Обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников

3

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

14.00.14 - онкология

Обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников

Антонеева Инна Ивановна

Уфа - 2009



Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет Федерального агентства по образованию».

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Максимов Сергей Янович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Орлова Рашида Вахидовна

доктор медицинских наук, профессор Урманчеева Адель Федоровна;

доктор медицинских наук Пушкарев Василий Александрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ученый секретарь диссертационного совета И.Р. Рахматуллина



1. Общая характеристика работы

метаболический атипизм опухолевый клетка

Актуальность проблемы.

Рак яичников - пятая по частоте причина смерти от злокачественных новообразований среди женщин и наиболее частая причина смерти у всех больных с опухолями женских половых органов (Новикова Е.Г. с соавт., 2003; Jemal A.et al., 2007; Parkin D.M. et al., 2002.). Согласно данным, опубликованным в Eurocare-3 Studu, пятилетняя выживаемость больных раком яичников не превышает 29 - 30% ( Sant M. et al., 2003). По данным Jemal A. c cоавт. (2007) эта цифра, несмотря на успехи хирургии и химиотерапии, остановилась на уровне 45%. Ежегодно в России регистрируется 11,7 тысяч злокачественных новообразований яичников и 7,3 тыс. летальных исходов из них (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2006; Мерабишвили В.М., 2004). Низкая выживаемость при раке яичников - следствие поздней диагностики. На сегодня в 70% случаев диагносцируется распространенная стадия заболевания (Урманчеева А.Ф., 2002; Charles N. et al., 2008; Kurian A.W. et al, 2005). Подобная ситуация будет сохраняться при одновременном возрастании показателей смертности, в связи с чем данная проблема приобретает также и социальное значение (Awada A., Klastersky J., 2004).

Основными причинами неэффективности усилий по улучшению отдаленных результатов лечения больных раком яичников являются отсутствие четких представлений об этиологии и патогенезе, патогномоничных симптомах для различных стадий заболевания, а также низкая эффективность лечения при III-IV стадиях (Жорданиа К.И., 2002; Паниченко И.В. с соавт., 2004). Расширение исследований в области биологии опухолевого роста при раке яичников может позволить выявить факторы, имеющие практическое значение для понимания патогенетических механизмов развития, метастазирования и рецидивирования опухоли, а также явиться теоретическим обоснованием для введения новых подходов к лечению данного заболевания.

Считается установленным, что необходимым условием роста и развития злокачественной опухоли является перестройка свободнорадикальных процессов в организме (Горожанская Э.Г. с соавт., 2001; Дейчман Г.И., 2000; Лю Б.Н., 2004; Пушкарев В.А., 2007; Франциянц Е.М., 1997; Якубовская Р.И., 2000). Однако в литературе отсутствуют данные о динамике изменения функционального состояния системы ПОЛ-АО при прогрессировании рака яичников и о патогенетической взаимосвязи этой системы с формированием фенотипа неоплазмы на различных клинических стадиях рака яичников.

На сегодня представления о патогенезе онкологических заболеваний, основанные на постулате о чужеродности злокачественного новообразования, уже не являются абсолютными. У онкологических больных показаны дисфункции клеточного звена иммунной системы, в частности, нарушение эффекторной функции Т-лимфоцитов и баланса «проопухолевых», «противоопухолевых» и «регуляторных» цитокинов (Антонов В.Г. с соавт., 2004; Бережная Н.М., 2000; Balkwill F., 2001; Shah C.F. et al., 2008). Врожденный иммунитет, по мнению ряда авторов, играет инструктивную и контролирующую роль в индукции специфического иммунитета (Дейчман Г.И.,2004; Huarte E. et al., 2008; Sengupta S. et al., 2008).

Особый интерес представляет характер влияния взаимодействия опухолевых и иммунных клеток на протекающие в них метаболические процессы (Инжеваткин Е.В. с соавт., 2007). К основным свойствам всех злокачественных опухолей относят повышенную способность к пролиферации и утрату способности к апоптотической гибели (Копнин Б.П., 2006; Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002). Последнее, с одной стороны, способствует прогрессированию опухолевого процесса, а с другой - может стать причиной множественной лекарственной устойчивости (Абраменко И.В., Фильченков А.А., 2003). В связи с этим в последнее время уделяется большое внимание изучению молекулярных маркеров, характеризующих апоптоз и пролиферацию при различных злокачественных новообразованиях (Пожарисский К.М., Леенман Е.Н., 2000; Полушкина И.Н., 2002). Ведущую роль в развитии апоптоза и регуляции клеточной пролиферации играет природный тип гена-онкосупрессора Wt p53 и кодируемый им ядерный белок р53 (Копнин Б.П., 2000). В значительной части злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме 17 в области локализации гена-супрессора р53 (Копнин Б.П., 2004; Soussi T. et al., 2000).

Одним из основных компонентов системы защиты клетки против факторов, вызывающих апоптоз, является Всl-2, который ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути.

Таким образом, биологический портрет опухоли и установление его патогенетических взаимосвязей с иммунным, цитокиновым и метаболическим статусом организма на различных этапах прогрессирования неоплазмы позволит обосновать новые принципы диагностики степени распространения неоплазии и прогнозирования течения заболевания, а также оценить предполагаемую эффективность планируемой терапии.

Цель исследования

Обоснование и совершенствование диагностики прогрессирующего рака яичников на основе оценки взаимосвязи локальных морфофункциональных и метаболических сдвигов в зоне первичной опухоли с системными расстройствами иммунного, цитокинового и метаболического статуса.

Задачи исследования

По данным современной мировой литературы и данным медико-статистических показателей, отражающих заболеваемость и смертность и т.д., обосновать необходимость проведения исследования, касающегося прогрессирующего рака яичников, на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

Ретроспективно оценить значимость общепринятых диагностических методов обследования больных раком яичников для определения степени распространения злокачественного процесса.

Установить корреляционную связь между морфологическим и функциональным атипизмом опухолевых клеток, характером экспрессии иммуногистохимических онкомаркеров, степенью пролиферативной активности в паренхиме первичной опухоли со стадией рака яичников.

Изучить закономерности связей изменений ангиогенеза, морфо-функционального состояния микроциркуляторного русла, интенсивности развития некроза в паренхиме первичной опухоли рака яичников с характером метаболических сдвигов, в частности, активностью окислительно-восстановительных реакций и антирадикальной защиты клеток в зоне опухоли, а также в системном кровотоке и с изменением уровня цитокинов в крови в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

Изучить патогенетическую значимость недостаточности неспецифических механизмов резистентности, связанной с количественным и качественным изменением нейтрофилов, а также характер и механизмы нарушения специфического клеточного звена иммунитета, обеспечиваемого Т-системой лимфоцитов и NK-клетками в динамике прогрессирующих форм рака яичников.

Установить взаимосвязь интенсивности экспрессии маркеров апоптоза лимфоцитов, а также дифференцировочных и активационных маркеров (CD₃, CD₄, CD₈, CD₁₆, CD₂₅, HLA-DR, CD₇₁, CD₉₅) лимфоцитов крови со стадией распространения опухолевого процесса.

Выявить новые диагноститеческие критерии прогрессирующего рака яичников. Создать алгоритм диагностики прогрессирующего течения заболевания в соответствии с установлением патогенетической взаимосвязи морфо-функциональных и метаболических сдвигов в зоне первичной опухоли, системных расстройств иммунного, цитокинового и метаболического статуса со стадией распространения опухолевого процесса.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом ИМЭиФК УлГУ «Патогенетические аспекты прогрессирования неоплазмы», номер горегистрации: 01200803757.

Научная новизна

На основании результатов клинико-лабораторных, биохимических, патоморфологических, иммунологических методов исследования впервые проведена сравнительная оценка характера и механизмов развития неоплазмы и взаимодействия ее с организмом на различных клинических стадиях рака яичников (РЯ).

Впервые показано, что к общим закономерностям нарушения метаболического статуса у больных раком яичников относится локальное (в зоне неоплазии) и системное изменение функционального состояния системы ПОЛ-АО, коррелирующее со стадией патологического процесса.

Установлено, что ведущим патогенетическим фактором локальной и системной активации процессов свободнорадикального окисления является избыточное ПОЛ в опухолевых клетках, возникающее вследствие фактической гипероксии, связанной с нарушением митохондриального дыхания в неоплазме и усиливающееся в процессе прогрессирования РЯ. Динамика антиоксидантных ферментов при этом свидетельствует о возможности отбора вариантов опухолевых клеток, характеризующихся повышенным уровнем антиоксидантной активности.

Активация процессов липопероксидации сопровождается повышенной экспрессией протоонкогена bcl-2, что приводит к дальнейшему снижению скорости митохондриального дыхания, возрастанию рО₂, усилению метастатического потенциала опухолевых клеток при прогрессировании РЯ.

Установлено, что при прогрессировании РЯ увеличивается количество атипических эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих mt р53, что позволяет предполагать как нарастание мутаций гена р53 в процессе прогрессирования первичной опухоли, так и отбор р53+ опухолевых клеток, обеспечивающих более агрессивное течение. При этом впервые показана корреляция усиления экспрессии mp53 с активацией неоангиогенеза в первичном опухолевом узле при прогрессировании РЯ.

Показано, что пролиферативная активность клеток овариального рака неодинакова на различных клинических стадиях заболевания. В группе раков яичников на III клинической стадии показатели экспрессии PCNA, Ki-67 и МИ достоверно и существенно превышали таковые в группе на I и II клинических стадиях и продолжали возрастать на IV клинической стадии заболевания, что позволяет предполагать в процессе прогрессирования РЯ появление клонов с высокой пролиферативной активностью. Одновременно имеет место снижение уровня инфильтрации первичного опухолевого узла. При этом снижение количества лимфоидных клеток в инфильтрате сопровождается уменьшением относительного количества плазматических клеток при нарастании числа макрофагов. Таким образом, показано, что лимфоидно-клеточная инфильтрация при раковых опухолях яичников весьма слабо выражена.

При оценке компонентов неспецифического естественного иммунитета показано существенное повышение содержания Нф периферической крови больных РЯ, нарастающее в динамике прогрессирования опухоли. Однако, на фоне увеличения абсолютного фагоцитарного индекса и абсолютного фагоцитарного числа имеет место снижение внутрилейкоцитарных катионных белков и уровня активности МПО - основных факторов, необходимых для завершенного фагоцитоза.

При оценке количества NK в периферической крови показано его возрастание при прогрессировании РЯ. Предполагается, что подобная динамика показателей естественной противоопухолевой защиты может свидетельствовать как о селекции резистентных к ней вариантов раковых клеток, так и о влиянии опухоли на дифференцировку предшественников и функциональное состояние эффекторных клеток.

Впервые показана динамика дифференцировочных и активационных маркеров лимфоцитов периферической крови, а также повышенная их чувствительность к спонтанному и индуцированному апоптозу, нарастающая в процессе развития неоплазмы.

Установлено, что в процессе прогрессирования РЯ неоплазма интегрируется в основные гомеостатические процессы макроорганизма благодаря использованию региональных и системных функций цитокинов. При этом ключевая роль принадлежит цитокинам с системными эффектами - IL-1, TNF-б и IFN-г. Существенными для усиления биологического потенциала опухоли являются такие эффекты этих цитокинов, как стимулирование пролиферации опухолевых клеток и образования сосудов в зоне опухолевого роста.

Практическая ценность работы

Углубление существующих представлений о характере и механизмах развития системных метаболических расстройств на различных клинических стадиях РЯ, установление патогенетической взаимосвязи нарушений метаболического, иммунного, цитокинового статуса и клеточного состава периферической крови со степенью распространения неоплазии позволило рекомендовать новые дополнительные диагностические критерии, которые могут быть использованы для адекватного стадирования и разработки схем терапии РЯ на различных клинических стадиях заболевания.

Применение кластерного анализа, где в качестве признака таксономии использовалась клиническая стадия заболевания по FIGO при прогрессировании РЯ, при оценке рутинных биохимических показателей крови позволило показать наличие 2-х стадий процесса изменения биохимической картины сыворотки крови. При этом стадии различны для больных, находящихся в репродуктивном периоде и в постменопаузе. Если у больных, находящихся в репродуктивном периоде 1-ая группа соответствует 1-ой клинической стадии по FIGO, а 2-ая группа включает больных, находящихся на II, III и IV клинической стадиях, то у больных, находящихся в постменопаузе, изменения биохимической картины крови происходят позже: 1-ая группа включает больных на I и II-ой стадиях заболевания, а вторая - больных, находящихся на III и IV стадиях заболевания. Полученные данные могут быть использованы при оценке результатов рутинных биохимических исследований крови больных РЯ.

Результаты исследования позволяют учитывать такие факторы внешней среды, как наличие геопатогенных зон, захоронений радиоактивных отходов и Чернобыльского следа в оценке заболеваемости РЯ и планировании профилактических мероприятий.

В диссертационном исследовании впервые рекомендован алгоритм диагностики паранеопластических сдвигов на II-ой, III-ей и IV-ой стадиях заболевания по FIGO.

В качестве объективных критериев оценки паранеопластических расстройств на различных клинических стадиях РЯ рекомендован мониторинг содержания в плазме крови МДА, каталазы, ГР и КБ, МПО и ФЧ в Нф периферической крови.

Использование специально разработанной методом аппроксимации нелинейных функций формулы на основании ряда лабораторных показателей периферической крови позволит ориентировочно оценить I-II, III и IV стадии заболевания РЯ по FIGO.

Результаты исследования могут быть использованы в процессе преподавания патофизиологии, патанатомии, онкологии и клинической фармакологии при подготовке врачей, аспирантов и клинических ординаторов соответствующих специальностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

Данные современной литературы и результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о необходимости углублённого изучения проблем, касающихся прогрессирующего РЯ на территории крупного промышленного региона (Ульяновская область).

Повышение пролиферативной активности ткани первичного опухолевого узла при низком уровне некротизирования на фоне значимого повышения уровня Bcl-2 и mt p53 в динамике прогрессирования определяет высокий злокачественный потенциал РЯ.

Неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ характеризуется снижением интенсивности митохондриального дыхания, приводящего на фоне фиктивной гипоксии к фактической гипероксии, что сопровождается увеличением АФК, элиминация которых затруднена. В результате дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно возрастает на I-ой клинической стадии заболевания, сохраняется на уровне канцерогенеза на II-ой и III-ей стадиях, не достигая при этом уровня апоптоза и возвращается к уровню пролиферации (окислительного митогенеза) на IV-ой клинической стадии заболевания. При этом поддерживается высокий уровень кровоснабжения неоплазмы за счет возрастающих объема и плотности сосудов с дефектной или полностью отсутствующей сосудистой стенкой.

В динамике прогрессирования РЯ изменяется количество и функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. На фоне снижения общего количества лейкоцитов увеличивается количество Нф, АФИ и АФЧ, но при этом статистически значимо снижается количество КБ и активность МПО в Нф, что свидетельствует о снижении способности к завершенному фагоцитозу.

У больных РЯ на фоне снижения общего количества Лф происходят значительные сдвиги в экспрессии на них как дифференцировочных, так и активационных маркеров, коррелирующие с клинической стадией заболевания. При этом имеет место снижение CD₃⁺ и CD₄⁺ лимфоцитов, увеличение CD₈⁺, CD₁₆⁺, CD₂₅⁺, CD₇₁⁺ и CD₉₅⁺, свидетельствующее, как об активации и усилении пролиферации Лф, так и об усилении апоптоза лимфоидных клеток периферической крови. Последнее может быть связанно с «гиперреактивностью» их митохондрий, нарастающей в динамике прогрессирования опухоли.

Развитие РЯ закономерно сочетается с паранеопластическими расстройствами в виде изменения уровня функционирования системы ПОЛ-АО в плазме и эритроцитах, нарушения иммунного и цитокинового статуса, сдвигом клеточного состава периферической крови, коррелирующих со степенью распространения неоплазии.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), I Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкогинекологии» (Ростов-на-Дону, 2005), III Ассамблеи «Врач-провизор-пациент» (Санкт-Петербург, 2005), Международном конгрессе «Иммунитет и болезнь» («Immune-mediated Diseases. From Theory to Yherapy») (Москва, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (МАПО, Санкт-Петербург, 2006), VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006), XX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2007), 16^th International conference “AIDS, Cancer and Public Health” (St. Petersburg 2007), Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепция болезней цивилизации» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Паллиативная медицина. Вчера. Сегодня. Завтра» (Москва, 2008), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008), на совместном заседании сотрудников кафедр лучевой диагностики, лучевой терапии и онкологии; госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии и ортопедии; факультетской терапии; физиологии и патофизиологии; педиатрии; семейной медицины; общественного здоровья, здравоохранения и общей гигиены; общей биологии Ульяновского государственного университета (г. Ульяновск, 2009), на заседании кафедры онкологии с курсом ИПО Башкирского государственного медицинского университета (г. Уфа, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 91 печатная работа, из них 24 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 монографии.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав собственных данных, заключения, выводов, и библиографического списка, который включает в себя 181 отечественных и 269 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 107 рисунками.

Материал и методы исследования

Настоящая работа выполнена на базе кафедр онкологии, физиологии и патофизиологии ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», Ульяновского областного клинического онкологического диспансера.

Материалом для диссертационного исследования послужили данные о 404 больных раком яичников, 36 больных раком тела матки и 24 больных с миомой матки, лечившихся в Ульяновском областном онкологическом диспансере в 1998-2007 гг.

Распределение больных по группам проведено в зависимости от клинической стадии заболевания в соответствии с классификацией FIGO. К первой группе были отнесены больные с I-ой стадией РЯ - 70 человек; ко 2-ой группе - 41 больная со II стадией РЯ, к 3-ей группе - 162 больных с III стадией РЯ и 131 больная с IV стадией РЯ была отнесена к 4-ой группе. В качестве активного контроля были использованы результаты обследования 36 больных раком тела матки, находящиеся в I-III клинических стадиях заболевания.

При постановке диагноза, оценке степени распространения опухолевого процесса и характера неоплазии, а также в целях рандомизации обследуемых групп больных были использованы традиционные методы обследования; диагностика РЯ проводилась путем комплексного обследования больных, которое включало в себя бимануальное и ректовагинальное исследование, ультразвуковую томографию органов брюшной полости, малого таза и забрюшинного пространства, определение уровня опухольассоциированного маркера CA-125 в сыворотке крови, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, желудка и толстой кишки, цитологическое и гистологическое исследование материала. Обследование и лечение, а также оценка результатов проводилась в соответствии с принятыми методиками и программами, согласно стандартам ВОЗ.

В качестве критериев оценки метаболического статуса в плазме крови, эритроцитах и гомогенатах яичников определяли содержание малонового диальдегида (МДА) в тесте тиобарбитуровой кислоты (Андреева Л.И., 1989), активность каталазы (Карпищенко А.И., 1999), глутатионредуктазы (ГР) (Асатиани В.С., 1969) и супероксиддисмутазы (СОД) (Дубинина М.И., 1988). В гомогенате определяли также активность цитохромоксидазы (ЦХО) по Vernon (цит. по Овезмурадовой, 1964) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (цит. по Т.П. Генинг, 1980).

Для оценки функционального состояния нейтрофилов (Нф) использовали цитохимические методы исследования. В клетках, выделенных из венозной крови, определяли активность миелопероксидазы (МПО) (по Тодорову И., 1963); содержание катионных белков (КБ) (Шубич М.Г., 1974); пробу с восстановлением нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном и стимулированном опсонизированными частицами зимозана вариантах теста проводили по А.А. Быковой (2003). Поглотительную способность Нф определяли с использованием суспензии дрожжей (Пигаревский В.Е., 1978). Рассчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ).

Для оценки клеточного звена иммунитета на лимфоцитах (Лф), выделенных из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте фиколл-верографина (плотность 1,007 г/мл) определяли дифференцировочные и активационные маркеры - CD₃, CD₄, CD₈, CD₁₆, CD₂₇, CD₇₀, CD₉₅ - методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител производства «Сорбент».

Оценку спонтанного и индуцированного апоптоза Лф проводили методом проточной цитофлуориметрии. При этом использовали методы оценки изменений в ядре, в клеточной мембране, изменений величины митохондриального потенциала ДШ_m.

Концентрацию цитокинов: интерлейкин-1 (IL-1), интерферон-гамма (IFN-г) и фактор некроза опухоли (TNF-б) определяли в сыворотке крови методом твердого иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин», г.С-Петербург).

При исследовании оперативно удаленных опухолей яичников проводились морфологические и иммуногистохимические исследования новообразования. При этом проводилось измерение трех размеров, учитывалась локализация и характер роста. Морфометрический анализ ткани опухоли включал:

- исследование паренхимы новообразования;

- исследование стромы новообразования;

- исследование сосудистого русла;

- исследование некрозов;

- исследование лимфоидноклеточной инфильтрации новообразования.

Квантиметрию составляющих опухоли осуществляли в 10 произвольных полях зрения на микроскопе «Reichzt Polivar 2» фирмы «Leika» с план-объективом FJ APO 10х0,30, совмещенным с цифровой видеокамерой JVC разрешением 800х600 пикселей при помощи анализаторов цифрового изображения «Quantiment 500c» («Leika»).

Гистохимические препараты опухолевой ткани окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимические исследования. При оценке пролиферативной активности использовали моноклональные антитела к антигену ядер пролиферирующих клеток PCNA и к негистонному белку Ki-67. Использовали коммерческие антитела фирм Novocastra и Dako. В иммуногистохимической оценке экспрессии mt p53 использовали мышиные моноклональные антитела р53, клон DO-7, Ig G2b (M7001 DakoCytomation) в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 мин. Критерием положительной реакции считалась окраска 10% и более ядер опухолевых клеток. Bcl-2 обнаруживался с помощью моноклональных антител к bcl-2, клон Bcl-2/100/D_5, IgGi (NCL-bcl-2 Novocastra) в разведении 1:80 при инкубации 60 мин. Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10% опухолевых клеток.

Статистическая обработка данных производилась с использованием параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических методов математической статистики (критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса, коэффициент корреляции Спирмена) и регрессионного анализа при помощи компьютерных программ Microsoft Excel и Stata 6.0., а также кластерным анализом, используя компьютерную программу S'-PLUS'-2000.

Результаты исследования и их обсуждение

Статистический анализ заболеваемости раком яичников в Ульяновской области за период 1999-2005 гг. позволил установить следующее.

Динамика заболеваемости раком яичников, равно как и смертности от него в Ульяновской области имеют стабильную и, особенно выраженную для заболеваемости, тенденцию роста. Средний возраст больных на момент установки диагноза колеблется от 51 года до 67 лет. Распределение по возрасту нормальное.

Методическая основа актуариального метода - предположение о дожитии до конца анализируемого i-летнего срока, либо Ѕ от числа выбывших, либо всех этих больных, является неточной и приводит к существенному завышению результатов. В связи с этим в качестве критерия при оценке онкоэпидемиологических данными использовали срок жизни с момента установки диагноза. Было установлено, что срок жизни с момента установки диагноза у больных в Ульяновской области варьирует от 3,3 до 30,2 месяцев. Значимость района проживания при этом не является существенной.

На момент постановки диагноза I-II клинические стадии по FIGO имели 30,3% больных раком яичников; III стадию- 30,2% и IV стадию 39,5%. Достоверно меньшую продолжительность жизни с момента установки диагноза имели больные, находящиеся в IV клинической стадии заболевания по сравнению с больными в I, II и III клиническими стадиями, а также больные с III стадией по FIGO по сравнению с больными, в I стадии. Стадия FIGO имеет высокую значимость для прогноза срока жизни с момента установки диагноза. А вот общая эффективность стадирования с использованием классификации TNM обусловлена позицией «М». Значимость критериев «Т» и «N» для прогноза сроков жизни с момента установки диагноза незначительна. При этом сроки жизни с момента установки диагноза слабо коррелируют с возрастом, в котором был установлен диагноз.

В зависимости от гистологической структуры опухоли у больных раком яичников в Ульяновской области за период 1999-2005 гг. 35% были отнесены к серозному гистологическому типу, 28% - к муцинозному, 19%- к эндометриоидному, 16% - к мезонефроидному, 16% - неклассифицируемые и 2% - злокачественная опухоль Бреннера. Процент морфологического подтверждения диагноза в соответствии с международной гистологической классификацией в рассматриваемой группе больных составил 70,4%. Наибольший срок жизни с момента установки диагноза наблюдается у больных с серозным раком, наименьший - у больных с муцинозным раком яичников. Значимость гистотипа опухоли для прогноза срока жизни с момента установки диагноза достаточно высокая.

Показано также, что среди злокачественных эпителиальных опухолей яичников в Ульяновской области высоко-, средне- и низкодифференцированные формы встречаются практически с одинаковой частотой (30,7%, 33,6% и 35,7% соответственно). При этом одновременно со снижением уровня дифференцировки опухоли наблюдается увеличение степени распространения опухолевого процесса. Однако, в целом, значимость дифференцировки для прогноза срока жизни с момента установки диагноза не является существенной.

Среди леченных в Ульяновском областном онкологическом диспансере в период 1999-2005гг. в течение периода наблюдения у 21,9% больных был обнаружен рецидив заболевания, представленный метастазами различной локализации.

В целях выявления факторов риска развития РЯ, в частности возрастного фактора и репродуктивного анамнеза, а также предшествующей или сопутствующей генитальной и экстагенитальной патологии, характера и степени распространения неоплазии яичников, проведен ретроспективный анализ 404 историй болезней и результатов собственных исследований. При изучении возрастной характеристики больных раком яичников, обращала на себя внимание более частая встречаемость заболевания у женщин в возрастной группе 50-69 лет, причем большую часть больных составили пациентки 50-59 лет. В группах младше 30 лет и старше 70 лет количество пациенток составляло соответственно 3 и 4 пациентки.

Анализируя менструальную функцию больных раком яичников, следует отметить, что наибольшее количество больных в изученной группе наблюдалось в постменопаузальном периоде. Именно в этот период возникает выраженный гормональный дисбаланс, подавляется продукция эстрогенов в яичниках, активизируется конверсия андрогенов в эстрогены в жировой ткани, печени. Характер сопутствующей генитальной патологии у больных раком яичников не отличался на различных стадиях заболевания. Наиболее часто, вне зависимости от стадии заболевания, у больных раком яичников диагностировались хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта и сердечнососудистые заболевания.

При изучении характера жалоб пациенток, мы также не обнаружили патогномоничной клинической симптоматики. В большинстве своем больные I-II стадий жалоб не предъявляли (57%), 43% пациенток беспокоили периодические боли, дискомфорт внизу живота. Больные распространенным раком яичников предъявляли жалобы на увеличение живота в объеме, одышку, слабость, затрудненное мочеиспускание и дефекацию.

Всем больным раком яичников было проведено эхографическое исследование гениталий. Однако, ретроспективно сопоставляя результаты УЗИ исследования и данные, полученные при лапаротомии, мы обнаружили расхождение в оценке объема, местоположения, целостности капсулы злокачественного новообразования яичников в 28% случаев, преимущественно у больных со II (16случаев) и III (41случай) стадиями процесса.

У всех больных РЯ оценивали общие и биохимические показатели крови. Результаты изложены в диссертации. Установлено отсутствие статистически значимой разницы этих показателей на различных клинических стадиях заболевания.

Всем больным с подозрением на рак яичников было произведено исследование крови на уровень онкомаркера СА125.

При этом, не выявлено корреляции между уровнем онкомаркера СА125 и стадией злокачественного процесса у первичных больных раком яичников.

Несмотря на обилие разнообразных методов диагностики, основным до сих пор остается гистологическое исследование биоптата яичника, которое может дать точный ответ о характере и структуре опухоли, а, следовательно, определить дальнейшую тактику ведения данной больной, основные методы лечения в применении к конкретному случаю и прогноз.

Таблица 1. Распределение обследуемых больных по гистологическому типу опухоли

Гистотип	Число больных	Из них с соответствующей стадией заболевания
		I-II	III	IV
		Абс. число	%	Абс. число	%	Абс. число	%
Серозная		40	36	47	29	43	32,8
Эндометриоидная		25	22,5	44	27,1	31	23,66
Муцинозная		24	21,6	28	17,2	24	18,3
Светолоклеточная		14	10,6	14	8,6	9	5,5
Неклассифицируемая		7	6,3	25	15,4	23	17,5
Злокачественная опухоль Бреннера		1	0,9	4	2,4	0

Таблица 2. Распределение больных раком яичников по степени дифференцировки опухоли и стадии заболевания

Степень дифференц. опухоли	Число больных	Из них с соответствующей стадией заболевания
		I-II	III	IV
		Абс. число	%	Абс. число	%	Абс. число	%
Высокая	118	49	41,5	52	44,06	17	14,4
Умеренная	133	43	32,3	57	42,8	33	24,8
Низкая	134	15	11,19	52	38,8	67	50
Недиффер.	19	0	-	7	36,8	12	63,2

Из анализа данных таблицы 2 следует, что среди больных ранними стадиями заболевания (I-II) высокодифференцированные формы опухоли составили 41,5%, а низкодифференцированные только 15%.

У больных с далеко зашедшей стадией заболевания (IV), напротив, низкодифференцированные формы существенно преобладали над высокодифференцированными (50% против 11,19%). Следовательно, одновременно со снижением уровня дифференцировки опухоли наблюдается увеличение степени распространения опухолевого процесса.

Таким образом, на основании результатов общепринятых клинико-лабораторных, патоморфологических и инструментальных методов обследования, можно заключить, что значимыми при определении стадии распространения злокачественного процесса в яичниках являются данные о размерах, локализации и гистологического строения опухоли, наличии или отсутствии отдаленных метастазов.

Данные литературы свидетельствуют о том, что «естественная история роста опухоли», которая позволила бы индивидуализировать лечение и повысить его эффективность, остается малоизученной (Моисеенко В.М., 2004). Показано, что существенную роль в определении биологического портрета опухоли играет изучение морфологических параметров, а также маркеров пролиферации и апоптоза в неоплазме первичного опухолевого узла. Морфологический анализ неоплазмы первичного опухолевого узла (результаты представлены в диссертации) позволил установить, что, в целом, большинство раков яичников не соответствует одному гистологическому типу, а содержит смесь папиллярных, крибриформных, гириформных, морулярных образцов роста; обнаруживает смесь светлых, темных и плоских клеток. Ввиду смешанности гистологических типов опухолей определение степени дифференцировки раковых клеток представляет определенную сложность.

Паренхима раковых опухолей яичников составляла большую часть изученных новообразований; средний ее объем без учета сосудов и некрозов составил 68,2%. Несмотря на то, что для опухоли понятие функции не может рассматриваться как эквивалент функции нормальной ткани, способность ее выживать и прогрессивно расти будут определяться в том числе и количеством ее функционально активных клеточных элементов.

На морфологических препаратах по классическим методикам прирост может документироваться изучением митотической активности (рис. 1).

Рис. 1. Митоз раковых клеток яичника (окраска гематоксилин-эозином, микрофото, х1200)

Рис. 2. Высокая активность PCNA в зонах инвазии рака яичника в строму (микрофото, х100)

Рис. 3. Единичные клетки Ki 67+ в недифференцированном раке яичника (микрофото, х600)



Рис. 4. Единичные клетки Bcl-2+ в мелких железах (микрофото, х300)

Рис. 5. Ki 67 в клетках мелких желез эндометриоидного рака яичника (микрофото, х300)

Рис. 6. Массивный некроз с захватом, как стромы, так и паренхимы опухоли при раке яичников (окраска гематоксилин-эозином, микрофото, х100)



Рис. 7. Высокая активность Кi 67 в зонах инвазии рака яичника в строму (микрофото, х100)

Рис. 8. Высокая интенсивность PCNA в папиллярных отделах эндометриоидного рака яичника (микрофото, х300)

Рис. 9. 100% активность PCNA в железах рака яичника (микрофото, х100)

С помощью современных методов иммуногистохимии эти параметры еще более точно определяются путем применения маркеров PCNA и Ki 67. Оба маркера относятся к нуклеарным и обнаруживаются в ядрах исследуемых клеток. Результаты оценки этих показателей в ткани первичного опухолевого узла на различных клинических стадиях РЯ представлены на рис. 10.

Рис. 10. Гистограмма пролиферативной активности раковых клеток в раковых опухолях яичников на различных клинических стадиях заболевания

Исследование некрозов в раковых опухолях яичников обнаружило крайне неравномерный их характер (рис. 11). В случаях массивных некрозов некротизированию подвергались как паренхима, так и строма с сосудами. Количественные показатели представлены в табл. 3.

Рис. 11. Объем массивных некрозов в раковых опухолях яичников



Таблица 3. Объем массивных некрозов в раковых опухолях яичников

Показатель	М	m	К.в.
Массивный некроз, %	8,5	1,4	1,5
Некроз РК, %	3,4	0,54	0,75
Суммарный некроз, %	14,9	1,43	1,7

Проведенные исследования показали, что PCNA наиболее интенсивно выявляется в папиллярных новообразованиях, в мелких железах и участках инвазивного роста (рис. 8).

На I и II клинических стадиях заболевания уровень PCNA демонстрирует значительные колебания от 18 % до 32%. Что касается Ki-67, то в результате проведенных исследований было установлено, что на I клинической стадии заболевания количество Ki-67+ -клеток невелико и составляет порядка 5,4±0,63% (рис.3). Расположение этих клеток не имеет выраженных закономерностей. Ki-67+ -клетки располагаются разрозненно и, как правило, единичны. Однако, имеется устойчивая тенденция к увеличению таких клеток в мелких железах (рис.5). В группе раковых опухолей яичников II стадии указанные тенденции сохранялись, количество Ki-67⁺ клеток составляла уже 10,2±0,66%.

При прогрессировании неоплазмы (III стадия) обнаруживается тенденция к усилению экспрессии Ki-67 (47,0±4,12%) (рис.7) и PCNA (рис. 8).

Исследование раковых опухолей яичников IV стадии показало сохранение высокой пролиферативной активности: экспрессия Ki-67 в ряде случаев достигала 58%, а PCNA - 100% (рис. 9).

Результаты исследования по оценке экспрессии иммуногистохимического маркера Bcl-2 атипическими эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ представлены на рис. 12.

Показано, что количество опухолевых клеток, экспрессирующих Bcl-2, статистически значимо возрастает. При этом корреляционная связь со стадией высокая (r=0,6255). Усиление антиапоптотического фактора при прогрессировании РЯ объясняет, в частности, высокий злокачественный потенциал этих новообразований (рис. 12).

При оценке стромы раковых опухолей яичников и эпителиально-стромальных взаимоотношений в первичном опухолевом узле при РЯ установлено, что объем стромы колеблется в зависимости от объема паренхимы и составляет 12,57±1,5%. Клеточный состав стромы характеризовался преобладанием молодых форм фибробластов и фиброцитов (рис. 13).

Эпителиально-стромальные взаимоотношения при РЯ характеризовались наличием разрывов, либо отсутствием базальной мембраны, разграничивающей эпителиальные и стромальные компоненты. Это, с одной стороны, облегчает в случае рыхлой соединительной стромы процесс продвижения раковых комплексов. В то же время в зоне контакта раковых и стромальных клеток начинают активно пролиферировать фибробласты и создается плотный пограничный вал. Со степенью зрелости и выраженностью соединительнотканной стромы взаимосвязаны неоангиогенез и уровень кровоснабжения раковых опухолей.

Рис. 12. Уровень экспрессии Bcl-2 атипичными эпителиальными клетками при РЯ в динамике прогрессирования заболевания



Рис. 13. Соотношение различных типов фибробластов в серозных РЯ

В результате проведенных исследований было установлено, что неоплазма первичного опухолевого узла при РЯ имеет, в целом, высокий уровень кровоснабжения; при этом объем кровеносных сосудов и их плотность возрастают в процессе прогрессирования опухоли (рис. 14).

Рис. 14. Параметры сосудистого русла первичной опухоли при РЯ на различных клинических стадиях заболевания

При этом длина сосудов положительно коррелирует с объемом стромы (r=+0,573) и числом средних (r=+0,265) и гиперактивных больших фибробластов (r=+0,327).

Уровень кровоснабжения определяет в значительной степени и питание раковых клеток, что не может не сказаться на соотношении между гликолитическим и аэробным метаболизмом в них. В результате исследования активности мембраносвязанных митохондриальных ферментов СДГ и ЦХО в опухолевой ткани было установлено снижение их активности в динамике прогрессирования опухоли (рис. 15).

Рис. 15. Гистограмма распределения СДГ и ЦХО в неоплазме первичного опухолевого узла у больных РЯ в зависимости от клинической стадии заболевания

Подобная динамика активности мембраносвязанных митохондриальных ферментов может свидетельствовать о нарастающей гипоксии опухолевых клеток, которая может быть результатом неполноценного кровоснабжения, особенно глубинных участков опухоли. Однако, по мнению рядов авторов (Лю Б.М., 2004), митохондрии опухолевых клеток дефектны и, как следствие, речь идет в них о так называемой «фиктивной» гипоксии, или фактической гипероксии.

Таблица 4. Уровень МДА, активность каталазы, ГР и СОД в неоплазме первичного опухолевого узла у больных раком яичников в зависимости от клинической стадии заболевания.

Изучаемые показатели

Рак яичников

I стадия

II стадия

III стадия

IV стадия

n

M±m

p

n

M±m

p

n

M±m

p

n

M±m

p

СОД, у.е./г

13

110,93±1,14

p<0,001

5

92,92±0,73

p<0,001 p1<0,001

33

136,67± 1,02

p<0,001 p1<0,001

7

105,79±0,73

p<0,001 p1<0,001

МДА, мкмоль/г

11

493,0±6,41

p<0,001

9

642,3±1,33

p<0,001 p1<0,001

36

703,3±1,15

p<0,001 p1<0,001

10

340,8±1,27

p<0,001 p1<0,001

Каталаза, моль/с·г

11

21,2±1,23

p>0,5

9

23,4±1,12

p>0,5 p1>0,5

36

26,9±0,94

p<0,001 p1<0,001

10

16,2±0,69

p<0,001 p1<0,001

ГР, мкмоль/с·г

11

26,8±0,97

p<0,001

9

29,4±1,04

p>0,5 p1<0,001

36

32,8±0,62

p<0,001 p1<0,001

10

21,4±0,92

p<0,001 p1<0,001

Примечание:

«р» - рассчитано по отношению к показателю при миоме матки

«р₁» - рассчитано по отношению к показателю на предыдущей стадии заболевания

Усиление гликолиза и ослабление аэробного метаболизма связывают с отсутствием активности белка р53 (Bensaad K. et al, 2006). На сегодня описано около 2000 типов миссенс мутаций р53, которые обеспечивают подавление его функций и потому подвергаются селекции в клетках опухолей (Hamroun D. et al, 2006). В наших исследованиях показано увеличение экспрессии р53 опухолевыми клетками в динамике прогрессирования РЯ (рис. 16).

У мутантного р53 появляются так называемые новоприобретенные функции, направленные на дальнейшее повышение злокачественности клеток и на приобретение устойчивости к противораковой терапии (Bensaad K. et al, 2006; Weisz L. et al, 2007). Одним из следствий недостаточности р53 может быть также повышение уровня внутриклеточных кислородных радикалов (Bensaad K. et al, 2006).

В результате проведенных нами исследований установлено повышение уровня ПОЛ в опухолевых клетках, нарастающее с I-ой по III-ю клинические стадии заболевания (табл. 4).

Следствием фактической гипероксии является переход системы ПОЛ-АО на III стадии заболевания в «специализированный» диапазон, характерный для канцерогенеза и затем, в отдельных зонах опухоли, окислительного цитолиза. Это подтверждается наблюдаемой динамикой антиоксидантных ферментов в опухолевой ткани (табл. 4).

Рис. 16. Гистограмма уровня экспрессии mt p53 атипичными эпителиальными клетками при прогрессировании РЯ



Считается установленным, что у больных РЯ имеет место значительная иммунодепрессия, затрагивающая, в основном, Т-, NK-клеточное и фагоцитарное звенья иммунитета. Однако, не существует единой точки зрения на динамику показателей специфической и неспецифической защиты организма при прогрессировании заболевания.

В результате проведенных исследований мы установили, что общее количество лейкоцитов периферической крови статистически значимо снижается на I-III клинических стадиях заболевания и возрастает на IV-ой стадии (рис. 17).

Рис. 17. Гистограмма изменений общего количества лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и NK периферической крови больных РЯ на различных клинических стадиях заболевания

При этом общее количество Нф периферической крови статистически значимо возрастает при прогрессировании опухоли (рис. 17), однако цитотоксичность Нф, как кислородзависимая, так и кислороднезависимая снижается (рис. 18). Последнее, на фоне возрастания АФИ и АФЧ (данные изложены в диссертации), может свидетельствовать о снижении способности Нф периферической крови к завершенному фагоцитозу.



Рис. 18. Гистограмма распределения активности МПО и уровень КБ нейтрофилов периферической крови больных РЯ на различных клинических стадиях заболевания

В ходе исследований также было установлено возрастание CD₁₆⁺ Лф при прогрессировании опухолевого процесса. Абсолютное количество NK при этом изменялось статистически не значимо (табл.5). Подобная динамика может свидетельствовать в пользу гипотезы о селекции NK-резистентных вариантов опухолевых клеток при развитии РЯ. Полученные нами результаты подтверждают данные о существенном изменении иммунного статуса при прогрессировании РЯ. Прежде всего было установлено снижение общего количества Лф периферической крови, прогрессирующее в ходе развития опухолевого процесса. На фоне снижения общего количества Лф происходит снижение относительного количества Т-Лф (CD₃⁺) и их субпопуляции (CD₄⁺) при одновременном увеличении CD₈⁺-клеток (табл. 5).

По данным ряда авторов (Yang T. et al., 2007), прогрессирующий РЯ поддерживает высокую пролиферативную активность CD₈⁺-Т-клеток.

Анализ динамики экспрессии на Лф периферической крови активационных маркеров показал коррелирующее со стадией увеличение CD₂₅⁺, CD₇₁⁺ и CD₉₅⁺ клеток (табл. 6).

Наблюдаемая динамика экспрессии дифференцировочных и активационных маркеров на Лф периферической крови может свидетельствовать о нарушении специфических механизмов иммунологической защиты при прогрессировании РЯ. В пользу такого утверждения свидетельствуют и полученные данные о нарастании чувствительности Лф периферической крови к спонтанному и индуцированному апоптозу in vitro в динамике опухолевой прогрессии (данные изложены в диссертации).

В результате проведенных исследований установлено, что у Лф доноров снижение величины ДШ и появление ФС на поверхности клеток происходит в первую очередь и практически одновременно. Упорядоченная фрагментация ДНК начинается несколько позже (результаты изложены в диссертации).

Снижение ДШ и экспрессия ФС на поверхности лимфоцитов больных РЯ в указанные сроки инкубации были достоверно более выражены, по сравнению с Лф доноров, и нарастали при прогрессировании опухоли. Процесс упорядоченной фрагментации ДНК в этих Лф начинался раньше, чем в Лф доноров, усиливался в процессе опухолевой прогрессии и у больных в VI-й клинической стадии заболевания более чем в 3 раза превышал показатели для Лф доноров (графический материал представлен в диссертации).

Инкубация с дексаметазоном (Дн) индуцировала в Лф вышеперечисленные изменения. Однако их динамика и степень выраженности в Лф доноров и в Лф больных РЯ были различными. Было установлено, что снижение ДШ при инкубации с Дн в Лф больных РЯ было существенно и достоверно более выражено, нежели в Лф здоровых женщин, и нарастало в динамике опухолевой прогрессии.

Выявленная обратная зависимость между падением ДШ, как спонтанным, так и Дн-индуцированным, и появлением молекул ФС на поверхности Лф свидетельствует в пользу высказанной ранее гипотезы (Бойчук С.В., Антонеева И.И., 2007), согласно которой экспрессия ФС на поверхности Лф происходит только при снижении ДШ.

Исследования показали четкую обратную зависимость между величиной ДШ и уровнем экспрессии ФС. Выявлено, что Лф с нормальной величиной митохондриального потенциала практически не экспрессируют ФС на своей поверхности. Снижение ДШ, как спонтанное, так и индуцированное Дн, предшествует появлению ФС на поверхности Лф.

Дн также индуцировал фрагментацию ДНК Лф больных РЯ после 72 часов инкубации. В Лф доноров этот процесс начинался несколько позже, после 96 часов инкубации. При этом количество клеток с упорядоченной фрагментацией ДНК было несколько выше среди Лф больных по сравнению с Лф доноров и больных на I-II-й стадиях и резко возрастало у больных в III-IV-й клинической стадии заболевания.

Аналогичные различия в изменении этого показателя апоптоза имели место и при 120 часах инкубации лимфоцитов с Дн.

Инкубация Лф с индуктором апоптоза ФГА вызвала более выраженные, нежели инкубация с Дн, изменения изучаемых параметров на всех сроках инкубации.

При этом достоверно выше, по сравнению с донорами, в Лф больных РЯ было падение ДШ, экспрессия ФС и фрагментация ДНК. Наблюдаемые изменения были также достоверно более выражены у больных с III-IV-й клиническими стадиями заболевания по сравнению с Лф больных I-II-й стадии.

Следующим фактором, способным оказать влияние на запуск процессов апоптоза, является наличие на клеточной поверхности специализированных «рецепторов смерти», к которым относятся Fas-рецепторы (CD₉₅). Наличие на клеточной поверхности рецепторов данного семейства определяет готовность клетки к Fas-индуцированному апоптозу при контакте с соответствующим лигандом.

Данные рецепторы опосредуют важнейший сигнальный путь запуска апоптоза такими различными факторами, как цитокины, свободные радикалы, гормоны, цитостатики, моноклональные антитела (анти-Fas) и другие специфические лиганды (Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002).

...