Фармакология кортиколибериновых механизмов подкрепления и зависимости

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Фармакология кортиколибериновых механизмов подкрепления и зависимости

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Стрельцов Владимир Федорович

Смоленск - 2009 год

Работа выполнена в Институте медицинского образования Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого".

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Петр Дмитриевич Шабанов.

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Лосев Николай Андреевич,

доктор медицинских наук, профессор Ковалев Георгий Иванович,

доктор медицинских наук, профессор Евсеев Андрей Викторович.

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки "Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства".

Защита состоится " ___ " ________ 2009 года в __.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.097.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Смоленская государственная медицинская академия" (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д.28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО "Смоленской государственной медицинской академии (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д.28).

Автореферат разослан "____"___________2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Яйленко Анна Андриановна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Настоящее исследование является одной из первых попыток рассмотрения подкрепления - базисной функции мозга, определяющей механизмы, посредством которых индифферентный раздражитель становится значимым (сигналом), - с позиции взаимодействия гормональных и медиаторных систем организма. Как правило, эти механизмы рассматриваются изолированно друг от друга, что затрудняет интеграцию современных знаний о механизмах подкрепления (Шабанов П.Д., 2003, 2008). Немаловажным фактом остается недостаточная изученность вопросов участия этих механизмов в формировании зависимости от психоактивных веществ (психостимуляторы, гипноседативные средства, включая алкоголь, галлюциногены). Без решения данных вопросов трудно ставить задачи чисто практические, включая лечение зависимости.

В последние годы акцент в исследовании механизмов зависимости сделан на изучении аномального функционирования эмоциогенных структур мозга, прежде всего, структур медиального переднемозгового пучка (Koob, 2003; Bruijzeel, Gold, 2005), включая гипоталамус и миндалину. Центральное ядро миндалины входит в систему так называемой расширенной миндалины (extended amygdala), которая локализуется в пределах базального переднего мозга и включает центральное и медиальное ядра миндалины, ядро ложа конечной полоски, медиальную часть прилежащего ядра (shell) и сублентикулярный отдел безымянной субстанции (Davis, 1992; Alheid, Heimer, 1996; Swanson, Petrowich, 1998; Waraczynski, 2005). Система расширенной миндалины была выделена анатомически согласно единому строению клеток и содержанию веществ, иммуноцитохимическим характеристикам и внутримозговым связям. Эта система состоит из стриатоподобных ГАМК-ергических клеток и имеет большое содержание кортиколиберина (Swanson, Petrowich 1998; Bruijzeel, Gold, 2005). Являясь звеном экстрагипоталамической системы кортиколиберина, система расширенной миндалины влияет на стресс-зависимое поведение, играет роль в инициации эмоционально-мотивированного ответа и опосредует анксиогенные эффекты кортиколиберина (Sarnyai et al., 2001; Waraczynski, 2005).

Система расширенной миндалины имеет тесные связи, прямые и обратные, с вентральной областью покрышки и латеральным отделом гипоталамуса, электрическая стимуляция которых вызывает наиболее интенсивную реакцию самораздражения с низкими порогами значений электрического тока (Шабанов П.Д. и др., 2004, 2006). Исследования структурно-функциональной организации эмоциональной функции мозга, согласно данным современной литературы, сосредоточены главным образом на анализе внутренней организации вентрального стриатума и в меньшей степени кортиколибериновой системы расширенной миндалины. Особенно неясным и противоречивым является вопрос о роли нейропептидов расширенной миндалины в регуляции подкрепляющих систем мозга, локализацию которых традиционно связывают с гипоталамусом и передним мозговым пучком. Нейрохимически последние представлены в основном дофаминергическими терминалями (Шабанов П.Д. и др., 2002, 2004; Shabanov et al., 2005, 2008).

Известно, что кортиколиберин выполняет роль кортикотропинрилизинг фактора, или гормона (КРГ). В мозгу рецепторы к кортиколиберину (R₁ и R₂) локализованы во всех областях, хотя и с разной плотностью (Rybnikova et al., 2003). КРГ-R₁ рецепторы локализованы преимущественно в неокортексе, особенно в префронтальной и энторинальной коре, в структурах обонятельного мозга, миндалевидном комплексе, гиппокампе, мозжечке и сенсорных релейных ядрах. В то же время КРГ-R₂ практически отсутствуют в коре, а концентрируются преимущественно в субфорникальных структурах, а именно в вентромедиальном ядре гипоталамуса, латеральном септуме, ядрах конечной полоски и некоторых ядрах миндалины. Функциональное значение КРГ-R₁ рецепторов связывают с управлением секреции АКТГ и контролем тревожности, в то время как КРГ-R₂ участвуют в регуляции пищевого и сексуального поведения, а также деятельности сердечно-сосудистой и репродуктивной систем (Bruijzeel, Gold, 2005). Вместе с тем, в механизмах подкрепления и зависимости участие рецепторов кортиколиберина изучено недостаточно. Наибольшее скопление рецепторов кортиколиберина зарегистрировано в гипоталамусе и миндалевидном комплексе. Это определило направленность настоящей работы, а именно: изучение гормональных механизмов подкрепления и зависимости от психоактивных веществ. Знание этих сведений принципиально важно для представлений о предпосылках формирования лекарственной зависимости, особенно в раннем постнатальном периоде жизни, определяющем вероятность развития девиантного поведения.

Цель работы - изучение участия центральных (кортиколибериновых) механизмов в регуляции подкрепления и формировании зависимости от различных наркогенов.

Задачи исследования:

1. Оценка подкрепляющих свойств пептидов (включая кортиколиберин) и синтетических наркогенов при их системном и внутримозговом введении у крыс, выращенных в сообществе или в условиях социальной изоляции.

2. Изучение подкрепляющих свойств пептидов и синтетических наркогенов при их центральном введении в миндалину у крыс, выращенных в сообществе или социальной изоляции и подвергшихся длительной алкоголизации.

3. Оценка отдаленных поведенческих последствий модуляции центральных систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе у крыс.

4. Морфологические исследования лимбических структур мозга крыс после модуляции центральных систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе у крыс.

5. Фармакологическая коррекция нарушений поведения крыс после модуляции систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе.

6. Исследование взаимодействия дофаминергической системы мозга и гормональных систем, оцененное в поведенческих тестах у крыс.

7. Исследование поведенческих эффектов гормонов гипофиза у крыс в моделях удаления гипофиза и внутрицистернального введения гормонов гипофиза.

8. Исследование экспрессии мРНК кортиколиберина и вазопресина в гипоталамусе и миндалине крыс при введении наркогенов.

9. Разработка концепции об участии амигдало-гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (АМГГИНА) системы в механизмах формирования зависимости от разных наркогенов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гипоталамическая и экстрагипоталамическая кортиколибериновые системы мозга принимают непосредственное участие в механизмах внутримозгового подкрепления, причем система расширенной миндалины играет в этом процессе ведущую роль в сравнении с паравентрикулярными механизмами гипоталамуса. Это доказывается опытами с блокадой экстрагипоталамических (в центральном ядре миндалины) и гипоталамических (в паравентрикулярной области) рецепторов кортиколиберина астрессином, который угнетает реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса и меняет действие разных наркогенов (морфина, лей-энкефалина, фенамина, этаминал-натрия) на нее.

2. У экспериментальных животных (крыс) большинство исследованных нейропептидов (лей-энкефалин) и синтетических наркогенов (фенамин, морфин, этаминал-натрий), обладают подкрепляющими свойствами в тесте самостимуляции латерального гипоталамуса. Подкрепляющий (наркогенный) потенциал изученных соединений различен и возрастает при выращивании животных в условиях стресса социальной изоляции. Кроме того, подкрепляющие свойства выявляются у некоторых эндогенных пептидов и белков (лей-энкефалин, белки теплового шока 70 кДа), но не кортиколиберина и субстанции Р при внутриструктурном введении их в центральное ядро миндалины или паравентрикулярное ядро гипоталамуса. Социальная изоляция крыс от сородичей меняет подкрепляющие свойства пептидов вплоть до инверсии.

3. В условиях хронической алкоголизации крыс, выращенных в сообществе, нейропептиды (лей-энкефалин, кортиколиберин, субстанция Р) при внутриструктурном введении в миндалину значительно повышают свои подкрепляющие свойства в тесте самостимуляции гипоталамуса, то есть, при искусственной активации подкрепляющих систем длительной алкоголизацией животные реагируют на естественные нейропептиды особым (измененным) образом.

4. Глюкокортикоидные гормоны (дексаметазон) и психостимуляторы (фенамин) реализуют свое действие на подкрепляющие системы мозга однотипно, но в разной степени. Максимальным стимулирующим действием обладают дофаминомиметические вещества, а глюкокортикоидные гормоны оказывают мягкий активирующий дозозависимый эффект. При этом первично-подкрепляющие свойства гормонов определяются в основном активацией дофаминергической системы, тогда как вторично-подкрепляющие свойства, помимо прямой активации данной системы, вовлекают и мнестические компоненты поведенческих реакций. Подкрепляющие свойства фенамина и глюкокортикоидных гормонов нарушаются при дисбалансе системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Это доказывается опытами с удалением гипофиза, надпочечников или избыточным введением адренокортикотропного гормона и дексаметазона.

5. Активация систем стресса и антистресса в раннем онтогенезе введением кортиколиберина или белков теплового шока 70 кДа (БТШ-70) существенно влияет на эмоциональное и двигательное поведение половозрелых крыс, а также состояние нейронов структур лимбической системы мозга. Отсроченные эффекты кортиколиберина и БТШ-70 различаются у самцов и самок, то есть зависят от пола животного. В структурах лимбической системы мозга (черная субстанция, вентральное область покрышки, подлимбическое поле, поясные поля) кортиколиберин, введенный в ранний постнатальный период, увеличивает рельефность (объем) нейронов, не меняя их плотности, а БТШ-70 вызывает умеренную дегенерацию нейронов, снижая их плотность. Фармакологические агенты пептидной природы (ноопепт, дилепт) устраняют или существенно уменьшают нарушения поведения, вызванного введением в раннем онтогенезе кортиколиберином или БТШ-70.

6. Психоактивные препараты, обладающие наркогенной активностью (фентанил, этаминал-натрий, лей-энкефалин, фенамин, дексаметазон, этанол), избирательно увеличивают экспрессию мРНК кортиколиберина в гипоталамусе и миндалине. В миндалине наибольшие значения экспрессии мРНК кортиколиберина регистрируются после введения дексаметазона, а в гипоталамусе - после введения этаминала натрия, этанола и фентанила.

7. Подкрепляющая система гипоталамуса обеспечивает однотипную реакцию на ведение наркогенов, тогда как система расширенной миндалины включает элементы как собственно подкрепления, так и стресс-реактивности. Это позволяет рассматривать нейрогормональную систему, вовлекающую миндалину, гипоталамус, гипофиз и надпочечники как структурно-функциональную основу формирования зависимости от различных наркогенов.

Научная новизна. Отсутствие четких представлений о механизмах формирования лекарственной зависимости от гормональных средств (гормонов стресса, в частности) и значении гормональной составляющей в механизмах действия наркогенов позволили автору сосредоточить основное внимание на изучении гормональных механизмов подкрепления, базисной функции мозга, определяющей адаптивное поведение человека и животных. С привлечением методологии экспериментального изучения медиаторных и гормональных механизмов подкрепления в работе рассмотрено участие гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в обеспечении подкрепляющей функции мозга. Особое внимание отведено внегипоталамическим кортиколибериновым механизмам подкрепления, новому направлению в психонейроэндокринологии. Подробное изучение системы расширенной миндалины (extended amygdala) показало, что центральное ядро миндалины, богатое содержанием кортиколиберина, играет ведущую роль в реализации подкрепляющих эффектов фармакологических средств, обладающих наркогенным потенциалом. Экспериментально доказано, что по сути миндалина выполняет побудительную роль в активации гипоталамических механизмов подкрепления. Это послужило отправной точкой в создании автором концепции амигдалярно-гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (АМГГИНА) системы как структурно-функциональной основе мозгового подкрепления, объединяющей ее медиаторные и гормональные механизмы. Именно системе АМГГИНА принадлежит ведущая роль в реализации подкрепляющих эффектов наркогенов (психостимуляторов, гипноседативных средств). Дисфункция системы, возникающая в раннем онтогенезе под воздействием стрессорных факторов, может лежать в основе развития девиантного поведения подростков, сопровождающегося повышенной агрессивностью, склонностью к употреблению психоактивных средств, депрессивностью и суцидальным поведением. Работа относится к исследованиям в области фундаментальной медицины.

Научно-практическая значимость работы. В работе продемонстрировано, что центральные (кортиколибериновые) механизмы стресса в значительной степени определяют подкрепляющую функцию мозга, благодаря которой индифферентный раздражитель становится значимым (сигналом). В этой системе ведущую роль играет центральное ядро миндалины, богатое скоплением рецепторов кортиколиберина (так называемая система расширенной миндалины). С позиции взаимодействия гормональных и медиаторных систем организма действие различных наркогенов (психостимуляторов, гипноседативных средств) зависит от состояния экстрагипоталамической системы кортиколиберина. Блокада рецепторов кортиколиберина в миндалине (в большей степени, чем в гипоталамусе) устраняет или существенно уменьшает подкрепляющее действие наркогенов в основном гипноседативной направленности (морфин, барбитураты, лей-энкефалин). Модуляция систем стресса-антистресса в раннем онтогенезе (постнатальном периоде) меняет поведенческие эффекты фармакологических средств. Эти изменения связаны с нарушением морфологии лимбических структур мозга. Направленное фармакологическое вмешательство с помощью препаратов пептидной структуры позволяет скоррегировать развивающиеся нарушения. На основании экспериментальных данных автором предложена концепция гиперциркуляции в амигдалярно-гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (АМГГИНА) системе как структурно-функциональной основе мозгового подкрепления, объединяющей ее медиаторные и гормональные механизмы. Доказывается, что именно системе АМГГИНА принадлежит ведущая роль в реализации подкрепляющих эффектов наркогенов (психостимуляторов, гипноседативных средств). На этом основании перспектива создания антинаркотических средств видится в изменении системы АМГИНА за счет блокады рецепторов кортиколиберина, составляющих основу подкрепления. Изучение этих и родственных с ними вопросов во многом может приблизить нас к пониманию механизмов зависимости и к разработке конкретных рекомендаций по ее биологической профилактике.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры неврологии и психиатрии и кафедры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого, кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, кафедры наркологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ, вошли в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований (№04-04-49672 и №07-04-00549). Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого.

Апробация материалов исследования. Материалы диссертации доложены на 33-м (Италия, 2003) и 35-м (Глазго, Шотландия, 2005) конгрессах международного общества психонейроэндокринологии (ISPNE), Всероссийской конференции "Актуальные вопросы психоэндокринологии", посвященной памяти проф. А.И. Белкина (Москва, 2004), международной конференции "Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине" (Минск, 2004), 3-м региональном конгрессе ISPNE (Невшехир, Турция, 2004), Всероссийских конференциях "Нейрохимия. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), "Нейроэндокринология-2005" (Санкт-Петербург, 2005), "Нейроиммунология-2005" (Санкт-Петербург, 2005), "Механизмы функционирования висцеральных систем", посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2005), XIV съезде психиатров России (Москва, 2005), 4-й международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006), 10-й международной конференции "Стресс и поведение" (Санкт-Петербург, 2007), 20-м международном конгрессе по нейропсихофармакологии (Барселона, Испания, 2008) обсуждены на совместном заседании кафедр неврологии и психиатрии, специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого, кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и Физиологического отдела им. И.П. Павлова НИИ экспериментальной медицины РАМН г. Санкт-Петербурга (Новгород 2009 год).

Публикация материалов исследования. Материалы диссертации вошли в монографии "Гормональные механизмы подкрепления", СПб.: Элби-СПб, 2008. 272 с. и "Иммунонаркология", СПб: Элби-СПб, 2008. 224 с. (с coавторами). По теме диссертации опубликованы 19 журнальных статей (11 статей в изданиях, рекомендованных ВАК) и 17 статей и тезисов в сборниках научно-практических работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка научной литературы. Работа изложена на 309 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и 39 таблицами. Библиографический указатель содержит 549 наименований, в том числе 100 отечественных и 449 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Выбор животных. Опыты выполнены на 2156 крысах самцах и самках Вистар и Спрэг-Доули массой 200-250 г, выращенных в группе по 5 особей или в условиях социальной изоляции от сородичей с 17-го дня жизни в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22±2^оС. Все опыты проведены в осенне-зимний период.

Выращивание животных в условиях частичной сенсорной и полной внутривидовой изоляции. Животных помещали в индивидуальные клетки с 17-го дня после рождения, когда они становились способными к самообеспечению. В изоляции крысы находились до 90-100 дней. Именно такой период постнатального развития считается наиболее значимым для влияния различных воздействий внешней среды на формирование адаптивного поведения у крыс (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007). К началу опыта возраст животных-изолянтов и сгруппированных крыс был одинаков (90-100 дней). После каждого опыта крысы-изолянты помещались в свои индивидуальные клетки.

Вживление электродов и канюль в структуры мозга. Вживление электродов в мозг крысам проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с использованием стереотаксического прибора фирмы "Medicor", Венгрия. Билатерально в латеральное гипоталамическое ядро вживляли нихромовые монополярные электроды в стеклянной изоляции (диаметр электрода 0,25 мм, длина оголенного кончика 0,25-0,30 мм, его толщина 0,12 мм) по следующим координатам: АР = 2,5 мм назад от брегмы, SD = 2,0 мм латерально от сагитального шва, Н = 8,4 мм от поверхности черепа (Kцnig, Klippel, 1963). Индифферентный электрод из нихромовой проволоки закрепляли на черепе животного. Все электроды коммутировались на микроразъеме, который фиксировался на черепе самотвердеющей пластмассой.

Металлические направляющие канюли из нержавеющей стали диаметром 0,2 мм вживляли униполярно в правое центральное ядро миндалины одновременно с гипоталамическими электродами по следующим координатам: АР = 2,8 мм назад от брегмы, SD = 3,9 мм латерально от сагитального шва, Н = 8,2 мм от поверхности черепа, либо в правую паравентрикулярную область гипоталамуса по координатам: АР = 2,0 мм назад от брегмы, SD = 1,5 мм латерально от сагитального шва, Н = 8,4 мм от поверхности черепа (Kцnig, Klippel, 1963). При внутриструктурном введении веществ в направляющие вставляли металлические микроканюли диаметром 100 мкм, кончик которых был на 0,2 мм длиннее направляющей. Канюли фиксировали на черепе животного самотвердеющей пластмассой и после операции закрывали специальным колпачком, который временно снимали для введения веществ в структуру мозга.

Поведенческие эксперименты начинали не ранее 10 дней после операции. По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию через вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с.

Методы самораздражения мозга у крыс. Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажимать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздражения мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, 1 мс, 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговые значения тока в режиме "фиксированных пачек"). Частота и длительность нажатий регистрировались автоматически. Анализировали частоту и время каждого нажатия на педаль. На основании этих результатов вычисляли коэффициент "рассогласования" (Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 1992), который является удобным дополнительным показателем для оценки действия фармакологических препаратов.

Исследование поведения крыс в "открытом поле". Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте "открытого поля", представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см с 16 отверстиями (норками) диаметром 3 см каждая. Продолжительность одного опыта составляла 3 мин. Регистрировали ряд элементарных двигательных актов и поз: горизонтальную и вертикальную активность, груминг, заглядывание в норки и др. Полученные данные обрабатывали математически.

Условная реакция предпочтения места. Опыты проводили в прямоугольной установке размером 35х 55х 30 см, стороны которой различались цветом (темный и светлый) и текстурой пола и были разделены перегородкой с опускающейся дверцей. В 1-й тестовый день регистрировали время нахождения животного в каждом отсеке в течение 10 мин. Отсек считался предпочитаемым, если животное проводило в нем больше 50 % времени. В последующие 6 дней обусловливания дверцу между отсеками закрывали. Животные получали через день инъекцию препарата непосредственно перед помещением в исходно непредпочитаемый отсек на 60 мин и инъекцию 0,9 %-ного раствора хлорида натрия перед помещением в исходно предпочитаемый отсек; животные контрольной группы получали только физиологический раствор. Средством инициации предпочтения служил фенамина гидрохлорид 1 мг/кг. Во 2-й тестовый день дверцы открывали и повторно измеряли время нахождения в каждом из отсеков в течение 10 минут.

Исследование функциональной асимметрии мозга с помощью метода ротации. Число ротаций определяли в полусфере диаметром 30 см через 30 мин после введения фенамина (2,5 мг/кг) за два последовательных периода по 10 мин, используя для анализа средние значения (определяемые за 10 мин). Регистрировали число полных вращений на 360^о отдельно вправо и влево, а также число неполных ротаций от 90^о до 360^о. В последние 10 с каждой минуты тестирования в ротометре определяли также показaтель стереотипии по 6-бальной шкале (Лебедев А.А., 2001).

Исследование тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте. Лабиринт состоял из двух открытых рукавов 50х 10 см и двух закрытых рукавов 50х 10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 мин.

Исследование агрессии в тесте "чужак-резидент". Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте "чужак-резидент" в соответствии с описанием этологического атласа (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007). Смысл методики состоит в том, что к крупному самцу, находящемуся в клетке (резиденту), подсаживают более мелкое животное (чужака). Регистрировали число поведенческих проявлений агрессивности и защиты, а также общее число поведенческих актов, описывающих взаимоотношение двух особей крыс.

Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта. Плавательный тест "отчаяния" Р.Д. Порсолта (1977) предусматривает оценку двигательной активности крыс, помещенных в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 27±1^оС. Животное помещают в цилиндр на 6 мин, регистрируют время активного и пассивного плавания и время иммобилизации. Увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации рассматривают как антидепрессантный эффект.

Исследование кратковременной памяти в Y-образном лабиринте. Экспериментальная установка представляла камеру с тремя равными рукавами, расположенными по отношению друг к другу под углом 120^о. Перед опытом один рукав камеры закрывали непрозрачной перегородкой. Крысу сажали в центр установки, и в течение 5 мин она обследовала свободные два ее рукава. Регистрировали время нахождения в рукавах. Через 2 ч повторяли эксперимент, предварительно открыв третий закрытый рукав. Животное могло обследовать все три рукава экспериментальной камеры в течение 5 мин, регистрировали те же показатели во всех рукавах. Об уровне кратковременной памяти судили по времени нахождения в новом рукаве установки.

Исследование кратковременной памяти с помощью условной реакции пассивного избегания (УРПИ). УРПИ электрокожного раздражения вырабатывали в одной пробе по методике Б.И. Любимова (1965). Установка состояла из двух отсеков - большого освещенного и малого темного с электрифицированным полом, соединенных круглым отверстием. Животных помещали в установку (освещенную ее часть) на 3 мин. В течение этого времени регистрировали суммарное время нахождения крысы в обоих отсеках, число захождений в темную часть установки и латентный период (ЛП) первого захождения в темную камеру. В конце 3-й мин, когда животное, как правило, находится в темной камере, на ее решетчатый пол подавали электрический ток (50 Гц, 2-3 с, 10 мс, пороговые значения тока, определяемые по вокализации), заставлявший крысу перебегать в освещенный отсек. После этого крысу сразу же из него удаляли. Контрольное тестирование осуществляли через 24 ч после обучения. Удлинение ЛП первого захождения в темную камеру, увеличение суммарного времени пребывания в освещенном отсеке и уменьшение числа захождений в темную часть установки трактовали как улучшение сохранения УРПИ, а противоположные изменения указанных показателей - как нарушение сохранения (амнезию) навыка.

Исследование поведения крыс в тесте "свет-темнота". Крыс помещали в светлый отсек двухкамерной установки размером 35х 55х 30 см, стороны которой различались цветом (темный и светлый) и текстурой пола и были разделены перегородкой с опускающейся дверцей. Регистрировали время пребывания в освещенной и темной отсеках установки и число выглядываний из темного отсека в течение 10 минут. Увеличение времени пребывания в светлом отсеке квалифицировали как снижение тревожности.

Операции удаления гипофиза и надпочечников. Экстирпацию гипофиза у крыс осуществляли трансаурикулярно в специальном стереотаксическом приборе, как описано в работе П.Д. Шабанова и Н.С. Сапронова (1986). Двустороннюю адреналэктомию производили, используя параспинальный доступ. Ложнооперированные животные подвергались всем оперативным манипуляциям, за исключением удаления гипофиза и надпочечников. Поведенческие опыты начинали на 10-е сутки после проведения всех операций.

Процедура полунасильственной алкоголизации. Часть крыс (174 крысы) подвергали полунасильственной алкоголизации, когда раствор этанола являлся единственным источником жидкости. Алкоголизацию крыс из сообщества и крыс-изолянтов начинали проводить с 17-го дня жизни, времени отсадки последних в индивидуальные клетки. Проводили ступенчатую алкоголизацию: в 1-й месяц жизни - 5 %-ным раствором этанола, во 2-й месяц - 10 %-ным и с 3-го месяца - 15 %-ным раствором этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму. Поведенческие опыты начинали у крыс в возрасте не менее 90-100 дней. На период поведенческих экспериментов алкоголь не отменяли.

Процедура форсированной наркотизации. Крысы в течение 4 дней подряд внутрибрюшинно получали в возрастающих дозах один из препаратов: 1) физиологический раствор (контроль; 0,1-0,2-0,4-0,8 мл/крысу), 2) психомоторный стимулятор фенамин (0,5-1,0-2,0-4,0 мг/кг); 3) наркотический аналгетик фентанил (0,00625-0,0125-0,025-0,05 мг/кг), 4) этанол (0,5-1,0-2,0-4,0 г/кг), 5) снотворное барбитурового ряда этаминал натрия (2,5-5-10-20 мг/кг) или 6) синтетический глюкокортикоид дексаметазон (0,5-1,0-2,0-4,0 мг/кг). Форсированный режим введения препаратов предусматривал повышение дозы препарата вдвое в каждый последующий день введения (всего 4 введения). Такой способ введения обеспечивает градуальную нагрузку организма препаратом и препятствует развитию толерантности. Данный способ активно применяется для ускоренного формирования зависимости (или отдельных ее признаков) от ряда наркогенов (Константинопольский М.Б. и др., 2006; Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2008).

Исследование экспрессии мРНК с помощью полимеразной цепной реакции. Экспрессию мРНК КРГ и аргинил-8-вазопрессина в гипоталамусе и миндалине крыс определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Тотальную мРНК выделяли в соответствии со стандартным протоколом (Sambrook et al., 1989) с использованием гуанидина тиоционата (Promega, США). Специфические праймеры подбирали с помощью программы Primer-Master 1.0 по нуклеотидным последовательностям соответствующих мРНК и ДНК крыс, полученным из Европейского молекулярного банка данных. В качестве внутреннего стандарта для оценки прохождения реакции обратной транскрипции использовали мРНК -актина.

Анализ ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием для визуализации мРНК. Фотографирование гелей производили цифровым фотоаппаратом Canon (Power Shot S30) в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Денситометрический анализ электрофоретических полос проводили с помощью программы SCNImage. Уровень мРНК КРГ и вазопрессина нормировали относительно уровня мРНК -актина, и представляли результат в виде соотношения этих величин.

Морфологические исследования. Головной мозг крыс в возрасте 4 мес через 3 мин после декапитации фиксировали в 9 %-ном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике приготовления гистологических препаратов. Производили ленточные серийные срезы головного мозга во фронтальной плоскости от лобного полюса правого полушария до рострального отдела моста. Шаг лезвия бритвы составлял 8 мкм, для последующей съемки на CCD Camera (320 КРixel) через микроскоп Laboval - 5 мкм. Расстояние среза от лобного полюса полушария определяли по количеству серийных срезов. Вычисляли среднее арифметическое и среднее квадратичное отклонение. Срезы в гистологических микропрепаратах окрашивали гематоксилином-эозином и по Нисслю. Составление блоков иллюстраций производили с помощью программы Microsoft Windows XP (Дробленков А.В., 2006).

Фармакологические вещества, используемые для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения. Для фармакологического анализа использовали психостимулятор фенамин (1-5 мг/кг), наркотический аналгетик морфин (1 мг/кг), барбитурат этаминал-натрий (5 мг/кг), эндогенный пентапептид лей-энкефалин (0,1 мг/кг), аналог меланостатина алаптид (1 мг/кг), антагонист опиоидных рецепторов налоксон (0,3 мг/кг), которые вводили внутрибрюшинно за 30-40 мин до опыта.

Белки и полипептиды вводили в центральное ядро миндалины или паравентрикулярное ядро гипоталамуса через вживленные в эти мозговые структуры канюли. Для анализа использовали лей-энкефалин (Sigma, США; 0,1-10 мкг), субстанцию Р (Sigma, США; 0,01-1 мкг), кортиколиберин (Sigma, США; 0,01-1 мкг), алаптид (Институт физиологии и фармакологии Чешской Республики, Прага; 0,1-1 мкг), астрессин (Sigma, США; 1 мкг), белки теплового шока 70 кДа (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург; 1-3 мкл, что соответствовало 0,3-1 мкг массы сухого белка). Все соединения вводили в помощью микроинъектора за 10-15 мин до тестирования после определения исходных значений самораздражения латерального гипоталамуса со скоростью 1 мкл/мин. Гормоны гипофиза (АКТГ, СТГ, ТТГ, ГТГ, арг-8-вазопрессин, лиз-8-вазопрессин, окситоцин) вводили внутрицистернально (0,1-0,2 ЕД/крысу) в объеме 10 мкл бодрствующим животным за 30 мин до тестирования.

Статистическая обработка полученных материалов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 крыс. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, таблиц В.С. Генеса (1967), дисперсионного анализа по методу ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка подкрепляющих свойств пептидов и синтетических наркогенов при их системном или центральном введении у крыс, выращенных в сообществе или в условиях социальной изоляции

При оценке подкрепляющих свойств пептидов и синтетических наркогенов в тесте самостимуляции латерального гипоталамуса (безусловных подкрепляющих свойств) у крыс наблюдали следующие закономерности (табл. 1).

Во-первых, не все исследованные вещества проявляют способность повышать подкрепление. Так, выраженными подкрепляющими свойствами в данном тесте обладают фенамин в дозе 1 мг/кг (+37 %), этаминал-натрий (+27 %), морфин (+18 %) и фенамин в дозе 5 мг/кг (+14 %). Следует отметить, что увеличение дозы фенамина в 5 раз не приводила к увеличению подкрепляющих свойств препарата. Во-вторых, алаптид и лей-энкефалин вовсе угнетали подкрепление, снижая его показатели соответственно на -29 % и -11 %. Антагонист опиоидных рецепторов налоксон не влиял на реакцию самостимуляции.

Несколько иные результаты были получены при изучении действия пептидов и синтетических наркогенов у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции.

Сопоставление эффектов фенамина на реакцию самостимуляции в камере Скиннера у крыс, выращенных в сообществе и в условиях изоляции, показывает, что они однонаправлены. Однако обращает внимание тот факт, что у крыс-изолянтов фенамин в большей степени стимулирует реакцию самораздражения в дозе 1 мг/кг (на +70 % против +37 % у сгруппированных), а в дозе 5 мг/кг проявляет сходный умеренно выраженный облегчающий эффект (на +23 % у изолянтов и +14 % у сгруппипрованных крыс). Эта однонаправленность сохраняется и при анализе значений коэффициента "рассогласования", хотя он снижается в большей степени при введении фенамина изолянтам. В то же время сами исходные значения коэффициента "рассогласования" у крыс-изолянтов значительно ниже, чем у животных, выращенных в сообществе (соответственно 0,12±0,04 и 0,18±0,02), что указывает на более высокую активацию системы "награды" у изолянтов в сравнении со сгруппированными животными.

Таблица 1. Влияние пептидов и синтетических наркогенов при системном введении на показатели самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс, выращенных в сообществе или в условиях социальной изоляции

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 в сравнении с соответствующим контролем.

Циклический аналог меланостатина алаптид у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции, на 19 % активировал реакцию самостимуляции. Этот умеренный психоактивирующий эффект препарата может быть связан с активацией D₂ рецепторов дофамина в мозгу. Однако следует отметить, что полученные в приведенной серии опытов данные противоположны тем, которые были продемонстрированы у сгруппированных животных, где алаптид на 29 % подавлял реакцию самостимуляции.

Блокада опиоидных рецепторов налоксоном, как и у сгруппированных животных, существенно не влияла на реакцию самостимуляции. У крыс-изолянтов налоксон лишь незначительно (на +9 %, p>0,05) подавлял самостимуляцию гипоталамуса.

Полученные результаты в части умеренной активирующей активности наркогенов и пептидов у крыс, выращенных в сообществе, вполне ожидаемы, поскольку реакция самораздражения мозга является одной из наиболее жестко детерминированных реакций, и ее активировать у интактных здоровых особей крыс нелегко. Социальная изоляция животных приводит к повышению чувствительности крыс к действию пептидов и синтетических наркогенов. Это особенно ярко проявляется в случае введения фенамина, который в дозе 1 мг/кг на 70 % повышал самостимуляцию мозга. Другие наркогены были менее активны, например, этаминал-натрий повышал реакцию самостимуляции у крыс-изолянтов на 39 % (p<0,05), морфин - на 31 % (p<0,05), лей-энкефалин - на 20 % (p>0,05). Видно, что общая тенденция действия всех исследованных наркогенов на реакцию самостимуляции сходна - все они активируют самостимуляцию мозга у крыс-изолянтов в большей степени, чем у животных, выращенных в сообществе.

В дальнейшем мы видоизменили исследования и оценили подкрепляющие свойства некоторых пептидов, которые вводили непосредственно в центральное ядро миндалины, в котором найдено максимальное скопление экстрагипоталамических кортиколиберинсодержащих нейронов.

Оценка подкрепляющих свойств пептидов и синтетических наркогенов при их центральном введении в миндалину у крыс, выращенных в сообществе или в условиях социальной изоляции. В данном разделе исследований оценили подкрепляющие свойства некоторых пептидов и синтетических наркогенов при их введении в центральное ядро миндалины через имплантированные в мозг канюли. В этой серии экспериментов было найдено, что наибольшими подкрепляющими свойствами у крыс, выращенных в сообществе (естественной среде лабораторных животных), обладают белки теплового шока 70 кДа (БТШ-70), которые зависимо от дозы (0,1-1 мкг) повышали самостимуляцию на 18-48 %, алаптид 0,1 мкг (+26 %) и лей-энкефалин 0,1 мкг (+16 %). В других дозах эти соединения не активировали самостимуляции, а алаптид 0,5 мкг даже ее подавлял (-24 %). Стабильно угнетающий эффект на самостимуляцию оказывал кортиколиберин в дозах 1 и 10 мкг (-28-31 %), неизбирательный антагонист его рецепторов астрессин (-55 %) и субстанция Р 0,1 мкг (-22 %). Остальные вещества существенно не меняли реакции самостимуляции (табл. 2).

В дальнейшем мы расширили эксперименты и выполнили сходные исследования на крысах, выращенных с 17-го дня жизни в условиях полной внутривидовой и частичной сенсорной изоляции. Опыты выполняли на половозрелых особях в возрасте 90-100 дней.

Таблица 2. Влияние пептидов и белков теплового шока 70 кДа при введении в центральное ядро миндалины на показатели самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс, выращенных в сообществе или в условиях социальной изоляции

Примечание. *р<0,05; **р<0,01 в сравнении с контролем.

У крыс, выращенных в условиях социальной изоляции от сородичей, эффекты действия пептидов несколько видоизменились. Так, сохранил свое подкрепляющее действие лей-энкефалин 0,1 мкг (+56 %). В то же время в дозе 0,5 мкг лей-энкефалин существенно подавлял самостимуляцию гипоталамуса (-34 %). Сходным образом БТШ-70, проявлявший активирующий эффект на самостимуляцию крыс из сообщества, подавлял ее у крыс-изолянтов (-12-27 %).

Напротив, кортиколиберин умеренно активировал реакцию самостимуляции (+11-19 %), а субстанция Р 0,1 мкг выражено ее повышала (+45 %). Оба последних пептида оказывали противоположный эффект у крыс, выращенных в сообществе. Другие соединения существенно не влияли на реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс-изолянтов.

Таким образом, выращивание животных в условиях социальной изоляции меняет реактивность животных на введение пептидных препаратов. При этом реакции многих из них извращаются и даже меняются на противоположные. В целом, безусловное подкрепление, оцененное в тесте самостимуляции латерального гипоталамуса, существенно отличается от других подкрепляющих реакций (например, от реакции предпочтения места, которую рассматривают как условнорефлекторное подкрепление), где практически все наркогены синтетической и пептидной природы оказывали однонаправленное действие (Ли Ю.А., 2005).

Оценка подкрепляющих свойств пептидов и синтетических наркогенов при блокаде рецепторов кортиколиберина в миндалине и гипоталамусе астрессином. Как известно из литературы, наибольшее скопление рецепторов кортиколиберина зарегистрировано в гипоталамусе и миндалевидном комплексе. Это определило цель настоящего раздела работы - изучить значение рецепторов кортиколиберина, локализованных в миндалине и паравентрикулярной области гипоталамуса, для действия некоторых пептидов и синтетических наркогенов на реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса. Для блокады рецепторов кортиколиберина использовали неселективный антагонист астрессин (Sigma, США), который вводили в дозе 1 мкг локально в структуры мозга (центральное ядро миндалины или паравентрикулярную область гипоталамуса), в объеме 1 мкл, растворяя его в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Скорость подачи раствора, содержащего астрессин, составила 1 мкл/мин. Выбор дозы астрессина и других соединений основывался на предпочтительном использовании указанных доз в поведенческих экспериментах. В качестве контроля использовали введение 0,9 %-ного раствора хлорида натрия.

Астрессин, вводимый локально в центральное ядро миндалины, снижал число нажатий на педаль более чем в 2 раза (-55 %), а при введении в паравентрикулярную область гипоталамуса - лишь на 17 %. На фоне микроинъекции астрессина в миндалину или паравентрикулярную область гипоталамуса системно вводимый фенамин сохранял свой психоактивирующий эффект, при этом прирост числа нажатий на педаль относительно действия самого астрессина составил +68 % и +24 % соответственно (табл. 3). Сходный эффект регистрировали и для этаминал-натрия, где прирост числа нажатий на педаль относительно действия самого астрессина в указанных группах составил +94 % и +50 % соответственно, , т. е. проявлялся в полной мере (был выше исходных значений в контроле на 33-39 %).

Таблица 3. Влияние фенамина, этаминал-натрия, морфина и лей-энкефалина на показатели самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс, выращенных в сообществе, после внутриструктурного введения астрессина

Примечание. *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 в сравнении с соответствующим контролем; в/ам - внутриамигдалярное введение, в/гип - внутригипоталамическое введение (в паравентрикулярное ядро).

В то же время, активирующее действие морфина на реакцию самостимуляции гипоталамуса полностью блокировалось внутриамигдалярным (-57 % против +18 % в контроле), но не внутригипоталамическим (+27 %) введением астрессина. Лей-энкефалин еще более драматически угнетал реакцию самостимуляции (-89 % против -11 % в контроле) на фоне внутриамигдалярной блокады рецепторов кортиколиберина астрессином. И, сходно с действием морфина, лей-энкефалин не проявлял своего психоактивирующего действия на фоне внутригипоталамического ведения астрессина.

Таким образом, блокада экстрагипоталамических (локализованных преимущественно в центральном ядре миндалины) рецепторов кортиколиберина астрессином меняет действие разных наркогенов на реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса.

На этом фоне этаминал-натрий и в меньшей степени фенамин сохраняют выраженный психоактивирующий эффект, а у морфина умеренный стимулирующий эффект меняется на депрессантный. Лей-энкефалин при этом вызывает стойкий депрессантный эффект, потенцируя действие астрессина.