Иммунологические и структурно-метаболические нарушения у доношенных детей с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы, прогнозирование исходов и оптимизация лечения

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ У ДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ С ГИПОКСИЧЕСКИМ ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ИСХОДОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ

14.00.09 - Педиатрия

ГРОМАДА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

Екатеринбург - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ковтун Ольга Петровна.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дегтярева Марина Васильевна,

доктор медицинских наук, профессор Романенко Владислав Александрович,

доктор медицинских наук, профессор Зеленцова Вера Леонидовна.

Ведущая организация: Федеральное Государственное учреждение "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи".

Защита состоится "____" __________2009 г. в ____ часов на заседании совета по защите докторских диссертаций Д 208.102.02, созданного при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", по адресу: 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3, Зал заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО УГМА Росздрава, по адресу: 620028, г. Екатеринбург, ул. Ключевская, д. 17, а с текстом автореферата - на сайте ВАКа Министерства образования и науки Российской Федерации: http://vak.eb.qov.ru.

Автореферат разослан "___"________2009 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор И.Ф. Гришина.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема изучения перинатальной патологии нервной системы у детей раннего возраста остается актуальной, что обусловлено прогрессирующим ростом частоты церебральных нарушений у новорожденных - 80 % (Баранов А.А., 2008; Барашнев Ю.И., 2005; Володин Н.Н., 2001).

Перинатальные факторы, вызывающие развитие церебральной гипоксии-ишемии приводят в дальнейшем к неврологическим и соматическим расстройствам, инвалидизации, социальной дизадаптации, что придает данной проблеме медико-социальную значимость. Среди детей, впервые признанных инвалидами, 57 % составляют больные ДЦП. Формирование церебрального паралича у 50 % доношенных имеет пренатальную этиологию и в 36 % - пери/неонатальное происхождение (Васильева Е.М. и др., 2005; Ларина О.А., 2005; Митиш М.Д., 2004; Морозов В.И., 2005; Пальчик А.Б., 2006; Яцык Г.В. и др., 2007).

До настоящего времени изучение последствий гипоксического поражения ЦНС у детей различного гестационного возраста проводилось в сравнительном аспекте. Многие патогенетические модели формирования патоморфологических изменений головного мозга, толерантность к гипоксии, особенности адаптации, возможность прогнозирования у доношенных детей неясны (Володин Н.Н. и др., 2001; Чехонин В.П. и др., 2004; Шабалов Н.П., 2004; Ballanyi K., 2004; Murata Y. et al, 2005).

Недостаточно изучены последовательность, динамика восстановления функциональной активности ЦНС у доношенных, перенесших критические состояния в перинатальном периоде, и структура исходов заболевания (Ахмадеева Э.Н., 2005; Каплина С. П., 2001; Лобанова Л.В., 2000; Лукашевич И.П., 2008).

Не определены стандарты по тактике ведения, оценке эффективности и обоснования применения нейрометаболической терапии (Брин И.Л., 2006; Николаева Е.А. и др., 2005; Сухоруков В.С., 2008).

В течение последних 15 лет широко изучается состояние иммунной системы, изменение энзиматической активности иммунокомпетентных клеток, нейробиохимические маркеры нейродеструктивных и репаративных механизмов при гипоксии у новорожденных (Володин Н.Н. и др., 2001; Дегтярева М.В., 2000; Ковтун О.П. и др., 2006; Левитина Е.В., 2002; Голосная Г.С., 2005; Allan S., 2002). Исследования, посвященные изучению ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксией, единичны и информация в них разноречива (Вознюк И.А. и др., 2000; Hupperts B. et al, 2004; Tuaeva N.O. et al, 2005).

Данные последних лет свидетельствуют о влиянии перенесенной гипоксии в перинатальном периоде на формирование митохондриальной и иммунной недостаточности (Измайлова Т.Д. и др., 2005; Николаева Е.А. и др., 2007; Синчихин С. П. и др., 2008; Сухоруков В.С. и др., 2007). В то же время, представления о значении качественных изменений лимфоцитов на уровне внутриклеточных ферментов, цитокин-гормональных реакций, которые могут влиять на реализацию иммунного ответа и ход патологического процесса, имеют неоднородный характер (Воеводин Д.А. и др., 2006; Пшенникова М.Г., 2000; Скворцова В.И. и др., 2000; Hava M.G. et al, 2004; Rodriguez M. et al, 2001).

Для практического здравоохранения необходимо предложить алгоритм определения тяжести состояния и модель прогнозирования исходов гипоксического поражения ЦНС по стартовым клинико-анамнестическим и лабораторно- инструментальным стартовым показателям.

Цель работы. Установить закономерности иммунологических и структурно-метаболических нарушений при гипоксическом поражении ЦНС у доношенных новорожденных в динамике заболевания, выявить маркеры оценки тяжести и прогноза с последующей оптимизацией лечения.

Задачи исследования:

1. Определить факторы риска, структуру и клинические особенности течения гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных на 1-м году жизни.

2. Выявить особенности развития и состояние здоровья доношенных детей с последствиями перинатального поражения ЦНС гипоксического генеза в течение 3-х лет катамнестического наблюдения.

3. Исследовать показатели иммунологического профиля и определить участие цитокиновой регуляторной сети в механизмах нейроиммуно-эндокринного взаимодействия у новорожденных с гипоксией в зависимости от степени тяжести и нейроморфологических изменений ЦНС.

4. Определить количественное содержание ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови, маркеров апоптоза, в зависимости от тяжести гипоксического поражения ЦНС.

5. Выявить особенности нарушения клеточного энергообмена по результатам цитохимического исследования ферментов лимфоцитов в периферической крови СДГ, -ГФДГ, МДГ, ГДГ, ЛДГ в зависимости от тяжести процесса в ЦНС.

6. Установить корреляционные связи между структурно-метаболическими, иммунологическими, нейробиохимическими показателями и факторами апоптоза, оценить их роль в патогенезе постгипоксических структурных изменений мозга.

7. Разработать методы патогенетической терапии перинатального поражения ЦНС гипоксического генеза на основе применения препарата Элькар, ИВТ и их сочетания.

8. Создать на базе стартовых показателей состояния здоровья новорожденных модель прогнозирования исходов гипоксического поражения ЦНС.

Научная новизна. Впервые на репрезентативной группе больных в процессе катамнестического наблюдения в течение 3-х лет был проведен мониторинг показателей иммунологического профиля и цитокин - опосредованных реакций с гормональными эффектами интерлейкинов (ФНО-б, ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-4), содержания ДНК в ядрах периферических лимфоцитов (кариометрия), показателей клеточного энергообмена на модели иммунокомпетентной клетки - лимфоцит, который является единой мигрирующей, информационной, интегративной клеткой и способен отражать изменения, происходящие в организме новорожденного на фоне гипоксического перинатального поражений ЦНС.

Впервые разработаны модели формирования механизмов компенсаторно-адаптационных, цитокин-индуцированных, иммунно-гормональных, структурно-метаболических и нейробиохимических реакций при гипоксическом поражении ЦНС различной степени тяжести.

Комплексное проспективное динамическое наблюдение и исследование детей с последствиями гипоксического поражения ЦНС в течение 3-х лет позволило выявить объективные клинико-лабораторные маркеры тяжести: иммунологические, нейробиохимические и цитокин-гормональные реакции ЦНС, показатели нарушения энергообмена клетки.

Впервые рассмотрена роль маркера апоптоза в патогенезе заболевания - изменение количественного содержания ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови (кариометрия). Доказано, что низкие показатели кариометрии коррелируют с развитием деструктивных процессов в ЦНС.

В результате проведенных исследований установлена связь между тяжестью перенесенной гипоксии у доношенных новорожденных и развитием соматических заболеваний, неврологических расстройств в раннем возрасте.

Впервые на основании проведенных исследований на клиническом материале, верифицированном иммунологическими и энергометаболи-ческими показателями, патогенетически обоснованы показания для применения препарата Элькар в сочетании с информационной радиоволновой терапией (ИВТ) при лечении перинатальных гипоксических поражений ЦНС у детей.

Новизна исследования заключается в создании алгоритма определения категории больных по тяжести состояния и правила прогнозирования исходов заболевания у доношенных детей по стартовым показателям.

Практическая значимость. По результатам проведенных исследований определены факторы, влияющие на формирование компенсаторно-адаптивных реакций и нейродеструктивных повреждений ЦНС, большинство из которых являются управляемыми и могут быть предупреждены при дальнейшем развитии акушерских и перинатальных технологий. Показаны особенности клинической картины, проанализированы результаты лабораторно-инструментальных данных с различными структурными повреждениями ЦНС, позволяющие неонатологам, педиатрам определить особенности и последовательность восстановления утраченной функциональной активности ЦНС и других органов и систем у доношенных детей.

Материалы исследования дают основание для проведения ранней, комплексной и более объективной дифференциальной диагностики гипоксических поражений ЦНС у доношенных детей. Практическую значимость для неонатологов, педиатров, неврологов перинатальных центров, организаторов здравоохранения имеют:

- разработанный метод диагностики определения степени тяжести перинатальной гипоксии (кариометрия), с высокой чувствительностью и специфичностью (89 % и 96 %) позволит определить тактику ведения, прогноз заболевания по стартовым показателям неонатального периода;

- выявленные особенности адаптационно-компенсаторных иммунно-гормональных и цитокин-индуцированных реакций, показатели ферментативной митохондриальной активности, определение маркеров апоптоза по данным кариометрии и нейробиохимическим показателям в неонатальном периоде позволят педиатрам и неврологам прогнозировать неврологические и соматические исходы у доношенных детей, разработать индивидуальные схемы наблюдения и профилактику заболеваний у указанного контингента детей;

- сочетанное применение препарата Элькар и ИВТ у доношенных детей с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС позволит повысить эффективность проводимых терапевтических мероприятий, направленных на восстановление двигательного, психоречевого дефицита и профилактировать развитие вторичной митохондриальной и иммунной недостаточности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Течение гипоксического перинатального поражения ЦНС у доношенных новорожденных характеризуется полисиндромностью клинических проявлений, торпидностью неврологических и соматических расстройств.

2. Механизмы формирования компенсаторно-адаптационных и структурных нарушений в ЦНС имеют дифференциальные отличия в зависимости от степени тяжести и обусловлены иммунопатологическими цитокин-индуцированными реакциями и цитокин-гормональными эффектами интерлейкинов (ФНО-б, ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-4), усилением цитотоксической активности лимфоцитов, Fas-индуцированного апоптоза, снижением количества ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови, нарушением ферментативного статуса клетки.

3. Лимфоцит как интегративная, информационная, мигрирующая, иммунокомпетентная клетка является универсальной моделью для исследования механизмов формирования гипоксического повреждения ЦНС.

4. Количественное содержание ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови (кариометрия), является маркером степени тяжести гипоксического поражения ЦНС, определяет исход заболевания.

5. Сочетанное применение препарата Элькар и информационно-радиоволновой терапии патогенетически обосновано: способствует благоприятному исходу заболевания, сокращает частоту двигательного и психоречевого дефицита, нормализует иммунологические показатели, влияет на оптимизацию метаболического статуса иммунокомпетентных клеток.

6. Созданная система информативных анамнестических, клинико-лабораторных и инструментальных критериев является основой для оценки тяжести состояния и прогнозирования исходов заболевания по стартовым показателям.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы по диагностике степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС, прогнозирования течения и исходов заболевания используются в практической деятельности неонатологов и педиатров отделений патологии новорожденных № 1, 2, 4 МУ ГДБ № 5, отделения новорожденных роддома и кабинета катамнестического наблюдения МКБ № 14 г. Екатеринбурга.

Клинико-лабораторная оценка эффективности применения препарата Элькар и информационной радиоволновой терапии в составе комплексной терапии гипоксического поражения ЦНС у детей в раннем восстановительном периоде и в течение 3 лет используется неонатологами и педиатрами в отделениях МУ ГДБ № 5, ОДКБ № 1 педиатрами поликлинических отделений г. Екатеринбурга.

Данные методики применяются в практической работе врачей-иммунологов отделения клинической иммунологии ФГУН ЕМНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промышленных предприятий, внедрены в практическую деятельность областного центра планирования семьи и репродукции г. Екатеринбурга. Результаты проведенного исследования используются в лекционном курсе и в тематике практических занятий для врачей-курсантов ФПК и ПП, аспирантов, ординаторов, интернов и студентов 4, 5 и 6 курсов ГОУ ВПО УГМА на кафедре неврологии детского возраста и неонатологии и ФПК и ПП педиатрии.

ГОУ ВПО УГМА Росздрава утверждены и тиражированы методические рекомендации для студентов и врачей постдипломной подготовки методические рекомендации: "Методика неврологического обследования здорового доношенного новорожденного" (1999г.) и "Принципы диагностики и лечения перинатальных повреждений нервной системы у детей (2001г.).

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на VII Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И. Иоффе, "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 23-26 июня 2003г.; на объединенном иммунологическом форуме 31 мая - 4 июня 2004 г., г. Екатеринбург; на региональных конференциях по проблемам неонатологии и неврологии, г. Екатеринбург, 18 ноября 2003 г., 15 мая 2007 г. и в марте 2008г.; на научно-практической конференции "Актуальные вопросы вскармливания и питания детей при острых и хронических заболеваниях" г. Екатеринбург, 9 ноября 2006 г.; на областной конференции "Нарушения энергообмена у детей" 18 мая 2006 г., г. Екатеринбург; на V Российском конгрессе "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии", г. Москва, 24-26 октября 2006 г.; на XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии" 28-31 мая 2007 г.; на Всероссийской Юбилейной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы психиатрии и неврологии", посвященной 150-летию со дня рождения В.М. Бехтерева, 18-19 октября 2007 г.; на объединенном иммунологическом форуме, г. Санкт-Петербург, IV съезде иммунологов России, XII Всероссийском форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", IX конгрессе РААКИ, 30 июня - 5 июля 2008 г.; на Всероссийском III съезде детских патоморфологов, г. Санкт-Петербург, 19-20 мая 2008 г.

Работа апробирована на заседании проблемной комиссии по педиатрии ГОУ ВПО УГМА 13 марта 2009 г. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы. Из них 9 в рецензируемых научных журналах перечня ВАК. Получены 2 патента на изобретение (№ 2345363, № 2345364).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 340 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения 1, библиографического списка из 310 источников (в том числе 148 зарубежных), иллюстрирована 68 таблицами и 58 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в период с 2002 по 2007 гг. на кафедре неврологии детского возраста и неонатологии ГОУ ВПО УГМА Росздрава, на базе отделений неонатологии № 1 и № 2 роддома МКБ № 14, отделений патологии новорожденных № 1 и 2 МУ ГДБ № 5, куда поступали дети из роддомов г. Екатеринбурга на 5-7-е сутки жизни, кабинета катамнестического наблюдения на базе роддома МКБ № 14 и отделения неврологии № 4 МУ ГДБ № 5. 483 ребенка с гипоксическим ППЦНС наблюдались с периода новорожденности и в дальнейшем в течение 3-х лет. Исследования проводили в 1-3-и сутки, 5-7-е, 25-27-е сутки, 3-6 мес., 9-12 мес., 1год 6 мес., 2 года, 2 года 6 мес., 3 года. Группу контроля составили 60 здоровых детей.

На первом этапе исследования в возрасте 1-3 дня - 1 мес. у 483 новорожденных проводили анализ факторов риска, клинико-лабораторных особенностей течения ППЦНС гипоксического генеза.

В зависимости от тяжести гипоксического поражения ЦНС новорожденные были разделены на 3 группы: 1-я группа - дети с легкой степенью перинатального поражения ЦНС (n=110); 2-я - дети с перинатальным поражением ЦНС средней тяжести (n=199); 3-я - с перинатальным поражением ЦНС тяжелой степени (n=174). Тяжесть течения заболевания определялась в соответствии с "Классификацией перинатальных поражений нервной системы у новорожденных" (Володин Н.Н и соавт., 2000г. и критериям тяжести по Барашневу Ю.И., 2005г.)

Критериями исключения из исследования были: наличие ВПР (множественные) и ВПР головного мозга; врожденной эндокринной патологии; дети из двоен; недоношенные дети; новорожденные с ВУИ и гнойно-септическими заболеваниями; дети, которым проводили переливание компонентов крови до забора крови на иммунологическое исследование.

На втором этапе исследования после 25-27 дня жизни дети, вошедшие в основные группы, были разделены на 2 группы с сохранением принципа репрезентативности для дальнейшего динамического клинического наблюдения в течение 3-х лет. Группу А составили 248 детей с гетерогенной неврологической и соматической симптоматикой и в зависимости от степени тяжести ППЦНС гипоксического генеза они были разделены на 3 группы: 1-я - дети с ППЦНС легкой степени А 1 (n=72); 2-я - дети с ППЦНС средней степени тяжести А 2 (n=97); 3-я - дети с ППЦНС тяжелой степени А 3 (n=79), которые соответствовали основным группам 1, 2 и 3.

В группу Б вошли 197 детей для исследования эффективности применения в комплексной терапии информационной радиоволновой терапии (ИВТ), метаболической терапии с применением препарата Элькар и их сочетания в возрасте от 4-х недель до 3-х лет. Из них 102 ребенка составили группу детей с ППЦНС средней тяжести (группа Б 1) и 95 детей с тяжелой степенью поражения (группа Б 2).

Группы сформированы методом случайного отбора с применением компьютерной программы - генератора случайных чисел и были сопоставимы по основным характеристикам: гестационному возрасту, полу, антропометрическим параметрам, факторам риска развития перинатальной патологии, степени тяжести, клиническим синдромам, наличию сопутствующей соматической патологии, проводимой патогенетической терапии и общему объему оказанной медицинской помощи.

Наряду с клиническим наблюдением у 150 детей (группы А) - А 1 (n=50), А 2 (n=50), А 3 (n=50) соответственно, группы контроля (n=50) и у 197 детей группы Б с 1-3 дня жизни проводили динамическую проспективную оценку результатов иммунологических, нейробиохимических, структурно-метаболических, инструментальных методов исследования в течение 3-х лет в регламентированные периоды наблюдения.

На третьем этапе по результатам проведенных исследований представлено обоснование определения категории больных по степени тяжести и прогноза заболевания по стартовым показателям с применением математического метода дискриминантного анализа.

Лечение новорожденных в роддоме и в отделениях патологии новорожденных проводилось с учетом современных технологий в неонатологии, строго индивидуально, интенсивная терапия соответствовала стандартной многокомпонентной программе этиологической и посиндромной терапии.

Для объективизации оценки неврологического состояния больных использовали специальную балльную шкала "Neo-Neuro" (Ellisson P., 1993).

Психомоторное развитие детей на 1-м году жизни оценивали по шкале Журбы Л.Т. и Мастюковой Е.М., 1981г., а также проводили тестирование по шкале КАТ/КЛАМС, и по шкале психомоторного развития (по Гриффитс).

Оценку морфофункциональной зрелости проводили с использованием шкалы Дж. Балларда (1991г.). Оценку физического развития определяли по стандартам физического развития детей Свердловской области от 0 до 16 лет (2001г., г. Екатеринбург).

Всем детям в динамике проводили НСГ с целью объективизации клинических признаков перинатального поражения ЦНС и наблюдения за трансформацией выявленных структурных церебральных нарушений с помощью аппарата фирмы "Siemens" "Aloca 3500 plus" путем последовательного получения десяти стандартных сечений в коронарной и сагиттальной плоскостях. Ишемические изменения оценивали согласно классификации L. S. de Vries et al., Классификация ВЖК, основана на данных НСГ (М. Levene, L. Crespigny, 1983).

Для объективной оценки функционального состояния органов и систем применялись: ультразвуковое исследование сердца, печени, почек, тимуса, рентгенография органов грудной клетки, брюшной полости, компьютерная томография (на аппаратах фирмы "Siemens"). По показаниям проводилась электромиография (электронейромиограф Nichon Kohden MEB 7102K Neuropack 2), электроэнцефалография (электроэнцефалограф Энцефалан 09, 2005г.), полисомнография (полисомнограф/видео ЭЭГ мониторинг Grass-Telefactor Comet, 2006г.), элетрокардиография с использованием электрокардиографа "Heart Minor liko", 2003г. Клинические лабораторные и биохимические исследования осуществлялись по стандартным методикам согласно требованиям медико-экономического стандарта.

Иммунологические исследования проводили на базе ЦНИЛ УГМА и ФГУН ЕМНЦ.

Анализировалась лейкоцитарная формула. Количественное определение субпопуляций лимфоцитов проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. Определение концентрации интерлейкинов и иммуноглобулинов в сыворотке крови и ликворе выполнено на тест - системах ELISA - IL-4, ELISA - IL-6, ELISA - TNFб, IL-1в производства ООО "Протеиновый контур", г. Санкт-Петербург, методом твердофазного ИФА.

Определение концентрации кортизола в сыворотке крови и ликворе выполнено на тест - системе HUMAN ELISA (Германия), методом ИФА. Количественное определение нейронспецифической енолазы (NSE) в сыворотке крови и ликворе проводили, используя тест UBI MAGIWEL tm NEURON SPECIFIC ENOLASE QUANTI TATIVE CM-901, основанный на принципе твердофазного иммуноферментного анализа.

Кариометрию (плоидометрию) лимфоцитов периферической крови проводили на базе патологоанатомического отделения ФГУЗ ЦМСЧ №15 ФМБА России, г. Снежинск, Челябинской области.

Автором данной работы разработан способ диагностики степени гипоксии - кариометрия (плоидометрия) лимфоцитов периферической крови (определение количественного содержания ДНК в ядрах лимфоцитов) с использованием компьютерных микротелефотометрических автоматизированных систем с математическим моделированием гистопатологического процесса. Получены 2 патента на изобретение № 2345363, № 2345364.

Метод кариометрии разработан на основании методологии и медицинской морфометрии, методики (плоидометрии лимфоцитов), предложенной и усовершенствованной Г.Г. Автандиловым (1990г, 2002г.). Количество ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови вычислялось по плотности окрашивания ядер десинтометрически с построением гистограмм в относительных единицах - пикселах. В каждом препарате вычисления производились не менее чем по 25 ядрам. Определялись средние величины, минимальное и максимальное значение относительных единиц с применением непараметрического критерия метода углового преображения Фишера и критерия Розенбаума. Число единиц наблюдения в выборках определялось по таблице Г.Г. Автандилова.

Активность дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови определяли количественным цитохимическим методом по Р.П. Нарциссову (1969г., 1997г.). Цитохимическое определение активности ферментов энергообмена проводили наборами реактивов фирмы ООО МНПК "Химтехмаш", ГосНИИ "ИРЕА": сукцинатдегидрогеназы (СДГ), -глицерофосфатдегидрогеназы (-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы МДГ) в лимфоцитах периферической крови. Метод основан на свойстве пара-нитротетразолия фиолетового при восстановлении в процессе реакций, катализируемых дегидрогеназами, образовывать в местах локализации изучаемого фермента нерастворимые в воде округлые гранулы формазана. Реакции проводились на мазках крови. Среда для выявления активности фермента состояла из инкубационной среды и субстрата, специфичного для выявляемого фермента. Подсчет гранул формазана после проведения реакции осуществлялся в 20 лимфоцитах под микроскопом Olympus CX31 10x40 в проходящем свете. Активность фермента выражалась средней на одну клетку величиной активности фермента.

Статистическая обработка материала проводилась методом вариационной статистики с использованием программ Microsoft Excel. Достоверность полученных результатов оценивалась парным методом по t - критерию Стьюдента, также использовался непараметрический критерий Манна-Уитни и метод Фишера (различия считались достоверными при p<0,05). Для анализа данных применялись методы суммарных статистик, корреляционного, дискриминантного, множественного регрессионного анализа. Для построения решающего правила по предложенной выборке были использованы математические методы распознавания образов, реализованные в пакетах "STATGRAPH", "КВАЗАР", "КВАЗАР-ПЛЮС" (разработанные Институтом механики и математики УрО РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Значимые факторы формирования перинатального гипоксического поражения ЦНС и клинико-лабораторная характеристика детей в зависимости от степени тяжести. Исследование, проведенное с использованием дискриминантного анализа, определило информативно значимые перинатальные факторы риска в развитии гипоксического поражения ЦНС: курение матери, поздние гестозы, ХФПН, артериальная гипертензия, ОРЗ во время беременности, аномалия родовой деятельности, длительный безводный период, экстренное кесарево сечение, мекониальные воды с аспирацией. Все вышеописанные факторы риска встречались чаще в 2-3 раза у детей 2 и 3 групп по сравнению с 1 и достоверно чаще в 3 группе, по сравнению со 2 группой (с<0,05). Значимыми факторами интранатального риска развития тяжелой гипоксии были слабость родовой деятельности, незапланированное кесарево сечение, длительный безводный период. Для гипоксии средней тяжести отличительной особенностью были стремительные роды.

Большинство новорожденных А 1 группы (94,6 %) родились без признаков гипоксии. У детей А 3 группы доминировала асфиксия тяжелой степени (74,5 %) и СДР II типа. Новорожденным, родившимся в тяжелом состоянии, в родильном зале проводился комплекс реанимационных мероприятий (86,6 %) с последующей ИВЛ (78,8 %) от 2 до 7 суток.

Анализируя частоту клинических неврологических синдромов острого периода можно отметить, что у детей 1 группы доминантными неврологическими синдромами были: СПНРВ (25,5 %). У детей со средне-тяжелой степенью поражения ЦНС (2 группа) ведущими в клинике были: синдром внутричерепной гипертензии (44,2 %), мышечной гипотонии (32,7 %) и вегето-висцеральных нарушений (33,7 %). У детей 3 группы клиническая характеристика представлена в основном синдромом угнетения (55,2 %), который наблюдался в 2 раза чаще по сравнению с группой 2 (с<0,05). Синдром угнетения сопровождался у 18 новорожденных (12,4 %) судорогами различного характера и 10,4 % детей с тяжелой гипоксией находились в состоянии комы. Результаты нейросонографического сканирования на данном этапе показали, что церебральная ишемия I ст. определялась у детей с легкой степенью поражения (17,4 %), II ст. - в 97,5 % у детей со средне-тяжелой степенью поражения и у всех детей 3 группы - в виде церебральной ишемии III ст.

ВЖК отсутствовали у детей 1 группы. Частота ВЖК во 2 и 3 группах была одинаковой, но тяжесть была большей у новорожденных 3 группы (ВЖК III-IV ст. - 4,8 %).

В раннем неонатальном периоде к 27-28 дню жизни больные с тяжелой степенью поражения ЦНС вышли из состояния комы и синдрома угнетения. Купировались судороги. В то же время у детей А 3 группы в 2 раза чаще формировался гипертензионно-гидроцефальный синдром, в 4 раза - центральные парезы (17,2 %) (с<0,05) по сравнению с группой - А 2 (4,5 %) (с<0,05).

К 3-6 месяцам ведущим неврологическим синдромом у наблюдаемых детей был синдром двигательных расстройств (47,1 %), причем, 42,8 % составили дети с синдромом мышечной гипотонии А 3 группы и 21,1 % - группы А 2, синдром пирамидной недостаточности диагностирован у 31,75 % и 25,1 % пациентов соответственно. Нормализация клинической картины была достигнута у 47,9 % детей, из них 89,2 % составили дети с легкой степенью поражения ЦНС. В этом периоде наблюдения синдром задержки психомоторного развития являлся ведущим и диагностирован у 58,1 % детей А 3 группы, в 5 раз чаще, по сравнению с группой 2А (с<0,05). Гидроцефально-гипертензионный синдром зарегистрирован у 27,1 % больных и демонстрировал тенденцию к компенсации и нормализации (с<0,05) после 6 месяцев.

Наиболее стабильным по клиническим проявлениям и жалобам в течение первого года жизни был синдром вегето-висцеральных нарушений (с<0,05).

Особенностью течения перинатального поражения ЦНС на 1-м году жизни было появление у пациентов диссомнических расстройств в возрасте 6 месяцев (с<0,05) и постоянство их регистрации далее на всех периодах наблюдения (36,1 %). У детей с легкой степенью ППЦНС вышеописанные синдромы встречались в единичных случаях.

Патогенетическими закономерностями формирования у тяжелых детей ПВЛ (6,2 %), субкортикальной лейкомаляции (4,2 %), развития ВЖК были: острая гипоксия в родах, СДР II типа на фоне морфологических признаков незрелости головного мозга, преимущественно у детей с ЗВУР.

Исходы гипоксических поражений ЦНС у наблюдаемых детей в возрасте 1-го года. Исходы гипоксических поражений ЦНС у наблюдаемых детей в возрасте 1-го года зависели от степени тяжести перинатальной гипоксии, перинатальных факторов риска, тяжести структурных поражений ЦНС, признаков морфологической незрелости, адекватной патогенетической терапии (рис. 1).

Процент инвалидности составил 11,4 % у детей группы А 3. В структуре инвалидности преобладала следующая патология: ДЦП, окклюзионная гидроцефалия, эпилепсия.

Рис. 1. Частота различных исходов перинатального поражения ЦНС в возрасте 1 года

К концу позднего восстановительного периода (к 1 году жизни) наблюдался регресс клинической симптоматики, но двигательные расстройства имели тенденцию к сохранению в резидуальном периоде

(рис. 2). Задержка психомоторного развития сформировалась у 55,9 % у больных А 3 группы и у 21,6 % детей группы А 2. У детей со среднетяжелой степенью ППЦНС доминировали функциональные расстройства в виде астено-невротического (астенического) синдрома, ликвородинамических нарушений, диссомний. Синдром нарушения сна доминировал в группе А 3 (с<0,05). У детей группы А 1 указанные синдромы наблюдались редко (с<0,05). В ряде наблюдений имело место сочетание нескольких неврологических синдромов.

Основными структурными повреждениями головного мозга в возрасте 1 года по данным нейровизуализации в группах наблюдения были расширение МПЩ у 26,2 % детей, резидуальная вентрикуломегалия у 23,8 % и только у детей группы А 3 диагностирована ПВЛ (6,2 %), субкортикальная лейкомаляция (4,2 %), атрофия коры (6,2 %) и негрубая атрофия мозгового вещества (13,8 %).

Рис. 2. Ведущие клинические синдромы перинатального поражения ЦНС гипоксического генеза у детей А 1, А 2 и А 3 групп в 1 год (%)

Наряду с неврологической симптоматикой, у наблюдаемых детей преимущественно А 3 группы, были выявлены рахит, анемия, синдром раздраженного кишечника, аллергический дерматит. Частыми осложнениями у детей были респираторные инфекции верхних и нижних дыхательных путей в виде ОРВИ, бронхита и ЛОР заболеваний, которые у пациентов группы А 3 диагностированы более часто, чем в группе А 1 и А 2 (с<0,05). Гипотрофия I-II степени зарегистрирована у детей с тяжелым гипоксическим поражением ЦНС (15,2 %). Сопутствующая соматическая патология имела положительную динамику в общей группе наблюдения в течение 1 года жизни.

На естественном вскармливании находились дети А 1 и А 2 групп (85,5 % и 66,3 %) по сравнению с А 3 (35,2 %).

Анализ особенностей развития и состояния здоровья детей с последствиями гипоксического перинатального поражения ЦНС в раннем возрасте. В раннем возрасте у детей сохранились и сформировались различные формы неврологического дефицита: у детей А 1 и А 2 групп в единичных случаях в виде миатонического синдрома и пирамидной недостаточности. В А 3 группе наблюдения формирование неблагоприятных исходов отмечалось более часто (с<0,05) по сравнению с А 2 группой по такой неврологической патологии, как нарушение двигательной сферы в виде пирамидной недостаточности (20,1 % в сравнении 4,1 %), и психоречевого развития (33,1 % в сравнении 8,5 %).

Рис. 3. Частота различных исходов перинатального поражения ЦНС в возрасте 3 лет

Наблюдение в течение 3-х лет показало более низкий процент выздоровления (34,2 %) и высокий инвалидизации - 11,4 % у детей А 3 группы.

В группе А 2 было зарегистрировано выздоровление у 65,3 % и в А 1 - у 90,2 %. Больные дети группы А 3 с органическими поражениями ЦНС составили 17,7 % к концу 3 года жизни. Неврологические нарушения в виде гипердинамического расстройства детства в общей группе наблюдения составили 39,2 % (рис. 3).

Сравнительный анализ физического развития детей на 2-3 году показал, что число детей с нормальным физическим развитием зарегистрировано в группе А 1 и А 2 (94 %, 74,3 %) по сравнению с А 3 группой (66 %).

Рис. 4. Динамика инфекционных заболеваний респираторной системы (ОРВИ) в течение 3-х лет жизни

В структуре заболеваемости в раннем возрасте доминировали инфекционная патология верхних и нижних дыхательных путей, аллергический дерматит, дисбактериоз, функциональные расстройства в виде дискинезии желудочно-кишечного тракта. Нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта наблюдались у детей А 3 группы (23,1 %) в 3 раза чаще по сравнению с А 2 группой (6,5 %)(с<0,05) (рис. 4-5).

Рис. 5. Динамика частоты синдрома нарушения роста флоры кишечника у наблюдаемых детей в течение 3-х лет

В раннем возрасте в первую группу здоровья вошло 90,1 % детей А 1 группы и только 56,3 % и 33,8 % детей А 2 и А 3 групп, а хроническая патология сформировалась у 14 % и 35,2 % больных, перенесших перинатальную гипоксию среднетяжелой и тяжелой степени.

Иммунологические показатели у наблюдаемых детей с гипоксическим поражением ЦНС в зависимости от степени тяжести. Анализируя данные иммунологических показателей 1-3 дня у детей с различной степенью тяжести ППЦНС можно отметить формирование первичного иммунного ответа, аналогичного ответу здоровых новорожденных.

Для детей А 2 группы характерным отличием был лимфоцитоз (СД 4+, СД 3+, СД 8+, СД 25+, СД 16+, СД 95+, СД 20+), моноцитоз. Усиление цитотоксической активности наблюдалось в основном у детей А 3 группы (СД 8+), на фоне нейтропении и моноцитоза. Увеличение СД 95+ во 2 и 3 группах свидетельствует об активации Fas-индуцированного апоптоза.

У детей А 1 группы показатели 1-3 дня достоверно не отличались от нормативных, за исключением увеличения количества СД 20+. Во А 2 и А 3 группах наблюдения отмечались высокие уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке крови ФНО-б, ИЛ-1в в первые 7 дней в 6, 7, 8 раз превышающие (с<0,001) нормативные значения, в то время, как в группе А 1, достоверных отличий не наблюдалось (с>0,05) (табл. 1).

На 5-7 день жизни показатели иммунологического профиля у детей А 1 группы были наиболее физиологическими. У пациентов А 2 группы изменения иммунологических показателей можно расценить как достаточно высокую напряженную адаптационно-компенсаторную реакцию иммунологической системы с увеличением количества всех клеток, за исключением нейтрофилов и тенденцию к повышению антител класса IgM.

Количественные характеристики интерлейкинов были аналогичны предыдущему возрастному периоду (табл. 2).

Характерными отличиями А 3 группы было увеличение количества клеток активации цитотоксичности (СД 8+), повышенной экспрессии СД 16+, СД 95+, моноцитоз, нейтропения на фоне отсутствия адекватного увеличения СД 4+, СД 3+, СД 20+. Количество Т-цитотоксических клеток в ответ на гипоксию было достоверно значимым во А 2 и А 3 группах (с<0,05) по сравнению с А 1. Снижение нейтрофилов свидетельствует о перераспределении клеток в очаг повреждения, в то же время, тенденция к снижению нейтрофилов является адекватной физиологической реакцией для здоровых детей в 5-7 дней жизни.

Таблица 1. Значимые показатели иммунного профиля детей исследуемых групп в возрасте 1-3 дня (М±m)

Таблица 2. Показатели иммунного профиля детей исследуемых групп в возрасте 5-7 дней (М±m)

Результаты исследования показали, что у новорожденных А 3 группы показатели цитокинов в крови и ликворе (ФНО-б, ИЛ-1в, ИЛ-4) коррелировали с массивностью патологического процесса, повреждением структур мозга в виде ишемии III степени и ВЖК II-III степени с последующим развитием гидроцефалии, ПВЛ, кистозной дегенерацией и атрофией (с<0,05), r=0,85, r=0,79 (табл. 3 и табл. 4).

Таблица 3. Динамика уровней цитокинов в СМЖ у новорожденных с органическим и без органического поражения ЦНС в неонатальном периоде

Повышение уровня противовоспалительного ИЛ-4, по-видимому, играет роль в уравновешивании провоспалительного каскада и ограничении последующего повреждения тканей и отражает существование баланса про- и противовоспалительных цитокинов.

Сравнительная характеристика иммунологических показателей в зависимости от степени тяжести гипоксического повреждения ЦНС в раннем восстановительном периоде (25-27 суток) показала, что в А 2 и А 3 группах в этот период наблюдалось снижение уровня ИЛ-1в, ФНО-б, ИЛ-4 в сыворотке крови, но показатели не имели нормативных значений. Данная тенденция сохранялась на протяжении 3-6 месяцев с последующей нормализацией к концу первого года. Это указывает на то, что патологический процесс на фоне ишемизации головного мозга и нейродеструктивных нарушений не завершен. гипоксическое перинатальное нервная цитокиновая

Таблица 4. Значимые показатели иммунного профиля в сыворотке крови доношенных детей в неонатальном периоде в зависимости от формирования органического поражения ЦНС

Таблица 5. Показатели иммунного профиля детей исследуемых групп в возрасте 1 месяц (М±m)

В раннем восстановительном периоде отмечалась тенденция к нормализации клеточного состава и гуморального звена иммунитета у детей А 1 группы. У детей А 2 группы изменения свидетельствуют о формировании вторичного иммунного ответа с повышенными компенсаторными реакциями. В тоже же время, у пациентов с тяжелой гипоксией (группа А 3) наблюдаются процессы "иммунологической декомпенсации" с дефицитом лимфоцитов, моноцитов и тенденцией к снижению СД 3+, СД 4+ (табл. 5).

Количество клеток СД 95+ достоверно увеличено во А 2 и А 3 группах по сравнению со здоровой группой детей и группой А 1 (с<0,001), что возможно указывает на пролонгированное течение патологического процесса с признаками апоптоза.

Поздний восстановительный период характеризовался нормализацией клеточного звена иммунитета, лимфоцитопенией СД 20+, увеличением СД 3+, СД 8+, СД 16+, снижением IgA, IgG в основном у пациентов А 3 группы (с<0,05), что по-видимому, связано с формированием вторичной иммунной недостаточности и объясняет более частую заболеваемость ОРЗ, ЛОР- патологию, нарушение роста микрофлоры кишечника, рахит, анемию по сравнению с детьми группы контроля.

Исследование иммунологического профиля у детей с тяжелым поражением ЦНС в динамике на 2-3 году жизни констатирует формиро...