Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере

Размещено на http://www.allbest.ru/

30

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Рыбников Владимир Николаевич

Курск 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Лазарев Алексей Иванович

доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Муляр Александр Георгиевич

доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович

доктор медицинских наук, профессор Кинзирский Александр Сергеевич

Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита состоится «___» ___________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «_____» _________________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Пашин Е.Н.

кровопотеря гликозаминогликан витамин гепатопротекторный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Различные формы нарушения гомеостаза характеризуются иммуносупрессией, основными причинами развития которой является усиление генерации активных метаболитов кислорода, снижение антиокислительного потенциала тканей, повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов мембран, снижение энергообеспечения клеток, нарушение структуры и функции иммуноцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 1999; Новицкий В.В. и др., 2003).

Наряду с принципиально общими механизмами развития метаболической иммуносупрессии при состояниях, характеризующихся выраженным стрессорным компонентом (алиментарные нагрузки, голодание, охлаждение, физические нагрузки), имеют место характерные для них особенности, обусловленные природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., 2003). Общность направленности и в значительной степени выраженность иммунометаболических сдвигов, наблюдающиеся при различных формах стресса и патологии, сочетается с неодинаковой эффективностью корригирующего действия различных фармакологических средств.

Потеря значительного количества крови, как правило, сочетается с травматизацией тканей, а иногда с действием наркотизирующих веществ. Такая форма стресса является одной из наиболее частых в условиях чрезвычайных ситуациий, а также хирургической и акушерско-гинекологической практики. Иммунометаболические сдвиги, возникающие после острых кровопотерь, изучены недостаточно.

Известно, что умеренная острая кровопотеря приводит к снижению антиоксидантного потенциала гепатоцитов, усилению перекисного окисления и нарушению энергетического обмена в клетках, повышению проницаемости клеточных мембран гепатоцитов (Матвеев С.Б. и др., 1991,1999). Кровопотеря сопровождается увеличением числа ретикулоцитов и снижением количества зрелых эритроцитов в периферической крови, изменением деформируемости этих клеток, снижением числа тромбоцитов, повышением их адгезивных и агрегативных свойств (Соловьев С.В., 1989). Эритроциты и тромбоциты оказывают существенное влияние на функциональную активность иммуноцитов (Прокопенко Л.Г., Сипливая Л.Е, 1992). Значительные кровопотери, имеющие место при травмах и хирургических вмешательствах, сопровождаются нарушением иммунологических функций (Прокопенко Л.Г. и др., 1993), механизм которого изучен недостаточно, а соответственно этому мало разработаны способы иммунореабилитации после острых кровопотерь.

Многие фитопрепараты обладают иммуномодулирующими свойствами, обусловленными наличием в них каротиноидов, сапонинов, флавоноидов и, особенно, полисахаридных комплексов (Хаитов P.M. и др., 1995; Du J.-Y. et al., 1996). Гликозаминогликаны различного видового происхождения корри-гируют развитие различных форм иммунного ответа при токсических поражениях печени, интенсивных физических нагрузках, алиментарных нарушениях гомеостаза, остром тепловом и холодовом стрессах (Конопля Е.Н., 1997; Ермакова А.Е., 1995; Прокопенко Л.Г. и др. 1999; Байбурин Ф.Я. и др., 2000).

В составе природных фитопрепаратов содержатся ГАГ, которые могут взаимодействовать с другими соединениями, обладающими иммуномодулирующими свойствами. В то же время, механизмы взаимодействия ГАГ с жиро- и водорастворимыми витаминами мало изучены, что представляет большой научный и практический интерес.

Цель - выявление иммунометаболических и гепатопротекторных эритроцитзависимых эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз, протеаз и витаминов при острой кровопотере.

Задачи.

1. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и жирорастворимых витаминов при кровопотере.

2. Выявление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и водорастворимых витаминов после кровопотери.

3. Установление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов животного происхождения и витаминов при кровопотере.

4. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов после кровопотери.

5. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия витаминов и продуктов фрагментации гликозаминогликанов при кровопотере.

6. Выяснение роли эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

7. Выявление гепатопротекторных эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

8. Изучение иммунометаболических эффектов совместного введения протеолитических ферментов и витаминов после кровопотери.

Научная новизна. Острая кровопотеря вызывает развитие иммуносупрессии, в реализации которой принимают участие эритроциты. Гликозаминогликаны растительного происхождения (ГАГ-Р, ГАГ-Т, ГАГ-А) как иммунокорректоры при кровопотере более эффективны, чем гликозаминогликаны животного происхождения («Остенил», «Дона», АНК). Иммунометаболические эффекты гликозаминогликанов различного видового происхождения и гликозидаз («Лидазы» и «Лизоцима») при кровопотере усиливаются жиро- («Ретинола ацетат», «Токоферола ацетат», «Викасол», «Менадион») и водорастворимыми витаминами («Пиридоксина гидрохлорид», «Фолиевая кислота», «Цианкобаламин»). Наиболее эффективно при этом совместное применение гликозаминогликанов и гликозидаз с витаминами А, К, В₆, и В₁₂. В реализации иммунотропного действия совместного применения гликозидаз с витаминами А и К важную роль играют тяжелые эритроциты. Высокой иммунометаболической активностью обладает строма эритроцитов, включающая менадион и обработанная лизоцимом. Гликозаминогликаны или лизоцим, введенные с витаминами А или К, вызывают выраженный гепатопротекторный эффект. Иммунометаболические эффекты гликовитаминных взаимодействий опосредуются соединениями, выделяющимися различными популяциями спленоцитов. Протеазы по отдельности и в сочетании с жиро- или водорастворимыми витаминами в норме или после кровопотере оказывают разнонаправленные иммунометаболические эффекты. Папаин не влияет, а лизоцим или террилитин по отдельности, в большей степени в сочетании с витаминами, повышают ФМА нейтрофилов и иммунную реактивность крыс после кровопотери. Строма эритроцитов крыс, полученная после кровопотери реагирует на кобаламин повышением имуномодулирующей активности, индуцируемой лизоцимом и террилитином

Практическая значимость. Экспериментально обоснована перспектива изучения иммуномодулирующего, гепатопротекторного действия лизоцима в сочетании с витаминами А, К, В₆ или B₁₂ при острых кровопотерях в хирургической, травматологической и акушерско-гинекологической практике. Показана возможность получения высокоэффективных иммунокорректоров, гепатопротекторов на основе стромы эритроцитов, экстракорпорально взаимодействующих с менадионом и лизоцимом. Показана взаимосвязь фармакологических эффектов действия витаминов и гликолитических ферментов при кровопотере. Установлены стимулирующие эффекты террилитина и лизоцима, как по отдельности, так и в сочетании с витаминами на функциональную активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность крыс после кровопотери. Обнаружены иммуномодулирующие свойства стромы эритроцитов, индуцированной лизоцимом или террилитином, полученной после кровопотери и обработанной кобаламином.

Материалы диссертации включены в рабочие программы ряда кафедр Курского, Саратовского, Самарского и Российского государственных медицинских университетов, Нижегородской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Различие иммунометаболической активности гликозаминогликанов растительного и животного происхождения.

2. Эффективность иммунометаболического взаимодействия гликозаминогликанов и витаминов.

3. Особенности иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов.

4. Интегрирующая роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов.

5. Гепатопротекторные эффекты взаимодействия гликозаминогли-канов, гликозидаз и витаминов.

6. Сочетанное применение террилитина или лизоцима с ретинола ацетатом или менадионом вызывает более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем раздельное введение препаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета: конференциях, посвященных 65 и 66-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации» (Курск, 2000, 2001), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2000), VII и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2003), Международной научно-практической конференции «Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), на совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, биохимии, спортивной медицины и медицинской реабилитации, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, микробиологии и патофизиологии Курского государственного медицинского университета (2008).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 32 работы, в том числе в 10, рекомендуемых ВАК РФ, и 3 монографиях. В работах содержится весь объем информации, касающейся темы диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 64 таблицами и 16 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (11 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 280 отечественных и 111 иностранных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 200-220 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом. Для исследования от опытных животных получали сыворотку крови, эритроциты и нейтрофилы периферической крови, ткань селезенки, подколенные лимфатические узлы.

Кровопотерю моделировали следующим образом: после предварительного обильного питья под общим обезболиванием выполняли венесекцию участка бедренной вены одной из задних лапок крысы, затем канюлировали мобилизованную вену и вводили 1000 МЕ гепарина, после чего из кровотока удаляли 21 мл/кг крови, что приблизительно соответствует 3,5-4 мл или кровопотере. Объем циркулирующеей жидкости восполняли аналогичным кровопотере объемом 0,15 М раствора хлорида натрия (Sapirstein L.A., 1960).

Использованные фармакологические препараты и активные субстанции, производитель, способы, дозировки и кратность их введения представлены в табл. 1.

Таблица 1

Изученные препараты и фармакологически активные субстанции

Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях по их использованию препаратов.

Таблица 2

Методы исследований

Размещено на http://www.allbest.ru/

О выраженности ГИО судили по количеству АОК и РОК в селезенке. Индукцию иммунного ответа проводили эритроцитами барана (Кэбот Е., Мейер М., 1968). Антиген вводили внутрибрюшинно в дозе 10⁸ клеток на 1 кг массы тела. Число АОК к ЭБ устанавливали методом прямого, локального гемолиза в агаре (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Количество иммунных РОК определяли по Х. Зауэр (1987). Для определения выраженности ГЗТ сенсибилизирующую дозу ЭБ (10⁶) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу ЭБ (10⁸), а в подушечку левой лапки вводили 0,15 М хлорид натрия. О выраженности ГЗТ судили по величинам разницы массы регионарных и контралатеральных лимфатических узлов спустя 24 ч. после введения разрешающей дозы (Федосеева В.Н. и др., 1993) (табл. 2).

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латекса размером 1,5-2 мкм. Рассчитывали: фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, индекс активности фагоцитоза (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность полиморфноядерных лейкоцитов оценивали по показателям НСТ-тестов спонтанного и стимулированного зимозаном и по общему резерву нейтрофилов - разнице между спонтанным и стимулированным тестами (Щербаков В.И., 1989) (табл. 2).

Спленоциты получали из ткани селезенки, которую извлекали в асептических условиях и измельчали ножницами в чашках Петри. Полученную тканевую массу разбавляли средой 199, гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Уэлса и центрифугировали 10-15 минут при 200 g. Суспензию фильтровали через капроновые сетки и дважды отмывали средой 199 в течение 10 минут при 200 g. Эритроциты удаляли гемолитическим шоком (Бурмейстер Ю., 1979). Клетки селезенки фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре (Родионов С.В. и др., 1985). Прилипающие и не прилипающие клетки инкубировали в среде 199 (10⁷ клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 4-6 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% двуокиси углерода) и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Белки супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-150. Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с молекулярной массой более 150 кД, фракция II - белки с молекулярной массой 50-60 кД и фракция III - белки с молекулярной массой менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорд. Активность фракций оценивали путем внесения их в среду инкубации ПЯЛ.

Выделение эритроцитов проводили следующим образом. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН = 7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 2% декстрана Т-500 в течение 30 мин при 37°С. Затем кровь центрифугировали (3000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С). Слой эритроцитов удаляли аспирацией. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на хроматографической колонке, содержащей HBS-целлюлозу в 10 мМ Na-фосфатном буфере, содержащем 0,9% хлорида натрия. После очистки эритроциты осаждали центрифугированием (3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С) (Beutler, 1985). Эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобзев Т.В. и др., 1978). Для приготовления градиента носителя навеску сухого яичного альбумина растворяли в буферном растворе (рН = 7,8). Готовили ряд пробирок, содержащих 1 мл раствора яичного альбумина: 1 пробирка - конц. 28% (d = 1,079 г/см³), 2 пробирка - конц. 30% (d = 1,091 г/см³), 3 пробирка - конц. 40% (d = 1,105 г/см³), 4 пробирка - 43% ( d = 1,117 г/см³). Взвесь эритроцитов (5 х 10⁹ клеток в 0,5 мл среды 199) наносили на раствор альбумина в первую пробирку и центрифугировали при 1400 g в течение 10 мин. Верхняя зона представляла собой легкие эритроциты (плотность ниже 1,079 г/см³). Нижнюю зону переносили во 2 пробирку и центрифугировали, верхнюю зону клеток отбрасывали, а нижнюю переносили в третью пробирку. После центрифугирования отделяли эритроциты верхней зоны, имеющие плотность 1,091-1,105 г/см³ (промежуточная по плотности фракция), а клетки нижней зоны вносили в 4 пробирку. После центрифугирования отделяли нижнюю зону клеток. Это фракция тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117.

Полученные фракции эритроцитов тщательно отмывали от альбумина 0,15 М хлоридом натрия и использовали для введения аллогенным животным.

Спленоциты культивировали с аллогенными эритроцитами или их фракциями в соотношении клеток 1:2 (5 х 10⁷ лимфоцитов и 10⁸ эритроцитов на 3 мл среды) в среде 199 (5 х 10⁷ клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин, стрептомицин), в течение 4 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа). По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 минут и готовили пул надосадочных жидкостей, содержащих равные объемы жидкостей 5-6 животных.

Пул жидкости диализовали в течение 12-15 часов против 50 кратного объема 0,05 М трис-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М хлориде натрия. После диализа его концентрировали полиэтиленгликолем (ММ 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1-буфера). Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость осаждали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием при 800 g в течение 20 минут. Концентрацию белка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (Шишкин С.С., 1982).

Активность надосадочных жидкостей и их фракций определяли путем добавления их к взвеси мононуклеаров в объеме, содержавшем 100 мкг белка, и последующего определения показателей ФМА мононуклеаров.

Выделение стабильного метаболита оксида натрия лейкоцитами определяли спектрофотометрически с использованием реактива Грисса (Голиков П.П. и др., 2003). Активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов определяли по Л.В. Никитиной и др. (2001), содержание фруктозо-2,6-дифосфата (ФДФ) в лимфоцитах - по Б.Ф. Коровкину и др. (1999). В строме эритроцитов определяли суммарную активность Na⁺, K⁺-АТФазы и Mg²⁺-АТФазы (Рыжикова Г.Ф., Вишняков С.И., 2005). Активность последней устанавливали в присутствии дабалена, ингибирующего Na⁺, K⁺-АТФазу. В тромбоцитах определяли содержание МДА (Негреску Е.В., 1992) (табл. 2).

Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке ЛНП (Кобл В.Г., Камышников B.C., 1976), ДК и МДА (Стальная И.Д., 1977; Стальная И.Д. и Гаришвили Т.Г., 1977), ГАГ (Мудрашов Б.Ф. и др., 1986), активности антипротеолитических белков - АЛЛ и АМГ (Нартикова В.Ф., Пасхина Г.С., 1979). Иммуностимулирующую активность сыворотки оценивали по концентрации АНК (Колб В.Г. и Камышников B.C., 1976), активности протеолитических ферментов (Покровский А.А., 1969) и лизоцима (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974) (табл. 2).

В эритроцитах определяли содержание макроэргических соединений (БФГ и АТФ) (Виноградова И.Л. и др., 1980) и активность антиоксидантных ферментов (СОД и ГР) (Макаренко Е.В., 1988) (табл. 2).

ГАГ выделяли из соцветий лекарственных растений Polygonaceae (ГАГ-Р), Tiliaceae (ГАГ-Т) и Astraceae (ГАГ-А) по способу Ласковой И.Л. и др. (а.с. №1603714). Способ включает экстракцию 5% раствором серного эфира в этаноле и очищение горячей (95 єС) водой, деминерализацию путем переосаждения этанолом и диализом, дополнительную деминерализацию ионитами, очистку от белковых примесей, обработкой смесью хлороформа и этилового спирта и щелочного омыления гетерополисахаридного комплекса. Количественный и качественный состав выделенных полисахаридов изучен и описан ранее. Полученные соединения являются глюкуроногликанами, в состав которых входят D-галактуроновая кислота (60-80%), галактоза (15-19%), глюкоза (6-12%), арабиноза (4-8%) и рамноза (5-10%) (Яковлев А.И. и др., 1985, 1988).

Получение эритроцитов, обработанных ГАГ-P и менадионом. Эритроциты здоровых крыс и животных, потерявших 2% крови, инкубировали в растворах, 1 мл которых содержал 1, 2 или 3 мг ГАГ-Р или 1, 2 или 3 мг менадиона. К 1 мл раствора добавляли 10⁷ эритроцитов и инкубировали 30 минут при 37 єС.

Для включения менадиона в строму эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза (Генинг Т.П. и др., 1988; Жумадилов Ж.Ш., Макаренкова Р.В., 1990) Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течении 5 мин при 4°С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0°С дистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g в течении 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем менадиона, растворенного в охлажденной до 5°С дистиллированной воде. Концентрация препарата в инкубационной среде составляла 1, 2 или 3 мг/мл. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% хлорида натрия для восстановления целостности стромы и инкубировали в течении 30 мин при 37°С. После включения менадиона в стромальные сферы, последние дважды отмывали изотоничеким раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500 g в течении 10 мин.

Включение ГАГ в строму эритроцитов осуществляли методом гипоосмотического гемолиза (см. выше). О включении ГАГ в строму судили по увеличению в среде гексуроновых кислот после полного гемолиза стромальных сфер (Прохорова М.И., 1982).

СЭОГ и СЭОМ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 10⁸ частиц на 1 кг массы тела. Одновременно с первой инъекцией СЭОГ или СЭОМ животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, которым вводили строму эритроцитов, не обработанную препаратами.

Статистическая обработка материала. Вычисляли средние арифметические величины определявшихся показателей и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента (Лакин Т.Ф., 1980), Вилкоксона, Манна-Уитни (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов и гликозаминогликанов при кровопотере. Внутрижелудочное введение ГАГ, выделенных из растений семейства Teliaceae, Asteraceae и Polygonaceae (ГАГ-Т, ГАГ-А и ГАГ-Р) интактным крысам не влияло на развитие у них ГИО и ГЗГ, индуцированных ЭБ. Внутримышечное введение ГАГ интактным животным стимулировало развитие ГИО, но не влияло на ГЗГ. Наиболее выраженный стимулирующий эффект вызвало введение ГАГ-Р.

Потеря 2% крови угнетала развитие ГИО и ГЗТ, подавляла функционально-метаболическую активность лейкоцитов периферической крови, снижала содержание БФГ, АТФ, активность СОД и ГР в эритроцитах, повышала концентрацию АГП и МДА, активность АЛТ, АСТ, ААП, АМГ, ЩФ и содержание ОБ в плазме крови. По-видимому, после потери 2% крови иммуносупрессирующий эффект вызываемый повышением интенсивности ПОЛ усиливается нарушением функций гепатоцитов и накоплением в крови ААП и АМГ, обладающих выраженными иммуносупрессорными свойствами (Прокопенко Л.Г. и др., 1998).

Установлено, что внутримышечное и внутрижелудочное введение ГАГ-Р в сочетании с РА или ТА корригирует ГИО и ФМА нейтрофилов и не влияет на развитие ГЗТ. Комбинированное применение ГАГ-Р и филлохинона или менадиона частично или полностью корригирует клеточный и гуморальный иммунный ответ и ФМА полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови КПК (табл. 3).

После кровопотери легкие эритроциты приобретали иммуносупрессирующие свойства. Введение ГАГ-Р и менадиона ослабляло иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Полученные данные свидетельствуют о существенной роли эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия совместного применения ГАГ и менадиона при кровопотере.

Таблица 3

Влияние сочетанного применения гликозаминогликанов растительного происхождения с жирорастворимыми витаминами на иммунитет крыс после кровопотери

Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов Polygonaceae и менадиона, иммобилизованных стромой эритроцитов после кровопотери. Наиболее простым способом фиксации лекарственных препаратов на нерастворимом в водной фазе носителе является адсорбция их на цитоплазматической мембране эритроцитов. Известно, что инкубация эритроцитов в растворах, содержащих ферменты и фосфолипиды, приводила к появлению у этих клеток иммуномодулирующих свойств (Прокопенко Л.Г. и др., 1998). Выраженное влияние на иммуномодулирующие свойства эритроцитов оказывает менадион. Принимая во внимания изложенное, были изучены иммуномодулирующие свойства ГАГ-Р и менадиона соиммобилизованных на эритроцитах и их строме.

После инкубации с ГАГ-P, эритроциты интактных крыс приобретали свойство стимулировать развитие иммунного ответа у здоровых животных и крыс после кровопотери, причем, наиболее выраженными иммуномодулирующими свойствами обладали эритроциты, инкубированные в среде, содержащей 3 мг/мл ГАГ-P.

Инкубация с ГАГ-Р не индуцировала у эритроцитов, полученных у КПК после кровопотери свойства модулировать развитие гуморального иммунного ответа у здоровых животных и крыс, потерявших 2% крови. Полностью неактивными были также эритроциты инкубированные с менадионом. Эти наблюдения показывают, что после кровопотери мембрана эритроцитов становится рефрактерной к раздельному действию ГАГ-P и менадиона.

Принимая во внимание изложенное, было изучено иммуномодулирующее действие стромы эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанной ГАГ-P или менадионом.

СЭОГ и СЭОМ стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ у здоровых животных. Наиболее выраженная стимуляция имела место при введении частиц, полученных при содержании в инкубационной среде 2 и 3 мг/мл ГАГ-P. После кровопотери СЭОГ повышала, но не до уровня контрольной группы, а СЭОМ - не влияла на развитие различных форм иммунного ответа на ЭБ. Изучена также иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов, полученных после кровопотери и инкубированной с ГАГ-P или менадионом. Оказалось, что введение стромы, обработанной ГАГ-P в дозе 2 мг/мл до или после кровопотери, вызывало слабо выраженный иммуномодулирующий эффект, а инъекции стромы, инкубированной с менадионом или с ГАГ-P в дозе 1 и 3 мг/мл - не влияли на выраженность иммунной реакции, индуцированной ЭБ. На основании этих экспериментов можно прийти к заключению, что компоненты структуры стромы эритроцитов крыс, потерявших 2% крови, в процессе гемолиза претерпевают изменения, ослабляющие или предотвращающие взаимодействия с ними изученных соединений.

Принимая во внимание то обстоятельство, что цельные тяжелые эритроциты, инкубированные с ГАГ-P, приобретают иммуностимулирующие свойства, а клетки, обработанные аналогичным образом менадионом, остаются иммунологически неактивными, возникло предположение, что инкубация СЭОМ с ГАГ-P повысит стабильность и увеличит иммуномодулирующую активность стромальных частиц. Для проверки этого предположения СЭОМ, полученные на основе клеток интактных животных и крыс, подвергнутых кровопусканию обрабатывали in vitro ГАГ-P 2 мг/мл и полученные частицы (СЭОМГ) вводили животным до или после кровопотери.

Оказалось, что СЭОМГ интактных крыс стимулировала развитие иммунного ответа у здоровых животных в значительно большей степени, чем СЭОГ. Об этом свидетельствовал тот факт, что у животных, получавших инъекции СЭОГ, количество АОК в селезенке было в 3,2 раза выше, чем в контроле, а у крыс, которым вводили СЭОМГ, эти параметры превышали контрольный уровень соответственно в 4,9 и 3,5 раза (табл. 4). В отличие от СЭОГ, СЭОМГ нормализовал развитие иммунного ответа после кровопотери. Принципиально важным является тот факт, что СЭОМГ, полученный на основе клеток, выделенных после кровопотери в отличие от СЭОГ стимулирует развитие гуморальной иммунной реакции на ЭБ у здоровых и КПК (табл. 4).

Таблица 4

Влияние стромы эритроцитов интактных животных и КПК, последовательно обработанной меналионом и ГАГ-P, на развитие иммунного ответа у здоровых животных и КПК

Примечание: здесь и на последующих таблицах: 1. * - p<0,05; 2. - цифра рядом со звездочкой указывает на группу, по отношению к которой различия достоверно.

Таким образом, обработка стромы эритроцитов менадионом повышает чувствительность ее структур к модифицирующему действию ГАГ-P. Механизм этого эффекта остается неясным. Можно лишь предположить, что при взаимодействии менадиона с соединениями стромы эритроцитов, образуются структуры, модифицирующие состояние фосфолипидного каркаса мембраны эритроцитов и повышающие эффективность связывания с ними ГАГ-P.

Иммуномодулирующее действие модифицированных лекарственными соединениями эритроцитов обусловлено цитокинами, выделяемыми моноцитарно-макрофагальными и лимфоидными клетками селезенки (Конопля Н.А., 2001). Не исключено, что аналогичный механизм реализуется при введении в организм модифицированной стромы эритроцитов. Для проверки этого предположения клетки селезенки крыс, подвергнутых кровопусканию и получавших инъекции СЭОМГ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре среды, культивировали в течение 6 ч, получали супернатант и тестировали его на наличие иммуномодулирующей активности. Установлено, что супернатант клеток, прилипающих к стеклу при 4-10 єС супрессирует у аллогенных животных развитие иммунного ответа на ЭБ. Супернатант неприлипающих клеток увеличивает выраженность иммунной реакции, но в меньшей степени, чем супернатант прилипающих при 32-37єС клеток (табл. 5).

Фракция III супернатанта неприлипающих клеток при аллогенном переносе стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракционированного супернатанта. Остальные фракции супернатанта неприлипающих клеток не влияли на выраженность реакции индуцированной ЭБ. Фракция II клеток, прилипающих при 4-10 єС, обладала иммуносупрессирующей активностью, а фракция III клеток, прилипающих при 32-37 °С - иммуностимулирующими свойствами.

Клетки моноцитарно-макрофагального ряда выделяют пептиды, оказывающие влияние не только на функциональную активность иммуноцитов, но обладающие также антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами (Кетлинский С.А. и др., 1992). Определение антиоксидантной и гепатопротекторной активности прилипающих и неприлипающих клеток селезенки крыс, потерявших 2% крови, получавших инъекции СЭОМГ, показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37 єС снижает содержание ДК, МДА, активность АЛТ, АСТ и ЩФ, но не влияет на концентрацию общего билирубина в сыворотке крыс, подвергнутых кровопусканию и не получавших инъекции СЭОМГ. Остальные фракции супернатантов, прилипающих и неприлипающих клеток, не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов после кровопотери. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что иммуномодулирующее действие и метаболические эффекты ГАГ-Р и менадиона опосредуются цитокинами, выделяемыми различными популяциями спленоцитов.

Таблица 5

Влияние фракций клеток селезенки КПК, получавших инъекции СЭОМГ, на развитие ГИО у интактных крыс

Примечание:

1) каждая средняя величина получены в опытах на 8-10 крысах;

2) в контроле количество АОК 24,7±3,1 тыс./орган, количество РОК 52,6±5,8 тыс./орган;

3) * - существенность различий относительно контроля;

4) ** - существенность различий относительно не фракционированного супернатанта;

5) *** - существенность различий относительно группы фракция I+III.

В качестве препарата сравнения использовали гетерополисахарид животного происхождения - гиалуронат калия. Оказалось, что внутрижелудочное и внутримышечное введение ГК в дозах, соответственно равных 10 мг/кг и 5 мг/кг не оказывало влияния на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.

Отдельное использование ГК и менадиона не оказывает влияния на ФМА ПЯЛ, показатели ГИО и ГЗТ животных после кровопотери. Совместное внутримышечное применение ГК с менадионом не влияет на ФЧ, но повышает ФИ, НСТ-сп. и НСТ-ст. тесты, развитие ГИО и ГЗТ у животных после кровопотери.

Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой, глюкозамином, водо- и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Введение после кровопотери АНК в дозе 1 мг/кг увеличивало показатели ГИО, но не влияло на выраженность ГЗТ. В дозе 2 мг/кг АНК нормализовала развитие ГИО и усиливала, но не нормализовала развитие ГЗТ. ГА в дозе 1 мг/кг не влиял на иммунную реактивность, а в дозе 2 мг/кг - угнетал показатели ГИО и ГЗТ. N-ацетилнейраминовая кислота уменьшала выраженность вызываемого кровопотерей снижения величины метаболических маркеров активности полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов (активности НАДФH-оксидазы и содержания ФДФ) и не влияла на величины маркеров эритроцитов и тромбоцитов (активности Mg²⁺-АТФазы и содержания МДА). Установлено, что тромбоциты, полученные после кровопотери существенно угнетают активность Mg²⁺-АТФазы в стромальных частицах эритроцитов интактных животных (активность Mg²⁺-АТФазы стромы эритроцитов интактных крыс равнялась 0,63±0,08%, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами - 0,40±0,05 мкмоль фосфата на 1г белка в час, р < 0,05). Снижают выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации 11,6±1,3% после инкубации - 7,2±0,8%), не влияя на активность НАДФН-оксидазы ПЯЛ (до инкубации - 1,31 ± 0,19, после инкубации 13,8 ± 0,17 г моль/мин на 10³ клеток) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации - 0,92±0,18, после инкубации 0,78±0,15 пкмоль/10⁶ клеток). Введение АНК после кровопотери не влияло на вызываемое тромбоцитами снижение активности Mg²⁺-АТФазы стромы эритроцитов интактных животных и ослабляло тромбоцит-зависимое снижение индекса АЗКЦ.

Введение АНК, пиридоксина, фолата или кобаламина здоровым или КПК не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Сочетанное применение АНК с пиридоксином, фолатом вызывало существенное повышение всех показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ, выраженность развития ГИО (но не ГЗТ) на ЭБ. При сочетании АНК с кобаламином величины ФМА ПЯЛ, ГИО и ГЗТ достигали уровня контроля. Введение после кровопотери ретинола ацетата, токоферола ацетата повышало (но не нормализовали) ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность организма в отношении ЭБ. Инъекции АНК не влияли на эффекты, вызываемые токоферола ацетатом, но усиливали иммуномодулирующее действие ретинола ацетата и менадиона (табл. 6).

Таблица 6

Влияние сочетанного применения N-ацетилнейраминовой кислоты, водо- и жирорастворимых на иммунную реактивность и ФМА нейтрофилов КПК

Введение АНК и препаратов витаминов В₆ В₉ и В₁₂ по отдельности не влияло на показатели окислительно-энергетического статуса и иммунологические свойства легких и тяжелых эритроцитов КПК. Введение АНК в сочетании с пиридоксином, фолатом или кобаламином уменьшало выраженность метаболических изменений эритроцитов и их иммуносупрессирующих свойств, а инъекции АНК с кобаламином, кроме указанного выше индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.

Экстракорпоральное воздействие АНК и кобаламина или АНК и менадиона на эритроциты не индуцировало появление у них иммуномодулирующих свойств. Это дает основание считать, что необходимой предпосылкой появления у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующей активности, служит изменение в организме метаболического состояния эритроцитов, возможно, их энергетического и антиоксидантного потенциала, сопровождающегося возникновением мембранных структур, распознаваемых иммунокомпетентными клетками крови и лимфоидных органов.

Для проверки обоснованности этого представления проведены два варианта экспериментов. В первом КПК, получавшим инъекции кобаламина или менадиона вводили экстракорпорально обработанные АНК тяжелые эритроциты интактных крыс, во втором - КПК, получавшим инъекции АНК, вводили экстракорпорально обработанные кобаламином или менадионом эритроциты здоровых крыс. В первом случае имел место иммуномодулирующий эффект, во втором такой эффект не выявлен. На основании полученных данных можно считать, что кобаламин и менадион в организме КПК сенсибилизируют эритроциты к последующему экстракорпоральному взаимодействию с АНК, приводящему к появлению у эритроцитов иммуностимулирующей активности. В отличие от этого АНК в организме не повышает чувствительности эритроцитов к экстракорпоральному взаимодействию с витаминами.

Можно предположить, что N-ацетилнейраминовая кислота взаимодействует с гликопептидными эпитопами наружной поверхности цитоплазматической мембраны эритроцита. Кобаламин внедряет-ся в фосфолипидную структуру мембраны, а менадион проникает в цитоплазму клетки и активирует белки, регулирующие активность мембранных белков (Лазарев А.И., Конопля Н.А., 2003). Вероятно, вызываемые кобаламином и менадионом метаболические эффекты трансформируются в конформационные изменения эпитопов, облегчающие связывание с ними N-ацетилнейраминовой кислоты. Результатом этого, по-видимому, является повышение эффективности взаимодействия эритроцитов с мембранными структурами макрофагов, приводящее к активации их защитных функций.

В качестве препарата сравнения выбран глюкозамин. Введение глюкозамина здоровым или подвергнутым кровопусканию крысам не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Инъекции глюкозамина с витаминами усиливали иммунологические функции после острой кровопотери. Наиболее выраженным было иммуномодулирующее действие глюкозамина с кобаламином, однако, даже в случае введения этих препаратов, параметры иммунологических функций не нормализовались полностью.

Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и после кровопотери. Введение здоровым животным препарата гиалуроновой кислоты вызывает слабо выраженный иммуносупрессирующий эффект. В отличие от этого, продукты частичного гидролиза гликозаминогликанов стимулируют индуцированную фитогемагглютинином бласттрансформацию лимфоцитов и выделение ими хелперных цитокинов, усиливают развитие гуморальной и клеточной форм иммунного ответа (Лазарев А.И., Прокопенко Л.Г., 1995). Фрагментация гликозаминогликанов осуществляется набором ферментов, важнейшим из которых является гиалуронидаза. Установлено, что введение гиалуронидазы повышало ФМА полинуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в норме и не влияло на указанные параметры после кровопотери. Изучение влияния гиалуронидазы на иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов показало, что введение гиалуронидазы с РА, ТА или менадионом приводило к выраженному повышению фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов и иммунологической реактивности у здоровых крыс. Инъекции гиалуронидазы или жирорастворимых витаминов по отдельности не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Введение гиалуронидазы с РА или менадионом индуцировало появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Инъекции гиалуронидазы с ТА такого эффекта не вызывали (табл. 7).

Таблица 7

Влияние гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс

Установлено, что введение интактным крысам ЭКПГ не влияло на активность полинуклеаров и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции ЭКПГ животным, получавшим РА, ТА или менадион, повышали активность полинуклеаров и стимулировали развитие иммунного ответа в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПГ. Наиболее выраженное усиление ГИО и ГЗТ имело место при в...