Иммунохимические показатели в клинической оценке черепно-мозговой и скелетной травмы

18

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Иммунохимические показатели в клинической оценке черепно-мозговой и скелетной травмы

03.00.04. - Биохимия

доктора медицинских наук

Коханов Александр Владимирович

Москва - 2009

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, Терентьев

доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава».

доктор медицинских наук, профессор Тогузов Руслан Тимофееевич

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

доктор медицинских наук, профессор Сучков Сергей Викторович

ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава

Ведущая организация: - ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» Адрес: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а. фетопротеин беременность гликопротеин интоксикация

Защита диссертации состоится «____» _________2009 г. в ____ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу: 117997, ул. Островитянова, 1)

Автореферат разослан «____» ____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор П.К. Джанашия

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. За последние 5 лет летальность от дорожно-транспортных происшествий в РФ увеличилась на 65% и число погибших, по данным ГИБДД, достигает 33-35 тыс. человек в год [Багненко С.Ф. и соавт., 2008; Соколов В.А. и соавт., 2008]. Травма, особенно черепно-мозговая (ЧМТ) и политравма, остаётся одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения [Шапот Ю.Б. и соавт., 2002; Агаджанян В.В., 2003; Гаврилин С.В. и соавт., 2006], а у лиц, не достигших 40 лет, тяжелая сочетанная травма занимает первое место среди причин смерти [Краснов А.Ф., Соколов В.А., 1995; Бондаренко А.В. и соавт., 2004; Соколов В.А., 2006].

Отдельной проблемой социального и медицинского характера является высокая взаимосвязь травматизма с состоянием алкогольной интоксикации пострадавших [Шабанов П.Д., Калишевич С.Ю., 1998; Демин А.К., Демина И.А., 2000; Пауков В.С. и соавт., 2001; Ельский А.В. и соавт., 2003; Цивинский А.Д. и соавт., 2003; Соколов В.А., 2006]. Интоксикация этанолом, обнаруживаемая у 35% пострадавших [Цеймах Е.А. и соавт., 2003], существенно утяжеляет течение травматической болезни и ухудшает ее прогноз.

Наиболее распространенным сочетанием при политравмах остается комбинация повреждений опорно-двигательного аппарата и головного мозга [Цеймах Е.А. и соавт., 2003; Соколов В.А., 2006]. Даже в случае изолированной ЧМТ легкой степени, на долю которой в структуре нейротравмы приходится от 60 до 80%, все более ощутимой становится ее социальная и экономическая цена [Лихтерман Л.Б. и соавт., 2000; Лебедев В.В., Крылов В.В., 2000; Куршакова И.В., 2006; Царенко С.В., 2006].

Несмотря на очевидные успехи медицинской науки по спасению и реабилитации контингента ранее обреченных больных, сохраняется высокий процент смертности и осложнений после тяжелых изолированных, множественных и сочетанных травм [Неговский В.А., Мороз В.В., 2000; Гуманенко Е.К., Сингаевский А.Б., 2004; Гаврилин С.В. и соавт.,2006; Царенко С.В., 2006].

Отсутствие заметного прогресса в лечении этой группы пострадавших привело в 90-х годах к пересмотру взглядов на патогенез травмы и возникновению концепции травматической болезни [Дерябин И.И., Насонкин О.О., 1987; Котельников Г.П., Чеснокова И.Г., 2002; Вашетко Р.В., 2003; Калинкин О.Г., Калинкин А.О, 2003; Селезнев С.А., Шапот Ю.Б., Багненко С.Ф., 2003]. Суть ее в том, что вызываемые травмой нарушения витальных функций и параметров гомеостаза носят закономерный пролонгированный характер и характеризуются однотипностью первичных аварийных регуляторных реакций и адаптационных синдромов, независимо от локализации повреждения [Флорикян А.К., 1999; Немченко Н.С. и соавт., 2001; Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2005; Астраков С.В., 2007; Кудлай Д.А., 2007].

С другой стороны известно [Шапот Ю.Б. и соавт., 1995; Лейдерман И.Н. и соавт., 1997; Соколов В.А., 2006; Царенко С.В., 2006], что изменения многих показателей аварийного метаболизма при ЧМТ отличаются от первичных аварийных регуляторных реакций, характерных для травмы другой локализации, в частности, опорно-двигательного аппарата (ОДА).

Для решения вопроса о клиническом значении сходства и различий аварийного метаболизма при ЧМТ и травме ОДА полезную информацию можно получить, применив чувствительные методы иммунохимического анализа [Зильбер Л.А., 1968; Петров Р.В., 1987; Нго Т., Ленхофф Г., 1988; Егоров А.М. и соавт., 1991], которые пока не находят распространения в ургентной медицине.

Исследования роли иммунохимических показателей в остром периоде травмы должны получить добавочный импульс еще и в силу того, что появление нанотехнологий уже привело к созданию новых экспресс-методов анализа [Биосенсоры, 1992; Дзантиев Б.Б. и соавт., 2003; Гвоздев А.Р., Гвоздев Р.И. 2003; Ермолов А.С. и соавт., 2008; Заседателев А.С. и соавт., 2008; Меньшиков В.В., 2008; Рупперт Й., Кузьмина Н. 2008; Morgan C.L. et al., 1996; Vikinge T.P. et al., 1998] (иммуносенсоры, иммуночипы, количественные и качественные иммунохроматографические тесты, основанные на методах «сухой» химии), отвечающих потребностям медицины критических состояний [Зильбер А.П., 1995; Неговский В.А., Мороз В.В., 2000].

Однако, на сегодняшний день спектр иммунохимических тестов, диагностически и прогностически значимых для острого периода ЧМТ и травмы ОДА и пригодных для мониторирования состояния больных, не систематизирован [Немченко Н.С. и соавт., 2001; Верховский А.И. и соавт., 2003; Черный и соавт., 2003].

Неравномерно исследованы взаимосвязи отдельных белков со степенью выраженности основных синдромов травматической болезни (гипоксия, системный воспалительный ответ, коагулопатия, токсемия и т.д.) [Гуманенко Е.К. и соавт., 1999; Верховский А.И. и соавт., 2003; Куршакова И.В. и соавт., 2003; Мустафин Р.Д., 2004; Гаврилин С.В. и соавт., 2006; Матюшичев В.Б., Шамратова В.Г., 2006; Соколов В.А., 2006], не проводилось комплексного изучения взаимосвязи уровня и спектра белков сыворотки с количественной оценкой (в баллах) степени тяжести состояния пострадавших.

Вместе с тем, давно существует и постоянно пополняется широкий выбор маркерных белков для иммунохимического контроля воспалительных и иммунных реакций, септических осложнений, повреждения тканей и органной недостаточности [Долгов В.В., Шевченко О.П., 1997; Чехонин В.П. с соавт., 1999; Мороз В.В. и соавт., 2000; Назаров П.Г., 2001; Черешнев В.А., Гусев Е.Ю., 2001; Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2002; Галстян Г.М. и соавт., 2003; Лисков Л.В., 2003; Симбирцев А.С., 2004; Титов В.Н., 2004; Шевченко О.П. и соавт., 2005; Наджар М.X. и соавт., 2007; Brunkhorst F.M. et al., 2000].

Роль других белков, таких как СБАГ, транскортин или ПЩФ, в патогенезе травмы практически не исследована, очевидно, по причине отсутствия на эти белки коммерческих тест-систем [Зорин Н.А. и соавт., 2006; Сухарев А.Е. и соавт., 2006; Безрукавникова Н.В., 2008]. Для восполнения этого пробела становится актуальной проблема их выделения, очистки и конструирования моноспецифических тест-систем для их количественного анализа.

Систематизация значимых имунохимических индикаторов состояния постравматического аварийного метаболизма актуальна и для диагностики и прогнозирования осложнений, и для оценки результатов оперативного и консервативного лечения. В том числе такого перспективного метода немедикаментозного лечения, как транскутанная электростимуляция головного мозга (ТКЭС), эффективной при лечении сопутствующей травме алкогольной интоксикации [Кацнельсон Я.С., 1985; Гриненко А.Я. и соавт., 1988; Крупицкий Е.М. и соавт., 1988; Герасимова Л.И. и соавт., 1997; Бураков А.М. и соавт., 1999; Кораблева Н.Н., 1999; Демичев Н.П. и соавт., 2002; Суринков Д.Б., 2004].

Цель исследования.

Улучшение диагностики и мониторинга состояния пострадавших с травмами головного мозга и опорно-двигательного аппарата путем включения в программу клинико-лабораторного обследования иммунохимических показателей.

Задачи исследования.

1. Изучить физико-химические свойства альфа-фетопротеина (АФП), плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ), связанного с беременностью альфа₂-гликопротеина (СБАГ), транскортина (ТК) и сывороточного альбумина (СА).

2. Разработать методы выделения и очистки СБАГ, ТК, АФП и ПЩФ и сконструировать иммунохимические тест-системы различной чувствительности для определения СБАГ, ТК и ПЩФ.

3. Определить связь этих и других белков крови со степенью тяжести травматического эндотоксикоза, гипоксии, системного воспалительного ответа, комы и других патологических синдромов острого периода черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА).

4. Разрабатывать иммунохимические тесты для количественной оценки эндогенной интоксикации, гипоксии, кровопотери и других синдромов.

5. Проанализировать в динамике травматической болезни взаимосвязь уровней иммунохимических, биохимических и гематологических показателей между собой и с количественной оценкой тяжести повреждения, общего состояния пострадавшего, выраженности алкогольной интоксикации при поступлении, характера последующих осложнений и метода лечения, в том числе транскутанной электроимпульсной стимуляции головного мозга.

6. Используя методы статистического анализа отобрать диагностически и прогностически значимые лабораторные и иммунохимические показатели, общие и различные для травмы головного мозга и перелома длинных костей.

Научная новизна исследования.

На основании изучения физико-химических характеристик сывороточных белков, связывающих гидрофобные лиганды, разработан новый общий метод выделения и очистки альфа-фетопротеина (АФП), связанного с беременностью альфа₂-гликопротеина (СБАГ), транскортина (ТК) и сывороточного альбумина (СА), основанный на принципах гидрофобной, высаливающей и аффинной хроматографии.

Впервые обнаружена корреляция уровней СБАГ, ТК и СА как со степенью выраженности интоксикационного синдрома (значения МСМ и ЛИИ), так и со степенью выраженности SIRS. Показано, что белки с транспортной функцией в большей степени коррелируют со степенью интоксикационного синдрома, и в меньшей -- с SIRS. Для СРБ и других БОФ, не выполняющих транспортную функцию наблюдаются противоположные корреляционные отношения.

Впервые в сыворотках крови больных с выраженным травматическим эндотоксикозом обнаружено явление нарастания термостабильной фракции сывороточного альбумина (ТСА), пропорционально степени выраженности эндотоксикоза. Разработан и внедрен в клиническую практику новый иммунохимический способ определения связывающей емкости альбумина по отношению к низкомолекулярным веществам различного происхождения, являющийся иммунохимическим способом количественной оценки степени эндогенной интоксикации.

Проведен многомерный статистический анализ уровней изученных биохимических, гематологических показателей и содержания острофазовых, сывороточных и онкофетальных белков в сыворотках у больных в группах с изолированной и сочетанной ЧМТ и травмой ОДА с количественной оценкой тяжести травмы и общего состояния пострадавших при поступлении и в динамике травматической болезни, в том числе с учетом сопутствующей алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении.

Впервые определена диагностическая и прогностическая эффективность определения у больных с изолированной и сочетанной ЧМТ и переломами длинных костей отдельных иммунохимических показателей, а также их комбинаций и отношений (диагностических коэффициентов). С помощью многомерного факторного анализа из числа острофазовых, сывороточных и органоспецифических белков отобраны маркеры, эффективные для оценки степени выраженности гипоксии, интоксикации, SIRS, септических осложнений на ранних и поздних стадиях ЧМТ, травмы ОДА и политравмы.

Впервые определена взаимосвязь каждого из отобранных антигенов со степенью выраженности основных патологических синдромов, сопутствующих изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА.

Впервые с биохимических и иммунохимических позиций нашел подтверждение синдром взаимного отягощения при сочетанной травме и у пострадавших с СГМ и диафизарными переломами длинных костей на фоне алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении. Обнаружены изменения сывороточных уровней железосодержащих белков ферритина и лактоферрина, в сочетании с некоторыми биохимическими параметрами (глюкоза и рО₂) перспективные в дифференциальной диагностике этиологии комы.

Впервые для оценки степени гипоксии при тяжелой нейро- и скелетной травме использован иммунохимический тест на фетальный гемоглобин, введен новый информативный показатель: коэффициент отношения HbF/HbA.

Впервые с иммунохимических позиций подтверждена эффективность применения у больных с СГМ и диафизарными переломами длинных костей разновидность транскраниальной электростимуляции мозга -- МДМ-терапии.

Практическая значимость работы.

Предложенные схемы выделения и очистки белков с помощью хроматографии на аффинных и гидрофобных носителях позволяют получать очищенные препараты ПЩФ, СБАГ и ТК для конструирования иммунохимических тест-систем.

Установлено, что тяжелая изолированная и сочетанная ЧМТ и травма ОДА сопровождаются эндогенной интоксикацией, пропорциональной степени тяжести повреждения. Отмечено повышение в крови тяжелых больных термостабильной фракции сывороточного альбумина в 1,5-2,5 раза. Это факт реализован в «способе определения связывающей емкости альбумина человека», который может быть использован как для исследования межмолекулярных взаимодействий типа «лиганд-альбумин» в эксперименте, так и для диагностики степени интоксикации в клинической практике.

По результатам исследований разработан и внедрен ряд диагностических тестов для иммунохимической оценки степени интоксикации и системного воспалительного ответа, степени тяжести политравмы, степени гипоксии при ЧМТ, степени травматического повреждения головного мозга, а также способ оценки эффективности МДМ-терапии при травматической болезни. Для нужд экспериментальной хирургии разработан новый иммуноферментный тест на АФП кролика для оценки послеоперационных репаративных процессов в паренхиматозных органах.

Предложен иммунохимический «способ оценки адаптационных реакций у травматологических больных» по результатам определения и последующего вычисления соотношения острофазовых белков (СРБ и СБАГ) и онкомаркеров (АФП и ПЩФ).

Иммунохимические экспресс-тесты на СБАГ, HbF, АФП, ПЩФ, ферритин, лактоферрин, б₂-макроглобулин, продукты деградации фибриногена могут найти применение в качестве критериев эффективности лечения травматической болезни мозга и ОДА.

Внедрение результатов исследования в практику.

Разработанные в диссертации методики и полученные результаты внедрены в практическую деятельность отделения анестезиологии и реанимации, нейрохирургического, травматологического отделений МУЗ «Городская клиническая больница №3» г.Астрахани, МНТК «Экологическая медицина» «Астраханьгазпрома», МУЗ «Станция скорой медицинской помощи» г.Астрахани, отделения реанимации МУЗ «Клинический родильный дом» г.Астрахани.

Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биологии, биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии, нервных болезней, травматологии и ортопедии Астраханской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроматографические характеристики альбумина, АФП, ПЩФ, СБАГ и ТК на гидрофобных и аффинных сорбентах зависят от ионной силы элюэнта, концентрации и свойств лигандов, что позволяет подбирать условия для их выделения и очистки. Характеристика очищенных препаратов АФП, ПЩФ, СБАГ и ТК и иммунохимических тест-систем для их определения.

2. Термостабильность транспортных белков сыворотки изменяется в присутствии лигандов, в том числе эндотоксинов известного и неизвестного составов. Это явление повышения термостабильности альбумина может быть использовано как тест для диагностики степени эндогенной и экзогенной интоксикации в клинической практике.

3. Уровни острофазовых, сывороточных и органоспецифических белков в сыворотках пострадавших, биохимические и гематологические показатели крови в динамике острого периода изолированной травмы головного мозга и переломов длинных костей в зависимости от степени тяжести травмы и степени тяжести состояния пострадавших при поступлении. Особенности изучаемых показателей в остром периоде нейро- и скелетной травмы на фоне алкогольной интоксикации при поступлении и во взаимосвязи с характером оперативного лечения и проводимой МДМ-терапией.

4. Взаимосвязь изучаемых иммунохимических показателей пострадавших с данными биохимических и гематологических исследований в динамике острого периода изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА. Иммунохимические показатели, эффективные для оценки основных патологических синдромов травматической болезни: маркеры степени выраженности гипоксии, интоксикации, SIRS, репаративных процессов, осложнений травмы ОДА и ЧМТ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на заседаниях кафедры биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, научно-практических конференциях сотрудников медицинской академии (Астрахань, 2000-2008); на заседаниях Астраханского областного научного общества травматологов-ортопедов (Астрахань, 2000-2005) и областного научного общества врачей скорой помощи (Астрахань, 2004-2007); на заседании проблемной комиссии ГОУ ВПО АГМА «Теоретическое и практическое изучение белков маркеров патологических состояний», 2004.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Влияние антропогенных факторов на морфогенез и структурные преобразования органов», Астрахань, 1991; международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза человека в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины», Астрахань, 2000, 2007; на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001»; на III съезде биохимического общества РАН, Санкт-Петербург, 2002; на VII съезде травматологов-ортопедов Белоруссии, Гомель, 2002; на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний», Астрахань-Москва, 2001, 2003; на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2004, Астрахань-Волгоград-Москва, 2006; на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря», Астрахань, 2005; Всероссийской конференции, посвященной 85-летию Астраханского областного научного общества хирургов (Астрахань, 2006); на научно-практическом Симпозиуме "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 2007, 2008) и Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 научных работ, в том числе, 13 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 310 страницах текста, иллюстрирована 49 таблицами, 37 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, характеристики обследованных больных, трех глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 319 отечественных и 144 зарубежных источника.

Личное участие автора в получении результатов исследования

Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

В работу вошли результаты исследований, проведенных совместно с представителями клинических кафедр и научных лабораторий АГМА, РГМУ, других учебных и научных учреждений. Автор выражает благодарность всем коллегам, в соавторстве с которыми были опубликованы работы.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Объектом биохимического исследования являлась группа сывороточных и ассоциированных с беременностью белков, обладающих сродством к стероидным гормонам: альбумина, АФП, ТК и СБАГ (сыворотки крови пуповинной крови и беременных третьего триместра при нормально протекающей беременности и с гестозом), ПЩФ (экстракт плаценты). Образцы препаратов белка исследовались методами ионообменной, гидрофобной, высаливающей и аффинной хроматографии. Очищенные препараты белков ТК и СБАГ получали из сывороток беременных, АФП-- из абортивного материала, ПЩФ -- из экстракта доношенной плаценты по схемам, разработанным самостоятельно.

Для качественной и количественной характеристики исходных препаратов, фракций и очищенных препаратов ТК, СБАГ и ПЩФ использовали иммунохимические, электрофоретические и хроматографические и другие методы очистки белков (Л.А.Зильбер, ред., 1968; Г.Детерман, 1970; Г.Маурер, 1971; Э.Руослахти, 1979; Л.А.Остерман, 1983,1985; Э.Гааль и соавт., 1982; X. Фримель, ред., 1987; О.Микеш, ред., 1982; Р.Скоупс, 1985; А.М.Егоров и соавт., 1991). Использовали диск- (Davis 1964; Ornstein 1964) и SDS-электрофорез (Laemmli, 1970), электрофорез в градиенте концентраций (5-40%) ПААГ (Kopperschlander et al. 1969) и градиенте мочевины (0-8М), двухмерные системы (фингерпринты); препаративный электрофорез. Идентификацию полученных препаратов проводили методами иммунохимического анализа. Содержание общего белка в экстрактах и фракциях определяли по O.H.Lowry et al. (1951) или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу. Всего протестировано свыше 3000 образцов биоматериала.

Антисыворотки к ТК, ПЩФ и СБАГ получены нами самостоятельно путем гипериммунизации кроликов очищенными антигенами по общепринятым схемам. Верификацию моноспецифических тест-систем проводили с референтными наборами на эти антигены из банка тест-систем кафедры биохимии АГМА.

Клинический материал представлен 472 больными с изолированными и сочетанными черепно-мозговыми травмами и переломами длинных (трубчатых) костей нижних конечностей мужского и женского пола в возрасте от 19 до 70 лет обследованными в период с 1996 по 2007 годы (табл.1).

Больные с травмами опорно-двигательного аппарата (ОДА) в зависимости от степени тяжести повреждений были распределены на три группы (табл.1). В первую группу (ОДА I) вошли 143 больных (59 женщин и 84 мужчины) с закрытыми переломами диафиза берцовой кости или дистального отдела костей голени (одной лодыжки). Шокогенность травмы по Цибину 0,1 балла, тяжесть повреждений по AIS и ISS -- 2 балла. Все больные находились в удовлетворительном клиническом состоянии; влияющих на исход травмы сопутствующих заболеваний у них не обнаружено.

Во вторую группу (ОДА II) были включены 82 больных (40 женщин и 42 мужчины) с закрытыми переломами диафиза и проксимального отдела бедра, осложненные непродолжительным периодом шока I степени, обеих костей голени, множественными, открытыми или оскольчатыми переломами костей голени. Шокогенность травмы по Цибину не выше 2-х баллов, тяжесть повреждений по AIS -- 2-3 балла (2,5±0,06). Больные находились в клиническом состоянии средней тяжести.

Таблица 1. Распределение обследованных больных по характеру повреждений

Характер повреждений	Число больных	в %	Тяжесть травмы
			AIS	ВПХ-П
Травма:	472	100
Переломы длинных костей нижн. конечностей	265	56,1	2,4	1,6
диафиза большеберцовой кости закрытый	102	21,6	2	0,1
диафиза обеих костей голени	20	4,2	2	2
дистального отдела костей голени	41	8,7	2	0,1
диафиза бедренной кости закрытый	18	3,8	3	2
вертельной области	21	4,4	3	2
шейки бедра	23	4,9	2	2
диафиза бедра открытый + шок I-II	11	2,3	3	6
множественные и о/переломы + шок II-III	29	6,1	4	6
Всего по группе ОДА I:	143	30,3	2	0,1
Всего по группе ОДА II:	82	17,4	2,5	2
Всего по группе ОДА III:	40	8,5	3,7	6
Множ. травмы ОДА + шок II-III (ОДА III)	142	30,1	3,4	4,7
Изолированная ЧМТ:	30	6,4	2	2
СГМ	22	4,7	3	5
УГМ легкой степени	41	8,7	4	5
УГМ средней степени	49	10,4	4	6
УГМ тяжелой степени	52	11,0	2,4	3,3
Всего по группе ЧМТ I:	90	19,1	4,0	5,5
Всего по группе ЧМТ II:	65	13,7	6,8	6,5
ЧМТ, сочетанная с травмой ОДА	143	30,3	2	0,1
в том числе:
ЧМТ II + ОДА I	27	5,7	6	5
ЧМТ II + ОДА II	26	5,5	7	7
ЧМТ II + ОДА III	12	2,5	8	9
Доноры	68
ВСЕГО	540

В третью группу (ОДА III) вошли 40 больных (12 женщин и 28 мужчин) с закрытыми и открытыми диафизарными переломами бедра и с множественными переломами длинных костей нижних конечностей, осложненными шоком II-III степени тяжести. Шокогенность травмы по Цибину до 6 баллов, тяжесть повреждений по AIS 3-4 балла (3,7±0,07).

Диагноз СГМ ставили в соответствии с принятой единой классификацией острой ЧМТ [Коновалов А.Н., 1992]. Больные с ЧМТ условно были разделены на две группы (табл.1).

В группу пациентов с легкой черепно-мозговой травмой (ЧМТ I) были включены больные с сотрясением головного мозга -- 30 человек (8 женщин и 22 мужчины) и ушибом головного мозга легкой степени -- 22 человека (5 женщин и 17 мужчин). В этой группе больных у 5 пациентов было диагностировано субарахноидальное кровоизлияние, перелом свода черепа -- у 5, и переломы костей лицевого черепа -- у 8, средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 13,7±0,09 балла и 2,4±0,07 балла по международной шкале повреждений AIS. Клиническая симптоматика поражения нервной системы носила нестойкий характер, характеризовалась наличием рассеянной микроорганики и симптомами вегетативной дисфункции.

Группу с тяжелой черепно-мозговой травмой (ЧМТ II) составили 90 пациентов, из которых 41 пациент с ушибом головного мозга средней степени тяжести (5 женщин и 36 мужчин) и 49 с тяжелым ушибом и сдавлением головного мозга (8 женщин и 41 мужчина), у 45 пациентов из этой группы было диагностировано субарахноидально-паренхиматозное кровоизлияние, у 8 -- эпидуральная гематома, у 10 -- субдуральная гематома, у 1 пациента внутримозговая гематома, переломы свода черепа были выявлены у 19 пострадавших, основания черепа у 10, переломы лицевого черепа -- у 5, средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 8,0±0,19 и колебалась от 11 до 5-4 баллов по шкале AIS.

Группа пациентов с сочетанной ЧМТ (табл.2) включала 65 больных, из них 36 пациентов -- с диагнозом ушиб головного мозга средней степени тяжести (балл ЧМТ по AIS--4) и 29 больных с диагнозом тяжелый ушиб головного мозга (AIS--4) в сочетании с переломами бедра (AIS--3-4) и костей голени (AIS--2). Пострадавшие с ЧМТ, сочетанной с травмой нижних конечностей легкой степени, соответствующей 1 баллу по системе AIS (ушибы, ссадины, растяжения связок) квалифицировались как пострадавшие с изолированной ЧМТ. Пострадавшие с сочетанными травмами других областей тела в обследование не включались. Средняя балльная оценка тяжести повреждений в группе пациентов с сочетанной ЧМТ составила по шкале AIS -- 6,8±0,09 баллов (из них 4 балла -- вклад ЧМТ), по шкале тяжести политравм ISS -- 22,6±0,76 и по шкале комы Глазго -- 7,3±0,20, что соответствует тяжелой сочетанной травме [Соколов В.А.,2006]. У большинства больных с тяжелой сочетанной черепно-мозговой травмой выявлялись очаговые симптомы базально-стволового уровня, в ряде случаев поражение внутренней капсулы.

Структура политравмы в этой группе такова: сочетания ЧМТ II с ОДА I выявлено у 27 из 65 больных, с ОДА II -- у 26 из 65, с ОДА III-- у 12 пострадавших.

По возрасту и полу больные распределились следующим образом (табл.2). Средний возраст всех пациентов с изолированной и сочетанной ЧМТ и переломами нижних конечностей составил 43,8±0,62 года (женщин 45,4±1,11 года и мужчин 43,0±0,75 года), ОДА I - 42,1±1,08 года, ОДА II - 53,2±1,59 года, ОДА III - 43,1±1,66 года, ЧМТ I - 41,3±1,85 года, ЧМТ II - 43,1±1,37 года, сочетанная ЧМТ+ОДА II - 39,1±1,44 года.

Повышенные цифры среднего возраста больных в группе ОДА II связаны с тем, что по степени тяжести травмы в эту группу вошли пациенты с переломами шейки бедра, средний возраст которых составил 63,3±1,45 года.

Таблица 2. Распределение обследованных пострадавших с изолированной и сочетанной ЧМТ и травмой ОДА и по полу, возрасту и наличию алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении

	ЧМТ	Переломы длинных костей н/конечностей	Сочетанная травма
Мужчины Из них с АИ: 15-39 лет 40-59 лет 60 лет и старше	116 33 (28,4%) 49 56 11	154 47 (30,5%) 58 69 27	43 16 (37,2%) 25 16 2
Женщины Из них с АИ: 15-39 лет 40-59 лет 60 лет и старше	26 6 (23,1%) 12 11 3	111 21 (18,9%) 36 42 33	22 8 (36,4%) 9 12 1
Всего Из них с АИ:	142 39 (27,5%)	265 68 (25,6%)	65 24 (36,9%)

Как видно из табл.2, большинство больных составляли лица молодого и среднего возраста, тогда как пациентов старше 60 лет было 16,3%. У лиц молодого и среднего возраста преобладали ЧМТ, переломы голени и бедра, частое наличие сопутствующей алкогольной интоксикации (рис.1), а в возрасте 60 лет и старше - переломы вертельной области и шейки бедренной кости.

Среди мужчин переломы голени встречались чаще, чем у женщин почти в 2 раза, диафиза бедра и ЧМТ -- более, чем в 3 раза. Среди женщин преобладали переломы шейки бедренной кости (более чем в 2 раза чаще, чем у мужчин).

Ни в одной группе обследованных больных в период наблюдения летальных исходов не зафиксировано. Больные с сопутствующей соматической патологией исключены из исследования. Больные с кранио-абдоминальной сочетанной травмой, имеющих высокую госпитальную летальность (Шапот Ю.Б., 2002), а также пострадавшие с ретроспективно установленной политравмой более двух систем в данное исследование не включены.

Оценивались следующие клинические параметры, необходимые для балльной оценки тяжести травмы и общего состояния: характер, локализация и степень повреждений (AIS, ISS, шкала Цибина), степень тяжести шока (индекс Альговера), комы (по шкале ком Глазго -- SCG) и общего состояния (шкала ВПХ-СП, APACHE-II -- у пострадавших и больных, находящихся в ОРИТ, отдельно три параметра SIRS лейкоцитоз, температуру, частоту сердечных сокращений в баллах, взятых из шкалы APACHE-II). Наличие и степень алкогольной интоксикации (АИ) при поступлении определялось по записи в истории болезни о концентрации этанола в крови. Учитывались следующие характеристики больных: возраст, пол, характер предпринимавшегося оперативного вмешательства и последующих физиотерапевтических воздействий и вид посттравматических осложнений (нагноения, пневмонии).



Рис.1. Частота наблюдения алкогольной интоксикации у пострадавших в зависимости от степени тяжести изолированной травмы опорно-двигательного аппарата (ОДА), изолированной ЧМТи политравмы (ЧМТ + скелетная травма)

Всем больным проводилось подробное клиническое обследование, включая в зависимости от характера травмы методы инструментальной (ЭКГ, ЭЭГ и др), рентгенологической (рентгенография, в том числе рентгеноскопия, КТ, ангиография). У тяжелых больных в реанимационном отделении мониторовались параметры, необходимые для количественной оценки тяжести состояния по угрозометрическим шкалам. Всем больным с изолированной и сочетанной ЧМТ, травмой ОДА проводилась адекватная соответстующая терапия и необходимые оперативные вмешательства.

Кровь с антикоагулянтом (трилон Б) и сыворотку крови для гематологических, биохимических и иммунохимических исследований в соответствии с требованиями этического комитета забиралась на 1-3, 5-7 и при возможности на 14-19 сутки после травмы. У некоторой части больных удавалось провести дополнительный 4-й забор крови на 21-28 сутки. Общее количество проанализированных с 2000 по 2007 годы образцов крови и сыворотки от 472 пациентов и 68 доноров составило 1773.

Результаты анализа крови пострадавших включали СОЭ и следующие параметры, определенные на автоматическом гематологическом анализаторе МАХ (Франция): WBC (лейкоциты), RBC (эритроциты), HGB (гемоглобин), HCT (гематокрит), MCV (средний объем эритроцита), MCH (среднее содержание гемоглобина в эритроците), MCHC (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), RDW (анизоцитоз), PLT (тромбоциты), NEU%#, LYM%#, MON%# или MXD%# (соответственно % и абсолютное количество нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов или смеси моноцитов, эозинофилов и базофилов).

Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) рассчитывали по формуле Кальф-Калифа, С.Ф.Хомич в модификации А.Л.Костюченко и соавт. (2000):

,

У больных, находящихся после тяжелой травмы в реанимационном отделении, помимо шкалы комы Глазго (SCG), точнее ее обратной величины (15 -- SCG), двух гематологических показателей HCT и WBC, креатинина в сыворотке, дополнительно учитывались еще 8 параметров, необходимых для балльной оценки по системе APACHE-II: температура тела, среднее АД [(2АД_диаст+АД_сист)/3], ЧСС (частота сердечных сокращений), ЧДД (частота дыхательных движений), рО₂ или раО₂, рН артериальной крови или содержание Na⁺, K⁺ и бикарбоната в сыворотке, сыворотки.

Триада клинических показателей: гипертермия, тахикардия и лейкоцитоз считаются клиническими проявлениями SIRS. Признаками напряженности SIRS служили повышение температуры более 38,5°С, ЧСС более 90 в мин и лейкоцитоз свыше 12Ч10⁹/л -- параметры, которые включены в шкалу APACHE-II. Исходя из этой системы, SIRS в баллах оценивали следующим образом: температура - 38,5-38,9°С (1 балл), 39-40,9°С (3 балла), >41°С (4 балла), пульс -110-139 (2 балла), 140-179 (3 балла), >180 (4 балла), лейкоциты, Ч10⁹/л - 15-19,9 (1 балл), 20-39,9 (2 балла), >40 (4 балла).

Из биохимических показателей крови, определенных одномоментно на автоматическом анализаторе "Hitachi 911" (Австрия) с использованием реактивов фирмы «Олвекс» (г.Санкт-Петербург) или на анализаторе «HUMAN» с наборами реактивов фирмы «HUMAN» (Германия) и «LACHEMA» (Чешская Республика), в исследование включены следующие параметры: уровень глюкозы, общего белка, альбумина, ферментов (АСТ, АЛТ, ГГТ, ЛДГ, КК и ЩФ), мочевины, мочевой кислоты и креатинина.

Содержание молекул средней массы (МСМ) в сыворотке крови определяли скрининг-методом (Габриэлян Н.И. с соавт.,1985). Уровень МСМ выражали в единицах оптической плотности при длине волны 280 нм.

В динамике травматической болезни мозга и ОДА различными иммунохимическими методами были исследованы сывороточные уровни белков, отражающих влияние травмы на иммунный и системный воспалительный ответ -- иммуноглобулины трех классов (IgG, IgM, IgA), острофазовые белки: лактоферрин (ЛФ), СРБ, связанный с беременностью б2-гликопротеин (СБАГ), б2-макроглобулин (МГ), на окислительный стресс-- церуллоплазмин (ЦП), на систему гемостаза -- продукты деградации фибриногена (ПДФ), повреждение тканей -- ферритин (Фр), и органоспецифические белки: миоглобин (MG), тропонины Т и I (TrТ, TrI), креатинфосфокиназа (КФК), костная кислая фосфатаза (ККФ), костная щелочная фосфатаза (КЩФ), нейроспецифический белок S-100 (S-100), репаративную регенерацию -- онкомаркеры альфа-фетопротеин (АФП), раковоэмбриональный антиген (РЭА) и щелочную фосфатазу плацентарного типа (ПЩФ).

В этих же сыворотках больных иммунохимическими методами исследовалась концентрации транспортных сывороточных белков сывороточного альбумина (СА), его термостабильной фракции (ТСА), транскортина (ТК), соотношению уровней субфракций альбумина и содержание МСМ, а в крови этих же больных иммунохимическими методами исследовалась концентрации HbF.

Количественное определение HbF проводили в гемолизированной сапонином или гипотоническим шоком крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием кроличьих антисывороток к HbF из банка иммунохимических тест-систем Астраханской медицинской академии.

Количественное определение СБАГ, СРБ и ПДФ, а также идентификация тканевых и сывороточных белков в период конструирования моноспецифических тест-систем проводилась двойной радиальной иммунодиффузией (РИД) в агаре по Ouchterlony в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абелева (1961), концентрации ТСА, МГ, ЦП и ПДФ, иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM -- методом радиальной иммунодиффузии в геле по Mancini (1970) на готовых планшетах или с применением тест-систем и моноспецифических антисывороток фирм-изготовителей (Нижегородского, Санкт-Петербургского НИИВС; Берингверке, ФРГ; Sebia, Франция; Corning, Великобритания). СА, ТСА, ТК и МГ -- методом метод «ракетного» иммуноэлектрофореза по Laurell et al. (1972), ПЩФ, частично ЛФ и Фр в экстрактах тканей -- методом встречного иммуноэлектрофореза по Kohn (1970)., ККФ, КЩФ определяли в единицах Боданского денситометрией диск-электрофореграмм после инкубации с ингибиторами и субстратами. ПЩФ и оксидазную активность ЦП после специального окрашивания иммунопреципитатов. Определение высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP) проводили на автоматическом анализаторе Cobas С (Швейцария), идентификацию КФК, миоглобина и тропонинов Т и I -- методом иммунохромато-графического анализа (Прогрессивные медицинские технологии, Россия; ACON, США; Hoffman La Rochе, Россия--Швейцария).

РЭА, кортизол, частично АФП и Фр определяли методом РИА с реактивами фирм (Hцechst, Германия; Cis Bio International, Франция; рио-РЭА-¹²⁵J-М, Беларусь). Радиометрию результатов РИА осуществляли на радиоизотопном анализаторе "Гамма-1" и "Гамма-800". В основном антигены (АФП, ЛФ, Фр, ЦП, S-100, МГ) определялись количественно методом ИФА в различных модификациях с использованием коммерческих тест-наборов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; «Spinreact S.А.», Испания) в соответствии с требованиями фирм-поставщиков реагентов.

Молекулярные массы очищенных белков определяли методом диск-электрофореза в SDS- и градиенте концентраций ПААГ, на колонке с сефадексом G-100 и G-200 с использованием как минимум пяти соответствующих маркеров с известной молекулярной массой (Sigma): ферритина (440 kDa), сывороточного альбумина быка или человека (67 kDa), овальбумина (45 kDa), трипсина (23 kDa), тропонинов T, I, C (38; 24; 18,5 kDa), цитохрома С (12 kDa).

Для изучения влияния мезодиэнцефальной модуляции (МДМ) на лабораторные показатели крови с первых суток после получения травмы 77 пациентам с переломами длинных костей нижних конечностей из групп ОДА I и II и 33 пациентам с сотрясением и ушибом головного мозга легкой степени из группы ЧМТ I в схему лечения были включены сеансы МДМ по 12 процедур модулированной частотой 70-90 Гц, длительностью импульса 3,0-5,0 мс, продолжительность воздействия - 30 минут. Остальные больные служили контрольной группой, которых лечили по традиционной схеме. Для проведения данной процедуры использовался аппарат МДМ - 101. Электроды накладывались в саггитальной плоскости, один из которых располагался в области лба, второй в проекции затылочного отверстия. Сила тока зависела от индивидуальной чувствительности пациентов и колебалась от 0,5 до 2,5 мА. Сеансы мезодиэнцефальной модуляции хорошо переносились больными. Пострадавшие, имевшие на голове раны и другие дефекты кожного покрова входили в контрольную группу больных, не получавших МДМ-терапию.

Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков на полученных данных был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-98 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.).

Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (у), среднюю ошибки средней арифметической (m). Оценку нормальности распределений проводили с использованием коэффициентов асимметрии и эксцесса.

С целью определения значимости (достоверности) р различий сопоставляемых средних величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Разницу средних величин считали достоверной при р < 0,05.

Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Среди иммунохимических маркеров, представляющих интерес для оценки травматической болезни, для трех белков (СБАГ, ТК, ПЩФ) по разным причинам, отсутствовали доступные коммерческие наборы для их определения.

Для конструирования иммунохимических тест-систем на связанный с беременностью альфа2-гликопротеин (СБАГ), транскортин (ТК), плацентарную щелочную фофатазу (ПЩФ) предварительно исследовали их поведение на гелях для ионообменной (КМ- и ДЕАЕ-целлюлоза), гидрофобной (фенил-сефароза), амфифильной (агароза) и аффинной хроматографии (эстрадиол-сефароза и голубая сефароза). Параллельно изучались хроматографические характеристики еще двух белков -- сывороточного альбумина (СА) и альфа-фетопротеина (АФП). Для иммунохимической идентификации белков во фракциях на данном этапе исследования применяли тест-системы для РИД по Оухтерлони, любезно предоставленные д.м.н. Сухаревым А.Е. (ПЩФ), к.м.н. Безрукавниковой Н.В. (ТК), к.м.н. Никулиной Д.М. (СБАГ) и антисыворотки НИИВС им. И.И.Мечникова (АФП и поливалентные к белкам сыворотки человека).

Акцент на методы гидрофобной хроматографии и аффинной элюции сделан в связи с общей особенностью всех пяти белков связываться или изменять свою активность (ПЩФ) в присутствии стероидных гормонов и триазиновых красителей.

Ионообменная хроматография. Установлено, что АФП, ПЩФ, ТК и ЧСА не адсорбируются на катионообменнике СМ-сефадексе С-50 (Pharmacia, Швеция) при трех значениях рН (8,0; 6,6; 5,8) 0,02М фосфатного и рН 4,6 0,02М ацетатного буферов. СБАГ довольно прочно связывается с катионообменным гелем в нейтральной и слабощелочной среде (рН 6,6 и 8,0).

Нами проанализирован характер элюции белков с этих анионообменников в зависимости от значения рН буферных систем (табл.3). Пробы в колонку вносились из расчета 20 мг белка на 1 мл геля. Хроматографию сывороток и экстрактов на колонке с ДЕ-52 целлюлозой проводили стартовым 0,01 М фосфатным или ацетатным буфером с линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3М.

Все белки связываются с анионообменной целлюлозой DЕ-52 (Watman, США) при низкой ионной силе (0,02 М) стартового буфера в диапазоне рН 5-9.

Установлено, что при рН 5,1 ацетатного буфера все белки слабо связывались с анионообменником и легко десорбировались уже 0,05М NaCl. При всех остальных значениях рН первым из пяти белков элюируется ПЩФ при концентрации NaCl 0,10М. Альбумин десорбируется с хроматографической колонки широким пиком при ионной силы NaCl от 0,12 до 0,21М независимо от рН элюирующего буфера в диапазоне от 5,8 до 8,0. В отличие от альбумина пик АФП с уменьшением рН элюэнта десорбируется все более высокими концентрациями NaCl (табл.3). Этот факт может быть использован для отделения АФП от основной массы СА как один из этапов выделения и очистки АФП. Параметры десорбции ТК близки к таковым для СА (табл.3) и не позволяют отделять его от остальных сывороточных белков.

Повышенную «липкость» проявляет СБАГ и к анионообменному сорбенту (табл.3). При рН 8,0-6,4 белок элюируется более высокими концентрациями NaCl, чем все остальные рассматриваемые белки. СБАГ также как и СА десорбируется достаточно широким пиком, в связи с чем, применение ионообменной хроматографии в классическом виде для очистки СБАГ не дает определенных преимуществ. Вместе с тем, возможности анионообменной хроматографии могут быть расширены за счет использования аффинной элюции и гидрофобных свойств ионообменников на основе целлюлозы.

Таблица 3.Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с анионообменной целлюлоза ДЕ-52

рН буфера	СА	АФП	ПЩФ	СБАГ	ТК
8,0	0,13 - 0,21	0,14 - 0,18	0,10 - 0,15	0,15 - 0,25	0,15 - 0,21
7,2	0,13 - 0,21	0,15 - 0,20	0,11 - 0,18	0,18 - 0,25	0,13 - 0,20
6,4	0,12 - 0,20	0,17 - 0,22	0,12 - 0,18	0,13 - 0,20	0,13 - 0,20
5,8	0,12 - 0,21	0,20 - 0,23	0,13 - 0,18	0,08 - 0,11	0,11 - 0,18
5,1	0,05 - 0,11	0,11 - 0,20	0,08 - 0,09	--	0,05 - 0,09

Гидрофобная хроматография. Поскольку макромолекулы АФП, ПЩФ, ТК, СБАГ и ЧСА имеют на своей поверхности гидрофобные области, необходимые для осуществления их транспортной и (или) каталитической функции (Чегер С.И., 1975; Луйк А.И., Лукьянчук В.Д., 1984; Терентьев А.А., 1990; Розен В.В., 1994; Кривенцев Ю.А., 1999; Сухарев А.Е. и соавт., 2006), мы сочли целесообразным применение гидрофобной хроматографии для изучения их поведения на гидрофобных гелях, их разделения и очистки.

В качестве гидрофобного сорбента мы использовали фенилсефарозу CL-4В. Активацию геля проводили в колонке последовательным промыванием 1% тритоном Х-100 на 0,02М фосфатном буфере рН 7,2, 20%, 50%, 96% этанолом, бутанолом, этанолом в обратной последовательности, фосфатным буфером и буфером с добавлением 0,5 М NaCl или 2 М (NH₄)₂SO₄.

Смесь белков из расчета 50 мг на мл геля в 2М сульфате аммония после центрифугирования при 8000 g и удаления осадка при комнатной температуре наносили на колонку, заполненную фенилсефарозой. В случае хроматографии сывороток беременных, содержащих СБАГ, проба и колонка с агарозой содержали 1 моль/л соли. Результаты хроматографических экспериментов представлены в табл.4.

В варианте хроматографии нисходящим линейным градиентом сульфата аммония забуференного до рН 7,2 СА начинал десорбироваться 0,8М солью и его широкий пик заканчивался при 0,15М концентрации соли, но следы ЧСА содержались и в последних фракциях. АФП более прочно связывался с сорбентом и незначительно элюировался заключительным объемом градиентного буфера, начиная с 0,13 М (NH₄)₂SO₄, но основная фракция АФП продолжал десорбироваться после дополнительного промывания колонки 0,02 М стартовым буфером. ПЩФ элюировался с фенилсефарозы раньше АФП, начиная с 0,5М (NH₄)₂SO₄, и его пик заканчивался при 0,1М концентрации соли. Пик ТК десорбировался после СА.

СБАГ прочно связывался с гидрофобной колонкой и не десорбировался промыванием стартовым буфером. Для его элюции требовалось дополнительная обработка колонки неионным детергентом. Таким образом, применение простого солевого градиента позволило нам отделить АФП, ТК и СБАГ от основной массы альбумина.

Таблица 4.Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с фенил-сефарозы CL-4B

	СА	АФП	ПЩФ	СБАГ*	ТК
Сульфат аммония градиент 2М - 0 М	0,8М - -0,15М	0,13М - - 0 М	0,5М - - 0,1М	Не десор- -бируется	0,35М - - 0 М
Сульфат аммония 1М Тритон X-100 0 -1%	0,1% - - 0,5%	0,2% - - 0,4%	0,1% - - 0,3%	0,4% - - 1%	0,2% - - 0,5%
Сульфат аммония 1М Глицерин 0 -75%	25%- - 75%	Не десор- -бируется	25%- - 75%	Не десор- -бируется	50%- - 75%
Сульфат аммония 2М-0 М Тритон X-100 0-0,5%	1,2 - 0,7М 0,2 -0,33%	1,0 - 0,6М 0,25-0,35	1,2 - 0,6М 0,2-0,35%	0,6 - 0,3М 0,35-0,42	1,0 - 0,6 М 0,25-0,35
Сульфат аммония 2М-0 М Глицерин 0 -75%	1,2 - 0,5 М 29 - 57 %	0,8 - 0,3М 45 - 65%	1,0 - 0,6 М 38 - 50%	0,3 - 0М 65 - 75%	0,9 - 0,3М 34 - 65%

* -- линейный градиент сульфата аммония 1М - 0 М

Десорбция связанных с фенилсефарозой белков ускорялась снижением полярности 0,02 М фосфатного буфера добавлением 0,1% тритона X-100, но не глицерина. Дополнительное введение в элюирующий буфер гидрофобных лигандов (спиртовых растворов билирубина, стероидных гормонов) с целью создания эффекта аффинной элюции было невозможно из-за их нерастворимости в солевых растворах высокой концентрации.

Как видно из табл.4, при изменении полярности с помощью детергента и глицерина на фоне неизменной 1М концентрации сульфата аммония, сходные по электрофоретической подвижности белки ведут себя по разному: тритон хорошо десорбирует ПЩФ (0,1-0,3%), СА (0,1-0,5%), ТК (0,2-0,5%), и АФП (0,2-0,4%) пики которых полностью накладываются друг на друга. СБАГ в присутствии сульфата аммония десорбируется с гидрофобной колонки только высокими концентрациями тритона Х-100. Глицерин частично вымывает СА и ПЩФ, начиная с 25% концентрации вплоть до последней фракции (75%), начиная с 50% элюирует ТК и не элюирует АФП и СБАГ на фоне такой ионной силы, задаваемой сульфатом аммония.

В последующих опытах (табл.4) нарастающий градиент тритона или глицерина добавлялся к понижающемуся градиенту концентрации соли (ножницы). Применение таких комбинаций получило в гидрофобной хроматографии особенно широкое распространение (Туркова Я., 1979; Скоупс Р., 1985; Ochoa J.L. 1978).

Обе комбинации ножниц (табл.4) давали приблизительно сходные картины элюции белков: сначала вымывался альбумин, затем ПЩФ, ТК и АФП, причем, их пики частично перекрывались. Последним элюировался СБАГ. Таким образом, целенаправленно изменяя в циклах гидрофобной рехроматографии концентрацию соли, детергента и неполярного растворителя в элюирующей буферной системе, можно подобрать условия для их выделения и очистки.

Амфифильная (высаливающая) хроматография. Обнаружено, что замещенные целлюлозы способны эффективно адсорбировать белки при высокой концентрации соли (Скоупс Р., 1985). Еще в большей степени, чем у ДЕАЕ-целлюлозы гидрофобные свойства выражены у агарозы. Благодаря своей амфифильной природе эти матрицы (частично гидрофобные и частично гидрофильные) подходят для адсорбции белков при высоких концентрациях соли, чем чисто гидрофобные материалы (Von der Haar F., 1976).

Белки, связанные с такими целлюлозными и агарозными матрицами, можно элюировать раствором с такой же высокой концентрацией соли, которая используется для их адсорбции, добавив в раствор вещества, ослабляющие водородные связи, -- глицерин, сахарозу, мочевину или этанол (Fujita T. et al., 1980).

...