Клинико-генетический и биохимический анализ болезни Паркинсона: механизмы предрасположенности, экспериментальные модели, подходы к терапии

Таблица 6. Распределение частот аллелей и генотипов у пациентов с БП и в группе контроля для ассоциированных генов.

Референсный номер SNP	Аллели и генотипы	Контроль N (%)	Больные БП N (%)	Р
Ген HTR2A
rs6311	G A GG GA AA	135 (67,5) 65 (32,5) 46 (46) 43 (43) 11 (11)	113 (58) 81 (42) 31 (32) 51 (53) 15 (15)	0,043
Ген WFS1
rs1801211	C T CC CT TT	173 (86,5) 27 (13,5) 73 (73) 27 (23) 0 (0)	147 (76) 47 (24) 52 (54) 43 (44) 2 (2)	0,007
Ген POMC
rs 28930368	C T CC CT TT	197 (98,5) 3 (1,5) 98 (98) 1 (1) 1 (1)	180 (93) 14 (7) 88 (91) 4 (4) 5 (5)	0,026
rs2071345	C T CC CT TT	194 (99) 2 (1) 96 (98) 2 (2) 0 (0)	176 (92) 16 (8) 88 (91) 2 (2) 7 (7)	0,027

В работе установлено, что для 4 SNP-сайтов из 3 генов имеют место выраженные различия частот аллелей и генотипов между БП и контролем (таблица 6). Ассоциация выявлена между БП и одним из 3 полиморфизмов гена HTR2A (cеротониновый рецептор 2A): -1438A аллель полиморфного маркера rs6311 встречается при БП статистически значимо чаще, чем в контроле (P=0,04). Еще одна ассоциация была выявлена для одного из 6 исследованных полиморфизмов гена WFS1 - маркера rs1801211 из 8-го экзона: установлено, что аллель 1645T значимо чаще имеет место у пациентов с БП по сравнению с контролем (P=0,007).

Среди трех исследованных полиморфизмов гена РОМС (проопиомеланокортин) два полиморфизма из 3-го экзона - C282T (rs28930368) и C585T (rs2071345) - показали значимую ассоциацию с БП по распределению аллелей и генотипов (P=0,03, см. таб. 6). Значительно повышенная частота редкого аллеля Т и гомозиготного генотипа ТТ наблюдалась в группе больных БП для обоих полиморфизмов. Указанные SNP находятся почти в полном неравновесном сцеплении друг с другом (парный Dґ=0,94, r2=0,83). При проведенном анализе гаплотипов по данным двум тесно сцепленным маркерам нами суммарно были выявлены 4 гаплотипа, при этом «ядерный» гаплотип СС был статистически значимо превалирующим в контрольной группе (P=0,002), тогда как гаплотип ТТ был значимо более частым в группе пациентов с БП (P=0,002). Анализ третьего полиморфизма в гене РОМС - C866T (rs1042571) - показал превалирование гомозиготности по С-аллелю в группе больных (64% vs. 57% в контроле), однако это различие не достигало уровня статистической значимости (P=0,31). Данный полиморфизм не находится в неравновесном сцеплении с двумя предыдущими.

Таблица 7. Распределение комбинированных POMC-генотипов rs28930368 и rs2071345 у пациентов с различными формами БП.

Полиморфизм	Генотип	Клинические формы БП
		Преобладание тремора N (%)	Преобладание мышечной ригидности N (%)
rs28930368 (C282T)	CC	60 (68)	28 (32)
	CT+TT	2 (22)	7 (78)
rs2071345 (C585T)	CC	60 (68)	28 (32)
	CT+TT	2 (22)	7 (78)

Нами также оценено возможное комбинированное влияние двух «неблагоприятных» Т-аллелей указанных выше полиморфизмов C282T (rs28930368) и C585T (rs2071345) гена РОМС на развитие БП. С этой целью мы сгруппировали всех гетерозигот и гомозигот по Т-аллелям обоих SNP в единый генотип и изучили корреляции между группами комбинированных генотипов, возрастом начала болезни и клинической формой БП. Для обоих полиморфизмов были обнаружены идентичные корреляции между формой болезни и комбинированным генотипом (гамма-корреляция: Гамма=0,5787, Z=2,8532, P=0,0043 для C282T и Гамма=0,5893, Z=2,8967, P=0,0038 для C585Т). У больных с преобладанием мышечной ригидности имело место значимое повышение частоты комбинированного генотипа CT+TT (для обоих полиморфизмов), тогда как у пациентов с преобладанием тремора - гомозиготного СС-генотипа (таблица 7).

Функциональное значение выявленных ассоциаций требует отдельного анализа. Ген HTR2A имеет отношение к обмену серотонина, состояние которого играет большую роль в функционировании экстрапирамидной системы за счет модуляции высвобождения дофамина в нигростриарных терминалях [Galloway et al., 1993; Ng et al., 1999]. В нейрохимических исследованиях установлено снижение концентрации серотонина в стриатуме, коре и цереброспинальной жидкости у больных БП [D'Amato et al., 1987]. Установленная нами российской выборке пациентов ассоциация БП с полиморфизмом -1438A гена HTR2A подтверждает патогенетическую связь данного заболевания и серотониновой системы. Белковый продукт гена WFS1, вольфрамин, является мембранным гликопротеином эндоплазматического ретикулума и предположительно участвует в формировании синаптических везикул [Takeda et al., 2001]. Как показывают данные литературы и результаты настоящего исследования, дефекты гена WFS1 могут быть вовлечены в селективную дегенерацию различных нейронов, включая дофаминергические.

Полученные нами данные свидетельствуют, что ген РОМС играет роль в патогенезе спорадической БП и предположительно является модификатором, в определенной степени ответственным за фенотипическую вариабельность БП в изученной популяции. Белок РОМС (проопиомеланокортин) - прекурсор регуляторных пептидов, включая АКТГ и -меланотропин. Предыдущие исследования показали, что синтетический аналог АКТГ(4?10) может повышать экспрессию мРНК мозгового нейротрофического фактора (BDGF) в первичных глиальных клетках мозга новорожденных крыс, а -меланотропин может повышать экспрессию мРНК BDGF в нейронах среднего мозга крыс [Shadrina et al., 2001; Dolotov et al., 2003]. Известно также, что РОМС как нейропептид ответствен за пролиферацию, дифференцировку и выживание нейронов. Эти данные объясняют выявленную ассоциацию между полиморфизмами гена РОМС и БП.

Результаты проведенного исследования хорошо иллюстрируют растущую роль молекулярно-генетического подхода в понимании закономерностей развития БП, причем не только ее семейных форм, но и наиболее распространенных в популяции спорадических случаев заболевания.

2. Новые подходы к моделированию паркинсонизма в эксперименте и возможности антиоксидантной терапии

Объектом настоящего исследования при разработке новой экспериментальной модели паркинсонизма стали мыши линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone), характеризующиеся ускоренными темпами накопления старческих признаков и значительно меньшей продолжительностью жизни (1,5-2 года по сравнению с 3-3,5 годами у животных исходной линии) [Takeda et al., 1994]. Эта модель, по нашему мнению, значительно точнее других моделей воспроизводит «контекст» возрастных изменений мозга, имеющих место при БП.

Морфофизиологические и биохимические особенности мышей SAMP1

Морфологическая и физиологическая характеристика. До 4-месячного возраста мыши линии SAMP1 по поведению ио морфологическим характеристикам практически не отличаются от животных контрольной линии SAMR1 (Senescence Accelerated Mice, Resistant). При оценке в 8 мес. практически по всем показателям мыши линии SAMP1 значительно опережали свой биологический возраст. У них проявляются нарушения поведенческих реакций (аномальная подвижность, пассивное избегание) и когнитивных функций (уменьшении способности к ориентации и запоминанию), отмечается снижение веса тела. Характерно появление «старческих» морфологических изменений - потеря волос, отсутствие их блеска, шероховатость и язвы на коже, воспаление слизистой оболочки глаз и носа, изъязвление роговицы, искривление позвоночника.

Особенности биохимических процессов у мышей линии SAMP1. Как представлено на рисунке 2, активность МАО-В у мышей линии SAMP1 в возрасте 8 мес. оказалась почти в 2 раза выше, а активность СОД существенно ниже, чем у мышей контрольной линии SAMR1.

Характеристика окислительного стресса, оцениваемая по ХЛ-тесту, в тканях мозга животных линии SAMP1 и контрольной линии SAMR1 представлена в таблице 8. В мозге быстростареющих мышей наблюдается повышенный уровень липидных гидроперекисей по сравнению с контрольными животными, а суммарная активность эндогенной антиоксидантной защиты у мышей SAMP1 значительно снижена относительно контроля. Эти данные свидетельствуют о развитии в мозге мышей с ускоренным старением окислительного стресса, обусловленного повышенной продукцией АФК.

Рисунок 2. Активность МАО-В (а) и СОД (б) в митохондриальной фракции мозга 8-месячных мышей исследуемых линий.

Таблица 8. Характеристика окислительного стресса в мозге мышей линий SAM, регистрируемого по параметрам Fe2+-индуцированной ХЛ.

Животные в возрасте 8 месяцев	Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции
	Гидроперекиси липидов (h, мВ)	Резистентность к окислению (ф, с)	Скорость окисления (V, отн. ед.)
SAMR1	84,0 ± 9,1	177,0 ± 5,7	1,1 ± 0,13
SAMP1	115,0 ± 6,0*	130,0 ± 9,0*	1,24 ± 0,14

Примечание: * р<0,05.

Нейродегенеративные изменения, индуцированные введением нейротоксина МРТР быстростареющим мышам

Биохимические изменения в мозге, индуцированные МРТР. Введение МРТР приводило к дальнейшему снижению уровня дофамина в стриатуме у животных линии SAMR1 (таблица 9). Уровень норадреналина в мозге исследуемых животных (быстростареющих и контрольных) также снижается при введении МРТР. Соотношение норадреналина к дофамину в стриарной области мозга после воздействия МРТР снижается как у быстростареющих, так и у контрольных мышей, причем у первых ? более значительно.

Таблица 9. Изменение уровня катехоламинов в стриатуме 8-месячных мышей линий SAMR1 и SAMP1 под действием МРТР.

Группы животных	Дофамин, нмоль/г ткани	Норадреналин, нмоль/г ткани	Норадреналин/ Дофамин
SAMR1	0,27±0,20	2,5±0,44	9,25
SAMR1+MPTP	0,052±0,07*	0,31 ±0,1*	5,96
SAMP1	0,021 ±0,01#	1,8±0,50#	85,71#
SAMP1+MPTP	0,07±0,03	0,33±0,1*	4,71*

Примечание: р<0,05 характеризует достоверные различия по отношению к животным этой же линии, получавшим физиологический раствор (*), или к животным линии SAMR1 (#).

Активность МАО-В после введения МРТР возрастала у животных SAMP1 с 129,0±3,0 до 150,04,1 нмоль/мг белка, в то время как у устойчивых мышей линии SAMR1 не было отмечено повышения активности этого фермента (85,1±2,0 и 80,52,6 нмоль/мг белка для контроля и опыта, соответственно). Активность СОД после введения МРТР преимущественно снижалась в мозге животных контрольной линии (с 99,01,0 ед/мг белка в час до 45,02,0 ед/мг белка в час) и оставалась в мозге SAMP1 практически такой же низкой, как и без введения МРТР (35,70,7 и 40,51,5 ед/мг белка в час, соответственно).

Результаты количественной оценки окислительного стресса в мозге животных на фоне введения МРТР представлены в таблице 10. У мышей контрольной линии SAMR1 МРТР не изменяет уровень предобразованных гидроперекисей и скорость окисления, что, по-видимому, связано с наличием у этих животных мощной антиоксидантной системы, предотвращающей образование окисленных продуктов. В то же время, после введения МРТР животным SAMP1 выраженный окислительный стресс у них проявлялся существенным повышением уровня преобразованных липидных гидроперекисей в мозге, укорочением латентного периода индуцированного окисления (свидетельствующего об устойчивости мембран мозга к окислению) и возрастанием в 2 раза скорости окисления мембранных липидов.

Таблица 10. Окисляемость мембран мозга 8-месячных животных линий SAMR1 и SAMP1 в норме и после введения МРТР.

Группы животных	Гидроперекиси липидов (h, мВ)	Резистентность к окислению (ф, с)	Скорость окисления (V, отн. ед.)	Суммарная окисляемость (Н, мВ)
SAMR1	99,5±19,1	177,0±5,7	1,24±0,13	2612±18
SAMR1 +МРТР	88,7±4,2	140,0±8,0#	1,30±0,11	1849±18
SAMP1	115,0±10,6	130,0±9,7*	1,10±0,14	2076±25*
SAMP1 +МРТР	127,0±15,3#	115,0±2,5 #	2,03±0,30#	2162±10*

Примечание:* достоверное различие (р<0,05) между группами SAMP1 и SAMR1, # достоверное различие (р<0,05) между группами, получавшими МРТР и соответствующим контролем.

Для оценки влияния МРТР на состояние белков клетки мы исследовали уровень карбонильных групп в белках, которые возникают при окислительной модификации аминогрупп белковых молекул. Уровень окисленных белков, измеренный в митохондриальной фракции и в гомогенате мозга мышей, до введения мышам был одинаков у животных SAMP1 (соответственно, 1,5±0,01 и 0,58±0,04 нмоль/мг белка) и SAMR1 (1,5±0,02 и 0,62±0,02 нмоль/мг белка). Введение МРТР индуцировало накопление белковых карбонилов в обоих случаях, но этот параметр возрастал гораздо существеннее у мышей SAMP1 (3,1±0,01 нмоль/мг в митохондриальной фракции и 1,04 ±0,05 нмоль/мг в гомогенате мозга) по сравнению с контрольными животными SAMR1 (1,6±0,01 и 0,77±0,05 нмоль/мг белка; р<0,05 при сравнении показателей групп SAMP1 и SAMR1).

Физиологические изменения и соответствие их симптоматике паркинсонизма у мышей линии SAMP1 на фоне введения МРТР. После курсового введения МРТР как горизонтальная, так и вертикальная двигательная активность у мышей линии SAMP1 оказалась существенно снижена по сравнению с исходными значениями (рис. 3). Исследовательская активность у мышей линии SAMP1 (рис. 4 а) была ниже, чем у мышей линии SAMR1. В то же время, у животных с ускоренным темпом старения после введения МРТР изменений исследовательской активности обнаружено не было.

Рисунок 3. Нарушения горизонтальной (а) и вертикальной (б) двигательной активности, вызванные введением мышам исследуемых линий нейротоксина МРТР.

Примечание: * р<0,05 по отношению к исходному измерению.

Одновременно с этим на фоне введения МРТР наблюдалось существенное увеличение мышечной ригидности у животных линии SAMP1 (рис. 4 б). У мышей линии SAMR1 в ответ на введение МРТР ригидность не развивалась.

Таким образом, животные линии SAMP1 характеризовались значительно большей чувствительностью к нейротоксину МРТР по сравнению с контролем, что проявлялось усилением проявлений окислительного стресса, нарастанием дисбаланса катехоламинов, нарастанием уровня окисленных белков и нарушениями выполнения двигательных и физиологических тестов, свидетельствующими об МРТР-индуцированном повреждении в области черной субстанции и дофаминергической системы мозга.

Рисунок 4. А. Исследовательская активность мышей линии SAMP1 и SAMR1 до и после введения МРТР. Б. Развитие ригидности, вызванной введением МРТР мышам исследуемых линий.

Примечание: * р<0,05 по отношению к исходному измерению.

Влияние карнозина на физиологические и биохимические проявления паркинсонизма, вызванного введением МРТР мышам линии SAM

В настоящей работе возможности снижения токсического действия МРТР и коррекции дефицита антиоксидантной защиты у животных SAM с экспериментальным паркинсонизмом были исследованы применительно к природному нейропептиду карнозину, характеризующемуся широким спектром нейропротективных эффектов [Болдырев, 1998; Boldyrev, 2001; 2007]. Карнозин вводили животным одновременно с МРТР.

Влияние карнозина на физиологические характеристики животных. Как видно на рисунке 5, карнозин практически полностью препятствовал угнетению горизонтальной и вертикальной двигательной активности у быстростареющих мышей линии SAMP1 на фоне введения нейротоксина МРТР. Исследовательская активность, исходно низкая у мышей линии SAMP1, после введения МРТР и карнозина не претерпела существенной динамики.

Рисунок 5. Влияние карнозина на развитие нарушений горизонтальной (а) и вертикальной (б) двигательной активности, вызванных введением мышам исследуемых линий нейротоксина МРТР.

Примечание: * р<0,05 по отношению к исходному измерению.

Как видно на рисунке 6, карнозин существенно (до уровня контрольных значений) препятствовал развитию ригидности у мышей линии SAMP1 на фоне введения нейротоксина МРТР.

Рисунок 6. Влияние карнозина на ригидность, вызванную введением МРТР мышам исследуемых линий.

Примечание: * р<0,05 по отношению к исходному измерению.

Влияние карнозина на биохимические характеристики животных. Как видно в таблице 11, при сочетанном введении МРТР и карнозина предотвращается МРТР-индуцированное подавление активности СОД (активность фермента сохраняется на уровне контрольных значений). Повышение активности МАО-В, индуцируемое введением животным МРТР, также существенно нивелируется сочетанным применением карнозина.

Таблица 11. Влияние карнозина на изменение активности МАО-В и СОД в митохондриях серого вещества мозга мышей линии SAMP1

Группа животных	МАО-В, нмоль/мг белка в час	СОД, ед/мг белка
Контроль (физ. раствор)	130 ± 6	66,6 ± 5
Введение МРТР	156 ± 9*	50 ± 5*
Введение карнозина и МРТР	79 ± 5**	58,1 ± 7

Примечание: * р<0,05 при сопоставлении исследуемой группы с контролем;

** достоверность различий между группой животных, которым вводился только МРТР, и группой МРТР + карнозин.

Таблица 12. Параметры Fe2+-индуцируемой ХЛ мембран мозга мышей линии SAMP1, содержащихся в различных условиях.

Группы животных	Гидроперекиси липидов (мВ)	Резистентность к окислению (с)
SAMP + MPTP	127,0 15,3 *	115 2,5 *
SAMP + MPTP + + карнозин	75,0 5,3**	123,0 11,0**
SAMP + физ. раствор	95,0 7,0	126 5,5

Примечание. Достоверность различий: * ? по сравнению с контролем (SAMP + физиологический раствор), ** ? по сравнению с животными, получавшими МРТР (SAMP + MPTP).

Карнозин оказывал положительное влияние и на количественные характеристики окислительного стресса в митохондриальной фракции мозга (таблица 12). Уровень липидных гидроперекисей под действием карнозина нормализовывался, одновременно карнозин способствовал повышению резистентности липидов к окислению, снижающейся под действием МРТР, до контрольных величин. Карнозин также предотвращал МРТР-индуцированное увеличение концентрации карбонильных групп белков в митохондриях мозга.

Таким образом, карнозин при сочетанном применении с МРТР эффективно восстанавливает двигательные параметры экспериментальных животных и препятствовует развитию в мозге мышей SAMP1окислительного стресса, который является важным патогенетическим фактором развития паркинсонизма. Эффект карнозина может, по-видимому, опосредоваться несколькими механизмами, включая как взаимодействие с радикальными продуктами, так и активацию супероксид-перехватывающей активности и подавление МАО-B. Поскольку карнозин является природным компонентом нервной ткани, можно ожидать, что он не будет вызывать побочных эффектов даже при длительном применении. Все это экспериментально обосновывают возможность использования карнозина в качестве препарата, влияющего на динамику нейродегенеративных изменений в условиях окислительного повреждения мозга.

3. Оценка эффективности антиоксидантной терапии болезни Паркинсона

Одним из ключевых молекулярных механизмов нейродегенерации при БП является поражение митохондрий, сопровождающееся нарушением клеточной энергетики и развитием окислительного стресса в нигростриарных нейронах [Иллариошкин, 2008; Thomas, Beal, 2007]. В связи с этим особое значение имеет внедрение в практику методов нейропротекции при БП на основе применения современных антиоксидантов с различными механизмами действия. В настоящей работе нами на основании анализа совокупности клинических и лабораторно-биохимических показателей, характеризующих эндогенный антиоксидантный статус пациентов с БП, была оценена эффективность двух новых препаратов с антиоксидантным действием - карнозина и мексиданта.

Результат применения карнозина при болезни Паркинсона

В исследование были включены 36 больных с дрожательно-ригидной и дрожательной формами БП (женщин - 16, мужчин - 20) в возрасте от 46 до 68 лет (средний возраст 53,7±15,2 лет). Обязательным условием включения было информированное согласие больного; разрешение на применение карнозина в целях настоящего исследования у пациентов с БП было дано локальным этическим комитетом НЦН РАМН. Пациенты находились на лечении леводопа-содержащими препаратами (мадопар, наком), агонистами дофаминовых рецепторов (проноран, мирапекс) и амантадинами, дозы которых подбирались индивидуально в зависимости от состояния пациентов и тяжести клинической симптоматики.

Все больные были разделены на 2 группы, сопоставимые по возрасту, длительности заболевания и выраженности симптомов. В группу 1 входили 16 пациентов, получавших базисную терапию. При поступлении в стационар этим пациентам оказывался только стандартный объем специализированной помощи (коррекция дозировок и форм леводопы и агонистов дофаминовых рецепторов, проведение курсов баланс-тренинга на стабилометрической платформе, специализированной лечебной физкультуры и т.д.). В группу 2 входили 20 пациентов, получавших базисную терапию в сочетании с карнозином.

Продолжительность лечения составила 30 дней. Обследование проводилось на 1-м визите и через 30 дней после начала терапии - либо только базисной, либо базисной в сочетании с карнозином. Суммарная суточная доза карнозина (в составе биологически активной добавки - севитина, производство «Медтехника, Россия) составляла 1,5 г в 3 приема. Группа контроля включала 20 практически здоровых лиц сопоставимого возраста.

Таблица 13. Окислительный статус обследованных пациентов с БП.

Показатели	Норма	Больные БП
Активность МАО-В (нмоль бензиламина/мг белка)	73,0 ± 7,0	49,8 ± 3,0
Активность Cu/Zn-СОД (ед/мг гемоглобина)	3,2 ± 0,4	2,98 ± 0,1
Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липопротеинов плазмы крови	Гидроперекиси (h, мВ)	111 ± 6	107 ± 25
	Лаг-период (ф, с)	78,0 ± 4,3	42,4 ± 15*
	Суммарная окисляемость (Н, мВ)	923 ± 100	1076 ± 215
	Скорость (V, отн. ед.)	2,18 ± 0,42	2,75 ± 0,42**

Примечание: * р=0,05; ** р=0,02 (различия по сравнению с контролем).

Исходное состояние окислительного статуса у больных БП. Исходный биохимический статус пациентов с БП, оцененный до начала специфической антиоксидантной терапии (таблица 13), характеризовался статистически значимым (вдвое) снижением резистентности к индуцированному окислению липопротеинов, значимым повышением скорости окислительных повреждений липопротеинов плазмы крови, тенденцией к повышению суммарной окисляемости липопротеинов плазмы крови, статистически значимым снижением активности МАО-В и тенденцией к снижению активности СОД в эритроцитах. Полученные данные демонстрируют наличие значительных, комплексных нарушений антиоксидантного статуса организма и снижении его устойчивости к окислительному стрессу при БП, что в целом соответствует изменениям, выявляемым в мозге экспериментальных мышей линии SAMP1 с МРТР-индуцированным паркинсонизмом (см. выше).

Динамика клинических показателей на фоне лечения. В общей выборке обследованных больных средняя выраженность неврологической симптоматики по шкале UPDRS исходно составила в среднем 39 баллов (40,8±14,6 в группе 1 и 37,3±15,0 в группе 2). Через 30 дней лечения в обеих группах пациентов произошло достоверное уменьшение степени выраженности неврологической симптоматики. Так, в группе 1 (базисная терапия) зарегистрировано уменьшение выраженности клинической симптоматики на 20,3% - конечный суммарный балл по шкале UPDRS составил 32,5±12,0 (p=0,05). В группе 2 у больных, получавших карнозин в дополнение к базисной терапии, симптоматика к окончанию курса лечения уменьшилась на 33,2% ? конечный суммарный балл по шкале UPDRS составил 24,9±8,1 (p=0,01). Различие между группами больных было статистически значимо (р=0,02). Таким образом, введение карнозина в схему лечения способствовало усилению позитивной клинической динамики, достигнутой на фоне противопаркинсонической терапии.

В результате проведенного лечения у больных обеих групп отмечалось улучшение двигательной активности, более выраженное на фоне карнозина (в группе 1 - на 24,4%, в группе 2 - на 32,0%). Достигнутое улучшение проявлялось также в уменьшении одного из наиболее значимых клинических проявлений паркинсонизма ? гипокинезии, выявляемой тестами «пронация-супинация», «движения в стопе», «движение кистей рук» (рисунок 7). У пациентов обеих групп отмечалось снижение других двигательных проявлений паркинсонизма - ригидности (выявляемой в верхних и нижних конечностях) и тремора, причем применение карнозина способствовало более выраженному улучшению моторики.

Серые столбики - группа 2; черные - группа 1; указана значимость различий по отношению к группе больных, не получавших карнозина (значимые различия выделены жирным шрифтом).



Рисунок 7. Динамика отдельных симптомов на фоне лечения канозином.

Субъективная оценка эффективности лечения, определяемая по тесту «повседневная активность», также выявила преимущества карнозина: при базисной терапии происходило улучшение повседневной активности на 16%, а в группе с карнозином - на 30%, что сопровождалось улучшением самообслуживания.

Следует отметить, что для карнозина была выявлена хорошая переносимость и отсутствие побочных эффектов.

Оценка окислительного статуса. Как видно в таблице 14, базисная терапия приводит к некоторому (на 10%) повышению активности МАО-В, и добавление карнозина не изменяет этого параметра. Активность Zn/Cu-СОД на фоне базисной терапии статистически незначимо понижалась, тогда как при дополнительном приеме карнозина отмечено статистически значимое (p=0,035) повышение активности СОД относительно исходных величин.

Таблица 14. Динамика активности МАО-В и СОД у пациентов с БП на фоне лечения карнозином.

Группы пациентов	МАО-В (нмоль бензиламина/мг белка)	Cu/Zn-СОД (ед/мг гемоглобина)
До лечения	49,8 ± 3,0	3,0 ± 0,1
Базисная терапия	58,9 ± 4,2	2,7 ± 0,07
Базисная терапия + карнозин	57,1 ± 3,5	3,4 ± 0,1*

Примечание: * р=0,05 (различия до и после лечения).

Рисунок 8. Зависимость между динамикой неврологической симптоматикой и изменением активности Cu/Zn-СОД (r = 0,52; p = 0,07).

При сопоставлении активации СОД с динамикой выраженности неврологической симптоматики между этими параметрами была выявлена отчетливая положительная корреляция (r = 0,52, р=0,07) (рисунок 8). Более того, во всей группе пациентов с БП была установлена прямая зависимость между активностью СОД до лечения и степенью изменения клинической симптоматики на фоне терапии (r = 0,26). Можно предположить, что чем меньше начальное значение СОД, ниже тяжесть заболевания и больше возможности активировать антиоксидантную защиту, тем более выражен эффект терапии заболевания в результате торможения окислительных процессов, сопровождающих БП.

Таблица 15. Динамика параметров Fe2+-индуцированной ХЛ липопротеинов плазмы крови на фоне лечения карнозином.

Группы пациентов	Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции
	Гидроперекиси, отн. ед.	Лаг-период, с	Суммарная окисляемость, отн. ед.	Скорость, отн. ед.
Норма	111 ± 6	78,0 ± 4,3	923 ± 100	2,18 ± 0,42
До лечения	107 ± 25	42,4 ± 15	1076 ± 215	2,75 ± 0,42
Базисная терапия	114 ± 30	43,9 ± 11,0	1124 ± 186	2,72 ± 0,56
Базисная терапия + карнозин	94 ± 18	61,4 ± 16,0*	1025±134	2,29 ± 0,45**

Примечание: * р=0,015; ** р=0,001 (различия до и после лечения).

Оценка Fe2+-индуцированной ХЛ показала (таблица 15), что уровень липоперекисей плазмы крови больных БП не изменяется при базисной терапии, но статистически незначимо понижается при использовании карнозина. Дополнительное введение в протокол лечения карнозина статистически значимо увеличивает лаг-период окисления, почти возвращая к норме резистентность к ионам Fe2+. Скорость окислительных повреждений липопротеинов крови пациентов на фоне карнозина также статистически значимо понижается.

Результат применения мексиданта при болезни Паркинсона

В данной части исследования приняли участие 49 больных с дрожательно-ригидной и дрожательной формами БП (женщин - 28, мужчин - 21) в возрасте от 58 до 65 лет (средний возраст 61,7±3,8 лет). Длительность заболевания составила 6,5±3,8 лет. Как и в исследовании, посвященном карнозину, больные находились на базисном лечении леводопа-содержащими препаратами, агонистами дофаминовых рецепторов и/или амантадинами.

Все пациенты были разделены на две группы методом случайной выборки, сопоставимые по полу, возрасту, длительности и тяжести заболевания. Группу 1 составили 22 пациента, получавших базисное лечение (при поступлении - коррекция дозировок и форм леводопы и агонистов дофаминовых рецепторов, проведение курсов баланс-тренинга на стабилометрической платформе, специализированной лечебной физкультуры и т.д.). В группу 2 вошли 27 пациентов, дополнительно получавших в течение 20 дней мексидант ? структурный аналог антиоксиданта мексидола (препарат изготовлен на Экспериментальном производстве медико-биологических препаратов РКНПК Минздравсоцразвития России). С 1-го по 10-й день мексидант вводили внутривенно капельно (200 мг в сутки); в течение последующих 10 дней - внутримышечно 2 раза в сутки по 2 мл утром и вечером (200 мг в сутки).

Оцениваемые неврологические и биохимические исследования были теми же, как и при проведении терапии карнозином. Обследование проводилось до начала лечения (1-й визит) и через 20 дней (2-й визит) после начала терапии.

Динамика клинических показателей на фоне лечения. До начала лечения пациенты обеих групп были сопоставимы по степени тяжести неврологической симптоматики: в группе больных, получавших базисную терапию, исходная тяжесть симптомов по шкале UPDRS составлял 50,1±4,7 баллов, в группе больных, получавших дополнительно к базисной терапии мексидант ? 44,7±3,1 баллов. Через 20 дней лечения в обеих группах пациентов произошло достоверное (р=0,0001) снижение неврологической симптоматики, несколько более выраженное на фоне мексиданта в дополнение к базисной терапии: процент улучшения суммарного балла по шкале UPDRS у пациентов на базисной терапии составил 21,8%, а у пациентов, получавших дополнительно мексидант ? 26,8%.

На фоне лечения улучшение, регистрируемое по шкале «Повседневная активность», отмечалось у больных обеих групп, причем более выраженное - у пациентов, получавших мексидант. Уменьшение выраженности неврологических симптомов заболевания по шкале «Двигательные нарушения», наблюдавшееся у пациентов обеих групп в одинаковой степени, касалось снижения тремора покоя ног и постурального тремора рук. В группе пациентов, получавших мексидант, более отчетливым было улучшение по тестам «ригидность в верхних и нижних конечностях», «движение кистей рук», «движения в стопе», «чувствительные нарушения». Наиболее значимым преимуществом мексиданта явилось достоверное (р<0,03) уменьшение выраженности осложнений леводопа-терапии (дискинезии и др.) относительно пациентов, получавших базовую терапию (рисунок 9).

Рисунок 9. Динамика отдельных симптомов на фоне лечения мексидантом.

Оценка окислительного статуса. В процессе лечения в обеих группах больных достоверных изменений активности МАО-В не наблюдалось. Исходно низкая активность СОД на фоне мексиданта несколько возрастала, но все же продолжала оставаться пониженной по итогам терапии. Как видно в таблице 16, после лечения в группе базисной терапии уровень липидных гидроперекисей не изменяется и остается высоким, не изменяется и сниженная по сравнению с нормой резистентность липопротеинов к окислению. Введение в протокол лечения мексиданта предотвращает повышение уровня липидных гидроперекисей (р<0,05) и значительно (на 42%) увеличивает резистентность липопротеинов к окислению.

Таблица 16. Динамика параметров Fe2+-индуцированной ХЛ липопротеинов плазмы крови на фоне лечения мексидантом.

Группы пациентов	Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции
	Гидропере-киси, отн. ед.	Лаг-период, с	Суммарная окисляемость, отн. ед.	Скорость, отн. ед.
Норма	84,7 ± 7,4	78,0 ± 4,3	923 ± 100	2,18 ± 0,42
Базисная терапия	до	110,8 ± 29	44,2 ± 11,3	1096± 158	2,75± 0,42
	после	114,4 ± 30	43,9 ± 11,0	1124 ± 186	2,72 ±0,56
Базисная терапия + мексидант	до	103,7 ± 19	40,2 ± 12,5	1098 ± 283	3,36 ± 0,44
	после	89,6 ± 18	59,6 ± 16,0 *, **	1111 ± 334	2,41± 0,27*

Примечание: * р<0,05 (достоверность отличий до и после лечения); ** р<0,02 (достоверность отличий после лечения мексидантом относительно базовой терапии).

Таким образом, результаты клинико-биохимической части работы свидетельствуют о клинической эффективности карнозина, применяемого в сочетании с базисной терапией у пациентов с БП. Улучшение клинической симптоматики выявляется на фоне значительного улучшения антиоксидантного статуса организма. По-видимому, карнозин может оказаться перспективным соединением и при лечении других нейродегенеративных заболеваний, течение которых сопровождается развитием окислительного стресса. Нами показано также, что при БП клинически оправданным может быть включение в терапевтическую схему мексиданта, хотя в целом его эффекты при БП оказались менее выраженными, чем у карнозина (так, в частности, мексидант значимо не влиял на активность СОД и оказывал менее отчетливое клиническое действие). Наиболее перспективным оказался эффект мексиданта в отношении снижения частоты выявляемых побочных эффектов леводопа-терапии, что может способствовать повышению эффективности проводимого лечения.

Полученные данные показывают, что в комплексном лечении паркинсонизма значимое место должно отводиться использованию природных и синтетических антиоксидантов различных классов.

ВЫВОДЫ

1. При спорадической болезни Паркинсона в российской (преимущественно славянской) выборке пациентов наследуемые мутации в генах, связанных с менделирующими формами первичного паркинсонизма, выявляются более чем в 10% случаев. В их числе: гетерозиготные экзонные перестройки гена PRKN - 6,5% больных, мажорные мутации в генах LRRK2 и GBA - соответственно 1,1% и 3,9% больных.

2. Носительство мутаций в генах PRKN (паркин) и GBA (глюкоцереброзидаза) ассоциировано с более ранним дебютом клинической симптоматики паркинсонизма и достоверно чаще встречается в подгруппе пациентов молодого возраста. В работе впервые у больных со спорадической формой болезни Паркинсона выявлено сочетание мутаций в различных генах паркинсонизма (двойная гетерозиготность), что характеризуется аддитивным эффектом в отношении тяжести течения заболевания.

3. Доминантная мутация G2019S в гене LRRK2 обусловливает широкий полиморфизм клинических проявлений с точки зрения вариабельности возраста дебюта и особенностей фенотипа паркинсонизма. Высокая частота носительства данной мажорной мутации у пациентов с болезнью Паркинсона обусловлена как «эффектом основателя», так и повторными мутационными событиями de novo, что подтверждается анализом гаплотипов в критической области хромосомы 12q12.2 (локус PARK8).

4. При спорадической болезни Паркинсона в исследованной популяции впервые выявлена ассоциация заболевания с полиморфизмами в генах HTR2A (cеротониновый рецептор 2A), РОМС (проопиомеланокортин) и WFS1 (везикулярный пептид вольфрамин). Это подтверждает патогенетическую взаимосвязь болезни Паркинсона с активностью ряда нейротрансмиттерных систем головного мозга (в частности, нейропептидной и серотонинергической).

5. Установлено, что у быстростареющих мышей SAMP1 после введения МРТР имеют место выраженные нейрохимические нарушения, сопровождающиеся развитием окислительного стресса в мозге: повышением уровня преобразованных липидных гидроперекисей и скорости окисления мембранных липидов, одновременным истощением системы антиоксидантной защиты, усилением окислительной модификации белков. Нарушение поведенческих реакций в результате воздействия МРТР свидетельствует о возникновении повреждений в области черной субстанции и в связанной с ней дофаминергической системе мозга.

6. Окислительный стресс и его патофизиологические проявления в ткани мозга быстростареющих животных с экспериментальным паркинсонизмом предотвращается курсовым введением природного антиоксиданта карнозина, препятствующего угнетению двигательной активности животных и развитию МРТР-индуцированной мышечной ригидности. Нейропротекторный эффект карнозина позволяет компенсировать дефицит антиоксидантной защиты мозга в результате подавления активности МАО-В и/или активации СОД, а также защищать белки от окислительной модификации.

7. Назначение при болезни Паркинсона природного нейропептида карнозина показало существенное усиление позитивной динамики симптомов по сравнению с группой базисной терапии. Прием карнозина сопровождался улучшением общей двигательной активности, уменьшением тяжести гипокинезии, ригидности и тремора, а также улучшением теста «повседневная активность». Карнозин уменьшал окислительные повреждения липопротеинов крови на фоне повышения уровня эндогенной антиоксидантной защиты и сохранения активности Cu/Zn-СОД. Выявленная корреляция между активацией СОД и позитивной динамикой неврологической симптоматики указывает, что данный фермент является одной из точек приложения действия карнозина.

8. Показано, что при болезни Паркинсона клинически оправданным является включение в терапевтическую схему синтетического антиоксиданта мексиданта. Данный препарат продемонстрировал способность нейтрализовать рост липидных гидроперекисей и повышать уровень антиоксидантной защиты. Наиболее четким оказался эффект мексиданта в отношении снижения частоты выявляемых побочных эффектов леводопа-терапии.

9. Проведенное клинико-генетико-биохимическое и экспериментальное исследование раскрывает новые аспекты взаимодействия генетики и среды, а также роли окислительного стресса в патогенезе болезни Паркинсона. Результаты проведенных клинических исследований являются основанием для использования природных и синтетических антиоксидантов различных классов в комплексном лечении паркинсонизма.

Практические рекомендации

1. В силу генетической гетерогенности болезни Паркинсона часть спорадических случаев заболевания обусловлена носительством наследуемых мутаций в генах PRKN, LRRK2, GBA. Выявление мутаций у таких пациентов даже при отсутствии семейного анамнеза требует осуществления всего комплекса мероприятий медико-генетического консультирования, направленного на обследование клинически здоровых родственников их группы риска, профилактику повторных случаев заболевания в отягощенной семье с помощью пренатальной ДНК-диагностики и т.д.

2. При проведении комплексного лечения пациентов с болезнью Паркинсона в терапевтическую схему, помимо базисных противопаркинсонических средств, целесообразно дополнительно включать препараты с антиоксидантным нейропротекторным действием (карнозин, мексидант), что может способствовать повышению эффективности лечения и снижению числа побочных эффектов проводимой терапии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Багыева Г.Х., Федорова Т.Н., Стволинский С.Л. и др. Новые подходы к терапии при болезни Паркинсона. В сб.: XI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл. М., 2004: 7273.

Bagyeva G.K., Fedorova T.N., Stvolinsky S.L. et al. Oxidative stress in the pathogenesis of Parkinson's disease. Mov. Disord. 2004; 19 (Suppl. 9): S266.

Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Лимборская С.А., Левин О.С., Милосердова О.В., Проскокова Т.Н., Багыева Г.Х., Брис А. Клинико-генетический анализ ювенильного паркинсонизма в России. Журн. неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова 2004; 8: 6672.

Багыева Г.Х., Федорова Т.Н., Стволинский С.Л. и др. Новые подходы к антиоксидантной терапии при болезни Паркинсона: экспериментальные и клинические аспекты. В сб.: II Украинский симпозиум с междун. участием «Экстрапирамидные болезни и возраст»: Тез. докл. Киев, 2004: 20?21.

Болдырев А.А., Федорова Т.Н., Стволинский С. Л., Багыева Г.Х. и др. Новые перспективы применения нейропептида карнозина в защите от неврологических нарушений. В сб.: XII Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. М., 2005: 68.

Иллариошкин С.Н., Джурич Г.М., Багыева Г.Х. и др. Генетическая предрасположенность к болезни Паркинсона. Мед. генетика 2005; 5 (мат-лы V съезда Российского общества медицинских генетиков, часть II): 196.

Федорова Т.Н., Стволинский П.А., Багыева Г.Х. и др. Нейродегенеративные изменения, индуцированные введением нейротоксина МРТР быстростареющим мышам. Успехи физиол. наук 2005; 36: 94?101.

Illarioshkin S.N., Bagyeva G.K., Slominsky P.A. et al. Studies of candidate genes in young-onset parkinsonism in Russian population. Neurology 2006; 66 (Suppl. 2): P03.041.

Багыева Г.Х., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А. и др. Мутации в новом гене LRRK2 - важный фактор риска болезни Паркинсона. В сб. IX Всероссийский съезд неврологов: Тез. докл. Ярославль, 2006: 127.

Маркова Е.Д., Загоровская Т.Б., Багыева Г.Х. и др. Структурные перестройки в гене паркине у больных с ранним дебютом паркинсонизма в российской популяции. В сб. IX Всероссийский съезд неврологов: Тез. докл. Ярославль, 2006: 144.

Шадрина М.И., Семенова Е.В., Сломинский П.А., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х. и др. Метод определения делеций и дупликаций в гене паркина с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. Мед. генетика 2006; Приложение 2: 52?54.

Bagyeva G.K., Illarioshkin S.N., Slominsky P.A. et al. Structural rearrangements in the parkin gene in patients with young-onset parkinsonism in Russian population. Mov. Disord. 2006; 21 (Suppl. 15): S407.

Bagyeva G.K., Illarioshkin S.N., Slominsky P.A. et al. Frequency of the LRRK2 G2019S mutation in patients with Parkinson's disease in Russian population. Mov. Disord. 2006; 21 (Suppl. 15): S407.

Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Загоровская Т.Б., Карабанов А.В., Полещук В.В., Маркова Е.Д., Карпова Е.А., Полевая Е.В., Багыева Г.Х., Тимербаева С.Л., Нурманова Ш.А. Семилетний опыт применения Мирапекса у больных с различными формами первичного паркинсонизма. Журн. неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова 2006; 11: 26?32.

Иванова-Смоленская И.А., Багыева Г.Х. и др. Мутация G2019S в гене LRRK2 при семейной форме болезни Паркинсона. Мед. генетика 2006; 12: 19?21.

Шадрина М.И., Багыева Г.Х., Иллариошкин С.Н. и др. Структурные перестройки в гене паркина (PARK2) у больных с паркинсонизмом молодого возраста. Мед. генетика 2006; 12: 22?26.

Shadrina M., Nikopensius T., Slominsky P., Illarioshkin S., Bagyeva G. et al. Association study of sporadic Parkinson's disease genetic risk factors in patients from Russia by APEX technology. Neurosci. Lett. 2006; 405: 212?216.

Багыева Г.Х., Федорова Т.Н., Стволинский С.Л. и др. Новые экспериментальные подходы к изучению паркинсонизма. В кн.: Неврология длиною в жизнь. М.: Изд-во МГМСУ, 2006: 173?176.

Boldyrev A., Fedorova T.N., Stvolinsky S., Stepanova M., Dobrotvorskaya I., Kozlova E., Bagyeva G. et al. Carnosine increases efficiency of L-DOPA therapy of parkinsonics. In: Parkinsonism & Related Disorders, 2007. V.13 (Suppl. 2), Abstracts of the XVII WFN World Congress on Parkinson's Disease and Related Disorders. Amsterdam, 2007: S99.

Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А., Шадрина М.И., Багыева Г.Х. и др. Гетерогенность спорадической болезни Паркинсона: молекулярный подход к решению проблемы. Анн. клин. эксперим. неврол. 2007; 1: 23?31.

Шадрина М.И., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х. и др. PARK8-форма болезни Паркинсона: мутационный анализ гена LRRK2 в российской популяции. Журн. неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова 2007; 3: 46?50.

...