Инфекции при гемобластозах и депрессиях кроветворения: клиника, диагностика и лечение

Размещено на http://www.allbest.ru/

Инфекции при гемобластозах и депрессиях кроветворения: клиника, диагностика и лечение

Инфекционные осложнения являются ведущими у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Инфекции у них характеризуются рядом особенностей, которые включают скудность клинических проявлений, стремительность в развитии, полиэтиологичность. Они являются неотъемлемой частью такого полисиндромного заболевания как цитостатическая болезнь [Воробьев А.И., 1972]. Течение инфекций в период критической нейтропении может быть фатальным, если не начата своевременно терапия эффективными антибиотиками. Спектр микроорганизмов, ответственных за инфекционный процесс у больных, периодически претерпевает изменения. Так в 70-е годы преобладало выделение из крови грамотрицательных бактерий, в 90-е годы - грамположительных, а в настоящее время вновь появилась тенденция к увеличению роли грамотрицательных микроорганизмов в этиологии сепсиса [Schimpff S., 1971; Klastersky J. 1997; Velasco E., 2004; Norgaard M., 2005]. Что же касается инвазивных микозов, то в их структуре за истекшие годы существенно уменьшилась частота выделения грибов рода Candida и возросла доля Aspergillus. [Groll A., 2002; Barnes P., 2007].

В выборе противоинфекционных средств постоянно возникают ограничения не только из-за изменений в спектре патогенов, но и по причине формирования новых механизмов резистентности бактерий. Нередко лечение антибиотиками, эффективность которых была подтверждена исследованиями в 90-е годы, становится неуспешным в настоящее время. Резистентность микроорганизмов, выделяемых у больных с нейтропенией, как и их спектр, может различаться в отдельных странах и в отдельных клиниках. В этой связи крайне важным является изучение этиологической структуры возбудителей сепсиса и их чувствительности к антибиотикам в современных условиях. Полученные данные необходимы как для разработки тактики эмпирического назначения антибиотиков, так и направленной антимикробной терапии при программном лечении гемобластозов и депрессий кроветворения.

Наряду с регистрируемыми переменами в структуре возбудителей сепсиса и их чувствительности in vitro к антибиотикам, произошли изменения и в клинических проявлениях инфекционного процесса, в методах диагностики, в эффективности антимикробных препаратов. Проблемными стали другие инфекции, и такой инфекцией, наряду с грамотрицательным сепсисом, является инвазивный аспергиллез. Именно грамотрицательный сепсис и инвазивный аспергиллез легких являются ведущими и наиболее тяжелыми среди инфекционных осложнений у иммунокомпрометированных больных в настоящее время. Их значимость определяется тяжелым течением, удлинением периода госпитализации, высокой летальностью, немалыми финансовыми затратами на лечение. Сепсис - генерализованный инфекционный процесс и неотъемлемой частью его, наряду с инфекцией, является синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, проявления которого были широко изучены в ранее выполненных научных работах [Воробьев А.И., 1985, 2006; Галстян Г.М., 2003], в то время как многие аспекты противомикробной терапии, диагностики в современных условиях этих наиболее тяжелых инфекций нуждаются в совершенствовании.

Также следует отметить, что в литературе, как правило, обсуждаются отдельные вопросы диагностики и антимикробной терапии инфекций у иммунокомпрометированных больных. В то же время, очевидно, что решению указанных задач может способствовать лишь углубленный совокупный анализ спектра возбудителей сепсиса, чувствительности их к антимикробным препаратам, современных подходов к диагностике, клинических особенностей тяжелых инфекций и прогностических факторов, влияющих на эффективность лечения. При этом, несомненно, важным является выяснение механизмов и источников инфицирования грамотрицательными бактериями и аспергиллами в стационаре в эпоху возрастающей резистентности к антибиотикам.

Актуальность настоящей работы определяется решением большого круга научных и практических вопросов, направленных на борьбу с наиболее тяжелыми инфекциями у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения.

Цель исследования

Разработать современные подходы к диагностике и антимикробной терапии тяжелых инфекционных осложнений у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения.

Задачи исследования

1. Исследовать этиологическую структуру возбудителей сепсиса, их чувствительность к антибиотикам у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения, разработать тактику эмпирической и направленной терапии инфекций.

2. Определить пути инфицирования грамотрицательными бактериями в стационаре с помощью генотипирования госпитальных штаммов бактерий, выделенных из крови при сепсисе у иммунокомпрометированных больных.

3. Изучить особенности диагностики, клинического течения, прогностические факторы, оказывающие влияние на результаты терапии сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями, в современных условиях.

4. Установить особенности диагностики, клинического течения, прогностические факторы, оказывающие влияние на результаты лечения инвазивного аспергиллеза легких.

5. Определить источники инфицирования аспергиллами в стационаре.

6. Разработать алгоритм диагностики и антимикробной терапии инфекционных осложнений у больных опухолями системы крови и депрессиями кроветворения.

Научная новизна исследования

Проведено первое в России многоцентровое исследование по изучению этиологической структуры и чувствительности к антибиотикам возбудителей сепсиса у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Детально изучена этиология возбудителей сепсиса, показано, что среди них преобладают грамотрицательные бактерии (49,1%), далее следуют грамположительные бактерии (43,4%), реже выявляют грибы (7,3%) и анаэробные бактерии (0,2%). Определено, что основными микроорганизмами являются Escherichia coli (18,6%) и стафилококк коагулазонегативный (18,0%). Отмечена высокая частота выделения энтеробактерий с продукцией бета - лактамаз расширенного спектра (БЛРС), а среди грибов выявлена низкая встречаемость Candida albicans (21%), преобладавших в прошлые годы.

Проведен сравнительный анализ чувствительности антибиотиков in vitro в отношении бактерий - возбудителей сепсиса. Зарегистрирована высокая резистентность микроорганизмов к антибиотикам, максимальная активность в отношении грамотрицательных бактерий определена у карбапенемов, из цефалоспоринов - у цефоперазона/сульбактама и цефепима; в отношении грамположительных бактерий - у линезолида. Впервые в России из крови выделены штаммы Enterococcus faecium, устойчивые к ванкомицину.

Молекулярное исследование возбудителей сепсиса доказало наличие двух путей инфицирования грамотрицательными бактериями в стационаре - экзогенного и эндогенного, с преобладание эндогенного варианта. Установлено, что для штаммов Escherichia coli наиболее характерным является эндогенный путь инфицирования, в то время как для других грамотрицательных бактерий, особенно для Pseudomonas aeruginosa, - смешанный вариант инфицирования. Генетическое изучение бактерий показало, что у штаммов с одинаковым генотипом могут быть разные параметры чувствительности, поэтому об экзогенном пути передачи инфекции нельзя судить только на основании результатов определения их чувствительности к антибиотикам.

Тяжелые инфекционные осложнения (грамотрицательный сепсис и инвазивный аспергиллез легких) развиваются преимущественно в период критической нейтропении (гранулоцитов < 0,5х10⁹/л). Представлены особенности клинического течения сепсиса, обусловленного грамотрицательными бактериями в современных условиях. Выявлена высокая частота клинически доказанных инфекционных осложнений, из них основные - пневмония (53%), мукозит (40%), некротическая энтеропатия (30%). Наибольший риск развития пневмонии установлен при сепсисе, обусловленном неферментирующими бактериями, прежде всего P.aeruginosa (84%), в сравнении с энтеробактериями (41%).

Изучена антимикробная терапия при грамотрицательном сепсисе. Определена эффективность антибиотиков, назначаемых на 1-ом этапе лечения, которая составляет при сепсисе, вызванном энтеробактериями - 49%, неферментирующими бактериями - 29%; в половине случаев возникает необходимость в назначении карбапенемов. Более высокая частота излечения при добавлении карбапенемов отмечена при сепсисе, вызванном энтеробактериями в сравнении с неферментирующими бактериями. Выявлена полиэтиологичность инфекционных осложнений, более чем в половине случаев к цефалоспоринам или к карбапенемам дополнительно присоединены препараты других групп из-за развития сопутствующей инфекции иной этиологии. Определены прогностические факторы, оказывающие влияние на результаты терапии сепсиса, обусловленного грамотрицательными бактериями.

Зарегистрировано увеличение инвазивного аспергиллеза легких у иммунокомпрометированных больных. Выявлено преобладание этой инфекции при острых лейкозах, отмечена высокая частота в период индукции, продемонстрирована неспецифичность клинических признаков. Показано, что основу ранней диагностики инвазивного аспергиллеза легких составляют определение антигена Aspergillus (галактоманнан) и компьютерная томография легких. Доказано, что терапия вориконазолом инвазивного аспергиллеза приводит к достоверному увеличению частоты излечения в сравнении с амфотерицином В (77,3% против 44%). Определены факторы, отрицательно влияющие на успех терапии, - резистентность опухоли, сохранение нейтропении, выделение культуры Aspergillus, проведение лечения амфотерцином В.

Определена минимальная концентрация спор аспергилл в воздухе одноместных палатах с ламинарным потоком воздуха и оснащенных приточно-вытяжной системой вентиляции.

Научно-практическая ценность работы

Проведенное исследование позволило разработать оптимальную тактику антимикробной терапии у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. На основании результатов изучения активности антибиотиков in vitro в отношении возбудителей сепсиса и анализа лечения грамотрицательного сепсиса внесены изменения в протокол эмпирической антимикробной терапии при лихорадке в период нейтропении, которые заключаются в назначении на 1-ом этапе цефоперазона/сульбактама или цефепима и замены их на карбапенем (имипенем или меропенем) в случае неэффективности.

Получены убедительные данные о механизмах инфицирования в стационаре. Всех пациентов с сепсисом, вызванном P.aeruginosa, следует изолировать, поскольку для этих микроорганизмов определено значимое преобладание экзогенного механизма инфицирования. Размещать в отдельных палатах следует больных с прогрессией опухоли, так как у них наиболее часто выявляются полирезистентные микроорганизмы, которые могут быть источником инфицирования в стационаре.

Клинический анализ случаев сепсиса, обусловленного грамотрицательными бактериями, показал, что выделение из крови штаммов E.coli и K.pneumoniae без продукции бета - лактамаз расширенного спектра значимо чаще происходит у больных до лечения антибиотиками, а неферментирующих бактерий - при использовании антибиотиков. Установлено, что на фоне применения карбапенемов достоверно чаще возникает сепсис, обусловленный штаммами P.aeruginosа.

Детальное изучение клинических проявлений сепсиса показало, что его первые симптомы возникают в течение недели до выделения бактерий из крови в 35% случаев, причем, значимо чаще при сепсисе, обусловленном неферментирующими бактериями (56%) в сравнении с энтеробактериями (26%). Это свидетельствует о необходимости активного проведения комплекса диагностических исследований, повторения их, изменения тактики антимикробной терапии при отрицательных результатах у больных с персистирующей лихорадкой. Отмечена высокая частота инфекций другой этиологии при грамотрицательном сепсисе и инвазивном аспергиллезе, что диктует необходимость повторных исследований при персистирующей гипертермии и нейтропении. Установлено, что периодом наибольшего риска присоединения инфекции является нейтропения длительностью более 20 дней, на фоне которой развиваются достоверно чаще сопутствующие инфекции другой этиологии, а также пневмонии, парапроктиты.

Показано, что современная диагностика инвазивного аспергиллеза легких должна базироваться на данных исследования антигена Aspergillus (галактоманнан) и компьютерной томографии легких, а не на результатах рентгенографии легких, поскольку в 69% не удается выявить изменений на рентгенограммах или они оказываются малоинформативными. Проведенные исследования позволили создать современные программы диагностики и лечения этого тяжелого осложнения и существенно улучшить выживаемость больных гемобластозами.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения этиологической структуры сепсиса у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения свидетельствуют об увеличении частоты выделения из гемокультур грамотрицательных и снижении грамположительных бактерий.

2. Микроорганизмы, выделенные из гемокультур, характеризуются высоким уровнем резистентности к антимикробным препаратам; максимальную активность в отношении грамотрицательных бактерий проявляют карбапенемы, из цефалоспоринов - цефоперазон/сульбактам и цефепим, в отношении грамположительных бактерий- линезолид.

3. Генетическое исследование возбудителей сепсиса доказывает преобладание эндогенного пути инфицирования грамотрицательными бактериями в стационаре.

4. Для сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями, характерна высокая частота развития пневмонии, стоматита, некротической энтеропатии. На успех терапии сепсиса оказывают влияние вид возбудителя и его чувствительность к антибиотикам, фаза заболевания, характер и длительность инфекционных осложнений.

5. Инвазивный аспергиллез легких преобладает у больных острыми лейкозами в период курсов индукции, для ранней диагностики важно определение антигена аспергилл (галактоманнан) и проведение компьютерной томографии легких, препаратом выбора в лечении является вориконазол. Концентрация аспергилл в воздухе одноместных палат с ламинарным потоком воздуха и оснащенных приточно-вытяжной вентиляцией минимальна.

Внедрение в практику

Разработанные протоколы антимикробной терапии и лечения инвазивного аспергиллеза у иммунокомпрометированных больных используют в клинической практике отделений гематологии ГНЦ РАМН и ряда гематологических отделений России.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 114 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях. В общей сложности опубликовано 165 печатных работ.

Апробация

Основные положения диссертации обсуждались на ежегодных Международных школах гематологов “Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования” (1992-2008 гг.), использовались в лекциях для клинических ординаторов и практических врачей, проходящих стажировку в ГНЦ РАМН, а также для курсантов кафедры гематологии и интенсивной терапии Российской медицинской академии последипломного образования. Результаты работы доложены на ежегодных декадниках по гематологии, проходящих в ГНЦ РАМН (1995-2009 гг.), на I Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2001 г.), на ежегодных конференциях “Современные проблемы антимикробной терапии” (Москва, 1999-2008 гг.), ежегодных конгрессах по медицинской микологии (2003-2007 гг.), конференции Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (2001 г), Московском онкологическом обществе (2009 г.).

Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии “Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения” 19 мая 2009 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 291 странице машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Работа иллюстрирована 74 таблицами, 93 рисунками. Библиографический указатель включает 23 отечественных и 247 зарубежных литературных источников.

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН (директор академик А.И.Воробьев) при научном сотрудничестве с лабораториями и отделениями ГНЦ РАМН, гематологическими отделениями Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор д.м.н., профессор, член-корр. РАМН Румянцев А.Г.), Гематологического научного центра г. Новосибирска (рук. центра д.м.н., проф. Поспелова Т.И.), областных клинических больниц г. Новосибирска (зав. лаб. бактериологии Крайнова Л.Е.), г. Иркутска (зав. лаб. бактериологии к.м.н. Верещагина С.А.), г. Самары (бактериолог Юрицина Н.Я.).

В проспективном многоцентровом исследовании была изучена этиологическая структура 1290 возбудителей сепсиса, выделенных из крови у 946 больных, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях 6 лечебных учреждений России (Москва - 2 центра, Новосибирск - 2 центра, Иркутск, Самара) с 2003 по 2007 гг., при этом 5 стационаров были для лечения взрослых пациентов, а один - для детей. Чувствительность к антимикробным препаратам была исследована у 1099 штаммов бактерий, выделенных из гемокультур.

Было проведено генотипирование 152 штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из крови больных, находившихся на лечении в ГНЦ РАМН.

Были изучены клинические проявления, диагностика и лечение у 155 больных 187 случаев сепсиса, обусловленного грамотрицательными бактериями, и у 75 больных инвазивного аспергиллеза легких. Исследование было у больных, находившихся на лечении в ГНЦ РАМН.

Методы исследования

Микробиологические исследования

Материалом проспективного многоцентрового исследования являлись микроорганизмы, выделенные из гемокультур от больных опухолями системы крови и симптомами сепсиса. Для исследования брали первый штамм, выделенный из крови, коагулазонегативные стафилококки и коринебактерии исследовали при повторном выделении из крови.

Все микроорганизмы были доставлены в лабораторию клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ГНЦ РАМН, где проводили 100% реидентификацию. Чувствительность бактерий к антибиотикам оценивали методом серийных микроразведений в бульоне в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) и с “Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам” [NCCLS, 2004; МУК 4.2.1890-04., 2004].

При характеристике результатов чувствительности бактерий использовали следующие показатели - чувствительные (Ч), умеренно-резистентные (УР), резистентные (Р), минимальная подавляющая концентрация (МПК) - наименьшая концентрация антибиотика, способная подавить видимый рост микроорганизма in vitro, МПК₅₀ (МПК антибиотика для 50% исследованных штаммов), МПК₉₀ (МПК антибиотика для 90% исследованных штаммов). Термин “нечувствительные” или “резистентные” штаммы объединял умеренно-резистентные и резистентные микроорганизмы.

Значения МПК определяли для меропенема, имипенема, цефтазидима, цефотаксима, цефтриаксона, цефепима, цефоперазона/сульбактама, триметоприма/сульфаметоксазола, левофлоксацина, ампициллина, гентамицина, амикацина, ванкомицина, линезолида, хлорамфеникола, тетрациклина, оксациллина, пенициллина, эритромицина. Скрининг для выявления высокого уровня устойчивости энтерококков проводили к гентамицину на агаре (гентамицина 500 мкг/мл) Мюллера - Хинтон, к стрептомицину в бульоне (стрептомицина 1000 мкг/мл) и на агаре (стрептомицина 2000 мкг/мл) Мюллера - Хинтон (Becton-Dickinson, США). Продукцию БЛРC у энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis) определяли методом “двойных дисков” и дополнительно сравнением МПК цефалоспоринов III поколения (цефотаксима и цефтазидима) и их комбинаций с клавулановой кислотой.

Исследование хромосомной ДНК бактерий

Исследование хромосомной ДНК грамотрицательных бактерий проводили методом гель - электрофореза в пульсирующем поле с использованием коммерческих наборов Genepath Reagent Kits (BioRad, США). Для расщепления ДНК применяли следующие рестриктазы: SpeI для штаммов P. aeruginosa и Enterobacter spp., XbaI - для K. pneumonia и NotI - для E. сoli. Электрофоретическое разделение полученных макрофрагментов ДНК проводили в аппарате GenePath (BioRad, США). В качестве маркеров использовали конкатемеры ДНК фага лямбда и контрольные штаммы бактерий (Control Plug E. coli 0157:H7, P. aeruginosa и E. coli). По количеству и расположению полос на электрофореграмме оценивали рестрикционные фрагменты ДНК бактерий. Сравнение и интерпретацию результатов исследования проводили с использованием программы компьютерного анализа (BioNumerics, Applied Maths) согласно критериям F.C. Tenover и соав. [Tenover F., 1995] Изоляты, различающиеся на электрофореграмме по трем и менее рестрикционным фрагментам ДНК, считали клонально-родственными (идентичными) и относили к подтипам одного клона. Изоляты с большим числом различий в рестрикционных фрагментах ДНК считали независимыми. Анализ дендрограмм проводился в программе GelCompar методом UPGMA с коэффицентом Dice.

Диагностика инвазивного аспергиллеза легких

Диагностику инвазивного аспергиллеза легких проводили в соответствии с Международными критериями 2002 г. [Ascioglu S., 2002].

Культуру Aspergillus spp. получали из мокроты, смывов из трахеи и бронхов, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, биоптата легкого. Определение антигена Aspergillus (галактоманнан) в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем PLATELIA Aspergillus (BioRad Laboratories, США). Антиген считали положительным при значениях индекса, равных 0,5 и выше.

Компьютерную томографию легких проводили при положительном антигене Aspergillus или при стойкой персистирующей лихорадке. Обнаружение изменений в легких на рентгенограмме также являлось основанием для проведения компьютерной томографии.

Исследование образцов воздуха и смывов с поверхностей на мицелиальные грибы

Проспективное исследование микологического мониторинга воздуха осуществляли в двух лечебных корпусах центра. Образцы воздуха были отобраны с помощью пробоотборного устройства ПУ - 1Б в режиме 250 л/мин. Внутри помещений центра пробы воздуха отбирались ежемесячно в палатах, расположенных в начале, середине и конце отделения, в душевых комнатах, прилегающих к этим палатам, в коридоре и на постах медицинских сестер. Один раз в сезон исследовали образцы воздуха на улице (вблизи лечебных корпусов на территории центра) на высоте 1,5 м от земли. Количество колоний грибов выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) в 1 м³. Концентрацию мицелиальных грибов в исследуемых образцах определяли по формуле: С=1000 P/Q, где С - концентрация, P - наиболее вероятное число осажденных микроскопических грибов в зависимости от числа колоний (N), представленное в таблице, Q - объем отбираемой пробы воздуха.

Алгоритм обследования больных при нейтропении

При лихорадке до назначения антибиотиков забирали кровь из вены во флаконы с двухфазной средой с 2000 по 2003 гг., а с 2004 г. - только в коммерческие флаконы (Becton-Dickinson, США). Коммерческие флаконы для гемокультур находились в отделениях.

При наличии стоматита выполняли посев со слизистой оболочки ротоглотки, симптомов инфекции мочевыводящих путей - посев мочи, признаков некротической энтеропатии - определение токсина Clostridium difficile. При сохранении температуры выше 38С комплекс микробиологических исследований повторяли, осуществляли мониторинг антигена Aspеrgillus (галактоманнан) в крови, компьютерную томографию легких. При пневмонии проводили бронхоскопию с исследованием бронхоальвеолярной жидкости на наличие бактерий, грибов (дрожжевых и мицелиальных), микобактерий (микроскопия), нокардий, пневмоцист, герпесвирусов.

Тактика антимикробной терапии при нейтропении.

При появлении лихорадки (температура более 38⁰С) назначали внутривенно антибиотики 1-го этапа - сочетание амикацина с цефалоспорином III-IV поколения (цефепим, цефтазидим, цефоперазон/сульбактам, цефоперазон) или один цефалоспорин III-IV поколения. Модификацию антибактериальной терапии проводили согласно результатам микробиологических исследований. Если проводимые исследования оказывались неинформативными при сохраняющейся лихорадке, то поэтапно эмпирически добавляли ванкомицин или амфотерицин В, последующим этапом была отмена антибиотиков 1-го этапа и назначение карбапенема (имипенема или меропенема). Антибиотики назначали в следующих дозах (в сутки) - амикацин 15 мг/кг, цефепим по 2г х 2 раза, цефтазидим по 2 г х 3 раза, цефоперазон/сульбактам по 4г х 2 раза, цефоперазон - по 2 г х 2 раза, имипенем по 0,5 х 4 раза, меропенем по 1г х 3 раза, ванкомицин по 0,5 х 4 раза. Лечение инвазивного аспергиллеза легких проводили амфотерицином В (в/в, 0,6-1,25 мг/кг в сутки), каспофунгином (в/в, в 1-й день 70 мг в сутки, далее по 50 мг), вориконазолом (в/в, в 1й день по 6 мг/кг 2 раза в сутки, далее по 4 мг/кг 2 раза в сутки; через неделю - в таблетках по 200 мг 2 раза в день). Антибактериальную терапию считали эффективной при совокупности следующих критериев: стойкое снижение температуры тела ниже 37,5⁰С, регрессия клинических симптомов и очагов инфекции. Замену антибиотиков считали адекватной, если она была проведена согласно результатам чувствительности выделенных из крови микроорганизмов или при замене отмечалась положительная динамика в состоянии пациента. Лечение антибиотиками считали неэффективным, если сохранялись симптомы инфекции, несмотря на проводимую терапию, или был летальный исход.

Другие исследования

Морфологическое исследование крови проводилось сотрудниками клинико-диагностической лаборатории (зав. лаб. - Тихонова Л.Ю.). Радиологические исследования проводились сотрудниками отделения рентгенорадиологии (руководитель - д.м.н., профессор Готман Л.Н.). Гистологическое исследование осуществлялось сотрудниками патологоанатомической лаборатории (рук. лаборатории - д.м.н., проф., член-корр. РАМН Франк Г.А.), вирусологические исследования - в лаборатории клинико-вирусологической диагностики гепатитов и СПИД (рук. лаборатории - д.б.н. Филатов Ф.П.). Статистическую обработку и анализ данных чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили с помощью компьютерной программы “WHONET 5.”

Статистический анализ инфекционных осложнений был проведен совместно с заведующим лабораторией биомедицинской статистики к.ф.м.н. Куликовым С.М. и сотрудником лаборатории Гемджяном Э.Г. (рук. лаб. - к.ф.м.н. Куликов С.М.). Эта процедура осуществлялась в статистической программе SAS и STATVIEW с использованием базы данных по инфекциям.

Результаты исследований

Этиологическая структура сепсиса у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Результаты проспективного многоцентрового исследования. Были изучены 1290 клинически значимых микроорганизмов, выделенных из крови при сепсисе у 946 больных. Сепсис чаще регистрировали у больных острыми лейкозами (47,5%), далее следовали больные лимфосаркомой/лимфомой (22%). В течение всех лет (2003-2007 гг.) наблюдалось некоторое преобладание грамотрицательных бактерий в общей структуре возбудителей сепсиса, и суммарно частота выделения их составила 49,1%, грамположительных бактерий - 43,4%. Грибы из крови были выявлены у 7,3% больных, у двух больных - анаэробные бактерии (0,2%). У 67 (7%) из 946 пациентов этиология сепсиса была полимикробной.

У 221 (23%) больного наблюдалось повторное выделение бактерий из крови в период полихимиотерапии (ПХТ), однако, только у 50 (23%) из них повторный эпизод сепсиса был обусловлен бактериями того же вида, что и первый эпизод. Следовательно, в случаях регистрации новых эпизодов лихорадки необходимо проводить поиск иных патогенов, поскольку вероятность того, что инфекция вызвана тем же возбудителем, невелика. Спектр возбудителей сепсиса у иммунокомпрометированных больных представлен в табл. 1.

инфекционный бактерия стационар

Таблица 1. Спектр микроорганизмов, выделенных при сепсисе из гемокультур у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения

В структуре микроорганизмов доминировали E.coli (18,6%) и стафилококк коагулазонегативный (18,0%), далее следовали Enterococcus spp. (9,9%), K. pneumoniae (7,3%), P. aeruginosa (7,0%), Streptococcus группы “viridans” (6,0%). Грибы среди всех возбудителей сепсиса заняли пятую позицию (7,3%). В число десяти наиболее часто выделяемых микроорганизмов также вошли S. aureus (5,1%), Enterobacter spp. (4,0%), Acinetobacter spp. (3,8%).

Этиологическая структура возбудителей сепсиса у взрослых и у детей, а также у больных, находившихся на лечении в нашем центре и в других клиниках, была сопоставимой по основным группам и видам бактерий. Значимое отличие было определено лишь по грибам: частота выделения их была достоверно выше в других стационарах в сравнении с нашим центром (10,6% против 5,7%, p=0,001). Выявленное сходство большинства позиций косвенно свидетельствует о наличии единых подходов антимикробной и цитостатической терапии в современной онкогематологии.

Среди грамотрицательных бактерий чаще выделяли микроорганизмы, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae (33,4%). Отмечена высокая частота детекции у них БЛРС (43%), особенно у штаммов K.pneumoniae (63%), табл. 2. Распространенность БЛРС среди энтеробактерий отличается в разных странах, но для России характерен высокий уровень их детекции. Проведенное нами исследование подтвердило высокую встречаемость их еще у одной категории больных - у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения.

В семействе Enterobacteriaceae третью позицию по частоте занимали штаммы Enterobacter spp. (n=51), которые были представлены в основном штаммами E.cloacae (n=47) и единичными штаммами E. gergoviae (n=3), E.asburiae (n=1). В состав иных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (n=46) вошли Salmonella enteritidis (n=15), Serratia marcescens (n=9), Pantoea spp. (n=6), Proteus mirabilis (n=4), Citrobacter freundii (n=3), Klebsiella oxytoca (n=3), Serratia liquefaciens (n=3), Providencia spp. (n=1), Escherichia fergusonii (n=1), Morganella morganii (n=1). Встречаемость этих штаммов была сопоставимой по годам.

Таблица 2. Частота энтеробактерий, продуцирующих БЛРС

Примечание. В столбцах - число штаммов, продуцирующих БЛРС к общему числу штаммов данного вида бактерий.

Частота выделения грамотрицательных неферментирующих бактерий составила 15,7% (n=203). В этой группе микроорганизмов преобладали P.aeruginosa (n=90) и Acinetobacter spp. (n=49), основная доля которых была представлена A.baumannii (42 из 49 штаммов), реже выявляли A.lwoffii (n=3), A.haemolyticus (n=2), A.junii (n=2). В составе иных неферментирующих микроорганизмов (n=64) доминировали Stenotrophomonas maltophilia (n=29), Burkholderia cepacia (n=6), Pseudomonas putida (n=7), другие бактерии были представлены единичными штаммами разного вида (всего выявлено 22 вида). Отмечено достоверное увеличение встречаемости иных неферментирующих бактерий в составе грамотрицательных неферментирующих бактерий с 21% (13 из 61 штамма) до 36% (51 из 142 штаммов) при сравнении результатов 2003-2004 гг. и 2005-2007 гг. (p=0,04). Регистрируемое увеличение произошло как за счет большего выделения из гемокультур штаммов S. maltophilia (3-4 штамма в 2003-2004 гг. и 9-8 в 2005-2006 гг.), так и расширения спектра микроорганизмов этой группы.

Среди грамположительных бактерий доминировали стафилококк коагулазонегативный (18%), Enterococcus spp. (9,9%), Streptococcus группы “viridans” (6,0%), S. aureus (5,1%). Основная доля энтерококков была представлена штаммами E. faecium (74%), существенно реже выделяли E. faecalis (23%), по одному штамму были выделены E.durans (1%), E.hirae (1%), E.gallinarum (1%). Преобладание штаммов E. faecium зарегистрировано в течение всего анализируемого периода. Стрептококки, принадлежащие к другим группам, были представлены S.pneumoniae (n=6), S.pyogenes (n=1), S.agalactiae (n=1). Видовая идентификация Streptococcus группы “viridans” была проведена у 56 из 78 штаммов, отмечено преобладание S.mitis (63%). Всего было выделено 66 штаммов S. aureus, частота их составляла в разные годы от 2% (2006 г.) до 7% (2003 г.), в 2007 г. - 5%. Число штаммов Corynebacterium spp. было 25, включая С.propinquum (n=10), C.jeikeium (n=8), C.striatum (n=3), C.auris (n=2), C.urealyticum (n=1), C.bovis (n=1). Частота выделения их была постоянной и не превышала 2%. За анализируемый период из крови было выделено 8 штаммов L. monocytogenes, причем, у двух больных L. monocytogenes были выделены одновременно из крови и из спинномозговой жидкости. Среди редко выявляемых грамположительных бактерий были Micrococcus spp. (n=7), Aureobacterium spp. (n=2), Kocuria varians (n=1), Arcanobacterium haemolyticum (n=1), Leuconostoc spp. (n=2), Rothia spp. (n=1). Единичное выделение этих штаммов наблюдалось в течение всего анализируемого периода.

У двух больных причиной сепсиса были анаэробные бактерии Сlostridium spp. (0,2%), в одном случае - С. perfringens, в другом - С.histolyticum.

За анализируемый период было выделено 94 штамма грибов, из них 89 (95%) Candida spp., 3 (3%) штамма мицелиальных грибов, 1 (1%) Cryptococcus neoformans, 1 (1%) Geotrichum capitatum. Среди Candida spp. частота обнаружения С.albicans составила всего 21% (n=19), в то время как С.non-albicans - 79% (n=70). Спектр С.non-albicans был разнообразным и включал штаммы C.parapsilosis 31% (n=22), C.kefyr 6% (n=4), C.tropicalis 6% (n=4), C.krusei 10% (n=7), C.guilliermondii 28,5% (n=20), C.famata 4% (n=3), C.glabrata 3% (n=2), C.lusitaniae 4% (n=3), C.pelliculosa 6% (n=4), в 1 (1,5%) случае идентификации до вида не проводилось. Из крови мицелиальные грибы были выделены в составе Paecilomyces lilacinus (n=2) и Fusarium spp. (n=1). Выделение из крови грибов P. lilacinus было проявлением катетер-ассоциированной инфекции, а обнаружение Fusarium spp. свидетельствовало о диссеминации инвазивного микоза. Мицелиальные грибы были выделены только в 2006 году, низкая частота встречаемости C.albicans была в течение всех лет исследования.

Заключение. Многоцентровое исследование продемонстрировало разнообразие микроорганизмов, вызывающих сепсис у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. В структуре возбудителей зарегистрировано некоторое преобладание грамотрицательных бактерий, отмечена высокая частота детекции БЛРС у энтеробактерий, выявлено расширение в спектре за счет редких грамотрицательных неферментирующих бактерий. Частота грамположительных бактерий в этиологии сепсиса снизилась, но роль их остается значимой. Среди грамположительных бактерий ведущая позиция сохраняется за штаммами стафилококка коагулазонегативного, отмечена высокая частота и постоянство выделения штаммов Enterococcus spp., а также Streptococcus группы “viridans”. Выявлено разнообразие грибов при фунгемии, отмечена низкая встречаемость C.albicans.

Результаты чувствительности возбудителей сепсиса к антимикробным препаратам

Была изучена чувствительность к антимикробным препаратам 1099 бактерий, выделенных из крови больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Среди тестированных штаммов было 612 грамотрицательных и 487 грамположительных бактерий.

Чувствительность грамотрицательных бактерий

В табл. 3 представлена сравнительная чувствительность к антибиотикам ведущих возбудителей сепсиса - энтеробактерий (n=431). По результатам исследования наиболее высокая активность определялась у имипенема и меропенема. Это были единственные антибиотики, к которым были чувствительными все штаммы энтеробактерий. Активность имипенема и меропенема была сопоставимой, отличия между препаратами определены лишь в значениях МПК, которые были ниже у меропенема. Из цефалоспоринов наибольшей активностью обладал цефоперазон/сульбактам (87% чувствительных штаммов), далее - цефепим (73%). Следует отметить, что основная доля нечувствительных к цефепиму энтеробактерий была представлена резистентными штаммами, а не штаммами с промежуточной чувствительностью, поэтому совершенно необоснованно назначать этот антибиотик при выделении нечувствительных к нему бактерий. К цефтазидиму - антибиотику, который был препаратом выбора в лечении фебрильной нейтропении 90х годов, чувствительность сохранили лишь 66% бактерий семейства Enterobacteriaceae. Активность других цефалоспоринов III-го поколения (цефтриаксон, цефотаксим) была невысокой и составила 63%. Из аминогликозидов более высокий уровень чувствительности проявлял амикацин.

Низкие показатели чувствительности в отношении бактерий семейства Enterobacteriaceae были выявлены у ампициллина (17%) и триметоприма/сульфаметоксазола (31%), поэтому совершенно неоправданно назначать триметоприм/сульфаметоксазол для селективной деконтаминации кишечника, а ампициллин для лечения фебрильной нейтропении.

Распространение БЛРС у энтеробактерий представляет серьезную проблему. Особое значение БЛРС определяется, прежде всего, их способностью обуславливать устойчивость ко всем современным цефалоспоринам, которые широко используют для лечения госпитальных инфекций. Активность антибиотиков в отношении энтеробактерий с продукцией (n=147) и без продукции БЛРС (n=284) имеет большие отличия (рис.1). Стабильными к действию БЛРС являются карбапенемы, эти препараты проявили абсолютную чувствительность. Вторую позицию по активности занимал амикацин (резистентные 21% штаммов). Из цефалоспоринов активность в отношении продуцентов БЛРС была определена лишь у одного препарата - цефоперазона/сульбактама, резистентными были 27% штаммов. Причем, чувствительность цефоперазона/сульбактама в отношении штаммов E.coli была более высокой и составила 84%, чем в отношении штаммов K.pneumoniae (60%), табл. 4. Другие цефалоспорины были неактивны в отношении энтеробактерий - продуцентов БЛРС.

Уровень антибиотикорезистентности микроорганизмов, входящих в семейство Enterobacteriaceae, определяется долей детекции у них БЛРС. Поскольку детекция БЛРС преобладала у штаммов K.pneumoniae, то для этих микроорганизмов была выявлена более высокая резистентность к бета лактамам по сравнению с другими энтеробактериями, табл. 3. Штаммы Enterobacter spp. занимали по активности промежуточную позицию между штаммами E.coli и K.pneumoniae: чувствительными к карбапенемам были все штаммы, далее следовали амикацин (96%), левофлоксацин (92%), цефоперазон/сульбактам (74%), цефепим (73%). Чувствительность бактерий семейства Enterobacteriaceae, входящих в состав “иные энтеробактерии”, характеризовалась более высокой активностью антибиотиков, табл. 3. Наиболее высокие показатели чувствительности были определены к карбапенемам (100%), цефоперазону/сульбактаму (96%), амикацину (92%), цефепиму (89%).

Таблица 3. Активность антибиотиков в отношении бактерий семейства Enterobacteriaceae

Рисунок 1. Резистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae, продуцирующих и непродуцирующих БЛРС.

Примечание. Иные энтеробактерии - S. enteritidis (n=15), S. marcescens (n=9), S. liquefaciens (n=3), Pantoea spp. (n=6), P. mirabilis (n=4), С.freundii (n=3), K.oxytoca (n=3), Providencia spp. (n=1), E. fergusonii (n=1), M. morganii (n=1)

Примечание. В категорию резистентных штаммов отнесены устойчивые и умеренно-устойчивые штаммы; цеф/сульбактам - цефоперазон/сульбактам.

Таблица 4. Активность антибиотиков в отношении E.coli и K. pneumoniae, продуцирующих БЛРС

Примечание. Тримет./сульф. - триметоприм/сульфаметоксазол

В последнее время становится нередким выделение из крови таких энтеробактерий, как Salmonella enteritidis. В нашем исследовании они были выделены из крови у 15 больных, причем, у большинства пациентов диарея отсутствовала. В отношении S.enteritidis многие антибиотики (карбапенемы, исследуемые цефалоспорины III и IV поколения, левофлоксацин, амикацин) проявили абсолютную активность, высокие показатели чувствительности были определены также у триметоприма/сульфаметоксазола (91%), ампициллина (93%), гентамицина (93%).

В последнее время отмечено нарастание устойчивости у штаммов P.aeruginosa к антимикробным препаратам, включая карбапенемы. Штаммы P.aeruginosa характеризовались высоким уровнем резистентности ко всем антибиотикам: в отношении этих бактерий не выявлено преимуществ карбапенемов над цефалоспоринами, полирезистентными были 21% штаммов, табл. 5. Наиболее высокие показатели чувствительности были определены для амикацина (76%), цефоперазона/сульбактама (66%), меропенема (66%), имипенема (62%), цефепима (64%). Диско-диффузионным методом была определена абсолютная активность только полимиксина в отношении P.aeruginosa.

Число антибиотиков, активных в отношении штаммов A.baumannii, было еще более ограниченным, табл. 5. Максимальная активность была определена у цефоперазона/сульбактама, чувствительными к нему были 86% штаммов. К имипенему были чувствительными 76% штаммов, а к меропенему - 57%. Столь выраженные отличия в чувствительности меропенема и имипенема могли быть обусловлены циркуляцией в стационаре клонально-родственных штаммов с идентичными параметрами устойчивости.

Активность антибиотиков в отношении других неферментирующих бактерий, частота которых увеличивается в последние годы, является неоднородной, активными могут быть один-два или, наоборот, несколько антимикробных препаратов. Так, в отношении штаммов S. maltophilia проявляют активность только 2 антибиотика: триметоприм/сульфаметоксазол и тикарциллин/клавуланат. Триметоприм/сульфаметоксазол сохранял чувствительность в отношении 90% штаммов S. maltophilia, активность тикарциллина/клавуланата нами не была изучена. В отношении Pseudomonas putida (n=7) были чувствительны амикацин, цефепим, цефтазидим, цефтриаксон, имипенем, меропенем, а в отношении Burkholderia cepacia (n=6) - только триметорим/сульфаметоксазол. Учитывая тот факт, что выделение неферментирующих бактерий становится нередким у иммунокомпрометированных больных, крайне важным является как их идентификация, так и исследование чувствительности, поскольку активными могут быть разные антибиотики.

Таблица 5. Активность антибиотиков в отношении P.aeruginosa и A.baumannii

Из 232 штаммов Staphylococcus coagulase-negative (Staphylococcus CN) устойчивыми к оксациллину были 190 (82%) штаммов, чувствительными к оксациллину - 42 (18%). Результаты чувствительности к оксациллину 66 штаммов S. aureus были диаметрально противоположными: устойчивыми были 18% (n=12) штаммов, чувствительными - 82% (n=54).

Результаты чувствительности оксациллиноустойчивых штаммов стафилококков представлены в табл. 6. Все оксациллиноустойчивые штаммы Staphylococcus CN и S. aureus были чувствительны к линезолиду и ванкомицину. Однако значения МПК₉₀ ванкомицина в отношении штаммов S. aureus были высокие и составили 2 мкг/мл, что может быть причиной неудач в лечении этим препаратом. На втором месте по активности in vitro в отношении оксациллиноустойчивых Staphylococcus CN был тетрациклин (75% чувствительных штаммов), в отношении S. aureus - триметоприм/сульфаметоксазол (83% чувствительных штаммов). Активность остальных антибиотиков была невысокой.

Иными параметрами активности характеризовались оксациллиночувствительные штаммы Staphylococcus CN и S. aureus, табл. 7. Все штаммы были чувствительны не только к оксациллину, ванкомицину и линезолиду, но и к амикацину, карбапенемам, всем исследуемым цефалоспоринам, за исключением одного препарата - цефтазидима.

Таблица 6. Активность антибиотиков в отношении оксациллиноустойчивых штаммов Staphylococcus CN и S. aureus

Таблица 7. Активность антибиотиков в отношении оксациллиночувствительных штаммов Staphylococcus CN и S. aureus

Примечание. Тримет./сульф. - триметоприм/сульфаметоксазол, цефопер./сульб. - цефоперазон/сульбактам

Триметоприм/сульфаметоксазол, эритромицин, тетрациклин были более активны в отношении оксациллиночувствительных штаммов S. aureus, чем в отношении оксациллиночувствительных штаммов Staphylococcus CN.

Таблица 8. Активность антибиотиков в отношении E.faecalis, E.faecium, Streptococcus группы “viridans”

Среди энтерококков преобладали E.faecium, для которых характерным является более высокий уровень природной устойчивости в сравнении с E.faecalis, табл. 8. Так, все штаммы E.faecalis были чувствительны к ампициллину, пенициллину, ванкомицину, линезолиду. Активность в отношении всех штаммов E.faecium проявлял только один препарат - линезолид. Впервые в России в 2005 г. был выделен из крови ванкомициноустойчивый штамм E.faecium, и за 5 лет исследования число их достигло 6 штаммов. Все ванкомициноустойчивые штаммы E.faecium имели высокие значения МПК ванкомицина (у одного штамма - 128 мкг/мл, у пяти - более 128 мкг/мл). Активность аминогликозидов была невысокой.

Активность большинства исследуемых антибиотиков в отношении штаммов Streptococcus группы “viridans” была высокой, однако, к пенициллину были нечувствительны 20% штаммов, табл. 8. Все штаммы были чувствительны к линезолиду и ванкомицину. Чувствительность цефепима (93%), цефтриаксона (91%) и цефотаксима (90%) была сопоставимой. Значения МПК₉₀ пенициллина, цефтриаксона, цефепима, цефотаксима, меропенема в отношении штаммов Streptococcus группы “viridans” были минимальны.

Стрептококки, принадлежащие к другим группам, были представлены единичными штаммами. Все исследованные штаммы S.pneumoniae (n=6) были чувствительны к цефепиму, цефотаксиму, линезолиду, меропенему, ванкомицину. К пенициллину чувствительность сохранили 5 из 6 штаммов.

Среди редких грамположительных бактерий были L. monocytogenes (n=8), все штаммы были чувствительны к ампициллину.

Заключение. Для возбудителей сепсиса была зарегистрирована высокая резистентность к антимикробным препаратам. Из цефалоспоринов наиболее активными были цефоперазон/сульбактам и цефепим, причем, цефоперазон/сульбактам в отличие от цефепима проявлял активность в отношении Acinetobacter spp. и энтеробактерий, продуцирующих БЛРС. Карбапенемы (имипенем и меропенем) демонстрировали наиболее высокую активность в отношении энтеробактерий, включая продуцентов БЛРС, и штаммов Acinetobacter spp. Из аминогликозидов выявлены преимущества у амикацина. Впервые в России из крови были выделены энтерококки, устойчивые к ванкомицину, и абсолютную активность в отношении грамположительных бактерий проявлял один антибиотик - линезолид.

Генотипирование госпитальных штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из гемокультур при сепсисе у больных опухолями системы крови

Следующей задачей стало изучение путей инфицирования грамотрицательными бактериями в стационаре, поскольку эти микроорганизмы преобладали в структуре возбудителей сепсиса, и для них была характерна высокая устойчивость к антибиотикам.

Была исследована хромосомная ДНК 152 штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных из крови при сепсисе у больных гемобластозами и депрессиями кроветворения. Все пациенты находились на лечении в ГНЦ РАМН с января 2003 г по октябрь 2006 г. Исследуемыми микроорганизмами были E. coli (n=80), Enterobacter spp. (n=15), K. pneumoniae (n=31) и P. aeruginosa (n=26). Результаты, полученные при генотипировании, представлены в табл. 9. При генотипировании штаммов P. aeruginosa был выявлен 21 независимый рестрикционный профиль ДНК бактерий. Идентичные рестрикционные профили были у 9 штаммов P. aeruginosa, принадлежащих к 4 клонам. Один клон включал 3 клонально-родственных штамма, которые имели полную идентичность, а другие 6 штаммов, относящиеся к трем клонам, были попарно схожими между собой и отличались на три позиции рестрикционных фрагментов.

При изучении 15 штаммов Enterobacter spp. было выявлено 12 независимых рестрикционных профилей ДНК бактерий. Идентичные рестрикционные профили были определены у 5 штаммов Enterobacter spp., которые принадлежали к двум клонам, один из них включал 3 идентичных штамма (100% сходство), а другой клон - два штамма (идентичность 87%).

Таблица 9. Результаты генотипирования грамотрицательных бактерий, выделенных из гемокультур при сепсисе у больных опухолями системы крови

Примечание. * - отмечены отличия p<0.0001

Генотипирование 31 штамма K. pneumoniae выявило принадлежность их к 27 различным пульс-электрофорезным типам ДНК. Было обнаружено 3 идентичных клона, включающих 7 штаммов, все они имели продукцию БЛРС.

У 80 изученных штаммов E. coli было выделено 79 независимых рестрикционных профилей ДНК бактерий. Только 2 (3%) из 80 штаммов E. coli были идентичными (100%), происходили от одного клона и являлись продуцентами БЛРС. Время между выделением идентичных штаммов E. coli составило 24 дня.

Таким образом, наибольшее число клонов, имеющих 2 и больше генетически идентичных штамма, определялось у P. aeruginosa (19%), далее у Enterobacter spp. (17%) и K. pneumoniae (11%), минимальное - у E. coli (1%), p<0.0001.