Научно-методические основы оценки влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии на адаптационно-компенсаторные реакции биомоделей

В организме крольчат-сосунков холерные вибрионы штамма V.cholerae КМ184 при 10-кратном пассировании не вызывали гибели подопытных животных и развития у них холерогенного синдрома, не приводили к формированию недопустимой морфологической патологии. Но по результатам морфометрического анализа были выявлены признаки некоторого функционального напряжения апудоцитов кишечника у подопытных животных. Так, на фоне относительного уменьшения числа апудоцитов регистрировали более чем трехкратное превышение Иап у иммунизированных крольчат по отношению к контрольным животным.

Эффективность защиты животных, иммунизированных V.cholerae КМ184, оценивали по результатам заражения их вирулентными холерными вибрионами по разработанной схеме: выживаемость подопытных животных к учетному сроку (5-е сутки) и (или) средняя продолжительность жизни (в часах); клинико-патологоанатомическая характеристика проявлений инфекционного процесса; гистологический анализ изменений во внутренних органах; количество и функциональное состояние клеток ЖКТ и иммунокомпетентных органов биомодели (апудоцитов, МЭЛ, бокаловидных клеток, НЭК лимфоидных органов) и уровень процессов пролиферации и апоптоза клеток в крови и селезенке. холера чума туляремия микроб

Регистрировали активацию МЭЛ и апудоцитов у животных, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации испытуемым штаммом, отсутствие резкого изменения профиля секрета, образующегося в бокаловидных клетках кишечника. В то же время у интактных зараженных кроликов наблюдали уменьшение количества МЭЛ и резкое опустошение апудоцитов кишечника, происходящие на фоне снижения количества бокаловидных клеток и изменения их секреторного профиля за счет повышения числа клеток, содержащих КМПС (таблица 10). В ответ на введение вирулентных холерных вибрионов предварительно иммунизированным кроликам регистрировали сохранение пролиферативной активности лимфоцитов крови и селезенки и не более чем двукратное увеличение числа клеток в состоянии апоптоза.

Таблица 10. Характеристика клеточных элементов слизистой оболочки ЖКТ взрослых кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации V. cholerae КМ184

Таким образом, по результатам морфометрического анализа испытуемый штамм, введенный однократно в дозе 5х109 м.к., обладал достаточной протективной активностью и защищал биомоделей от контрольного заражения 1х109 м.к. вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa Р3122.

Исследование рекомбинантного штамма V. cholerae КМ182, проведенное по разработанной схеме, позволило дать более точную характеристику результата взаимодействия вирулентных холерных вибрионов О139 серогруппы с кишечником предварительно иммунизированных животных (таблица 11).

При ультрамикроскопическом анализе, несмотря на общую схожесть и относительную доброкачественность изменений, наблюдаемых после введения биомоделям рекомбинантных штаммов холерных вибрионов как 01, так и 0139 серогрупп, был выявлен ряд особенностей в развитии у них компенсаторных реакций.

Так, после введения V.cholerae КМ182 имело место длительное обнаружение единичных микробных клеток как на поверхности слизистой оболочки тонкого кишечника животных, так и в составе фагоцитированных включений в гистиоцитах. Факт длительного (14-е сутки после инокуляции) пребывания холерных вибрионов 0139 серовара в слое кишечной слизи у подопытных животных объяснял наличие инфильтрации слизистой и СПС оболочки кишечника биомоделей

Таблица 11. Характеристика клеточных элементов слизистой оболочки ЖКТ взрослых кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации V. cholerae КМ 182

значительным количеством эозинофильных гранулоцитов в стадии активного синтеза и умеренное мембраноповреждающее действие рекомбинантного штамма.

Но, несмотря на усиление активности функциональных систем макроорганизма в ответ на введение холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп рекомбинантных штаммов, в клетках сохранялось равновесие между процессами синтеза и распада, что свидетельствовало о доброкачественности происходящих в них изменений и, следовательно, об определенной клеточной адаптации к воздействию этими агентами.

Таким образом, применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных на этапах авторского изучения рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, направленного на уточнение значимости тех или иных адаптационно-компенсаторных процессов, выявляемых при световой микроскопии, способствовало повышению информативности проводимых исследований.

По представленной ранее схеме было проведено исследование особенностей течения инфекционного процесса у биомоделей, предварительно иммунизированных коммерческими (холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб», коммерческой вакциной Cholera-Impstoff) и экспериментальными препаратами (препараты «теней» V.cholerae О1 и О139 с токсинкорегулируемыми пилями адгезии -VCG-TCP- и без них, полученные путем контролируемой экспрессии гена E фага PцiX174, кодирующего синтез мембранного протеина Е).

Оценку протективных свойств коммерческой холерной вакцины производства РосНИПЧИ «Микроб» проводили с использованием 2-х биомоделей: половозрелых беспородных мышей (модель - «запечатанные мыши») [Richardson S.H., et al., 1984] и взрослых кроликов (RITARD) [Spira W.M. et al., 1981].

Инфекционный процесс у предварительно иммунизированных мышей протекал доброкачественно, сопровождался явлениями иммунологической перестройки в иммунокомпетентных органах, чему соответствовали компенсаторные защитные реакции со стороны апудоцитов кишечника в виде некоторого повышения их функциональной активности. Независимо от используемой биомодели (беспородные мыши или взрослые кролики) общие тенденции в реакции этих клеток отличались от той, что развивается при инфекционном процессе в интактном организме.

У предварительно иммунизированных животных вирулентные холерные вибрионы вызывали умеренное функциональное напряжение апудоцитов кишечника в виде незначительного увеличения их количества и относительного опустошения клеток.

Анализ морфометрических показателей, характеризующих изменения у зараженных на фоне предварительной иммунизации кроликов (рис.1), выявил определенную зависимость между количеством НЭК в лимфоидных органах биомоделей и степенью их иммунологической перестройки. В частности, имела место средней силы прямая корреляционная связь (r = 0,4) между количеством аргирофильных клеток и величиной гиперплазии фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах животных. Описанные изменения количества и морфофункционального состояния апудоцитов в этих органах отчасти отражали регуляторные свойства синтезируемых ими гормонов (серотонин, гистамин). Мобилизация нейроэндокринного окружения иммунокомпетентных органов привитых животных, заключающаяся в достоверном (р < 0,05) увеличении числа апудоцитов по отношению к контролю, свидетельствовала об усилении синтеза ими БАВ и характеризовала стадию ограничения интенсивности иммунопатологических реакций при введении вирулентных холерных вибрионов, что укладывалось в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном ответе.

Таким образом, вирулентные холерные вибрионы в организме предварительно иммунизированных коммерческими препаратами биомоделей, вызывая развитие минимальных изменений со стороны внутренних органов, в ЖКТ сталкивались с функционирующим вследствие иммунизации «защитным барьером» из плазматических клеток, МЭЛ, активных зон в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, и клеток APUD-системы.

При испытании эффективности экспериментальных препаратов были выявлены определенные закономерности в изменении числа, морфофункционального состояния апудоцитов кишечника и НЭК в лимфоидных органах в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения, характера последующей обработки биомоделей. Впервые было показано, что оценка состояния апудоцитов кишечника в совокупности с другими морфометрическими показателями изменений ЖКТ является достаточно информативным критерием для характеристики инфекционного процесса у предварительно иммунизированных животных.

На основании этого была разработана система оценки показателей морфофункционального состояния клеток APUD-системы организма подопытных животных при первичном и вторичном иммунном ответе. Проведено сравнение двух групп экспериментальных препаратов, полученных на основе холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп и показаны преимущества первых перед вторыми.

По результатам проведенных исследований был предложен способ оценки качества противохолерных вакцин, заключающийся в использовании минимального набора хорошо воспроизводимых гистологических и гистохимических методик в сочетании с морфометрическим анализом для характеристики морфофункционального состояния систем макроорганизма, реагирующих на патоген. Эффективность местной защитной реакции макроорганизма при противохолерной вакцинации оценивали по изменению состояния клеток: МЭЛ, апудоцитов, бокаловидных клеток. Полученные количественные характеристики, отражающие характер и направленность адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей, представляли в виде ассоциаций показателей (коэффициентов, индексов), что значительно упрощало дальнейшую трактовку результатов по выявлению преимуществ тех или иных вакцинирующих препаратов, повышало информативность и объективность доклинических исследований новых противохолерных препаратов (таблица 12). Согласно полученным данным, наибольшей протективной активностью среди коммерческих препаратов обладала вакцина бивалентная таблетированная производства РосНИПЧИ «Микроб», среди экспериментальных препаратов - препараты «VCG+TCP».

Во второй части работы были проведены исследования по количественной оценке изменений в организме биомоделей, обусловленных влиянием чумного и туляремийного микробов штаммов с различной генетической характеристикой, охарактеризованы реакции функциональных систем экспериментальных животных, зараженных вирулентными культурами указанных возбудителей на фоне приобретенной резистентности к чуме и туляремии, проведено комплексное исследование противочумного и противотуляремийного вакцинного процессов.

Для сравнительного морфометрического исследования были взяты культуры вирулентного штамма Y.pestis 231 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+); штаммов, выделенных в 2006 г. на территории Прикаспийского природного очага чумы - Y.pestis 770, 6205, 6215 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm-) и вакцинного штамма Y.pestis EV (pFra+, pPst+, pCad+,Pgm-) линии НИИЭГ.

Алгоритм исследования включал анализ изменений в месте входных ворот инфекции, морфометрическую характеристику адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма с учетом реакции клеток нейроэндокринной системы.

Наиболее показательными были изменения со стороны НЭК в лимфоидных органах. На введение культур вирулентного штамма Y.pestis 231 отмечали резкое угнетение НЭК. Инокуляция мышам Pgm- природных штаммов чумного микроба приводила к относительной активации НЭК в лимфоидных органах, но менее выраженной, чем при введении вакцинного штамма Y.pestis EV.

Резкое угнетение ПВО у животных, зараженных Y.pestis 231 сопровождалось относительной активацией НЭК в легких. Аналогичная зависимость прослеживалась и на введение Pgm- штаммов, но диапазон изменения учитываемого показателя был близок к значению у контрольных животных.

Рис.1. Морфометрическая характеристика состояния: А.- селезенки; Б.- мезентариальных лимфатических узлов взрослых кроликов, зараженных холерными вибрионами по методу RITARD на фоне предварительной иммунизации: 1.- холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб»; 2.- коммерческой вакциной Cholera-Impstoff ; ГС - группа сравнения

Таблица 12. Результаты оценки качества различных вакцинных препаратов по разработанным показателям

Выявлены отличия и по другим морфометрическим параметрам, отражающим функциональное состояние систем жизнеобеспечения организма биомодели, на введение природных Pgm- штаммов, отличающие их по характеру вызываемых ими изменений как от Y.pestis 231, так и Y.pestis EV. Несмотря на отсутствие гибели мышей при подкожном введении им культур штаммов Y.pestis 770, 6205, 6215, регистрируемые умеренные изменения морфометрических параметров свидетельствовали о формировании адаптационно-компенсаторных реакций в организме биомоделей.

После сравнения ряда морфометрических характеристик для оценки интенсивности выраженности адаптационно-компенсаторных процессов в организме лабораторных мышей при изучении влияния различных культур чумного микроба, среди определяемых параметров были выбраны наиболее информативные, которые были апробированы в последующих исследованиях на морских свинках.

Чумные микробы вирулентного штамма Y.pestis 231 при подкожном введении морским свинкам вызывали в печени двукратное увеличение ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ) гепатоцитов, повышение деструктивного индекса (ДИ) в 4,5 раза, резкие инволютивные процессы со стороны клеток ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) на фоне формирования крупных инфильтратов из ПМЯЛ.

В ответ на введение Y.pestis вакцинного штамма EV у животных поддерживался определенный адаптационный потенциал. Вакцинный штамм достоверно не изменял перфузионно-вентиляционное отношение (ПВО), а введение вирулентных культур чумного микроба приводило к изменению ПВО в легких, понижая этот показатель в 10 раз из-за развития гемадинамических нарушений и воспалительных изменений в органе.

На срыв адаптации у биомоделей, инфицированных Y.pestis 231 указывали: инверсия зон коркового вещества надпочечников и изменение стрессорного индекса (Истресс.) более чем на 0,5 по отношению к показателю у интактных животных.

У биомоделей, зараженных Y. pestis 231 на фоне предварительной иммунизации регистрировали взаимосвязь между выраженностью количественных параметров, определяющих степень токсического повреждения функциональных структур макроорганизма, и уровнем иммунологических процессов в лимфоидных органах. Так, ключевые морфометрические параметры, отражающие функциональное состояние систем макроорганизма, у предварительно иммунизированных животных в ответ на введение вирулентных Y. pestis 231 не выходили за допустимые пределы и были близки к показателям у интактных контрольных животных.

Вирулентные культуры F.tularensis 503/840 уже через 24 ч локализовались в печени и селезенке, а к моменту гистологического исследования (12-е сутки) обнаруживались в крови подопытных морских свинок. Возбудитель вызывал гнойно-некротические изменения в коже места введения культур патогена, в регионарных и отдаленных лимфатических узлах, в селезенке, формирование в этих органах, особенно в селезенке, эпителиоидноклеточных гранулем. Во внутренних органах имели место: изменение ЯЦИ гепатоцитов и семикратное увеличение ДИ в печени, формирование преимущественно эпителиоидноклеточных гранулем; почти в 9 раз превышение ДИ для эпителия извитых канальцев почек; в 13 раз снижение ПВО. О срыве адаптации у биомоделей, инфицированных F.tularensis 503/840, свидетельствовал Истресс.= 1,97 (интактный контроль Истресс.= 1,25). Характерный гранулематозный характер воспаления в органах, присутствие в очагах воспаления лимфоидных элементов и макрофагов указывали на формирование иммунного воспаления (ГЗТ), играющего важную роль в патогенезе туляремии.

Таким образом, вирулентный штамм F.tularensis у чувствительной биомодели вызывал общую интоксикацию и генерализацию инфекции, образование во внутренних органах и лимфатических узлах специфических эпителиоидноклеточных туляремийных гранулем. Морфометрические параметры, характеризующие глубину повреждающего действия патогена, свидетельствовали о срыве адаптационного потенциала у биомодели.

Был проведен морфометрический анализ изменений у морских свинок, зараженных 5х103 м.к. вирулентного штамма F. tularensis 503/840 на фоне их предварительной иммунизации вакцинным штаммом F. tularensis 15 в дозе 2х108 м.к..

При практически полном отсутствии на 30-е сутки после заражения видимых патоморфологических изменений, морфометрический анализ выявил напряжение в работе функциональных систем макроорганизма в виде умеренной активации РЭС и элементов APUD-системы. Так, в легких ПВО в 4 раза было ниже, чем у животных из группы интактного контроля, а количество аргентаффинных клеток увеличивалось. Это вызвало интерес потому, что эндокринный аппарат органов дыхания представлен как одиночными НЭК - апудоцитами, диффузно расположенными среди клеток бронхиального эпителия, так и групповыми скоплениями (нейроэпителиальные тельца - НЭТ). Продуцируемые ими серотонин, бомбезин, дофамин, способны воздействовать на гладкомышечные элементы бронхиальной стенки, регулируя воздухораспределение. В то же время известна особая роль клеток альвеолярного эпителия не только в поддержании легочного гомеостаза, но и в запуске механизмов врожденного иммунитета при контакте с патогеном [Johnson M.D. et al., 2002]. F. tularensis, взаимодействуя с клетками альвеолярного эпителия, индуцирует каскад реакций, связанных с продукцией секретируемых цитокинов, результатом которых является миграция в очаг иммунокомпетентных клеток [Gentry M., Taormina J. et al., 2007]. При этом изменение морфофункционального состояния НЭК в легких влечет за собой локальное нарушение газообмена и может осложнять течение патологического или адаптивного процессов.

В надпочечниках регистрировали умеренную активацию НЭК. На фоне гиперпластических процессов в лимфатических узлах имела место активация аргентаффинных элементов при относительном покое аргирофильных клеток. В селезенке же напротив реагировали аргирофильные, а аргентаффинные элементы оставались в покое.

Исследования реакции клеток APUD-системы ряда функционально значимых органов биомоделей на вакцинные штаммы Y.pestis EV линии НИИЭГ и F. tularensis 15 линии НИИЭГ, расширяющие представления о механизмах нейроиммуноэндокринных взаимоотношений в макроорганизме, были направлены на совершенствование методов оценки безопасности и эффективности вакцин против чумы и туляремии.

В ответ на введение вакцинного штамма Y. pestis ЕV выявлены изменения реакции апудоцитов в лимфоидных органах, происходящие в соответствие с ролью регуляторных свойств синтезируемых этими клетками БАВ и пептидов (таблица 13). Активность НЭК тимуса в период с 3-х по 7-е сутки, коррелирующая с процессами активации лимфоидных элементов в нем, согласуется с данными о роли этого органа как координатора молекулярных и клеточных нейроэндокринных взаимодействий [Мanley N.R., 2000; Maroder M. et al., 2000]. Способность тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) секретировать такие БАВ, как серотонин, мелатонин, гистамин и другие [Акмаев И.Г., 1997], и продуцировать сигнальные молекулы - цитокины, играющие важную роль в дифференцировке и пролиферации тимоцитов [Кветной И.М. и др., 2005], позволяет предположить участие НЭК не только в иммуномодулирующих процессах при противочумной вакцинации, но и в ограничении аллергических и общетоксических реакций макроорганизма. В периферических органах иммунной системы первоначально регистрируемое снижение количества апудоцитов, направленное на стимуляцию иммунной реакции, в последующем сменяется увеличением их числа, способствуя ограничению интенсивности процесса. С увеличением дозы Y. pestis ЕV развивающиеся явления острого лимфаденита в регионарных лимфатических узлах, по-видимому, сопровождаются более ранней (до 3-их суток) активацией апудоцитов, в первую очередь - аргентаффинных клеток, а к 7-м суткам активность этих элементов резко уменьшается. К 14-м суткам, когда явления острого воспаления стихают, число НЭК начинает нарастать, что является отражением регуляторного влияния продуктов секреции этих клеток на различные компоненты или фазы воспалительного процесса. Таким образом, активация аргирофильных клеток оказывает влияние на регуляторные механизмы ранней фазы иммуногенеза, запускающей значительный клон антигеннеспецифических супрессоров тимуса, что в конечном итоге и определяет количественную основу иммунного ответа. Это согласуется с данными о максимальном изменении пула иммунокомпетентных клеток с рецепторами для серотонина и гистамина, происходящим в ранние сроки после противочумной вакцинации. Этот процесс предшествует развитию невосприимчивости лабораторных животных к заражению вирулентными чумными микробами, а отмечаемая разнонаправленность колебаний показателей, как по амплитуде, так и по вектору, носит дозозависимый и фазный характер [Щуковская Т.Н. и др., 1992].

Данные о разнообразии продуктов секреции, расположения клеток и функциональной значимости апудоцитов в лимфоидных органах и в органах дыхания [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003] обусловили интерес к выяснению роли и участия элементов APUD-системы при аэрогенном способе введения ЖЧВ (таблица 14).

На фоне изменения ПВО у морских свинок при аэрогенной иммунизации Y. pestis ЕV регистрировали снижение числа апудоцитов в легких за счет их опустошения. В регионарных и отдаленных лимфатических узлах реакция НЭК находилась в прямой зависимости от выраженности воспалительного компонента, отмечали снижение числа аргентаффинных клеток вплоть до 21-х суток, а количество аргирофильных элементов несколько превышало контрольные показатели в первые сутки и на 14-е сутки, когда активизировались гиперпластические процессы. К 45-м суткам количество НЭК в отдаленных лимфатических узлах практически возвращалась к контрольным значениям. Морфометрические показатели активации гиперпластических процессов в селезенке подопытных животных коррелировали с умеренной активацией НЭК, начинающейся с 3-х суток, максимум которой со стороны аргентаффинных клеток приходился на 14-е сутки, а аргирофильных - на 21-е сутки. Выявленные изменения морфофункционального состояния апудоцитов в легких и иммунокомпетентных органах свидетельствовали о заинтересованности элементов APUD-системы при ингаляционном способе поступления антигенного материала, а динамика их носила фазный характер.

Таблица 13. Динамика изменения количества клеток APUD_системы у морских свинок, иммунизированных подкожно вакцинным штаммом Y.pestis ЕV

Таблица 14. Количество клеток APUD-системы морских свинок при аэрогенной иммунизации вакцинным штаммом Y. pestis ЕV

После выяснения реакции макроорганизма на различные способы введения ЖЧВ, была предпринята попытка сравнения ревакцинирующего эффекта ЖЧВ и препарата ХЧВ. В результате проведенного морфометрического исследования были выявлены более выраженные проявления вторичного иммунного ответа к 14-м суткам наблюдения со стороны иммунокомпетентных органов морских свинок, ревакцинированных препаратом ХЧВ, по сравнению с ЖЧВ. В регионарных лимфатических узлах при ревакцинации ХЧВ гиперплазия лимфатических фолликулов выражалась в увеличении их площади в 2 раза по сравнению с интактным контролем. Отмечали в 1,3 раза чаще, чем у свинок ревакцинированных ЖЧВ, увеличение числа лимфатических фолликулов со светлыми центрами, характеризующими процессы активации этих структур. Чуть слабее была реакция со стороны отдаленных лимфатических узлах, где гиперпластические процессы в виде увеличения паракортикальных зон (ПКЗ) и размеров фолликулов наблюдались с 14-х суток у животных ревакцинированных как ЖЧВ, так и ХЧВ. Увеличение средней площади лимфатических фолликулов в селезенке животных, иммунизированных ХЧВ, было в 1,7 раза больше, чем на введение ЖЧВ, и в 1,3 раза чаще среди них встречались фолликулы с активными светлыми центрами, а ширина Т-зон в органе была в 1,2 раза больше.

Выраженности иммунологической перестройки в лимфоидных органах подопытных животных, регистрируемой по результатам морфометрического исследования к 14-м суткам после ревакцинации указанными препаратами, соответствовало максимальное накопление антител к FI у морских свинок иммунизированных ЖЧВ и ревакцинированных ХЧВ или ЖЧВ. Следует отметить, что на ревакцинацию ХЧВ этот показатель почти в 2 раза превышал аналогичный у свинок, ревакцинированных ЖЧВ.

Далее разрабатываемый принцип и схему оценки изменений в макроорганизме, обусловленных введением вакцинного штамма чумного микроба, апробировали для характеристики аттенуированного штамма Y.pestis 1217М (архив комиссионных испытаний 1986-1987 г.), проведя его сравнительное изучение с эталонным вакцинным штаммом Y.pestis ЕV линии НИИЭГ [МУ 3.3.1.1113-02]. Штамм Y.pestis 1217М, отклоненный по результатам комиссионных испытаний от внедрения в качестве вакцинного, был взят для проверки правильности выбора наиболее значимых параметров.

Отмечая общее сходство в направленности иммунологических процессов в лимфатических узлах и селезенке подопытных животных, иммунизированных чумными микробами испытуемого штамма, в сравнении с эталонным, регистрировали ряд отличий в количественной характеристике описываемых изменений. Так, в отличие от Y.pestis EV, введение Y.pestis 1217М дозе 1х107 м.к. вызывало на фоне наблюдаемых явлений умеренного серозного, иногда серозно-гнойного процесса в лимфоидных органах гиперплазию фолликулов в регионарных и отдаленных лимфатических узлах, регистрируемую морфометрическими методами, без активации бластической реакции в них вплоть до 14-х суток. С увеличением иммунизирующей дозы до 2х109 м.к. нарастал воспалительный компонент при введении культур, как эталонного штамма, так и испытуемого, а разница между определяемыми морфометрическими параметрами в группах нивелировалась. Адаптационно-компенсаторные реакции во внутренних органах характеризовали состояние функционального напряжения в работе систем жизнеобеспечения биомодели. Введение испытуемого штамма в дозе 100 м.к. или 1х107 м.к. вызывало умеренную активацию клеток РЭС в печени в ранние сроки. С увеличением иммунизирующей дозы до 2х109 м.к. наблюдали относительное истощение клеток РЭС. Эти изменения проходили на фоне усиления деструктивных процессов в гепатоцитах с изменением ДИ, значение которого вплоть до 45-х суток наблюдения отличалось от такового у интактного контроля и превышало показатели, определяемые в группе животных, иммунизированных культурами эталонного штамма. Аналогичная закономерность была установлена и для морфометрических параметров, характеризующих функциональное состояние почек. В легких инфильтративные процессы при введении культур испытуемого штамма в дозах 1х107 м.к. и 2х109 м.к. приводили к изменению ПВО, понижая этот показатель более чем в 8 раз по отношению к интактному контролю, без достижения контрольного значения к 45-м суткам. На введение же культур эталонного штамма достоверное изменение ПВО регистрировали лишь при иммунизации в дозе 2х109 м.к. и только в ранние сроки. Если стресс-реакцию организма на введение культур эталонного штамма Y.pestis EV в дозах 1х107 м.к. и 2х109 м.к. характеризовали незначительные отклонения Истресс. до 7-х суток, что согласуется с литературными данными о стрессорном действии ЖЧВ, характеризуемом по изменению концентрации 11-оксикортикостероидов в плазме крови подопытных животных [Анисимова Т.И. и др., 2005], то введение культур испытуемого штамма в аналогичных дозах приводило к изменению Истресс., вызывало гиперплазию коркового вещества органа на фоне резкой инверсии его слоев, а учитываемые морфометрические параметры лишь по отдельным позициям к 45-м суткам возвращались к контрольным значениям.

Таким образом, по полученным данным испытуемый штамм чаще вызывал патологические изменения в органах и тканях подопытных животных, эти изменения по продолжительности были более длительными, а процесс формирования адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма не всегда укладывался во временной промежуток до 45-х суток наблюдения.

Границы традиционного патоморфологического исследования биомоделей при введении F.tularensis 15 были расширены за счет введения характеристики реакций клеток нейроэндокринной (APUD) системы функционально значимых органов и морфометрического анализа изменений, отражающих характер адаптационно-компенсаторных процессов в макроорганизме, обусловленных иммуногенезом (таблица 15).

Таблица 15. Количество клеток APUD-системы морских свинок, иммунизированных культурой вакцинного штамма F.tularensis 15

Реакция НЭК в регионарных лимфатических узлах заключалась в некоторой активации аргентаффинных клеток, особенно на введение вакцинного штамма в дозе 5х107 м.к (опыт 1), а аргирофильных элементов - практически не отличалась от аналогичных показателей у интактного контроля. В отдаленных лимфатических узлах НЭК реагировали резкой активацией как аргентаффинных, так и аргирофильных клеток на введение культуры вакцинного штамма в дозе 5х109 м.к. (опыт 2) и умеренной активацией аргирофильных элементов на иммунизацию 5х107 м.к. Количество НЭК в селезенке достоверно увеличивалось при введении культур вакцинного штамма в дозе 5х107 м.к.

По результатам морфометрического анализа были отмечены умеренные деструктивные изменения на введение вакцинного штамма, но без резких инволютивных процессов со стороны РЭС. Если на введение вирулентных культур регистрировали снижение ПВО в 13 раз по отношению к интактному контролю, то у иммунизированных животных этот показатель отличался лишь в 1,5-1,6 раза. Относительная активация синтетических процессов в апудоцитах легких на 5-е сутки после иммунизации имела место только при введении 5х109 м.к. культур вакцинного штамма. Меньшая доза вакцинного штамма способствовала умеренному опустошению клеток. Аргентаффинные клетки APUD-системы в надпочечниках претерпевали дегрануляцию, а в аргирофильных элементах усиливались синтетические процессы.

Реакция апудоцитов кишечника на подкожное введение вакцинного штамма F.tularensis 15 заключалась в снижении их числа в 1,3 - 4 раза. На вирулентные туляремийные микробы кишечник биомодели реагировал увеличением количества клеток APUD-системы в 1,5-2 раза по отношению к показателю у интактных животных, причем преимущественно реагировали аргентаффинные - EC-клетки, продуцирующие серотонин и мелатонин. Но, несмотря на различную направленность процессов активации апудоцитов кишечника у вакцинированных и зараженных биомоделей, Иап в обеих группах изменялся однотипно.

В результате реализации возможности комплексного морфометрического анализа полученных данных для характеристики чумного, туляремийного инфекционных процессов и оценки реакций макроорганизма на введение культур вакцинных штаммов этих микроорганизмов намечены перспективы создания экспертных систем (ЭС), направленных на решение проблем, связанных с отбором штаммов - кандидатов в живые вакцины и задач экспериментальной морфологии.

Алгоритм оценки влияния испытуемых экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики чумы и туляремии разрабатывали таким образом, чтобы: количественно оценить повреждающее действие вакцины (остаточную вирулентность) и возможные побочные реакции макроорганизма на нее; охарактеризовать стресс-реакцию макроорганизма; проанализировать роль клеток APUD-системы как системы реагирования и контроля в реализации защитного потенциала макроорганизма при вакцинном процессе; выявить морфометрические параметры, определяющие специфическую активность вакцины на основании оценки устойчивости функционально значимых систем организма биомодели к повреждающему действию конкретного возбудителя.

Для оценки был отобран ряд формализованных признаков: определение функционального состояния паренхиматозных элементов и характера инфильтративных процессов в печени, отражающих степень нарушения дезинтоксикационной, синтетической и защитной функций органа; учет количества НЭК в легких, обеспечивающих местную регуляцию функций дыхательной системы - приспособление кровотока к вентиляции легких и изменение ПВО; оценка микроциркуляторных нарушений в ренальном звене - функциональное состояние почечных телец и эпителия канальцев, обеспечивающих адекватную работу выделительной системы; анализ морфофункционального состояния НЭК лимфоидных органов, выступающих в роли неспецифических регуляторов иммунологических процессов; количественная характеристика изменений в надпочечниках - органе, ответственном за формирование адаптационных реакций.

Таким образом, применение аппаратно-программных компьютерных комплексов и стандартных схем морфологического анализа по представленным алгоритмам в экспериментальной морфологии особо опасных инфекций, упрощая доклиническую характеристику создаваемых препаратов против холеры, чумы и туляремии, позволит нивелировать зависимость качества конечного результата исследования от субъективизма оценки исследователя.

Выводы

1. В ответ на введение штаммов V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой, рекомбинантных штаммов V. cholerae, экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии выявлены особенности изменения ряда морфометрических параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей, дополняющие имеющиеся представления о пато- и иммуногенезе указанных инфекций.

2. Введение штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с генотипом ctxA+ zot+ ace+ tcpA+приводит к развитию выраженных морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте и внутренних органах биомоделей, вызывая функциональное напряжение клеток APUD-системы кишечника с увеличением индекса активности апудоцитов по отношению к интактному контролю в 24-14 раз соответственно. Изменения в тонком кишечнике биомоделей на введение культур холерных вибрионов штаммов с генотипом ctxA- tcpA+ и ctxA-tcpA- носят однонаправленный характер, не имеют достоверных отличий между собой и свидетельствуют об умеренном напряжении морфофункционального состояния апудоцитов с увеличением их индекса активности в 3 раза. По предложенным морфометрическим параметрам отобран штамм V. cholerae биовара eltor, серовара Ogawa (ctxA-, zot-, tcpA-, toxR-), предлагаемый в качестве контрольного для морфологических и иммунологических исследований.

3. Установлены различия в течении экспериментальной холерной инфекции у биомоделей, зараженных холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп, касающиеся особенностей морфофункционального состояния клеток кишечника, выполняющих барьерные функции: межэпителиальных лимфоцитов, апудоцитов, бокаловидных клеток, клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Изменение соотношения между различными клеточными популяциями, нарушение интенсивности обменных процессов в них отражают уровень повреждающего действия холерных вибрионов на функциональные системы макроорганизма.

4. При испытании эффективности экспериментальных и коммерческих противохолерных вакцин и рекомбинантных штаммов V. cholerae О1 и О139 серо-групп обнаружены изменения числа и морфофункционального состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах, в том числе в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником биомоделей, в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения.

5. Разработан способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры, включающий морфологическое исследование гистологического материала от биопроб с использованием морфометрической характеристики трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника и математическую обработку количественных показателей. Применение предложенных коэффициентов и индексов учета результатов способствует объективизации и унификации оценки качества противохолерных вакцин.

6. При заражении беспородных белых мышей культурами штаммов Y. pestis pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+ и Y. pestis pFra+, pPst+, pCad+, Pgm- выявлены отличия в состоянии функционально значимых систем макроорганизма по изменению морфометрических параметров, характеризующих размер органа, число и площадь его функционально активных структур (фолликулов лимфоидных органов, почечных телец и сосудистых клубочков, легочных альвеол и капилляров), количество клеток разных видов, отвечающих на антигены возбудителя, в том числе апудоцитов, клеток ретикулоэндотелиальной системы, гепатоцитов.

7. Об эффективности защиты морских свинок, предварительно иммунизированных вакцинными штаммами Y. pestis EV линии НИИЭГ и F. tularensis 15 линии НИИЭГ, при введении вирулентных культур этих микроорганизмов свидетельствует отсутствие выраженных изменений морфометрических параметров, отражающих функциональное состояние печени, почек, аэрогематического барьера легких, клеток нейроэндокринной системы макроорганизма.

8. Выявлен фазный характер изменений количества и морфофункционального состояния нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах и легких при подкожном и аэрогенном способах иммунизации биомоделей вакциной Y. pestis EV, отражающий направленность процессов иммуногенеза и выраженность стресс-реакции макроорганизма.

9. Для повышения объективности характеристики безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности живых вакцин против чумы и туляремии с помощью экспертной системы предложен алгоритм оценки степени тяжести экспериментальной инфекции и адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей при моделировании вакцинного процесса, осно...