Восстановление эпителиальных тканей с использованием криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов и живого эквивалента кожи

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

«восстановление эпителиальных тканей с использованием криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов и живого эквивалента кожи»

14.00.27-хирургия

14.00.22 - травматология и ортопедия.

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ивашкин Александр Николаевич

Москва

2009

Работа выполнена в Государственном институте усовершенствования врачей

Министерства обороны Российской Федерации

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук

Зубрицкий

Владислав Феликсович

Доктор медицинских наук Артемьев

Александр Александрович

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Гостищев

Виктор Кузьмич

Доктор медицинских наук, профессор Розанов

Валерий Евгеньевич

Доктор медицинских наук, профессор Ломтатидзе

Евгений Шалвович

Ведущая организация:

Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова

Защита состоится « 16 » июня 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.009.01 при Государственном институте усовершенствования врачей Министерства обороны Российской Федерации по адресу: 107392, г. Москва, ул. Малая Черкизовская, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного института усовершенствования врачей МО РФ.

Автореферат разослан « » марта 2009 г.

ВрИО ученого секретаря диссертационного совета

Доктор медицинских наук Асташов Владимир Леонидович

Актуальность исследования

Рост числа травм и ожогов, увеличение количества больных с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами, старение населения обусловливают необходимость поиска новых малотравматичных и относительно недорогих методов для местного лечения ран.

Наиболее перспективным подходом к проблеме лечения ран и ожогов является биотехнологический, позволяющий значительно расширить арсенал методов лечения этих патологий и улучшить результаты. Особенно перспективными оказались биологические и биосинтетические средства, основанные на использовании аллогенных клеток и тканей. Несмотря на широкий выбор современных лекарственных средств и перевязочных материалов, в клинической практике нет искусственного покрытия, которое по своим физиологическим свойствам приближалось бы к коже человека (Бурмистров В.Н., 1986, Киселев И.В., 2000).

Во всех развитых странах мира успешно функционируют Банки тканей. В США на сегодняшний день их насчитывается более тысячи, действует Ассоциация тканевых Банков, которая выполняет важные мобилизационные функции. Такие запасы позволяют, в частности, временно замещать пораженные кожные покровы на этапах эвакуации пострадавших или позволяют закрывать раневой дефект в период лечения. В ходе оказания помощи пострадавшим от террористического акта в г.Нью-Йорке (11.09.2001) было использовано около 14 м2 донорской кожи и 200 м2 выделено в качестве неприкосновенного запаса на случай чрезвычайных ситуаций. Самый крупный Банк тканей создан в 304 армейском госпитале в Пекине (Китай). В нем хранится более 200 м2 аллодермотрансплантатов (Васильев А.В., 2004). В зарубежных банках кожи используется технология хранения кожи в глицерине, что не обеспечивает сохранения ее жизнеспособности при длительном хранении (Kearney J.N, 1998).

Преимущества использования жизнеспособных дермотрансплантатов становятся более очевидны при лечении больных пожилого и старческого возраста, раненых и пострадавших в тяжелом состоянии, пациентов с тяжелой сопутствующей патологией, для которых любое оперативное пособие может привести к значительному ухудшению состояния и необратимым последствиям (May S.R., 1980, Gram A.E., 1983).

В нашей стране аллогенные ткани для лечения ран практически не применяются. Также отсутствуют структуры (Банки кожи), предназначенные для хранения тестированных запасов аллогенных тканей, отсутствуют доступные технологии заготовки, хранения и использования аллогенной кожи, хотя спрос на данные материалы есть. Годовые потребности только Московского ожогового центра НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского превышают 30 м2 ежегодно, а таких центров и специализированных отделений в нашей стране насчитывается не менее семидесяти (Васильев А.В., 2004).

В связи с этим коллектив кафедры военно-полевой (военно-морской) хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ совместно с сотрудниками лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН на протяжении последних лет проводит научные исследования в сфере разработки и создания биологических и биосинтетических покрытий.

Цель работы: Улучшить результаты лечения обширных раневых дефектов (в том числе у пациентов с травматическими отрывами конечностей и открытыми переломами костей), длительно незаживающих ран и трофических язв путем разработки, обоснования и внедрения в клиническую практику современной технологии заготовки, хранения и использования криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов и живого эквивалента кожи.

Задачи исследования

незаживающий рана язва репаративный

1. Провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование клеточного и стромального компонентов длительно незаживающих ран и трофических язв различного генеза для выявления характерных особенностей и общих закономерностей их развития в зависимости от давности существования.

2. Изучить динамику репаративных процессов, а также механизмы, регулирующие межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в процессе репарации в длительно незаживающих ранах и трофических язвах, при использовании криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов.

3. Оценить клинические результаты при использовании криоконсервированных жизнеспособных аллогенных дермотрансплантатов для лечения длительно существующих ран и трофических язв, обосновать показания и противопоказания к применению разработанного метода.

4. Обосновать показания, оценить результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аутологичных дермотрансплантатов при лечении пострадавших с травматическими отрывами конечностей (с дефицитом кожных покровов на пострадавшем сегменте) путем забора жизнеспособной кожи с ампутированного сегмента (в случае невозможности реимплантации), выявить противопоказания и осложнения, наметить методы профилактики.

5. Обосновать показания, оценить результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аутологичных дермотрансплантатов при этапном закрытии обширных раневых дефектов, в том числе при открытых переломах костей, выявить противопоказания и осложнения, наметить методы профилактики.

6. Изучить динамику раневого процесса при использовании живого эквивалента кожи, обосновать показания, оценить результаты клинического применения, выявить противопоказания и осложнения.

7. Внедрить разработанный метод лечения обширных раневых дефектов, длительно незаживающих ран и трофических язв в клиническую практику.

Научная новизна

Установлено, что длительно незаживающие раны и трофические язвы, вне зависимости от факторов, обусловивших их развитие, характеризуются стереотипными изменениями со стороны состава воспалительного инфильтрата и внеклеточного матрикса: преобладанием клеток моноцитарно-макрофагального ряда в воспалительном инфильтрате в сочетании с недостаточным количеством Т-хелперов/Т-супрессоров; снижением содержания коллагена III типа, накоплением тенасцина и плазменной формы фибронектина, изменением типичной локализации ламинина, минимальным количеством миофибробластов в области раневого дефекта. Выявлены изменения со стороны медиаторных систем, регулирующих ход воспалительно-репаративной реакции: обнаружены повышенное накопление провоспалительных цитокинов (IL-1, MIP-1/MIP-1) и нарушение их нормального соотношения, отсутствие фиброгенных факторов роста (TGF-1, bFGF) в сочетании с повышенной активностью матриксной металлопротеиназы - 9 в области раны.

Установлено, что данные изменения становятся выраженными в раневых дефектах, существующих более 3 месяцев. Данный интервал времени предлагается использовать для разделения определений «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва».

Установлено, что после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов в ране происходит нормализация экспрессии провоспалительных цитокинов, активизация продукции факторов роста, снижение активности матриксной металлопротеиназы - 9. Это способствует формированию нормального внеклеточного матрикса, провизиональной базальной мембраны и заживлению ран. Выявлены особенности репаративных процессов после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов - сохранение в течение всего процесса заживления раны инфильтрации моноцитами/макрофагами и минимального количества миофибробластов, поэтому заживление раны происходит без контракции и формирования рубца.

Разработана современная отечественная технология заготовки, хранения и клинического применения криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов (как аллогенных, так и аутологичных) с использованием оригинального консерванта «Криодерм». Данная технология позволяет максимально поддерживать жизнеспособность и морфо-функциональные свойства дермотрансплантатов и подразумевает использование нескольких температурных режимов хранения дермотрансплантатов.

Доказана высокая клиническая эффективность модифицированного отечественного живого эквивалента кожи, разработанного в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. С учетом накопленного опыта в гель, содержащий фибробласты, была заключена биологически нетоксичная сетка, которая придает всей конструкции прочность, предотвращает горизонтальную контракцию геля и облегчает процесс трансплантации.

Практическая значимость

Результаты исследований могут служить основой для разработки принципов и подходов широкого применения жизнеспособных криоконсервированных алло(ауто)дермотрансплантатов в клинической практике и военной медицине в целом. Данная технология и консервант «Криодерм» могут быть использованы при развертывании в нашей стране Банков кожных и клеточных трансплантатов. Применение новых биотехнологических методов воостановления кожного покрова позволяет выйти на более высокий уровень лечения, снизить летальность и инвалидизацию больных, сократить сроки лечения в стационарах и амбулаторных условиях, в целом поменять взгляды клиницистов на давно устоявшиеся принципы лечения длительно незаживающих ран, трофических язв и обширных раневых дефектов. Особенно в тех случаях, когда тяжесть состояния больного или наличие сопутствующей патологии не позволяют проводить активную хирургическую тактику.

Результаты данной работы могут быть использованы в отделениях гнойной хирургии и травматологии, как в больницах, так и в поликлиниках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Длительно незаживающие раны и трофические язвы характеризуются похожими патологическими особенностями состава воспалительного инфильтрата и нарушениями в соотношении компонентов внеклеточного матрикса (соотношение провоспалительных цитокинов, дефицит фиброгенных факторов роста, дисбаланс в системе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов). Это препятствует репарации, создавая самоподдерживающуюся систему, функционирующую по принципу «порочного круга». Учитывая, что данные патологические изменения наиболее выражены для ран, существующих более 3 месяцев, целесообразно данный интервал времени использовать для разделения определений «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва».

2. Закрытие длительно существующего раневого дефекта жизнеспособными криоконсервированными аллодермотрансплантатами приводит к восстановлению систем, регулирующих межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в длительно существующих раневых дефектах. Происходит активизация репаративных процессов, которые приводят к восстановлению эпителиального покрова.

3. Результаты лечения пострадавших с дефицитом кожных покровов при травматических отрывах конечностей (в случае невозможности реимплантации) могут быть улучшены путем использования криоконсервированных жизнеспособных аутодермотрансплантатов, заготовленных по разработанной методике с ампутированного сегмента.

4. Учитывая, что у пациентов с обширными раневыми дефектами крайне сложно добиться одновременной готовности раны к кожной пластике на всей площади дефекта, целесообразно производить во время плановой операции аутодермопластики забор аутодермотрансплантатов «с запасом» и хранить излишки аутологичной кожи по разработанной методике. Это позволяет, по мере необходимости, производить повторную пластику жизнеспособной аутологичной кожи, не занимая операционную и не травмируя дополнительно больного.

5. Использование разработанного живого эквивалента кожи позволяет улучшить результаты местного лечения раневых дефектов, особенно в тех случаях, когда тяжесть состояния больного или наличие сопутствующей патологии не позволяют проводить активную хирургическую тактику.

Работа выполнена на кафедре военно-полевой хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ, в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (руководители - д.б.н. Терских В.В., д.б.н. Васильев А.В.). Морфологические исследования проведены и консультированы в лаборатории клеточной и молекулярной патологии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (заведующий - д.м.н. Иванов А.А.).

Апробация диссертационного материала

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 69 заседании секции военно-полевой хирургии Хирургического общества г.Москвы и Московской области, 2000; Всеармейской научно-практической конференции «Особенности оказания медицинской помощи, лечения раненых и больных с боевой хирургической и терапевтической травмой в локальных войнах и вооруженных конфликтах».-СПб, 2000; Научно-практической конференции «Актуальные вопросы оказания медицинской помощи в городской многопрофильной клинической больнице», посвященной 125-летию городской клинической больницы №29 «Утоли моя печали».- М., 2000; Международном российско- германском симпозиуме «Хирургия повреждений мирного и военного времени».- М., 2001; II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины».- М., 2001; 18-м Европейском Конгрессе патологов.- Берлин, Германия - 2001; Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы современной тяжелой травмы», посвященной 70- летию кафедры ВПХ ВМА. - СПб, 2001; Северо - кавказкой научно- практической конференции, посвящённой 20-летию кафедры военно-полевой хирургии Ростовского государственного медицинского университета «Достижения и проблемы современной военно-полевой и клинической хирургии». - г.Ростов - на - Дону, 2002; Международном хирургическом конгрессе «Актуальные проблемы современной хирургии». - М., 2003; Международной конференции. «Хирургические инфекции: профилактика и лечение». - М., 2003; Всероссийской конференции хирургов «Совершенствование специализированной медицинской помощи в многопрофильном стационаре», посвящённой 80-летнему юбилею профессора В.П.Петрова. - М., 2003; 14 международной конференции российского общества ангиологов и сосудистых хирургов «Новые тенденции в сосудистой хирургии и флебологии».- г.Ростов-на Дону, 2003; 4 международном конгрессе по пластической реконструктивной и эстетической хирургии (IV ICPRAS). - Ярославль, 2003; Международной конференции «Хирургические инфекции: профилактика и лечение». - М., 2003; Конференции посвященной, 300-летию ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития». - М.-2006; 3-м международном конгрессе «Современные технологии в травматологии и ортопедии».- РУДН, М.-2006; 6 всеармейской международной конференции «Инфекции в хирургии мирного и военного времени».- М., 2006; III Международном салоне вооружения и военной техники «МВСВ-2008» «Оказание медицинской помощи подразделениями военно-полевой медицины в условиях полевого госпиталя». - М., 2008.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры военно-полевой (военно-морской) хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ, в лечебную работу отделения гнойной хирургии, травматологических отделений ГКБ №29 им. Н.Э.Баумана г.Москва, ГКБ г.Мытищи (Московская область).

По теме диссертации опубликовано 42 работы в центральной печати и региональных сборниках, в том числе опубликовано два учебно-методических пособия и две монографии:

· Хрупкин В.И., Ханевич М.Д., Щелоков А.Л., Фоминых Е.М. Осложненные формы хронической венозной недостаточности нижних конечностей: М. «МедЭкспертПресс»; Петрозаводск: из-во «ИнтелТек».2003.-176 с.

· Хрупкин В.И., Артемьев А.А., Зубрицкий В.Ф., Ханевич М.Д., Фоминых Е.М. Дерматопластика раневых дефектов: М.: Гэотар-Медиа,2009.-193 с.

Материалы диссертации использовались при организации первой в Российской Федерации и в странах СНГ «Медицинской лаборатории тканевых трансплантатов (банка кожных и тканевых трансплантатов)» на базе СПК Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н. Бурденко МО РФ в соответствии с «Решением межведомственного совещания…» от 24.07.2004 г., утвержденного начальником ГВМУ МО РФ и директором Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Объём и структура работы: Диссертационная работа изложена на 313 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (145 отечественных и 204 зарубежных источника). Работа иллюстрирована 27 таблицами и 81 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика клинических наблюдений и методов обследования

Основные лабораторные, экспериментальные и клинические исследования выполнены в период с 1998 по 2008 годы на базе ГКБ№ 29 им.Н.Э.Баумана г. Москвы, ГКБ г. Мытищи (Московская область), Института Биологии Развития РАН им. Н.К. Кольцова РАН и Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Источники получения кожи и методика хранения жизнеспособных дермотрансплантатов. Необходимым условием для сохранения физиологических свойств и хорошего приживления дермотрансплантата является его высокая жизнеспособность, которая определяется технологией забора, зависит от выбранного консерванта и метода хранения дермотрансплантата.

Основным источником для создания запасов жизнеспособных дермотрансплантатов и получения аллогенных кератиноцитов является кадаверная кожа. С целью определения возможных сроков ее забора была оценена жизнеспособность кожи в различные сроки после смерти донора, табл. 1. Для определения жизнеспособности кожи был использован комплекс методов: культивирование выделенных кератиноцитов in vitro, тест на исключение кератиноцитами красителя - трипанового синего и оценка синтеза белка по включению меченого лейцина. Кроме этого, для оценки структуры кожи было применено гистологическое исследование.

Установлено, что кожа, взятая в течение 17 часов после смерти донора, может использоваться для создания запасов жизнеспособных кожных трансплантатов. Однако, поскольку одним из факторов, определяющих конечный результат хранения, является исходная жизнеспособность кожи, предпочтительным является использование кожи, полученной как можно в более ранние сроки после смерти. При этом необходимо учитывать возраст доноров, сопутствующую патологию, сроки и причину смерти, а также условия хранения трупа после смерти. В жаркое время года или при нахождении трупа в помещении с температурой выше 200С явления аутолиза развиваются быстрее. В этих случаях предельно допустимые сроки должны быть сокращены до 3-4 часов после смерти.

Таблица 1

Результаты оценки жизнеспособности дермотрансплантатов в зависимости от сроков забора после смерти донора

Время забора дермотрансплантата с момента смерти донора часы	Количество клеток не включающих краситель (%)	Радиоактивность включившегося С14 - лейцина на 100 тыс. клеток (имп/мин)	Результаты культивирования
До 3	87 + 2	2124 + 114	Многослойный пласт кератиноцитов
До 6	86 + 3	1827 + 74	Многослойный пласт кератиноцитов
До 12	83+ 6	1909 + 77	Многослойный пласт кератиноцитов
До 17	71+ 6	1578 + 122	Колонии на площади не менее 50% культурального флакона
18 - 21	50+ 5	65 + 5	Первоначальное прикрепление клеток к субстрату подложки без признаков колонизации и последующая их гибель
Дермотрансплантат от живых доноров	87 + 2	2086 ± 212	Многослойный пласт кератиноцитов
Минимальные критерии жизнеспособности дермотрансплантата	65 + 10	577 ± 103	Колонии на площади не менее 50% культурального флакона

С целью выбора оптимальных условий хранения было изучено влияние различных сред и температурных режимов на жизнеспособность кожи. В результате исследований была создана среда для криоконсервации «Криодерм» ТУ 9385-012-45171785-2007. Регистрационное удостоверение №ФСР 2007/01248 от 22 ноября 2007 года. После хранения в консерванте «Криодерм», содержащем эпидермальный фактор роста, происходит иммобилизация части эпидермального фактора роста на аллодермотрансплантат, что оказывает влияние на репаративные процессы, протекающие в ране.

В качестве температурного режима хранения использовались: -180С и -700С. Температурный режим -180С легко достижим в морозильных камерах обычных бытовых холодильников. Предельный рекомендованный срок хранения кожи при -180С составляет 10 суток. При -700С - 30 -45 суток, при -1960С кожа остается жизнеспособной не менее одного года. Окончательно же определить возможные сроки хранения каждого конкретного образца кожи можно, только лишь зная его исходную жизнеспособность.

При работе по забору аллодермотрансплантатов руководствовались директивой начальника Главного военно-медицинского управления МО РФ ДМ-9, от 20 марта 1996 г. «Об организации заготовки и трансплантации донорских органов в военных лечебных учреждениях». Заготовка тканей осуществлялась после осмотра трупа судебно-медицинским экспертом (согласно «Правилам судебно-медицинской экспертизы трупа» от 01 января 1997 г.), который давал разрешение на изъятие тканей и ознакомления с сопровождающими труп документами. Взятие кадаверной кожи осуществляли при помощи электродерматома толщиной около 0,3 мм в условиях перевязочной, с соблюдением правил асептики и антисептики.

В основном в качестве доноров использовались пострадавшие с тяжелой сочетанной травмой - 47%. Интервал времени с момента летального исхода до забора кожного трансплантата составил 12,4+2,7 часа. Обусловлен оформлением необходимых документов (посмертный эпикриз, сопроводительные документы и т.д.) и временем, необходимым для доставки трупа на специальном транспорте из лечебного учреждения в патологоанатомическое (судебно-медицинское) отделение. Всего было заготовлено около 22000 см2 аллогенной кожи от 21 донора. С одного донора осуществлялся забор от 500 до 1500 см2 аллокожи. Срок хранения - до 10 суток. Он был связан с необходимостью получить и оценить результаты вскрытия донора, данные анализов, а также максимальным сроком хранения жизнеспособной кожи при использованном температурном режиме хранения -180С. Размораживание закрытых флаконов с криоконсервированной кожей производили в водяной бане или под проточной водой при температуре +380С…+420С до полного исчезновения кристаллов льда непосредственно перед проведением трансплантации.

«Живой эквивалент кожи», информация о методе. Трансплантат представляет собой многокомпонентную трехмерную структуру. Характеристики и биологические свойства живого эквивалента кожи максимально приближены к характеристикам и свойствам живой ткани, это дает возможность использовать его в качестве заместителя утраченных полнослойных дефектов кожи. Восстановление целостности кожного покрова происходит за счет его приживления после трансплантации, стимуляции репаративных процессов в ране и формирования в месте трансплантации эпидермального и дермального слоев кожи.

Источником для получения постнатальных кератиноцитов и фибробластов человека служит кожа, получаемая в ходе пластических операций. С целью обеспечения биологической безопасности доноры исходного материала подвергаются тестированию на ВИЧ, сифилис, гепатиты В и С. Культивирование клеток и приготовление живого эквивалента кожи производится в стерильных условиях лабораторного бокса. Трансплантат поставляется в чашках Петри диаметром 9 см в стерильной упаковке. Транспортировка осуществляется в термоизолирующих контейнерах. Возможные сроки хранения составляют 48 часов в термостате при температуре от +26 до +370С. Живой эквивалент кожи (ЖЭК) представляет собой гелеобразную субстанцию розового цвета, включающую синтетическую сетчатую основу (Рис. 1.)



Рис. 1. Схема живого эквивалента кожи

Критерии готовности раневой поверхности - аналогичны требованиям, предъявляемым к раневой поверхности перед аутодермопластикой. Первая перевязка после трансплантации осуществляется на 5-е сутки после трансплантации. При промокании повязки гнойным отделяемым перевязка производится немедленно. При отсутствии признаков инфекционных раневых осложнений последующие перевязки производятся на 5-е сутки от предыдущей. При необходимости выполняется повторная трансплантация.

Характеристика клинических групп больных: Для решения поставленных задач был выполнен анализ материалов собственных наблюдений и ретроспективное изучение историй болезней 445 пациентов, находившихся на лечении с 1998 по 2008 гг. в городской клинической больнице №29 «Утоли моя печали»г.Москва и ГКБ г. Мытищи (Московская область).

В зависимости от этиологии заболевания и проводимой тактики лечения было выделено 14 групп больных (7 основных и 7 контрольных), табл. 2.

Больным всех групп проводили лечение в соответствии с основным заболеванием и сопутствующей соматической патологией. Назначались антибиотики широкого спектра действия. В дальнейшем производилась коррекция антибиотикотерапии в соответствии с результатами антибиотикограммы. По показаниям проводили инфузионную терапию, противовоспалительную, общеукрепляющую и иммунотерапию. Назначали физиотерапию, лечебную физкультуру.

Раневой дефект при поступлении в стационар обрабатывали раствором антисептика, некротизированные ткани удаляли механическим путем, накладывали повязки с протеолитическими ферментами, а в дальнейшем мази на водорастворимой основе («Левосин», «Левомеколь»).

Таблица 2

Распределение пациентов по группам.

Использованный метод лечения	Патология/ Травма	Группа пациентов*	Мужчины	Женщины	Ито-го
			Абс	%	Абс	%
Криоконсервированные жизнеспособные аллогенные дермотрансплантаты	Длительно незаживающие раны	I	О	30	52,6	27	47,4	57
			К	30	60	20	40	50
	Трофические язвы	II	О	20	39,2	31	60,8	51
			К	22	44	28	56	50
Криоконсервированные жизнеспособные аутологичные дермотрансплантаты	Травматические отрывы конечностей с дефицитом кожных покровов на пострадавшем сегменте	III	О	15	82,2	2	17,8	17
			К	17	85	3	15	20
	Скальпированные (рвано-ушибленные) раны конечностей	IV	О	12	57,1	9	42,9	21
			К	11	55	9	45	20
	Обширные дефекты кожных покровов	V	О	15	55,6	12	44,4	27
			К	18	60	12	40	30
	Открытые переломы конечностей	VI	О	16	53,3	14	46,7	30
			К	17	56,7	13	43,3	30
Живой эквивалент кожи	Длительно незаживающие раны	VII	О	13	59,1	9	40,9	22
			К	12	60	8	40	20
Итого	Основная	121	О	104	46,3	225
	Контрольная	127	К	93	42,3	220

*О - основная группа, К-контрольная группа

При распределении больных в зависимости от этиологии заболевания в первой группе превалировали длительно незаживающие раны после рожистого воспаления (некротические формы) и выполненной в хирургическом стационаре некрэктомии; они составили 33,3%. Значительную часть - 22,8%, составили пациенты после отморожения дистальных отделов конечностей III-IY степени и выполненной в хирургическом стационаре некрэктомии.

Вторую группу составляли, в основном, трофические язвы, возникшие на фоне варикозного изменения сосудов нижних конечностей, - 47,2%.

Раневые дефекты у пострадавших, лечившихся с использованием криоконсервированных жизнеспособных аутологичных дермотрансплантатов и живого эквивалента кожи (III, IV, V, VI, VII группы), образовались в результате травм. Причинами травм (всего по группам) были дорожно-транспортные происшествия и «рельсовые травмы» - 29,1%, производственные травмы - 24,5%, бытовые травмы - 46,4%.

Как правило, у больных имелись сопутствующие заболевания, чаще всего это были сахарный диабет, сердечная, лёгочная недостаточность, гипотрофия различного происхождения, лимфовенозный стаз в зоне раны любого происхождения, анемия. Всем больным этой группы проведение хирургического лечения было ограничено в связи с высоким операционным риском, неподготовленностью раны к свободной кожной пластике, неадекватностью поведения или отказом больного от оперативного лечения. Длительность существования дефекта в группах больных I, III, IV, V, VI, VII составила до 3 месяцев. Во II группе (с трофическими язвами) - от 3 месяцев до 20 лет.

Микробная обсемененность ран у больных до начала лечения находилась в пределах от 105 до 108 в 1 г ткани. У больных с длительно существующими раневыми дефектами микрофлора была представлена в 59,3 % в виде ассоциаций и в 40,7% - в виде монокультуры. У больных с относительно свежими ранами микрофлора была представлена, в основном, в виде монокультуры 87,5%. Все микроорганизмы отличались высокой антибиотикорезистентностью. Наиболее эффективно применение «Амикацина» - к нему чувствительны 54,4% микроорганизмов высеянных из раневого отделяемого. Применение «Эритромицина» мало оправдано. К нему резистентно 93,3% микроорганизмов, а чувствительных вообще не оказалось.

Для оценки динамики раневого процесса использовали субъективные и объективные критерии. В процессе исследования использовались общепринятые методы обследования: анамнестические данные, осмотр, пальпация, перкуссия, аускультация, методы лабораторного исследования. Для лучшего математического анализа результатов состояние больного оценивалось по системе бальной оценки тяжести состояния SAPS. Для оценки реактивности использовалась методика подсчёта лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) по Я.Я. Кальф-Калифу.

Для морфологического и иммуногистохимического исследования биоптаты, полученные в условиях операционной (перевязочной), доставляли в лабораторию в стерильном, охлажденном (+4?С) физиологическом растворе в течение 2 - 3 часов с момента взятия. Часть полученного материала префиксировали смесью параформальдегида и глютаральдегида по Карновскому и фиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия, заливали в аралдит по стандартной методике и в дальнейшем использовали для изготовления полутонких (1 мкм) срезов, которые окрашивали метиленовым синим - азуром II и основным фуксином.

Другая часть материала, хранившаяся при температуре -70?С, использовалась для приготовления криостатных срезов. Иммуногистохимические реакции проводили на криостатных срезах толщиной 5 мкм, фиксированных охлажденным ацетоном, по стандартному стрептавидин - биотин - пероксидазному методу с использованием моноклональных (“m”) и поликлональных (“p”) первичных антител. Для выявления продуктов реакции использовалась система визуализации HistoStain-Plus (Zymed, USA) с DAB (диаминобензидин) в качестве хромогена. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в эпоксидную смолу. Иммунофлюоресцентное исследование проводилось по аналогичной схеме (непрямой метод), с использованием ФИТЦ для визуализации продуктов реакции. Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов реакций использовались позитивный (внутренний позитивный контроль - поиск положительной реакции в структурах, достоверно содержащих исследуемый антиген) и негативные (А: замещение первичных антител 0,1%-ым BSA (ZyMed, USA) и В: А + исключение из реакции вторичных биотинизированных антител) контроли.

Для регистрации скорости уменьшения раневой поверхности использовали метод, предложенный Л.Н. Поповой (1942).

Измерения рН раневых дефектов проводили на перевязках, сразу после снятия всех слоев повязки и до выполнения любых манипуляций на ране. Измерения производились с использованием универсальной индикаторной бумаги согласно инструкции.

Результаты исследований заносили в специальные учетные карты для группировки и систематизации с последующей обработкой данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в длительно незаживающих ранах и трофических язвах.

Большинство зарубежных исследователей в своей практике пользуются исключительно понятием «длительно незаживающая рана» (в англоязычной литературе: chronic skin wounds, nonhealing chronic wounds, poorly healing wounds). Российские морфологи тоже давно объединили понятия «трофическая язва» и «длительно незаживающая рана», так как эти патологии в аспекте клинических проявлений и процессов происходящих на клеточном и субклеточном уровнях, характеризуются наличием хронического воспаления. Однако исторически сложилось, что для российских клиницистов «трофическая язва» и «длительно незаживающая рана» это разные понятия и основным критерием их деления является временной фактор, по окончании которого длительно незаживающая рана считается трофической язвой. Но здесь нет единого мнения. Некоторые исследователи называют срок 1,5 месяца, другие - 4-6 месяцев. При этом прослеживается тенденция - при употреблении термина «трофическая язва» подразумеваются трофические язвы нижних конечностей на фоне варикозной болезни, а в остальных случаях чаще используется термин «длительно незаживающая рана». Хотя иногда встречается и термин «длительно незаживающая венозная трофическая язва». Можно констатировать, что по настоящее время не определен временной фактор (как наиболее удобный в практике), по окончании которого длительно незаживающая рана считается трофической язвой.

Поэтому с целью изучения особенностей репаративных процессов у больных с различной длительностью существования раневых дефектов эпителиальных тканей был проведен ряд морфологических и иммуногистохимических исследований. Всего было исследовано 112 биоптатов от 29 пациентов, в том числе 89 биоптатов от 23 пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами, составляющих основную группу, и 23 биоптата от 6 пациентов с нормальным заживлением послеоперационных ран, входящих в контрольную группу. В основной группе по нозологическим формам материал распределялся следующим образом: трофические язвы развившиеся на фоне варикозно-расширенных вен нижних конечностей - 14 наблюдений, длительно незаживающие раны развившиеся после некрэктомии, выполненной по поводу отморожения дистальных отделов нижних конечностей III - IV степени - 6, длительно незаживающие раны развившаяся на фоне рожистого воспаления - 3. Биопсии получали в соответствующие сроки: пластика аллодермотрансплантатов (острая операционная рана), затем на 5-е, 10-е и 15-е сутки. Размеры биоптатов и глубина взятия материала обеспечивали получение информативных образцов, содержащих все слои раны и прилежащие ткани. Возраст больных был от 30 до 55 лет.

В результате исследований установлено, что длительно незаживающие раны и трофические язвы, вне зависимости от факторов, обусловивших их развитие, характеризуются стереотипными изменениями со стороны состава воспалительного инфильтрата и внеклеточного матрикса: преобладанием клеток моноцитарно-макрофагального ряда в воспалительном инфильтрате в сочетании с недостаточным количеством Т-хелперов/Т-супрессоров; снижением содержания коллагена III типа, накоплением тенасцина и плазменной формы фибронектина, изменением типичной локализации ламинина, минимальным количеством миофибробластов в области раневого дефекта. Выявлены изменения со стороны медиаторных систем, регулирующих ход воспалительно-репаративной реакции: обнаружены повышенное накопление провоспалительных цитокинов (IL-1, MIP-1/MIP-1) и нарушение их нормального соотношения, отсутствие фиброгенных факторов роста (TGF-1, bFGF) в сочетании с повышенной активностью матриксной металлопротеиназы - 9 в области раны. Все это препятствует репарации, создавая самоподдерживающуюся систему, функционирующую по принципу «порочного круга».

Установлено, что данные изменения становятся выраженными в раневых дефектах эпителиальных тканей, существующих более 3 месяцев. Данный интервал времени целесообразно использовать для разделения определений «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва». Это позволит упорядочить данные исследований, уточнить статистические данные, наметить оптимальную тактику в лечении пациентов.

Результаты использования криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов.

Для пациентов с длительно незаживающими ранами применение криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов оказалось эффективным. В начале лечения тяжесть состояния по шкале SAPS больных в I основной группе оценивалась в 2,3+0,5 балла, на 3 сутки была оценена в 2,1+0,6 балла. Клиническое состояние больных зависело от сроков временного приживления аллодермотрансплантата. В I основной группе отмечен период относительного ухудшения состояния на 8-11 сутки после выполнения аллодермотрансплантации, который связан с частичным лизисом аллодермотрансплантатов. В дальнейшем происходила постепенная стабилизация состояния, связанная с уменьшением раневых потерь, снижением интоксикации. На это указывает также то, что в контрольной группе такие изменения менее выражены. При исследовании динамики лейкоцитарного индекса интоксикации установлено, что в начале лечения этот показатель составлял 2,9+0,9. В I основной группе на третьи сутки после выполнения пластики этот показатель снижался до 2,0+0,8, а минимальные значения отмечены на 7 сутки - до 1,6+0,5.

В случае применения криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов уже на первой перевязке отмечали достоверный сдвиг рН до 6,7+0,3, сохранявшийся до эпителизации раны (в начале лечения рН составил 7,8+0,4). Также отмечали значительное уменьшение гиперемии, отека конечности. При проведении стандартной консервативной терапии наблюдали плавный сдвиг рН до 7,4+0,4 к концу 4 недели, независимо от этиологии заболевания. Вероятно, изменение кислотно-щелочного состояния в сторону незначительного ацидоза более благоприятно для течения репаративных процессов.

Интересными являются результаты примененния жизнеспособных криоконсервированных аллодермотрансплантатов у 5 больных со скальпированными инфицированными ранами на фоне гормонозависимой бронхиальной астмы, если учитывать выраженные изменения кожи при длительном приеме гормональных препаратов (“пергаментная кожа”) и связанные с этим сложности при проведении аутодермопластики. У данных больных наступило временное клиническое приживление жизнеспособных криоконсервированных аллодермотрансплантатов. Закрытие ран наступило за счет выраженной краевой эпителизации и постепенного замещения аллодермотрансплантатов собственной кожей. Вероятно, это связанно с выраженными изменениями иммунного статуса у таких больных.

В ряде случаев у пострадавших с обширными раневыми дефектами после стабилизации их состояния и при готовности раны выполнялась свободная кожная пластика расщеплённым кожным лоскутом.

Интенсивность уменьшения площади раневой поверхности в I основной группе составила 3,4+0,4 % в сутки (отмечались колебания от 1,1% до 6,4%). У больных I контрольной группы эпителизация была выражена хуже, и сокращение площади раневой поверхности составило около 1,3+0,2 % в сутки в начале лечения и увеличивалось до 1,7+0,2 % в сутки через 3-4 недели.

У большинства больных I основной группы к концу 4 недели наступило заживление (16,7%) или значительное уменьшение раневых дефектов (41,7%). У больных I контрольной группы репаративные процессы протекали значительно медленнее. Через 4 недели размеры ран сократились менее чем на 40%. У 20% пациентов полной эпителизации не наступило и в более поздние сроки. Первоначальная площадь длительно незаживающих ран составила в I основной группе 33,0+3,5 см2, в I контрольной - 35,5+3,6 см2.

В I основной группе 39 больным (68,4%) производили однократную пластику жизнеспособных криоконсервированных аллодермотрансплантатов, после чего отмечали выраженную краевую эпителизацию, значительное уменьшение болей и отека, прогрессивное уменьшение размеров дефекта. Десяти больным (17,5%) аллодермопластику выполняли дважды, а 8 (14,1%) - трижды.

Для пациентов с трофическими язвами применение криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов также оказалось эффективным. Но у больных с трофическими язвами чаще наступал первичный лизис аллодермотрансплантатов. Большинству больных (66,7%) производилась многократная пластика криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов. Как правило, чем длительнее существовал дефект и (или) чем больше была площадь дефекта, тем больше требовалось повторных наложений аллодермотрансплантатов. Двукратную пластику производили у 41,2% пациентов, трехкратную - у 11,8%, четырехкратную - у 13,7% больных. В среднем приходилось 2,1 аллодермотрансплантации на одного больного. При повторных аллодермотрансплантациях происходило или неравномерное отторжение трансплантата, протекающего по типу растянутого некробиоза (70,3% от числа повторных трансплантаций), или временное клиническое приживление кожи с последующим ее отторжением в различные сроки (29,7%). Аллодермотрансплантаты были жизнеспособными и фиксированными на ране от 3 дней до 6 недель и более. Но уже после первой пластики аллодермотрансплантата отмечалась выраженная положительная динамика, появлялась краевая эпителизация, происходило значительное уменьшение болей и отека, уменьшение размеров дефекта.

При сравнительной клинической оценке лучшие результаты получены у больных, в местном лечении которых использовались криоконсервированные жизнеспособные аллодермотрансплантаты. В начале лечения тяжесть состояния больных по шкале SAPS во II основной группе оценивалась в 2,4+0,5 балла, на 3 сутки была оценена в 2,2+0,6 балла. Однако положительная динамика изменения показателей по шкале SAPS у больных II группы в целом менее выражена, чем у пациентов I группы. Вероятно, это связанно с длительностью существования процесса и менее выраженным эффектом от лечения. Также необходимо учитывать особенность начисления баллов в шкале SAPS за возраст и сопутствующую патологию.

При исследовании динамики лейкоцитарного индекса интоксикации установлено, что в начале лечения этот показатель составлял 3,1+0,9. Но в дальнейшем динамика изменения во II основной и II контрольной группах принципиально не различалась, плавно снижаясь в процессе лечения до 2,1+0,5 к исходу второй недели. Данные показатели так же напрямую связаны с длительностью существования раневого дефекта. Изменения в состоянии ран при использовании данного метода соотносятся с другими клиническими данными. Репаративные процессы, по сравнению с пациентами I группы менее выражены.

У больных с трофическими язвами в области раневого дефекта наблюдались явления алколоза, более выраженные, чем у больных с длительно незаживающими ранами. В начале лечения рН ран составлял, в среднем, 7,9+0,4. При проведении стандартной консервативной терапии наблюдалось плавное снижение рН до 7,6+0,3 к исходу 4 недели лечения. В случае применения жизнеспособных кожных аллотрансплантатов уже на первой перевязке отмечалось достоверное уменьшение рН до 6,7+0,3. Также больные отмечали значительное улучшение самочувствия, уменьшение болей.

Необходимо более подробно остановиться на особенностях репаративных процессов в трофических язвах в зависимости от этиологии заболевания. В группе превалировали пациенты с трофическими язвами, возникшими на фоне варикозного изменения сосудов нижних конечностей - 47,2%. Оставшиеся 52,8% составили пациенты с трофическими язвами на фоне эндартериита, облитерирующего атеросклероза, диабетической ангиопатии нижних конечностей, системной красной волчанки.

Так у большинства пациентов с трофическими язвами, обусловленными хронической венозной недостаточностью, был выраженный эффект уже после первой аллодермотрансплантации. Отмечалась выраженная краевая эпителизация, а также «проявлялись» оставшиеся островки эпидермиса (от глубоких придатков кожи) пациентов в проекции раневого дефекта с последующим выраженным увеличением островков в размерах. За счет этого было прогрессивное уменьшение размеров раневого дефекта, интенсивность уменьшения площади раневой поверхности составила в среднем 3,4+0,6% в сутки, что близко к нормальным значениям. Также происходило значительное уменьшение болей и отека, количества отделяемого. Учитывая выраженное снижение болевого синдрома, проводили компрессию пораженной конечности эластичным бинтом и более раннюю активизацию больных, что так же способствовало лечению. Во II основной группе незначительная положительная динамика на проводимое лечение была только у одного больного с трофическими язвами на фоне варикозной болезни нижних конечностей, хотя пластика аллодермотрансплантатов производилась трижды.

При лечении больных с трофическими язвами другой этиологии интенсивность эпителизации была ниже. Уменьшение площади раневой поверхности за сутки составило, в среднем, для больных с трофическими язвами на фоне облитерирующего атеросклероза 1,2+0,2%, эндартериита нижних конечностей - 1,9+0,3%, диабетической ангиопатии - 2,3+0,3%. Для всей второй основной группы (вместе с трофическими язвами, обусловленными хронической венозной недостаточностью) скорость уменьшения площади раневой поверхности составила 2,9+0,8% в сутки.

У 3 пациентов с трофическими язвами на фоне системной красной волчанки, несмотря на проводимое лечение, не отмечалось никакой положительной динамики. Сохранялись гиперемия, боль, характер и объём отделяемого. Изменение рН не происходило или оно было незначительным и кратковременным до лизиса аллодермотрансплантатов, который происходил на 2-3 сутки. Повторные аллодермопластики также эффекта не имели. Вероятно, это связанно с особенностями патологического процесса. Во всех остальных случаях у больных основной группы отмечалась выраженная положительная динамика. К концу 4 недели наступило заживление у 21,6% больных, значительное уменьшение размеров раневых дефектов - у 47,1%.

У больных II контрольной группы репаративные процессы шли медленнее, эпителизация была хуже. Процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки составил от 1,2+0,1% в начале лечения до 1,6+0,1% - к концу 4 недели. К этому времени наступило заживление лишь у 4 % больных, значительное уменьшение размеров раневых дефектов - у 22 %., у 44% пациентов размеры ран сократились менее чем на 30%. У 50% пациентов полной эпителизации язвы не наступило и в более поздние сроки, рис. 2. Первоначальная площадь трофических язв составила во II основной группе 41,8+8,4 см, во II контрольной - 47,9+7,2 см.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Динамика сокращения площади трофических язв после пластики криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов (% от начальной площади раны).

Анализ исходов аллодермопластики как для больных с длительно незаживающими ранами, так и для больных с трофическими язвами позволяет выделить четыре её основных варианта:

· Временное клиническое приживление аллогенной кожи с последующим постепенным замещением аутокожей - у 8,8% пациентов.

· Временное клиническое приживление аллодермотрансплантатов с последующим их отторжением в различные сроки. (Аллодермотрансплантаты сначала приживаются на раневой поверхности почти как собственная кожа. На 3-4 день в пересаженную кожу врастают капилляры. Трансплантат плотно прикрепляется к ране и приобретает физиологическую окраску. Нередко обнаруживается краевая эпителизация. Однако, затем проросшие капилляры постепенно тромбируются. Пересаженная кожа лишается питания и через разные сроки постепенно отторгается.) - 49,1%.

· Неравномерное отторжение аллодермотрансплантата, протекающего по типу растянутого некробиоза (чаще всего вначале отторгается эпидермис, а глубокие слои дермы еще продолжительное время остаются на поверхности раны в виде тонкой белесоватой не снимаемой пленки) - 33,3%.

· Первичный лизис кожного лоскута, сопровождающийся острым нагноением в результате нежизнеспособности аллодермотрансплантата, либо неблагоприятного состояния раны - 8,8%.

Варианты исходов аллодермопластики зависят от степени подготовки раны, бактериальной загрязненности раны, исходной жизнеспособности аллодермотрансплантата, режимов и сроков хранения дермотрансплантата, общего состояния больного, а также этиологии заболевания и сопутствующей патологии. Достоверного различия в сроках приживления криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов к ране при сравнительном анализе в зависимости от совпадений групп крови и резус-фактора донора и реципиента не выявлено.

Проведенные морфологические и иммуногистохимические исследования процессов, происходящих в длительно незаживающих ранах и трофических язвах после закрытия криоконсервированными жизнеспособными аллодермотрансплантатами на различных сроках после начала лечения и сопоставление полученных данных с результатами исследования нормально заживающих ран в аналогичные периоды времени наглядно продемонстрировало различия в ходе репаративных процессов, таблица 3.

Таблица 3

Распределение компонентов внеклеточного матрикса, миофибробластов и моноцитов/макрофагов, экспрессия факторов роста, провоспалительных цитокинов, MMP-9 и TIMP-1/TIMP-2 в трофических язвах до начала лечения и на 5-е, 10-е и 15-е сутки после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов.

Иммуногистохимические маркеры	До трансплантации	После трансплантации
		5-е сутки	10-е сутки	15-е сутки
Коллаген I типа	++	++	++	++
Коллаген III типа	-/+	+	++	++
Ламинин	++	++	+	+
Тенасцин	+++	++	+	-/+
CD68+ клетки	+++	++	++	+
бSMA+ клетки	+	+	+	+
bFGF	-/+	++	++	++
TGF-в	-	++	+ / ++	+
IL-1в	+++	++	+	+
MIP-1б	-/+	+	+	-/+
MIP-1в	++	+	+	-/+
MMP-9	++	+	+	+
TIMP-1	- / -/+	-/+	+	+
TIMP-2	- / -/+	-/+	+	+

Критерии оценки:

« - » - реакция отсутствует,

« -/+ » - слабоположительная реакция,

« + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции.

Установлено, что использование криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов для закрытия ран активизирует процессы ремоделирования внеклеточного матрикса в области дефекта. Репарация в длительно незаживающих ранах и трофических язвах активизируется после закрытия ран криоконсервированными жизнеспособными аллодермотрансплантатами и характеризуется нормализацией состава внеклеточного матрикса: повышением содержания коллагена III типа, снижением аккумуляции тенасцина и плазменной формы фибронектина в строме, восстановлением баланса в экспрессии ММР-9 и ингибиторов матриксных металлопротеиназ; увеличением продукции фиброгенных факторов роста (TGF-в1, bFGF) и уменьшением экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-1в, MIP-1б/MIP-1в). В зоне контакта трансплантата и подлежащего матрикса формируется провизиональная базальная мембрана, необходимая для восстановления эпителиального покрова. Характерной особенностью репарации в длительно незаживающих ранах и трофических язвах является минимальное количество миофибробластов в течение всего периода репаративной регенерации, обусловливающее отсутствие контракции раневого дефекта и формирование рубцовой ткани.

...