитов и активность некоторых ферментов антиоксидантной защиты. Применяемые препараты оказывали выраженное влияние на пролиферацию, а, следовательно, и на дифференцировку клеток кожи, при этом изменялись показатели, характеризующие поведение про-антиоксидантной систем, а значит и окислительно-восстановительного статуса и энергетического метаболизма клеток. Сейчас, мы можем с уверенностью сказать, что полученные и наблюдаемые нами изменения предшествовали снижению пролиферации и уменьшению клеточного пула в культуре. Следовательно, вначале метаболизм, а затем морфологические проявления.

Полученные результаты позволяют сказать, что подавление пролиферации вводимыми в культуральную среду липосомальными препаратами, сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления, о чём свидетельствуют увеличенные концентрации ДК, МДА, падение значений ОАА.

В период активной пролиферации кератиноциты содержали высокий уровень ВГ. На наш взгляд это вполне логично. Мы знаем, что за счет превращения восстановленной формы глутатиона в окисленную эта система принимает ведущее участие в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в тканях [Кулинский В.И.,1990], необходимого для осуществления таких процессов жизнедеятельности клеток, как работа мембранных структур, деятельность цитоскелета, клеточное деление, регуляция активности гормонов пептидной природы [Cotgreave I.A. et al., 1998; Ghibelli L. Et al., 1999; Filomeni G., 2002]. В нашем случае все перечисленное необходимо для ускоренной пролиферации и успешного клеточного деления, для обеспечения активной белковосинтетической функции, что и отмечается при псориазе [Беляев Г.М. и соавт., 2005; Goldberg N., 1974; Roenigk H.H. et al., 1999]. Следовательно, высокий уровень ВГ может свидетельствовать о подержании высокого восстановительного потенциала, что дополнительно подтверждается высокой концентрацией сульфгидрильных групп, отмеченной во всех культурах на пике пролиферации и уменьшением содержания этого показателя параллельно со снижением концентраций ВГ при внесении в культуральную среду липосомальных препаратов. При падении концентраций глутатиона клетка меняет свой восстановленный статус на окисленный, что характеризуется интенсификацией ПОЛ.

Снижение концентрации ВГ в клетках связано с работой мембранной ?-глутамилтранспептидазы (?-ГТП) и цАМФ зависимых протеинкиназных механизмов. Рост содержания цАМФ в тканях вызывает снижение активности ?-ГТП и повышение внутриклеточной концентрации ВГ [Корнеев А.А. и соавт., 1993]. Следовательно, в нашем случае при действии пентоксифиллина и сальбутамола концентрация ВГ должна расти, а она почти во всех случаях достоверно падает, что объяснить на первый взгляд достаточно трудно. Можно предположить, что количество ?-адренергических рецепторов на псориатических кератиноцитах генетически снижено, что косвенно подтверждается их слабой реакцией на сальбутамол. В случае действия пентоксифиллина на культуры клеток можно сказать, что действие цАМФ-зависимых протеинкиназных механизмов на регуляцию концентрации ВГ неоднозначно, и видимо не только от них зависит изменение уровня этого трипептида в клетках. Об этом, например, свидетельствуют данные, полученные при действии селенита натрия и пирроксана, которые не имеют прямого отношения к регуляции цАМФ. Пролиферирующий кератиноцит нуждается в аминокислотах, возможно, этим и объясняется достоверно высокий уровень этого метаболита даже в условиях подавления пролиферативной активности.

Se-зависимая глутатионпероксидаза - фермент, который в ходе выполнения своих функций осуществляет обратимое окисление восстановленной формы глутатиона в окисленный (ОГ), а также принимает участие в антиоксидантной защите и регуляции тиол-дисульфидного равновесия в тканях. Активация фермента осуществляется цАМФ-зависимой протеинкиназой [Колесниченко Л.С. и соавт.,1987;1989; Isaacs J.et al., 1977]. Наиболее выраженное повышение активности фермента при добавлении в среду натрия селенита вероятно связано с его активирующим влиянием на этот фермент. Известно, что дефицит селена приводит к снижению активности ГП более чем в 65 раз [Кулинский В.И. и соавт., 1993]. Однако существуют данные, свидетельствующие о том, что неорганический селен не включается в состав данного фермента [Flohe L., 1978]. Избыток, как и недостаток селена, подавляет активность этого фермента. Повышение активности ГП после воздействия пентоксифиллина отчётливо свидетельствует об увеличении уровня цАМФ в клетке, коррелирует с падением концентрации ВГ и повышением антипролиферативного потенциала. Рост активности ГП при интенсификации ПОЛ является компенсаторным и может быть связан с необходимостью утилизации различных видов перекисей, которые образуются в избытке в этот период. Кроме того, активация ПОЛ ещё не говорит о повышении концентрации АФК и самого кислорода, т.к. известно, что снижение концентрации кислорода также как и его избыток ведут активизации процессов СРО [Владимиров Ю.А. и соавт., 1972; Зозуля Ю.А. и соавт., 2000].

Глутатионредуктаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. В наших наблюдениях ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, причём ГР теряет активность в большей степени.

Активность ГР регулируется цАМФ-зависимым механизмом [Кулинский В.И. и соавт., 1990; Isaacs J.et al., 1977] и зависит также от состояния ее SH-групп, поэтому при физиологических концентрациях ВГ оказывает ингибирующее влияние на фермент [Latta K. et al., 1984; Mannervik B., 1987; Chang S.W. et al., 1989]. Следовательно, при низких концентрациях ВГ активность фермента должна компенсаторно расти, а в наших наблюдениях при внесении липосомальных пирроксана, сальбутмола и натрия селенита она падает.

Мы знаем, что скорость НАДФ·Н-зависимого восстановления окисленного глутатиона в ВГ под действием глутатион-редуктазы (ГР) намного превосходит возможности его синтеза de novo в тканях [Кулинский В.И. и соавт., 1990; De Almeida A., 1989]. Необходимым условием для осуществления глутатионредуктазной реакции является наличие в тканях достаточного уровня НАДФ·Н, так как его расходование при этом в 6 раз выше, чем на биосинтез жирных кислот и обеспечение процессов микросомального окисления [Уайт А., 1981]. Основным источником восстановленной формы НАДФ является ключевая реакция пентозофосфатного пути метаболизма углеводов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная, которая и лимитирует возможности редокс-циклирования глутатиона [Тиунов Л.А., 1988; Tate S.S. et al.,1985]. В наших исследованиях активность Гл-6ф-ДГ достоверно снижена под влиянием всех вводимых препаратов, что может свидетельствовать об ингибировании механизма восстановления глутатиона вследствие недостаточного количества восстановленного НАДФ. Этим можно объяснить низкий уровень ВГ во всех группах наблюдения после воздействия липосомальных лекарственных препаратов. С другой стороны, активность данного энзима может быть подавлена возросшим прооксидантным статусом и окислением сульфгидрильных групп ГР. Это подтверждается и данными, свидетельствующими о том, что оксидативное повреждение тканей Н2О2 развивается при дефиците глутатиона и ГП.

Доказано, что активность основного фермента антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД), прогрессивно уменьшается с увеличением степени тяжести повреждения клеток и развития гипоксии. Возможно, угнетение активности СОД развивается по механизму обратной связи - ингибирование избытком субстрата, являющегося, в свою очередь, продуктом ксантиноксидазной и пероксидазной реакций. Таким субстратом являются супероксидный анион-радикал и перекись водорода. В нашем случае возрастание их концентраций в системе можно предположить с большой долей вероятности, так как на фоне увеличения активности ГП, каталазы и роста концентраций продуктов ПОЛ накопление перекисей и АФК вполне очевидно. Рост активности каталазы, вероятно является временным и имеет в основном компенсаторный характер в связи с увеличением концентраций Н2О2 во внутриклеточной среде.

Мы считаем, что полученные нами изменения в системе СРО и глутатиона во многом обусловлены тем, что кератиноцит с приостановленной пролиферативной активностью готовится к вступлению в апоптоз, а значит к последующей гибели. Кроме того, нельзя не учесть, что кератиноциты, живущие в культуре, к которой экстраполяция процессов, хорошо описанных для тканей внутренних органов, изъятых у животных в ходе эксперимента, не всегда в полной мере подходит.

Результаты влияния комбинаций липосомальных препаратов на про- и антиоксидантную активность культур кератиноцитов.

Для оценки состояния системы СРО в культурах кератиноцитов мы провели определение её параметров после воздействия комбинациями липосомальных препаратов, состоящих из пентоксифиллина, пирроксана, натрия селенита (смесь № 1) - как наиболее активной и пентоксифиллина и натрия селенита (смесь № 5) - как наименее подавляющей пролиферацию. Таким образом, было создано 2 группы клеточных культур, в одну из которых добавлялась липосомальная смесь № 1, в другую - смесь № 5. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6. Влияние комбинаций липосомальных препаратов на системы СРО и АОЗ культур кератиноцитов больных псориазом

*- различия достоверны по сравнению с контролем (р<0.001);

** - различия достоверны с результатами до воздействия (p<0,05)

Сопоставляя данные, полученные в обеих группах наблюдений с отдельными липосомальными препаратами и их комбинациями, хочется отметить единую тенденцию в поведении системы антирадикальной защиты и ПОЛ в их изменениях, при этом по многим показателям изменения, полученные при действии смесей препаратов, более значительны.

В первую очередь это проявляется в активации свободно-радикальных процессов по результатам ДК и МДА, которые значительно превалируют под влиянием лекарственных комбинаций, чем отдельных препаратов.

Также более значимым было падение концентраций ВГ и сульфгидрильных групп после применения липосомальных смесей. Динамика изменений остальных показателей как после применения смесей, так и отдельных препаратов различий не имела.

В целом следует также отметить, что изменения, происходившие в системе свободнорадикального окиления и АОЗ кератиноцитов, оказались более значимыми под влиянием липосомальных комбинаций и особенно № 1, что совершенно чётко коррелирует с данными, полученными при радиометрическом измерении пролиферативной активности, и клиническими данными, полученными при применении у больных препарата Липсор, изготовленного на базе именно этой антипролиферативной комбинации как наиболее эффективной.

Так как полученные результаты достаточно трудно поддаются трактовке и метаболические изменения, под влиянием липосомальных препаратов и их комбинаций не укладываются в цепь стандартных и хорошо известных биохимическиих превращений, способных пояснить механизмы поведения систем СРО и АОЗ. Мы сделали попытку подойти к объяснению полученных результатов с иных позиций.

Одной из важнейших составляющих псориаза как патологического процесса, является подавление дифференцировки кератиноцитов. При этом клетки сохраняют способность дифференцироваться, однако это требует дополнительного воздействия, которым может быть и внешний фактор в виде средств терапии в их числе и те, которые усиливают окислительное давление [Filomeni G. et al., 2002; 2005]. Иными словами, кератиноциты при псориазе располагают комплексом регуляторных и метаболических возможностей для дифференцировки, однако в определенных условиях не способны или ограниченно способны к их инициации. В этой связи закономерным является вопрос о содержании молекулярных механизмов ингибирования дифференцировки кератиноцитов и возможности воздействия на них.

Окислительно-восстановительное состояние клетки - баланс между эквивалентными уровнями окисления и восстановления. Определяется суммарным соотношением концентраций восстанавливающих и окисляющих агентов. При этом система главного редокс-буфера - глутатиона моделирует ответ клетки на окислительно-восстановительные изменения, вызванные внешними или внутриклеточными стимулами [Buuke T.M. et al., 1994; Wang X. et al., 1998]. Внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние определено вкладом различных окислительно-восстановительных пар (редокс-пар).

Каждая пара способна обменивать электроны таким образом, что может представлять необходимые в каждом конкретном случае кофакторы в окислительно-восстановительных ферментативных реакциях. Относительное количество восстановленной и окисленной формы каждой пары может определять изменения в клеточном окислительно-восстановительном состоянии, смещая его как в одну, так и в другую сторону. В клетках, включая и кератиноциты существуют три самых важных окислительно-восстановительные системы: никотинамидадениндинуклеотидфосфатная (НАДФН/НАДФ+), тиоредоксиновая (TRXred/TRXox) и глутатиона (ВГ/ОГ). Среди них, последняя является самой важной, так как концентрация глутатиона приблизительно в 500 - 1000 раз выше, чем TRX и НАДФН [Кулинский В.И. и соавт., 1990]. Таким образом, изменения в ВГ/ОГ буфере глутатиона непосредственно отражают внутриклеточное окислительно-восстановительное состояние и его изменения.

Одно из возможных объяснений схожего действия различных по химической природе и фармакологической активности соединений, содержащих азот, окси- и гидрокси- группы, может быть связано с их способностью образовывать комплексные координационные соединения (КС) с переходными биометаллами (железо, медь и некоторые др.), обладающими способностью в ультра малых количествах в присутствии кислорода и его производных или активных форм азота катализировать окислительные реакции в физиологических условиях [Басоло Ф., 1971; Костромина Н.А. и соавт., 1990]. В этом аспекте объяснимы эффекты селенита натрия, который способен координироваться с эндогенными азот- и серосодержащими органическими молекулами в комплексное соединение с каталитическим действием. Лигандом для селена может выступать молекула ВГ, комплексные соединения которой катализируют окислительно-восстановительные процессы.

Не исключено, что каталитическая активность координационных соединений приводила к снижению уровня восстановительных эквивалентов в цитозоле и, соответственно их экспорта в микроокружение клетки. Наличием подобного действия препаратов в составе липосом можно объяснить характер изменения прооксидантных процессов, а именно активацию СРО, приводящую в итоге к увеличению концентрации ДК и МДА. Мягкое окислительное воздействие на сульфгидрильные группы изучаемых внутриклеточных ферментов также объясняет изменение их активности.

Увеличение окислительной активности в цитозоле приводит к снижению уровня внутриклеточной концентрации ВГ. Так, в период активной пролиферации он достаточно высок. Величина снижения концентрации ВГ при каталитическом действии ультра малых концентраций координационных соединений лекарственных препаратов, введенных в составе липосом, вероятно определяется стабильностью образующихся (КС). Так, пентоксифиллин, способный образовывать более устойчивые КС, будет обладать более сильным действием на уровень ВГ. Пирроксан в совокупности с селенитом натрия значительно усиливают его действие. Особенности влияний селенита натрия обусловлены молекулярной массой координируемых молекул, возможностью их перемещения в различные клеточные компартменты, его возможным непосредственным воздействием на активность селен-зависимых ферментов.

ГР и Гл-6ф-ДГ являются ферментами, поддерживающими высокий уровень глутатиона в клетке. Установлено, что ГР и Гл-6ф-ДГ проявляют свою активность на пике пролиферации, а затем теряют её под воздействием вводимых в среду веществ, что может быть объяснено окислительной модификацией сульфгидрильных групп с участием КС, образуемых вводимыми лекарственными препаратами.

При воздействии окислительных стимулов отношение ВГ/ОГ имеет тенденцию к уменьшению, однако, в ответ на окислительное напряжение, глутатион поддерживает окислительно-восстановительное состояние клетки через различные механизмы. Так, активность ГР должна увеличиваться, или избыток ОГ, сформированный в ответ на атаку окислительных эквивалентов, должен быть вытеснен во внеклеточную среду. В наших исследованиях отмечено падение активности ГР, что вероятно связано с механизмами ингибирования этого энзима, каким образом это происходит пока не ясно. В тех случаях, когда окислительное напряжение становится длительным и массивным, а клеточные системы более не способны противодействовать генетически установленным для них дозам АФК, вероятно, как в случае воздействия пентоксифиллином и пирроксаном, количество ВГ уменьшается, что приводит к остановке пролиферации и последующему запуску апоптоза клетки. Уменьшение содержания ВГ считается доказанным звеном запуска митохондриально-зависимымых апоптотических сигнальных путей [Ghibelli L. et al., 1999].

Химическое и физическое воздействие (УФО, лекарственные препараты) или взаимодействие лиганд/рецептор - лишь некоторые из процессов, в которых окислительное напряжение должно быть фактором трансдукции, приводящим к апоптозу, пролиферации, дифференцировке и регуляции клеточного цикла. Доказано, что АФК являются посредниками в передаче клеточных сигналов. Ряд исследователей выдвигали гипотезу относительно роли окислительно-восстановительного состояния окружающей среды в регуляции многих сигнальных путей [Buuke T.M. et al., 1994; Schulze-Osthoff K. et al., 1998].

Окисление, приводящее к истощению ВГ, вызывает формирование межмолекулярных дисульфидов, что приводит к конформационным изменениям, увеличивающим сродство и специфику глутаматного участка ОГ к различным лигандам. Такие изменения способствуют увеличению чувствительности рецепторного аппарата клетки, который может быть заблокирован при излишней восстановленности как наружной, так и внутриклеточной среды псориатичесого кератиноцита [282, 316]. Этим можно объяснить эффективность действия препаратов и методов лечения, которые смещают редокс-потенциал в сторону окисления.

Активные молекулы, способные изменять окислительно-восстановительный фон, непосредственно изменяют внутриклеточную среду, входя в клетку и действуя на функциональные белки. Известно, что взаимодействие лиганд/рецептор вызывает клеточный ответ по механизму, который может произвести активацию нескольких процессов без прямой коммуникации с внутренней частью клетки [Filomeni G.et al., 2002]. Следовательно, тиол/дисульфидный обмен может быть представлен как новый способ преобразования и передачи сигналов из внеклеточной среды до внутриклеточных процессов и отдельных реакций. С этой точки зрения тиол-содержащие молекулы могут быть сигнальными, когда акт передачи происходит на определенных трансмембранных белках. С другой стороны, богатые цистеином мембранные белки могут представлять предполагаемые рецепторы, особенно если они вовлечены в активацию некоторых известных путей трансдукции сигнала [Cotgreave I.A.et al., 1998]. Известно, что десенситизация поверхностно-клеточных рецепторов, в числе прочих причин, может быть обусловлена избыточной восстановленностью среды, формируемой за счет экспорта восстановительных эквивалентов из клеток в свое микроокружение [Filomeni G.et al., 2002]. С участием этих соединений осуществляется процесс восстановления дисульфидных связей целого ряда поверхностно-клеточных рецепторов. Рецептор при отсутствии дисульфидных сшивок приобретает функционально неактивную конформацию, что означает неспособность клеток физиологически адекватно отвечать на регуляторные внеклеточные воздействия.

Таким образом, обобщенные данные могут предложить новый подход в объяснении действия внеклеточного окислительно-восстановительного фона и передаче клетке различных сигналов, влияющих, в том числе, на её цикл. Внеклеточный окислительно-восстановительный фон ведёт к возникновению перекрестных связей с клеточными рецепторными системами и вызывает ответ по механизмам, которые не являются основными, но используют прямое действие окислительно-восстановительных эквивалентов во внутриклеточных процессах. В частности, внеклеточные окислительно-восстановительные сигналы могут действовать через системы вторичных посредников, которые в свою очередь могут быть представлены или трансмембранными богатыми цистеином рецепторами или специализированными низкомолекулярными веществами.

Результаты, полученные при изучении процессов СРО и АОЗ в культурах кератиноцитов до и после воздействия различных молекулярных комбинаций свидетельствуют о том, что:

- состотояние гиперпролиферации кератиноцитов сопровождается резким угнетением процессов ПОЛ и высоким уровнем антиокислительной активности клеток, о чем свидетельствует низкая концентрация продуктов СРО: ДК и МДА, высокий уровень восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп, а также уровень активности ферментов, участвующих в регуляции антиокислительной защиты;

- угнетение клеточной пролиферации характеризуется резким возрастанием прооксидантного статуса и угнетением АОЗ культур эпидермальных кератиноцитов;

- процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты принимают самое непосредственное участие в регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности клеток кожи при псориазе таким образом, что увеличение интенсивности СРО ведёт к остановке пролиферации, а высокий уровень АОЗ ее поддерживает.

Клиническое исследование

1. Результаты изучения клинической эффективности липосомального крема

Липсор на течение вульгарного псориаза в различных группах больных в стационарных условиях.

На основе выбранной комбинации в наибольшей степени подавляющей пролиферацию из пентоксифиллина, пирроксана и селенита натрия был создан липосомальный крем для наружной терапии псориаза, получивший авторское название Липсор.

Результаты изучения препарата в стационарных условиях показали, что полная клиническая ремиссия была достигнута у 388 (67%) больных, значительное улучшение у 116 (20%), незначительное улучшение у 40 (7%) и без изменений у 35 (6%) пациентов. Изменение индекса PASI в сторону улучшения отмечалось у 502 стационарных больных (86,6%): в 4,5 раза - у больных с ограниченным псориазом и более чем в 2,6 раза - у больных с распространёнными формами болезни (2 раза - у больных с распространённым псориазом; в 6 раз - у больных с экссудативным псориазом; в 3,5 раза - у больных с диффузным псориазом) (рис.9). Отсутствие эффекта отмечалось у нескольких больных, страдающих, как правило, диффузным псориазом с торпидным течением, незначительное улучшение от применения крема отмечалось у больных с ограниченным экссудативным псориазом, с длительным сроком лечения - от 10 и более лет (табл. 7).

Таблица 7. Динамика значений индекса PASI у стационарных больных

*-различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р<0,05)

Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что данное наружное средство может эффективно и безопасно применяться для лечения вульгарного псориаза, о чём свидетельствует высокий суммарный процент клинической ремиссии и значительного улучшения в исследуемой группе больных (87%).

За время наблюдения у десяти больных на фоне применения Липсора появлялись свежие псориатические высыпания, которые при детальном анализе нами трактовались как обострения псориатического процесса, связанные с воздействиями, обусловленными другими причинами.

Результаты изучения клинической эффективности липосомального крема Липсор на течение вульгарного псориаза у больных в амбулаторных условиях.

Результаты, полученные согласно данных кожно-венерологических учреждений г. Санкт - Петербурга были следующими: полное разрешение процесса наблюдалось у 405 (45%) больных, значительное клиническое улучшение у 243 (27%), незначительное улучшение было отмечено у 162 (18 %), а без заметных изменений у 90 (10%) пациентов.

У лиц, проходивших амбулаторное лечение в ВМедА, результаты несколько отличались от городских. Так полное разрешение процесса наблюдалось у 315 (52%) больных, значительное клиническое улучшение у 153 (30%), незначительное улучшение было отмечено у 73 (14 %), а без заметных изменений у 21 (4%) больного.

Таким образом, высокая эффективность препарата наблюдалась в 72% случаев наблюдений в КВД и 82% случаев наблюдений в ВМедА. Слабая эффективность и отсутствие положительной динамики в 28% и 18% случаев соответственно.

Анализ показал, что в большинстве случаев недостаточная эффективность действия крема была связана с нерегулярным применением, отсутствием общей терапии в остром периоде псориаза, предшествующем длительным лечением наружными кортикостероидными средствами, а также личностными особенности пациента, требующими от врача детальных разъяснений о правильном и иногда настойчивом применении препарата. Нельзя также не учитывать низкую информативность врачей-специалистов лечебных учреждений, которым недостаточно своевременно доводились как способ применения, так и механизм действия препарата.

Следует также отметить, что в число лиц, у которых действие крема оказалось недостаточно эффективным входили больные, как правило, с ограниченным экссудативным и с диффузным псориазом. Динамика течения болезни у этих больных при применении комплексного лечения неоднозначна и изменения индекса PASI, при применении крема «Липсор» в качестве наружного средства (как и других современных препаратов) не всегда давали достоверно значимые различия (табл. 8).

Таблица 8. Динамика значений индекса PASI у амбулаторных больных

* различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р < 0,05)

Изменение индекса PASI в сторону улучшения отмечалось более чем у 90% амбулаторных больных: в 2 раза - у больных с распространённым псориазом; в 4,4 раза - у больных с ограниченным псориазом.

При этом, достоверные изменения в сторону улучшения отмечены начиная с 3 недели у больных с распространённым псориазом и с 4-ой при ограниченных формах заболевания (табл. 8).

Сравнительная характеристика динамики разрешения псориатических высыпаний у больных, получавших различные препараты для наружной терапии вульгарного псориаза.

Под нашим наблюдением находились 260 больных с вульгарным псориазом, которым в качества наружной терапии назначались наиболее эффективные препараты, наиболее часто используемые в клинике: «Элоком С» - 69 больных, «Дайвонекс» - 120, «Скин-Кап» - 71 человек. Все пациенты получали амбулаторное лечение. Назначение того или иного препарата проводилось с учётом анамнестических данных.

По форме заболевания больные распределились следующим образом: с распространённым псориазом - 38, с ограниченным - 175, с диффузным - 47 пациентов. В ходе наблюдения пациенты с распространенной и диффузной формами вульгарного псориаза были объединены в одну группу, так как динамика течения болезни и разрешения сыпи в этих группах достоверных отличий не имела.

Анализ полученных результатов показал, что все средства для наружной терапии псориаза, использующиеся наиболее часто в клинике, достаточно эффективны, однако, как при распространённых формах так и при ограниченной форме болезни наиболее эффективными являются «Элоком С» и Липсор. Так у больных с ограниченным псориазом при применении «Элокома С» индекс PASI резко и достоверно снижался на 3-ей неделе наблюдения в 2,5 раза, в период 4-ой недели составлял всего лишь 24% от исходного, а к концу 5-ой недели приближался к нулю. Похожая динамика была также характерна и для «Липсора». На 3-ей неделе наблюдения показатели были ниже исходных уже 2,17 раза и к концу 4-ой недели индекс PASI составлял всего лишь 20% от исходного, а к концу 5-ой был почти таким же низким как и у пациентов получавших «Элоком С». При применении препаратов «Дайвонекс» и «Скин-кап» отмечалась более вялая динамика в разрешении сыпи. Так, достоверное уменьшение показателей в группах больных, получавших данные средства, отмечается только на 4-ой неделе наблюдения в 1,8 и 2,2 раза соответственно. А окончательное снижение показателей индекса PASI было зафиксировано лишь к концу 6-ой недели применения препаратов (табл. 9). При этом нельзя не отметить, что достоверные отличия в динамике разрешения высыпаний во всех группах наблюдений достаточно от четливо начинают проявляться в течение 3-ей, начале 4-ой недели наблюдения, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности всех препаратов (табл.9). Лечение диффузных форм псориаза характеризовалось более торпидным течением, о чём свидетельствует более медленные изменения индекса PASI, отмеченные практически во всех группах. Однако тенденции в скорости разрешения сыпи, уменьшении шелушения, отёка эпидермиса и улучшении общего состояния пациентов в целом совпадают с той картиной, которая отмечалась у больных с ограниченными формами заболевания. Так достоверные уменьшения индекса PASI отмечены у пациентов применявших «Элоком С» в течение 4-ой недели лечения в 2 раза, при этом у больных использовавших Липсор, интенсивное разрешение сыпи начиналось немного ранее и уже на 3-ей неделе PASI был меньше исходного в 2,1 раза. В конце первого месяца наблюдения, у этих больных индекс РASI был достоверно ниже чем в других группах в этот же период. В течение последующего месяца скорость разрешения высыпаний в группах «Элокома С» и Липсора была практически одинаковой, но процесс полного разрешения сыпи завершился у больных, получавших Липсор неделей раньше, т.к. раньше начался.

Таблица 9. Динамика изменений индекса PASI у больных псориазом при применении различных препаратов для наружной терапии

*- различия достоверны по сравнению с началом наблюдения (р<0,05);

**- различия достоверны в группе больных, получавших разные препараты в один и тот-же период наблюдения (р<0,05)

Достоверно значимые изменения в группах, где применялись «Дайвонекс» и «Скин-кап» нами отмечены начиная с 5-ой недели наблюдения (уменьшение в 2 раза). В последующем динамика снижения показателей, несмотря на высокую интенсивность отличалась от таковой в группе «Элокома С» и наиболее сильно от группы где использовался Липсор. Связано это с тем, что начало интенсивного разрешения сыпи и следовательно снижения индекса РASI у этих больных началось на неделю позже чем у тех кто использовал «Элоком С» и почти на две недели чем у пациентов применявших «Липсор». Так к концу 9-ой недели наблюдений индекс PASI у пациентов, получавших «Дайвонекс» и «Скин-кап» составлял от исходного почти 9% и 6% соответственно. Эти показатели были получены в группе где применялся «Элоком С» на 8-ой неделе, а в группе где использовался «Липсор» уже в течение 6-ой применения. Достоверные отличия в эффективности действия препаратов при их сравнении друг с другом отмечаются с 3-ей недели наблюдения. В этот период эффективность Липсора превосходит «Элоком С», не говоря уже о «Дайвонексе» и «Скин-капе».

Следует также отметить, что результаты полученные у больных при применении Липсора на 3-ей неделе наблюдения при лечении распространённых форм псориаза, достигаются при лечении «Элокомом С» только на четвёртой, а при лечении «Дайвонексом» и «Скин-капом» только на 5-ой. В течение второго месяца лечения «Элоком С» и Липсор действуют одинаково эффективно, судя по скорости регресса индекса PASI, однако результаты исследования показали несколько более высокую эффективность «Липсора», нежели «Элокома С» при лечении диффузных форм псориаза.

Наблюдения за больными в течение столь длительного срока также показали, что среди получавших «Элоком С», практически не было лиц, у которых данный препарат не оказывал бы положительный лечебный эффект, т.е. 98% чувствительность к препарату, тогда как во всех остальных группах такие пациенты встречались (от 3 до 8% в разных группах больных).

Мы считаем, что скорость разрешения псориатического процесса безусловно зависит от исходной величины индекса PASI и общей площади поражённой кожи. Но как показали результаты проведённых исследований, в больших группах наблюдения в течение длительного периода, где показатели индекса PASI нивелированны как и общая площадь поражения кожи, отчётливо проявляется значение механизмов действия каждого отдельного препарата, что и определяет эффективность его применения.

Полученные клинические наблюдения позволяют сказать что:

- крем Липсор является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания;

- по сравнению с традиционными наружными средствами крем Липсор обладает большей терапевтической эффективностью, что в первую очередь сказывается на скорости разрешения псориатического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее выраженным антипролиферативным действием на культуры кератиноцитов больных псориазом обладают пентоксифиллин, пирроксан, селенит натрия, глутатион окисленный и сальбутамол (подавление включения 3Н-тимидина в 4,2; 4,2; 3,2; 2,5 и 2.2 раза соответственно; р < 0,001), предварительно переведённые в липосомальную форму.

2. Комбинации из липосомальных: пентоксифиллина, селенита натрия и пирроксана, а также из пентоксифиллина, селенита натрия и этмозина наиболее целесообразны для использования в качестве лекарственных средств наружной терапии псориаза, так как наиболее эффективно подавляют пролиферацию в культурах кератиноцитов больных псориазом (подавляя включение 3Н-тимидина в 36,2 и в 23 раза соответственно; р < 0,001).

3. Комбинированный препарат в состав которого входят липосомальные пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия является высокоэффективным средством для наружной терапии псориаза и может быть использован как в остром, так и в стационарном периоде заболевания, так как не обладает раздражающим эффектом (клиническая ремиссия - 87% у стационарных и 82% у амбулаторных больных, переносимость очень хорошая - 100%).

4. Комбинированный препарат в состав которого входят липосомальные пентоксифиллин, пирроксан и селенит натрия, по скорости разрешения псориатических высыпаний не уступает современным наружным средствам, что доказано на высокой чувствительности к нему (93,9 % стационарных и 90% амбулаторных) больных, и на быстрой скорости разрешения псориатических элементов кожной сыпи (4-5 недель у больных с ограниченной и до 8 недель при распространённой формах болезни).

5. Процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты участвуют в регуляции пролиферативно-дифференцировочной активности клеток кожи при псориазе таким образом, что увеличение интенсивности свободнорадикального окисления ведёт к остановке пролиферации, а высокий уровень антиоксислительной защиты ее поддерживает:

- состотояние гиперпролиферации кератиноцитов сопровождается резким угнетением процессов свободнорадикального окисления и высокой антиокислительной активностью клеток, о чем свидетельствует низкая концентрация диеновых коньюгатов и малонового диальдегида, повышенное содержание восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп, а также возрастание активности ферментов, участвующих в регуляции антиокислительной защиты (уменьшение содержания малонового диальдегида и диеновых коньюгатов в клетках более чем в 2 раза и увеличение концентраций восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп в 3,3 раза);

- подавление пролиферации кератиноцитов липосомальными препаратами и их комбинациями сопровождается преимущественной нормализацией параметров антиокислительной защиты и увеличением интенсивности свободнорадикального окисления (снижение концентрации восстановленного глутатиона и сульфгидрильных групп в 3 и 2,2 раза соответственно и увеличение содержания малонового диальдегида и диеновых коньюгатов в 1,8 и 2,2 раза соответственно. Приведены результаты применения пентоксифиллина, как наиболее активного антипролиферативного препарата).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Лабораторный метод определения чувствительности кератиноцитов больных псориазом к различным препаратам следует применять как для определения индивидуальной терапевтической эффективности средств наружной терапии, так и для изучения пролиферативно-дифференцировочных, морфологических и метаболических процессов кожи с последующим созданием новых лекарственных препаратов с целью оптимизации наружной терапии.

2. Определение показателей процессов свободнорадикального окисления и антиокислительной защиты, как высокоинформативных и диагностически значимых наиболее целесообразно проводить на изолированных клеточных культурах кератиноцитов с целью установления их окислительно-восстановительного потенциала и пролиферативной активности.

3. В наружной терапии вульгарного псориаза целесообразно использовать антипролиферативный липосомальный крем вне зависимости от периода заболевания. Препарат может применяться в виде монотерапии, так и в комплексном лечении в качестве основного средства наружной терапии.

4. Применение липосомального антипролиферативного крема целесообразно назначать до 2-х раз в сутки в максимальной суточной дозе до 300 г в зависимости от площади поражения кожи. Крем наносить на поражённые участки кожи, слегка втирая. Применять крем необходимо до полного разрешения элементов сыпи. Первый эффект препарата проявляется на 5-7 день после начала терапии в виде уплощения бляшек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гуманенко Е.К. Эндотрахеальное применение препаратов супероксиддисмутазы при тяжёлой сочетанной травме - патогенетически обоснованная мера профилактики посттравматических бронхолёгочных осложнений / Е.К. Гуманенко, Н.С. Немченко, А.М. Фахрутдинов, Р.А. Грашин // Вестн хир. им. Грекова. - 2004.- Т.163, №1. - С. 65-68.

2. Терлецкий О.В. Cлучай эффективного применения кремов «Липсор» и «Липэк» у больного, страдающего тяжёлой формой псориаза / О.В. Терлецкий., Р.А. Грашин // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2006. - № 1. - С. 175-178.

3. Барбинов В.В. Влияние липосомальных и обычных мыл на функциональную активность апокриновых потовых желёз человека / В.В. Барбинов, Р.А. Грашин [и др.] // Вестник Военно-медицинской академии. - 2007.- № 1(17).- С. 40-45.

4. Барбинов В.В. Новые подходы к наружной терапии псориаза / В.В. Барбинов, Р.А. Грашин // Росс. ж-л. кож. и вен. болезней. - 2008. - №3 - С. 23-28.

5. Грашин Р.А. Регуляция пролиферации кератиноцитов больных псориазом в культурах клеток с использованием липосом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов, А.О. Данилов, А.В. Самцов // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - № 6. - С. 13-20.

6. Грашин Р.А. Активность про- и антиоксидантных процессов в культурах кератиноцитов больных псориазом / Грашин Р.А. [и др.] // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - №4(24). - С. 125-130.

7. Шилов Ю.В. Токсические эффекты циклофосфана и подходы к их фармакологической коррекции / Ю.В. Шилов, В.А. Кашуро, Л.В. Минаева, Р.А. Грашин. // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. №3 (23). - С. 68-72.

8. Хайрутдинов В.Р. Роль полиморфных генов программируемой клеточной гибели в формировании риска развития псориаза / В.Р. Хайрутдинов, А.С. Жуков, И.А. Пономарев, Р.А. Грашин, А.В. Самцов, Е.Н. Имянитов // Вестник дерматологии и венерологии. - 2009. - № 4. - С. 4-9.

9. Ольшамовская А.О. Новые возможности комбинированной наружной терапии при атопическом дерматите / А.О. Ольшамовская, Р.А. Грашин, В.В. Барбинов // Росс. ж-л. кож. и вен. болезней. - 2009. - № 6. - С. 8-11.

10. Грашин Р.А. Системы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты как индикаторы активности пролиферации кератиноцитов при псориазе / Р.А. Грашин, В.Г. Антонов, А.И. Карпищенко, В.Р. Хайрутдинов / Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. - № 12. - С. 11-15.

11. Атаманчук В.Н. Использование липосомального крема «Липро» в лечении вульгарных и розовых угрей / В.Н Атаманчук. [и др.] // Вторая науч.-практ. конф. «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Военно-мед. акад. им. С.М. Кирова. - СПб.: «Человек и здоровье», 2008. - С.10 .

12. Барбинов В.В. Результаты изучения клинической эффективности рецептуры «Липсор» у больных псориазом / В.В Барбинов [и др.] // Тез. докл. VI Всероссийской науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях". - СПб., 2003. - С.180.

13. Барбинов В.В. Оценка антипролиферативного действия препаратов, включённых в липосомы, на культуру кератиноцитов больных псориазом / В.В. Барбинов [и др.] // Тез. докл. VI Всероссийской науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы лечения в многопрофильных учреждениях". - СПб., 2003. - С.181.

14. Барбинов В.В. Новые патогенетически обоснованные подходы в наружной терапии псориаза / В.В. Барбинов., Р.А. Грашин // Тез. докл. 1-ого Росс. конгр. дерматовенерологов.- СПб. - 2003.- С. 23-26.

15. Барбинов В.В. Оценка влияния отдельных липосомальных препаратов на пролиферацию культур кератиноцитов больных псориазом по состоянию систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты / В.В. Барбинов, Р.А. Грашин // Тез. научн. работ Всеросс. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы лабораторной диагностики".- СПб. -2008. - С. 15-17.

16. Барбинов В.В. Оценка эффективности применения крема «Липэк» в комплексной терапии больных атопическим дерматитом / В.В. Барбинов., Р.А. Грашин., В.Н. Атаманчук., А.О. Ольшамовская // Вторая научно-практическая конференция «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Военно-мед. акад. им. С.М. Кирова. - СПб.: «Человек и здоровье», 2008.- С.12.

17. Барбинов В.В. Сравнительная клиническая эффективность современных лекарственных средств, применяемых в наружной терапии псориаза / В.В Барбинов, Р.А. Грашин, Р.А. Раводин, Д.В. Барбинов // Вторая научно-практическая конференция «Санкт-Петербургские дерматологические чтения»: Тезисы конференции / Под ред. проф. Самцова А.В., проф., Соколовского Е.В., проф. Разнатовского К.И.; Воен.-мед. акад. им. С.М. Кирова. - СПб.: «Человек и здоровье», 2008. - С.12-13.

18. Внутрилабораторный контроль качества лабораторных исследований: Медицинские лабораторные технологии и диагностика // Под ред. проф. А.И. Карпищенко. - СПб: Интермедика, 2002.- С.119-154.

19. Грашин Р.А. Сравнительная оценка влияния липосомальных и обычных мыл на функциональную активность апокриновых потовых желез и химический состав пота человека / Р.А. Грашин, А.В. Бабкин /. Журнал дермато-венерологии и косметологии. - 2004. - №1.- С. 39-43.

20. Грашин Р.А. Системы свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты как показатели пролиферативно-дифференцировочной активности кератиноцитов больных псориазом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов // Тез. науч. работ II-ого Всеросс. Конгр. дерматовенерологов.- СПб., 2007.- С.47.

21. Грашин Р.А. Состояние процессов свободнорадикального окисления в культурах кератиноцитов больных псориазом / Р.А. Грашин., В.В. Барбинов Тез. науч. работ II-ого Всеросс. Конгр. дерматовенерологов.- СПб., 2007.- С. 47.

22. Грашин Р.А. Использование культур кератиноцитов больных псориазом для оценки про- и антиоксидантного статуса клеток. / Р.А. Грашин, В.В. Барбинов., А.О. Данилов // Тез. научн. работ Всеросс. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы лабораторной диагностики". - СПб.- 2008. - С.17.