Иммунохимические показатели в клинической оценке черепно-мозговой и скелетной травмы

Таким образом высаливающая хроматография на агарозном геле может использовать как принципы гидрофобной, так и аффинной хроматографии. Важным ограничением амфифильной хроматографии по сравнению с аффинной является то, что лиганд должен сохранять способность связываться с белком при высокой концентрации соли.

В качестве амфифильного сорбента мы использовали агарозу (Serva, США). Активацию геля проводили в колонке по схеме для фенилсефарозы и уравновешивали 2М (NH₄)₂SO₄. В случае хроматографии сывороток беременных, содержащих СБАГ, проба и колонка с агарозой содержали соли в 2 раза меньше (1 моль/л).

Смесь белков из расчета 10 мг на мл геля в 2М или 1М сульфате аммония после центрифугирования при 8000 g и удаления осадка наносили на колонку, заполненную агарозой при комнатной температуре.

Установлено что в присутствии 2М сульфата аммония, растворимые при такой концентрации белки (ПЩФ, ТК, СА, АФП) адсорбируются на геле агарозы, снижение концентрации соли до 1,8-1,5М вызывает их десорбцию с колонки. Нерастворимый в 2М (NH₄)₂SO₄ СБАГ удерживается на агарозе при 1-0,5М концентрации соли и элюируется при более низких концентрациях сульфата аммония в буфере. При постоянной 1М концентрации сульфата аммония десорбцию СБАГ с агарозы можно осуществлять 0,1% тритоном Х-100, солевым 5-15% раствором глицерина или 1-2М мочевины.

Аффинная хроматография. Из аффинных сорбентов для исследования хроматографичекого поведения белков мы применяли голубую сефарозу (Pharmacia, Швеция), представляющую собой коммерческий конъюгат сефарозы 4В с ковалентно присоединенным красителем цибакроновым синим, и два варианта иммобилизованного эстрадиола.

Конъюгат эстроген-бензидин-сефароза был синтезирован и любезно предоставлен канд. хим. наук Р.3.Алиевым (Астраханская медакадемия) и представлял собой иммобилизованный на сефарозе через бифункциональный бензидиновый спейсер эстрадиол, ковалентно присоединенный по кольцу А. Второй сорбент -- эстрадиол-С-17-триазинхлорид-сефароза был приготовлен на кафедре биохимии РГМУ и любезно предоставлен член-корр. РАМН, профессором А.А.Терентьевым.

На этапе получения высокоочищенных препаратов АФП, ТЩФ, ТК и СБАГ мы применили аффинные сорбенты, в которых использовались иммобилизованные различными методами антитела (негативные и позитивные иммуносорбенты).

Результаты изучения поведения белков на двух типах неантительных аффинных сорбентов, лиганды которых, эстрадиол и триазиновый краситель -- цибакроновый синий, по литературным сведениям имеют сродство к исследуемым белкам (Иванов В.Б.,1982; Скоупс Р., 1985) представлены в табл.5.

На подготовленную к работе голубую сефарозу наносили диализованные против стартового 0,02 М трис-солянокислого буфера рН 7,4 растворы белка из расчета 10 мг белка на 1 мл влажной суспензии. Хроматографию проводили стартовым буфером в объеме 160 мл со скоростью 10 мл/час линейным от 0 до 2М градиентом NaCl. Собранные фракции иммунохимически тестировались на изучаемые белки.

Установлено что на голубой сефарозе сорбируется альбумин, но не ПЩФ, АФП и ТК. Основной пик ЧСА обнаруживается во фракциях, содержащих 0,8-1М NaCl, однако альбумин частично вымывается стартовым буфером и загрязняет фракции АФП. СБАГ частично связывается с голубой сефарозой и элюируется 0,07-0,12 М NaCl на 0,02 М, трис-солянокислом буфере, другая часть этого белка элюируется стартовым буфером.

Таким образом, АФП и альбумин отличаются по их поведению на голубой сефарозе -- ЧСА связывается с красителем, АФП -- нет. Полученные данные обосновывают применение на одном из этапов очистки АФП негативной хроматографии на сорбенте с триазиновыми красителями -- голубой сефарозе. Что касается адсорбции СБАГ на голубой сефарозе, то учитывая физико-химические свойства этого белка, можно предположить о катионообменном, а не об аффинном механизме его связывания с окрашенным гелем.

Хроматографию белков на сорбентах эстрадиол-бензидин-сефарозы и эстрадиол-С-17-сефарозы проводили в двух режимах (табл.5).

Смесь белков, диализованная против солевого фосфатного буфера наносилась на колонку с эстрадиол-сефарозой, промывалась стартовым буфером и элюировалась ступенчатым градиентом NaCl до 1М на том же буфере. Последние ступени кроме соли содержали 2% тритона или эстрон в 20% диоксане.

Для хроматографии на эстрадиол-сефарозе в гидрофобном режиме проба в стартовом фосфатном буфере рН 7,2 с добавлением 1М сульфата аммония элюировалась нисходящим линейным градиентом этой соли.

В первом режиме на колонку наносилась диализованная против стартового буфера смесь исследуемых белков, при этом все белки вымывались со свободным объемом, не связываясь с сорбентом. Дополнительная последовательная элюция через колонку буферного раствора со ступенчатым градиентом NaCl до 2М, 1% тритона Х-100 и или эстрона на 20 % водном растворе диоксана не обнаружила в этих фракциях исследуемых белков.

Таблица 5. Условия десорбции (начальная и конечная молярной концентрации элюирующего буфера) белков с с аффинных сорбентов

Сорбент Стартовый буфер Линейный градиент	СА	АФП	ПЩФ	СБАГ*	ТК
Голубая сефароза 0,02 М, рН 7,4 трис-НCl 0 - 2 М NaCl	0,6 - - 1,1 М NaCl	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	0,07 - - 0,12М NaCl	Старто-вым буфером
Эстрадиол-бензидин-сефароза 0,02 М, рН 7,2 фосфатный	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером
Эстрадиол-бензидин-сеф 0,02 М, рН 7,2 фосфатный 1 - 0 М (NН4)2SO4	0,5 - 0 М (NН4)2SO4	0,2 - 0 М (NН4)2SO4	0,3 - 0 М (NН4)2SO4	0,05 - 0 М (NН4)2SO4	0,15 - 0 М (NН4)2SO4
Эстрадиол-С-17-сефароза 0,02 М, рН 7,2 фосфатный	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	Старто-вым буфером	Не десор- -бируется	Старто-вым буфером
Эстрадиол-С-17-сефароза 0,02 М, рН 7,2 фосфатный 1 - 0 М (NН4)2SO4	0,5 - 0 М (NН4)2SO4	0,2 - 0 М (NН4)2SO4	0,2 - 0 М (NН4)2SO4	Старто-вым буфером	0,1 - 0 М (NН4)2SO4

Так как белки при низкой ионной силе буферного раствора не связывались с иммобилизованным на сефарозе через бензидиновый спейсер по бензольному кольцу эстрадиолом, что совпадает с известными данными (Терентьев А.А., 1990), мы попытались сорбировать белки на этой колонке в гидрофобном режиме, при высокой молярности стартового буфера (табл.5.).

Установлено, что все белки связывались с эстрадиол-бензидин-сефарозой как с гидрофобным сорбентом в 1М сульфате аммония, (если на 1 мл аффинного геля наносилось не более 10 мг белка) и десорбировались с колонки при уменьшении концентрации соли в последовательности: СА => АФП => ПЩФ => ТК => СБАГ (табл.5).

Аффинный сорбент эстрадиол-С-17-триазинхлорид-сефароза, созданный для выделения эстрогенсвязывающих белков при хроматографии стартовым буфером не связывал СА, АФП, ТК и ПЩФ, так как имеет слишком короткий триазиновый спейсер (Терентьев А.А., 1990), однако в данном режиме на нем адсорбировался СБАГ, который потом элюировался при добавлении в стартовый буфер 1 М NaCl или водонасыщенного бутанола на этом буфере.

Разработка технологии получения препарата СБАГ и транскортина из сыворотки беременных. Обнаруженные нами особенности поведения СБАГ и ТК на хроматографических носителях легли в основу разработанных нами методов одновременного выделения этих белков из пула (500 мл) сыворотки крови беременных III триместра (табл.6 и 7). Метод для обоих белков включает последовательную высаливающую, ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию и не требует промежуточных этапов диализа и концентрирования.

Таблица. 6 Характеристика препарата СБАГ на этапах выделения.

Этап очистки	Cодержание белка, мг	Cодержание целевого продукта %	Степень очистки	Выход (%)
	общий	СБАГ
Исходный материал	31200	26,8	0,09%	1	100
Осаждение (NH4)2SO4 40% насыщения (осадок)	6736	28,0	0,42%	4,5	97
Высаливающая хроматография	1855	19,0	1,01%	11,1	66,0
Хроматография на ДЕ-52 целлюлозе	872	15,3	1,8%	19,0	53,1
Гель-фильтрация на Сефадексе G-200	373	14,2	3,8%	41,2	49,3
Хроматография на фенил-сефарозе CL-4B	194,7	12,5	6,4%	69,6	43,2
Хроматография на голубой сефарозе	82,5	9,5	11,5%	125	33,0
Хроматография на эстрадиол С-17-сефарозе	8,0	6,7	83,8%	907	7,81

Характеристика очищенного СБАГ представлена на рис.2, а очищенного транскортина вместе с маркерами молекулярной массы на рис.3.

Полученный нами препарат СБАГ не взаимодействовал с антисыворотками против сывороточных белков донора и против сывороточного альбумина и давал единственную дугу преципитации с поливалентной антисывороткой, полученной иммунизацией кроликов сывороткой беременных.

Методом диск-электрофореза препарат СБАГ выявлял только одну окрашенную полосу в зоне макроглобулинов (рис.2), а электрофорез полоски полиакриламидного геля во втором направлении с антисывороткой к сывороточным белкам беременной выявил единственный пик иммунопреципитата, принадлежащий СБАГ (рис.2).

По результатам SDS-ПААГ электрофореза препарат транскортина выявлял только одну окрашенную полосу в зоне между БСА (65 кД) и овальбумином (45 кД), соответствующую молекулярной массе 50-55 кД (рис.3).

Таблица. 7 Характеристика препарата транскортина на этапах выделения.

Этап очистки	Cодержание белка, мг	Cодержание целевого продукта %	Степень очистки	Выход (%)
	общий	ТК
Исходный материал	31200	26,0	0,08%	1	100
Надосадок (NH4)2SO4 40% насыщения	24400	25,0	0,10%	1,2	96
Высаливающая хроматография	4530	15,5	0,34%	4,1	60
Хроматография на ДЕ-52 целлюлозе	688	10,7	1,56%	18,7	41,2
Осаждение (NH4)2SO4 60% насыщения (осадок)	79,3	9,2	11,6%	139,2	35,4
Хроматография на фенил-сефарозе CL-4B	18,1	8,5	47%	583	32,7
Хроматография на голубой сефарозе	5,3	4,2	79%	950	16,2

Оба препарата не проявляет иммунохимической активности при взаимодействии с антителами к ТБГ, ПЩФ, АФП и с большинством коммерческих антисывороток к белкам плазмы человека, а их антисыворотки не дает перекрестных линий преципитации между собой (рис.4).



Рис. 2. Двумерный электрофорез препарата СБАГ. В первом направлении - электрофорез в 7,5% ПААГ, во втором направлении - электрофорез в агарозе с иммунопроявлением 15% антисывороткой к сывороточным белкам беременной.

Для выделения и очистки ПЩФ гомогенат зрелой плаценты, полученой в родах и освобожденной от плодных оболочек, смешивали с тремя объемами 0,02М трис-HCl буфера рН 8,6, троекратно замораживали при -6-8°С, оттаивали и добавляли один объем холодного бутанола.

Моноспецифические антисыворотки на СБАГ, транскортин и ПЩФ использованы для получения иммунодиффузионных и иммуноферментных наборов для их количественного определения при изучении роли иммунохимических показателей в оценке состояния пострадавших с изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА. Смесь перемешивали на магнитной мешалке, центрифугировали и в делительной воронке собирали нижнюю (водную) часть, содержащую ПЩФ.



Рис. 3. Характеристика очищенного препарата транскортина методом SDS-ПААГ электрофореза в сопоставлении с маркерами молекулярной массы

Рис.4. Иммунодиффузионный анализ качества полученных антисывороток против СБАГ и ТК.

В отличие от известных способов получения ПЩФ (Lehman et al., 1974; Сухарев А.Е. с соавт., 2006), в основе предлагаемого нами способа, лежит обнаруженный нами феномен относительной устойчивости ПЩФ к некоторым ионам тяжелых металлов (кадмий) при прогревании.

К плацентарному экстракту добавляли сульфат кадмия до конечной концентрации 0,14% и раствор прогревали при 65°С в течение 1-3 минут до образования осадка, который отделяли центрифугированием (табл.8). В супернатант добавляли сульфат аммония до 40% насыщения и после удаления осадка проводили с супернатантом дальнейшие хроматографические этапы, которые отражены в таблице 8.

Степень очистки ПЩФ по данному способу превышала 1000 раз, а чистота препарата достигала 98% (табл.8). Удельная активность фермента при его концентрации 10 мг/л составляла 8-10 тыс нмоль/сек/л (МЕ).

Так как в иммунохимическом анализе у пострадавших с травмами применялась коммерческая тест-система на АФП, данные по его хроматографической очистке не приводятся.

Таблица. 8 Характеристика препарата ПЩФ на этапах выделения.

Этап очистки	Cодержание белка, мкг	Cодержание целевого продукта %	Степень очистки	Выход (%)
	общий	ПЩФ
Бутанольный экстракт плаценты (1 литр)	4400000	4000	0,10%	1	100
0,14% CdSO4 65°С Ч 1-3 мин	250000	2500	1,0%	11	63
Надосадок (NH4)2SO4 40% насыщения	200000	2400	1,2%	13,2	60
Высаливающая хроматография	120000	1800	1,5%	16,5	45
Хроматография на ДЕ-52 целлюлозе	16000	1200	7,5%	82,5	30
Осаждение (NH4)2SO4 60% насыщения (осадок)	4000	880	22%	242	22
Хроматография на фенил-сефарозе CL-4B	360	320	89%	980	8,0
Хроматография на голубой сефарозе	285	280	98,2%	1080	7,0

Тепловая денатурация белков. Отношение к температуре -- одна из важных физических характеристик белка. Термостабильность белков может варьировать в определенных пределах в зависимости от целого ряда факторов: природы белка, рН, ионной силы раствора, присутствия различных низкомолекулярных лигандов. На примере транспортного белка -- сывороточного альбумина, обладающего сродством к большому количеству гидрофильных и гидрофобных лигандов нами исследована возможность регулировать такой параметр как термическая устойчивость.

Выбор СА в качестве экспериментальной модели связан не только с его биологической ролью в организме как главного неспецифического транспортного белка сыворотки, но и с удобством его иммунохимической регистрации даже при тысячекратном снижении концентрации (рис.5)

Для сравнительной оценки влияния лигандов на температуру денатурации СА в качестве низкомолекулярных лигандов использовали спиртовые растворы билирубина и эстрадиола (Merck, ФРГ), водонасыщенный бутанол, растворы глицерина, сульфата аммония и хлорида натрия различной концентрации (Реахим, Россия). Кроме того, исследовали комбинацию неизвестных низкомолекулярных лигандов в составе смывов гипертоническим раствором (1M NaCl) с медицинских угольных сорбентов «СНК», «СКК» и «СУГС» после сеанса гемосорбции у больных с интоксикационным синдромом различной этиологии (рис.6), полученными из отделения гемодиализа НПК «Экологическая медицина» Газпрома (г. Астрахань).

Рис.5 Результаты определения в крови уровней термостабильной фракции альбумина методом «ракетного» иммуноэлектрофореза по Лоурелю в зависимости от степени нагрузки альбумина лигандом



Рис.6. Кривые денатурации альбумина в присутствии различных лигандов

В качестве препаратов СА использовали сыворотки крови доноров, беременных, больных с выраженным эндотоксикозом, пуповинной крови и кристаллический СА человека фирмы BDH (США). Перед прогреванием готовили 0,5% растворы СА, а сыворотки разводили в 10 раз для профилактики гелеобразования.

Препараты СА с добавлением лигандов прогревали в стеклянных пробирках на водяной бане при следующих режимах 50° Ч 1 час, 60° Ч 1 час, 70° Ч 15 мин, 80° Ч 15 мин, 90° Ч 10 мин или 100° Ч 10 мин.

Установлено, что СА переносит без денатурации температуру до 70°С, сохраняется на четверть при 80°С и на 2-3% при 100°С. Высокие концентрации глицерина (20%) и солей (1М) предохраняют белок от денатурации при кипячении на 20-40%. Незначительное (до 2-3 раз) увеличение термостабильной фракции альбумина (ТСА) при 100°С наблюдается под влиянием гидрофобных лигандов (эстрадиола и билирубина).

Способность повышать концентрацию ТСА выявлена также у смеси токсинов элюированных с гемосорбента «СУГС» от больных перитонитом (рис.6).

В серии экспериментов иммунохимическими методами в индивидуальных разбавленных сыворотках здоровых лиц и больных с различной патологией, сопровождающейся эндотоксикозом, до и после обработки активированным углем определяли концентрации альбумина (ракетный иммуноэлектрофорез) (рис.5). Достоверно отличающиеся концентрации белков в параллельных пробах до и после обработки активированным углем выявлены у больных с выраженным токсикозом.

Предложен новый подход оценки степени выраженности эндогенной интоксикации (заявка на изобретение№ 2007146077, приоритет от 11.12.2007) при помощи количественной оценки термостабильной фракции сывороточного альбумина (ТСА). Способ заключается в одномоментном измерении уровня альбумина в одной микропробе кипяченой и некипяченой разбавленной крови методом иммунохимического анализа.

Результаты определения ТСА, СА, отношения ТСА/СА и обратного отношения (СА/ТСАЧ100%) коррелируют с другими лабораторными данными (общий анализ крови; ЛИИ, СМП254) -- маркерами интоксикации (r = +0,99 между ССА и МСМ, r = +0,95 между ССА и ЛИИ, r = +0,97 между ЛИИ и МСМ, r = -0,87 между ЛИИ и ОССА, r = -0,94 между ОССА и МСМ, r = -0,96 между ОССА и ССА).

Сравнительная характеристика чувствительности различных методов оценки интоксикации в% к контролю предсталена на рис.7.



Рис.7. Сравнительна характеристика чувствительности тестов количественной оценки степени интоксикации в % к контролю (доноры)

Иммунохимический мониторинг и лабораторные показатели в динамике изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА

Клинические показатели при изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА. Средний балл тяжести травмы по шкале AIS у травматологических больных (табл.9) составил 2,4±0,04, по шкале ISS -- 4,9±0,29, по ВПХ-П(МТ) -- 0,8±0,07 балла. Между шкалами AIS и ВПХ-П(МТ) у больных с травмами ОДА имеется тесная прямая корреляция (r=0,88).

Таблица 9. Интегральные показатели степени повреждения и тяжести состояния при поступлении у больных с изолированной и сочетанной ЧМТ и с переломами нижних конечностей

	Тяжесть повреждения	Тяжесть состояния
	AIS	ISS	ВПХ-П (МТ)	ВПХ-СП	Шкала Глазго
ОДА I (n = 143)	2	2	0,1	12,4±0,08	14,7±0,05
ОДА II (n = 82)	2,5±0,05	5,3±0,39	2	13,3±0,20	14,7±0,07
ОДА III (n = 40)	3,7±0,07	14,1±0,50	6	19,6±0,45	14,2±0,14
ЧМТ+ОДА (n = 65)	6,8±0,09	22,6±0,76	6,5±0,18	21,2±0,24	7,3±0,20
ЧМТ II (n = 90)	4	16	5,5±0,05	19,9±0,28	8,0±0,19
ЧМТ I (n = 52)	2,4±0,07	5,0±0,48	3,3±0,21	14,4±0,36	13,7±0,09

Степень тяжести состояния пострадавших с травмой ОДА по шкале комы Глазго (SCG) обычно соответствовала норме -- 15 баллов. Однако в связи с тем, что определенная часть (25,6%) пострадавших поступала в стационар в состоянии алькогольного интоксикации (АИ) с признаками угнетения сознания, балл SCG снижался вплоть до 11, и в среднем по группе пострадавших с изолированной травмой ОДА составил 14,7±0,05 балла.

Рис. 8. Средние баллы тяжести травмы при поступлении пострадавших в стационар в шести обследованных группах.

Применение МДМ-терапии позволило значительно улучшить показатели лечения и у больных с переломами (ОДА I и II) и у больных с ЧМТ I. В группе больных, лечившихся скелетным вытяжением и получавших мезодиэнцефальную модуляцию (34 больных) средний срок скелетного вытяжения составил 17,8 дней (табл.10). В контрольной группе (25 больных) -21,6 дня.

Таблица 10. Длительность основных этапов лечения больных с переломами длинных костей (группы ОДА I и II), леченных консервативно (в днях)

Группа	Этапы лечения
	Скелетное вытяжение	Сращение перелома	Реабили-тация	Общий срок лечения
МДМ-терапия	17,8	94,5	13,5	108,0
Контрольная	21,6	107,4	14,0	121,4

В первую неделю после поступления больных в стационар наиболее частым осложнением была гипостатическая пневмония, особенно у лиц пожилого возраста или страдающих алкогольной болезнью. Использование мезодиэнцефальной модуляции позволило снизить количество гипостатических пневмоний с 3,6% в группе больных, не получавших МДМ-терапию, до 1,9% у больных ее получавших, гнойных осложнений в 3,4 раза - с 6,1% до 1,8% соответственно.

Раннюю гипостатическую пневмонию следует дифференцировать от похожих клинически осложнений 3-4 суток после перелома -- жировой эмболии легочной артерии и синдрома «шокового легкого» (Соколов В.А.,2006). В этой ситуации показана оценка иммунохимических маркеров, характеризующих свертывающую систему и степень инфузионной гемодилюции.

Гематологические показатели при изолированной и сочетанной ЧМТ и травме ОДА. У больных с переломами длинных костей из группы ОДА I степень выраженности анемии была незначительной, так как наблюдались больные с повреждением одного сегмента, поэтому, не потребовалось назначения антианемических лекарственных средств. У больных с переломами длинных костей из группы ОДА II-III, в первую неделю после травмы отмечается нарастание анемии, что проявляется снижением числа эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и среднего содержания гемоглобина в эритроцитах. Такая динамика согласуется с исследованиями других авторов (Селезнев С.А., Худайбергенов Г.С., 1984, Takahashi, Henmi, Yaraki с соавт., 1983).

У больных с изолированной и сочетанной ЧМТ тяжелой степени такие лабораторные показатели красной крови как количество эритроцитов (RBC), гемоглобин (HGB), гематокрит (НСТ) достоверно снижены с первых дней после травмы. Через 5-7 суток после травмы продолжают снижаться: эритроциты (4,5±0,12Ч10¹²/л и 4,4±0,09Ч10¹²/л) и гемоглобин (136±2,82 г/л и 134±3,53 г/л соответственно). Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) достоверно снижается только в 1-3 сутки (32,7±0,79 пг и 31,2±0,83 пг) и имеет достоверную тенденцию к снижению и к 21 суткам до 31,7±1,39 пг. Гематокрит падает с 42,2±0,40 до 38,7±1,58 к 5-7 суткам, остается сниженным и на 14-16 сутки - 41,4±1,93% с намечающейся тенденцией к повышению на 21 день. Таким образом, у больных с изолированной и сочетанной ЧМТ тяжелой степени, несмотря на отсутствие выраженной кровопотери, в первую неделю после травмы отмечается нарастание анемии, что проявляется снижением числа эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и среднего содержания гемоглобина в эритроцитах.

На фоне показателей анемизации у больных тяжелой черепно-мозговой травмой обнаружено достоверное (р<0,01) снижение уровня HbF. Начиная с 3-й недели при изолированной травме ОДА и при сочетанной с ЧМТ травме ОДА, отмечается повышение абсолютного (г/л) и относительного (HbF/Hb в %) уровней фетального гемоглобина, чего не наблюдается у больных с тяжелой ЧМТ, видимо в результате нарушения центральных механизмов адаптации.

Показатели крови у больных из групп с травмами ОДА I-II и ЧМТ I на фоне мезодиэнцефальной модуляции восстанавливаются до исходного уровня примерно на одну неделю раньше, чем в соответствующей контрольной группе, что свидетельствует о выраженном положительном эффекте данного метода на организм пострадавших, в том числе у больных, поступивших в состоянии алкогольной интоксикации. Улучшение лабораторных показателей красной крови и иммунитета к 5-7 суткам в группе больных, получавших МДМ-терапию, по сравнению с контрольной группой (только на 14-19 сутки) создавало более благоприятные условия для оперативного лечения, способствовало снижению числа осложнений в раннем и позднем послеоперационном периоде.

Анализ полученных результатов показал, что через 5-7 суток после легкой травмы (ЧМТ I, ОДА I) наблюдалось максимальное увеличение числа лейкоцитов до 11,80,6 тыс. в 1 мкл, видимое сохранение на уровне нормы абсолютного числа лимфоцитов до 11,80,6 тыс в 1 мкл (260,6 %) и в дальнейшем восстановление их до нормы к третьей неделе.

Биохимические и иммунохимические показатели сыворотки при изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА. К наиболее лабильным биохимическим показателям, отражающим даже легкую травму следует отнести кортизол, изменяющимся даже в течение суток. Менее лабильная, но также цикличная для травмы легкой и средней тяжести характерна для транскортина (ТК). Уровень мочевины достоверно повышается через 5 - 7 суток после травмы до 6,370,86 ммоль/л (р ? 0,05). Это, по нашему мнению, свидетельствует о выраженности дезадаптационных процессов, являющихся результатом стрессовой реакции, а так же следствием непрямого воздействия механической травмы на обменные процессы в организме. К 14-19 суткам уровень мочевины снижается до 4,400,64 ммоль/л, что несколько ниже, чем содержание мочевины в сыворотке крови при поступлении.

Результаты биохимических исследований крови больных с изолированной ЧМТ тяжелой степени (ЧМТ II) показали, что в восстановительном периоде изолированной ЧМТ нормализация уровней основных обменных процессов наступает достаточно быстро к 5-7 дню.

В динамике травматической болезни головного мозга достоверное увеличение активности ферментов наблюдается в 1-3 сутки ЧМТ, что свидетельствует об активизации катаболических процессов у пострадавших в этот период. Нормализация катаболических процессов у больных с изолированной ЧМТ тяжелой степени происходит в пределах 5-7 суток, однако активность обеих трансаминаз (АСТ и АЛТ) сохраняется повышенной до двух-трех недель.

Полученные данные подтверждают, что первый период травматической болезни мозга, характеризует эти изменения метаболизма как «пожар обмена» (Ромоданов А.П., 1990).

Применение МДМ с первых суток после травмы позволяет ускорить процесс восстановления механизмов неспецифической резистентности организма и устранить иммунодепрессию уже на 5-7 сутки, о чем свидетельствует нормальное содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови больных из групп ОДА I-II и ЧМТ I, нормальные цифры содержания лейкоцитов к 5-7 суткам, а также восстановление показателей уровня белков острой фазы в эти же сроки, в то время как в контрольной группе возврат к исходному уровню происходит лишь на 14-19 сутки.

В 1-3 сутки, то есть до или в самом начале сеансов МДМ-терапии лабораторные и иммунохимические показатели в эспериментальной (77 больных с переломами нижних конечностей и 20 больных с ЧМТ I) и контрольной (42 и 18 больных соответственно) подгруппах, сформированных случайным образом, практически не отличались между собой, поэтому в точке «1-3 день» их значения объединены в одну группу (табл.11).

Вслед за резким подъемом в крови уровня белков острой фазы (БОФ) в течение первых 24-48 часов после травмы ОДА и ЧМТ формируются характерные для каждого реактанта кривые экспрессии и нормализации уровня белка. Усредненные данные для пяти БОФ у больных из групп ОДА I-II и ЧМТ I, получавших и не получавших МДМ-терапию, представлены в табл. 11.

СРБ на 5-7 сутки в контрольной группе снижается с 6,31,08 мг/л (485%) до 3,60,98 мг/л (277%) и незначительно возрастает до уровня 3,90,73 мг/л (300% от референтного значения) к 14-19 суткам (табл.10). В группе больных, получавших мезодиэнцефальную модуляцию, сохраняется приблизительно аналогичный уровень 3,40,52 мг/л белка через 5-7 суток после травмы (262%) и наблюдается тенденция к более ранней нормализации содержания СРБ до 2,10,48 мг/л (162%) к 14 - 19 суткам.

Для СБАГ характерно медленное нарастание с 3,90,54 мг/л (260%) до 4,31,06 мг/л (287%) с максимальным содержанием 6,41,19 мг/л (427% от референтного значения) к 14-19 суткам.

Для лейкоцитарного лактоферрина (ЛФ) характерно возрастание в контрольной группе на 5-7 сутки с 2,80,51 мг/л (187%) до 3,40,91 мг/л (227%) (обе группы достоверно отличаются от доноров по данному белку) со снижением к 14-19 суткам (2,10,62 мг/л или 140%). В группе МДМ снижение носит более выраженный характер (2,20,65 мг/л или 147%) на 5-7 сутки и восстановление показателей к 14-19 суткам на 67% от донорского уровня 1,00,42 мг/л (различие достоверно, р<0,05).

Наименее выраженные изменения наблюдались при изучении б₂-макроглобулина. После кратковременного снижения до 82% от донорского уровня, уровень МГ нарастает до максимального на 5-7 сутки и постепенному снижается к 19 суткам.

Таблица 11. Усредненная динамика восстановления уровней некоторых белков острой фазы в крови у больных с легкой и средней изолированной ЧМТ и у больных с переломами нижних конечностей (ЧМТ I + ОДА I-II)

Группа	Показатели
	СРБ мг/л	СБАГ мг/л	МГ г/л	ЛФ мг/л	Фр нг/мл
Контроль (доноры)	1,30±0,53	1,50±1,31	1,70±0,65	1,5±0,10	115±20,5
1-3 сутки	6,30±1,08*	3,90±0,54*	1,40±0,34	2,80±0,51*	222±33,7*
5-7 сутки	3,60±0,98	4,30±1,06	2,30±0,92	3,40±0,91	247±25,3*
14-19 сутки	3,90±0,73	6,40±1,19	2,0±0,88	2,10±0,62	196±21,2*
5-7 сутки МДМ	3,40±0,52	4,50±0,65	2,70±0,80*	2,20±0,65*	166±16,7*
14-19 сутки МДМ	2,10±0,48*	2,70±0,60*	1,90±0,73	1,00±0,42*	178±12,3*

* -- достоверные (р<0,05) различия с контрольной группой доноров

Полное снижение уровней БОФ у больных с переломами коррелирует с выявляемыми биомеханически и рентгенологически конечными этапами консолидации перелома -- редукцией пери- и эндостального регенерата с параллельным развитием интермедиарной мозоли, определяющей собственно сращение перелома.

Уровни феритина (Фр) (табл. 10) при лечении переломов длинных костей без включения метода МДМ-терапии достоверно повышаются в 1,5-2 раза, начиная с первых 5-7 дней после перелома и незначительно снижаются, сохраняясь на достоверно высоком по сравнению с контролем уровне на 14-19 сутки. Под влиянием МДМ-терапии проискодит более быстрое снижение содержания Фр в крови, начиная с 5-7 дня.

При сопоставлении травмы ОДА и ЧМТ уровень Фр достоверно (p<0,01) повышается в сыворотке пациентов с тяжелой и сочетанной травмой, у больных с изолированной ЧМТ, но сохраняется на относительно низком уровне в остром периоде при закрытых переломах длинных костей.

Средние значения Фр у пострадавших с ЧМТ на фоне алкогольной интоксикации выше, чем значения у трезвых пострадавших равной степени тяжести повреждения. Обнаружены противоположно направленные изменения биохимических показателей у пострадавших в первые сутки после тяжелой ЧМТ: на фоне алкогольной интоксикации уровень глюкозы в крови (4,4±0,57 ммоль/л) достоверно ниже (р<0,02), а ферритина (185±29,3 нг/мл) достоверно выше (р<0,05), чем у пострадавших с равной степенью тяжести ЧМТ по шкале комы, но без признаков алкогольной интоксикации (6,8±0,75 ммоль/л и 134±26,4 нг/мл соответственно).

Таким образом, коэффициент ферритин/глюкоза при ЧМТ на фоне алкогольной интоксикации в 2 раза выше (42,0 и 19,7 соответственно), чем у пострадавших с ЧМТ без признаков алкогольной интоксикации. Данная зависимость может представлять интерес в плане дифференциальной диагностики токсической и травматической комы.

Кроме СРБ, СБАГ, МГ, Фр и ЛФ в первые три дня изолированной и сочетанной ЧМТ II пропорционально степени выраженности состояния пострадавших по шкале AIS и SCG в крови увеличиваются концентрации ЦП, ТК, ПЩФ. В результате повреждения головного мозга у всех больных независимо от вида и исхода мозгового повреждения на 1-10 сутки формируются неспецифические посттравматические реакции. Наиболее обязательными ее проявлениями являются SIRS, синдром гемостазиологических нарушений (тромбоцитопения, ПДФ), гиперферментемия (АСТ, АЛТ, ЩФ) и интоксикационный синдром (МСМ, ТСА).

В отличие от острофазовых белков концентрация ТСА в сыворотке больных, прошедших МДМ-терапию, не отличалась от контрольной группы, что свидетельствует о невыраженности эндотоксикоза при неосложненных изолированных переломах длинных костей.

Установлено, что кроме ТСА, сильную связь с маркерами интоксикации (МСМ и ЛИИ) при травматическом токсикозе как на фоне тяжелой ЧМТ, так и при травме ОДА демонстрируют АФП, СБАГ и ТК, кортизол, ПДФ, умеренную -- СРБ, ЛФ и некоторые другие БОФ.

У больных из групп ОДА III, сочетанной и изолированной и ЧМТ II обнаружена корреляция уровней АФП, СБАГ, ТК и альбумина как со степенью выраженности интоксикационного синдрома, так и со степенью выраженности SIRS в баллах. Показано, что белки с транспортной функцией в большей степени коррелируют со степенью интоксикационного синдрома (r=0,86), и в меньшей с SIRS (r=0,58). Для СРБ и других БОФ, наблюдаются противоположные корреляционные отношения.

Ранними признаками инфекционных посттравматических осложнений является повторное нарастание СРБ, ПДФ и ЛФ. Повышенные уровни белка S-100 пропорциональные степени травмы обнаруживаются не только у пострадавших с ЧМТ, но и при переломах длинных костей, особенно у пострадавших с алкогольной болезнью и после первых сеансов МДМ-терапии. Клиническая эффективность МДМ-терапии коррелирует с нормализацией СРБ, СБАГ и IgM.

Включение в комплекс диагностических мероприятий у больных с переломами длинных костей и ЧМТ клинических (балльная оценка) и иммунохимических маркеров SIRS позволяет повысить точность прогноза осложнений. При отсутствии осложнений инфекционного характера на 3-4-ой неделе посттравматического периода диагностически и прогностически значимыми становятся онкомаркеры АФП и ПЩФ, уровни которых отражают степень консолидации длинных костей и репаративные процессы после ЧМТ.

Анализ полученных данных показал достоверные изменения содержания иммуноглобулинов IgA, IgG, IgM во всех группах в сроки 1-3, 5-7, 14-19 сутки после травмы.

Исследование содержания иммуноглобулинов IgA, IgG, IgM выявило следующие закономерности: IgA на 5-7 сутки в контрольной группе снижается с 1,940,09 г/л до 1,780,12 г/л и почти восстанавливается до прежнего уровня к 14-19 суткам 1,920,08 г/л; в группе больных, получавших мезодиэнцефальную модуляцию, наоборот наблюдается значительное повышение содержания иммуноглобулинов этого класса до 2,090,09 г/л через 5-7 суток после травмы с восстановлением данного показателя на несколько более высоком уровне к 14-19 суткам.

Для иммуноглобулинов IgG так же характерно снижение в контрольной группе на 5 -7 сутки с 9,02 0,19 г/л до 8,100,09 г/л с восстановлением к 14-19 суткам (9,000,08 г/л), в то время как в группе МДМ снижение носит незначительный характер (8,920,08 г/л) на 5-7 сутки и восстановление показателей к 19 суткам до прежнего уровня (рис.9).

Рис.9. Рис.10.

Динамика содержания иммуноглобулинов класса IgM (рис.10) у больных с переломами длинных костей на фоне проводимой мезодиэнцефальной модуляции и в контрольной группе несколько отличается. Восстановление его до исходного уровня 1,220,02 г/л к 14-19 суткам происходит только в группе больных, которым назначена МДМ - терапия. На 5-7 сутки в этой группе повышение их незначительно 1,29 0,05 г/л. В контрольной группе к 14-19 суткам восстановления содержания этих иммуноглобулинов не происходит 1,100,02 г/л, а в сроки 5-7 суток после травмы эти значения ниже, чем в МДМ - группе 1,060,03 г/л.

Из онкомаркеров альфа-фетопротеина (АФП), раково-эмбрионального антигена (РЭА) и плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) последний имел пик на 1-3 день, а не на 5-7-й день, как АФП и РЭА и постепенно снижается до нормы к 21 дню. Содержание АФП и РЭА в 1-3 сутки возрастает в полтора-два раза, достигая максимальных значений в конце первой недели (рис.43), в дальнейшем уровень РЭА снижается до нормы к 21-28 дню, а уровень АФП продолжает оставаться повышенным (рис.11).

Рис.11. Динамика онкомаркеров при переломах (группа ОДАII) в %

Содержание в сыворотке АФП, ПЩФ в большей степени зависит от тяжести травмы, чем РЭА. Максимальный уровень АФП при тяжелых травмах, осложненных травматическим шоком, возрастает по сравнению с донорами в 10 раз.

Повышенные концентрации ПЩФ при переломах в отдаленные сроки выявляется лишь у части больных с выраженным регенераторным ответом и коррелирует с активной консолидацией перелома. При этом успешно репонированные переломы одной из костей голени и бедра не приводили к появлению повышенных уровней ПЩФ. При вяло текущем заживлении, даже в случаях множественных и открытых переломов с повреждением окружающих тканей, появление ПЩФ было не характерно.

Выводы

1. На аффинных (иммобилизованный эстадиол и цибакроновый синий), гидрофобных и амфифильных сорбентах исследованы хроматографические свойства ассоциированных с этими лигандами белков альфа-фетопротеина (АФП), сывороточного альбумина (СА), транскортина (ТК), СБАГ и ПЩФ и установлены факторы, позволяющие управлять их поведением в колонке.

2. Разаработаны методы выделения и очистки ТК, СБАГ и ПЩФ, получены моноспецифические антисыворотки на эти белки и сконструированы иммунохимические тест системы для их определения методами иммунодиффузионного и иммуноферментного анализа.

3. Установлена обратная корреляционная зависимость между концентрацией гидрофобного и гидрофильного низкомолекулярного лиганда, адсорбированного на поверхности макромолекулы альбумина, и степенью его термической денатурации. Разработан способ количественной оценки эндогенной интоксикации по нарастанию уровня термостабильной фракции сывороточного альбумина.

4. Установлена прямая корреляционная зависимость между степенью тяжести повреждения в баллах по шкалам AIS и ВПХ-П и сывороточным уровнем ферритина (Фр), КФК, белка S-100 и кортизола (для ЧМТ) или уровнем Фр, КФК, миоглобина, кортизола и мочевины (для переломов длинных костей). Повышенные уровни белка S-100 обнаруживаются не только у пострадавших с ЧМТ, но и при переломах длинных костей у пострадавших с алкогольной болезнью, а также после первых сеансов МДМ-терапии.

5. Средние концентрации Фр при ЧМТ I составили 166±24,7; при ЧМТ II - 222±33,7; при сочетанной ЧМТ - 296±73,9; при травме ОДА I - 103±12,5; при травме ОДА II - 136±24,1; при травме ОДА III - 168±26,5; у доноров - 86±13,2 нг/мл. Повышение уровня Фр в крови выше 150 нг/мл является референтным для ЧМТ и может быть вместе с белком S-100 рекомендовано для качественных экспресс-тестов для догоспитальной диагностики.

6. При равной оценке степени тяжести ЧМТ по шкале ком Глазго наличие и отсутствие сопутствующей травме алкогольной интоксикации проявляются разными биохимическими и иммунохимическими профилями. Отношение ферритин/глюкоза достоверно выше (p<00,1) у пострадавших с алкогольной интоксикацией.

7. Уровень ЛФ в сыворотке крови достоверно повышается с первых дней травмы только у больных с сочетанной ЧМТ. Увеличение концентрации ЛФ на фоне синдрома взаимного отягощения повреждений указывает на одновременное с процессами деструкции начало активизации факторов специфической иммунной защиты.

8. Оценка состояния пострадавшего по шкалам ВПХ-СП, ВПХ-СГ и APASHE-2, после травмы коррелирует с клиническими, биохимическими и иммунохимическими маркерами гипоксии, гиперферментемии (АСТ, АЛТ, ЩФ), гемостазиологических нарушений (тромбоцитопения, ПДФ), травматического токсикоза и синдрома системного воспалительного ответа (ССВО, SIRS).

9. Клинические параметры SIRS (лихорадка, лейкоцитоз, тахикардия) входящие в шкалу оценки состояния реанимационных больных APASHE-2 и измеренные в баллах, находятся в тесной взаимосвязи с концентрацией белков острой фазы (СРБ - r=0,97), (СБАГ - r=0,92), (ЦП - r=0,91), (ЛФ - r=0,89), (ПДФ - r=0,81), (МГ - r=0,75), (СА - r=-0,67), (Фр - r=0,65) и в слабой связи (r=0,3-0,4) с транспортными белками и онкомаркерами (ТК, АФП, РЭА, ПЩФ). Ранними признаками инфекционных посттравматических осложнений является повторное нарастание СРБ, СБАГ, ПДФ и ЛФ. Одновременное появление, определяемых иммунодиффузионными методами концентраций СРБ, ПДФ, ПЩФ и подъем уровней ЛФ более 1000 нг/мл и Фр свыше 200 нг/мл характерно для гипостатической или нозокомиальной (внутрибольничной) пневмонии.

10. Лабораторные параметры интоксикационного синдрома (МСМ, ЛИИ) демонстрируют сильную связь (r=0,90-0,80) с концентрацией термостабильной фракции альбумина (ТСА), миоглобина, ТК, кортизола, ПЩФ, ЦП, ПДФ, трансаминаз и умеренную связь с другими БОФ (СРБ - r=0,67), (СБАГ - r=0,65), (ЛФ - r=0,44), (МГ - r=0,39), (Фр - r=0,36).

11. Лабораторные показатели красной крови свидетельствуют о развитии у больных с тяжелой сочетанной ЧМТ (группа ЧМТ+ОДА), синдрома взаимного отягощения повреждений, проявляющегося более выраженной анемизацией, по сравнению с больными с изолированной ЧМТ II и травмой ОДА III, и об отсутствии симптомов анемизации в группах ЧМТ I и ОДА I. В первые дни после ЧМТ и скелетной травмы обнаружено достоверное снижение в крови уровня фетального гемоглобина HbF. Начиная с 3-й недели во всех группах, отмечается повышение абсолютного (г/л) и относительного (HbF/Hb в %) уровней HbF. Не обнаружено взаимосвязи (r=0,1) между степенью сатурации артериальной крови кислородом (рО2) и содержанием в венозной крови HbF.

12. У больных из групп с травмами ОДА I-II и ЧМТ I обнаружена более ранняя нормализация всех показателей в условиях применения неспецифической транскутанной электроимпульсной стимуляции головного мозга методом МДМ-терапии. Использование мезодиэнцефальной модуляции с первых суток после получения травмы позволяет снизить количество гипостатических пневмоний в 1,9 раз, уменьшить число воспалительных местных послеоперационных осложнений в 3,4 раза, количество вялоконсолидирующих переломов и ложных суставов в 3,3 раза.

Практические рекомендации

1. Способность стероидсвязывающих и транспортных белков изменять в широких пределах свои хроматографические характеристики в присутствии специфичных и неспецифичных лигандов различной природы позволяет управлять их сорбционными свойствами и добиваться разделения близких по физико-химическим свойствам белков.

2. Предлагаемые схемы выделения альбумина, АФП, ПЩФ, СБАГ и транскортина с помощью аффинной, высаливающей и гидрофобной хроматографии дают возможность при минимальных экономических затратах очищать белки для последующего получения на эти белки моноспецифических антисывороток.

3. Для определения связывающей емкости альбумина по отношению к низкомолекулярным веществам-токсинам целесообразно применять иммунохимический способ измерения термостабильной фракции сывороточного альбумина (ТСА), с последующим вычислением соотношения ТСА/СА. Этот же иммунохимический метод может быть использован для количественной оценки синдрома эндогенной интоксикации.

4. Ранними признаками инфекционных посттравматических осложнений является повторное нарастание СРБ, СБАГ, ПДФ и ЛФ. Одновременное появление, определяемых иммунодиффузионными методами концентраций СРБ, ПДФ, ПЩФ и подъем уровней ЛФ более 1000 нг/мл и Фр свыше 200 нг/мл позволяет для гипостатической пневмонии.

5. Коэффициент ферритин/глюкоза при ЧМТ на фоне алкогольной интоксикации в 2 раза выше (42,0 и 19,7 соответственно), чем у пострадавших с ЧМТ без признаков алкогольной интоксикации. Рекомендуется использовать данное отношение для дифференциальной диагностики токсической и травматической комы..

6. При оценке тяжести состояния и прогнозировании исходов изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА в острейшем периоде повреждения (1-7 сутки) следует неоднократно в динамике сопоставлять параметрическую оценку состояния пострадавшего в баллах с наиболее значимыми лабораторными показателями (уровни красной и белой крови, БОФ, АСТ, АЛТ, тромбоцитов, HbF, мочевины, глюкозы) для своевременной коррекции интенсивной терапии.

7. Для оценки степени гипоксии при тяжелой нейро- и скелетной травме наряду с показателями оксигенации (рО2), кровопотери ( уровень альбумина и гравиметрия крови) и анемии (RBC, HGB, HCT) рекомендуется использовать иммунохимический тест на фетальный гемоглобин и коэффициент HbF/HbA.

8. В комплексную терапию всех больных с ЧМТ легкой степени и диафизарными переломами длинных костей, особенно пострадавших с алкогольной интоксикацией при поступлении, необходимо с первых суток включать МДМ-терапию, что позволяет уменьшить вероятность истощения адаптационного потенциала и предотвращает развитие гиперкатаболизма и осложнений раннего периода травматической болезни.

9. При оценке тяжести состояния и прогнозировании исходов изолированной и сочетанной ЧМТ и травмы ОДА в острейшем периоде повреждения (1-10 сутки) следует неоднократно в динамике сопоставлять клиническую оценку состояния пострадавшего в баллах (ВПХ, SCG, триада SIRS) с наиболее значимыми лабораторными показателями (уровни иммунохимических маркеров, биохимических и гематологических показателей). Иммунохимические тесты на СРБ, СБАГ, ЦП, ЛФ, МГ, HbF, АФП, ПЩФ, Фр, ТСА, ТК, MG рекомендуются для оценки эффективности лечения и прогноз течения травматической болезни мозга и ОДА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коханов А.В., Ульянов А.А. К вопросу о физиологической роли альфа-фетопротеина: влияние на процессы регенерации и воспаления // Особенности физиологии и патологии детей раннего возраста. - Саратов. - 1984. - С.19-23.

2. Коханов А.В. Возможности гидрофобной хроматографии в разделении белков с высокой степенью гомологии // Тезисы докладов 66-й научной конференции Астр.мединститута - Астрахань. - 1985. - С.91-92.

3. Мирошников В.М., Резников И.И., Коханов А.В. Сравнительная оценка действия некоторых сывороточных белков на регенерацию тканей // Бюлл. эксперим. биологии. - 1987. - №1. - С. 95 - 97.

4. Коханов А.В., Ульянов А.А., Коханов С.В. Четвертьвековой юбилей в иммунодиагностике: некоторые итоги и перспективы изучения первого иммунохимического маркера рака // Пролиферация и рак: медико-биологические проблемы. Сборник научных трудов. - Саратов. - 1988. - С.10-18.

5. Мирошников В.М., Коханов А.В. Иммунобиологические особенности регенерации при использованиии официнальных белковых препаратов // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1988. - №4. - С. 54 - 57.

6. Коханов А.В., Гайнуллина Л.Х. Белки беременности животных, их диагностическое значение // Сборник научных трудов СГУ. - Саратов. - 1990. - С.20-21.

7. Гайнуллина Л.Х., Коханов А.В. Антигены репродуктивной системы млекопитающих и их значение для экологического мониторинга // Влияние антропогенных факторов на морфогенез и структурные преобразования органов. Материалы Всероссийской конференции. Астрахань. - 1991. - С.35-36.

8. Коханов А.В., Костина Л.А. Тест на стадиоспецифические белки как дополнительный критерий иммунологической реактивности организма для оценки экзогенных повреждающих факторов // Влияние антропогенных факторов на морфогенез и структурные преобразования органов. Материалы Всероссийской конференции. Астрахань. - 1991. - С. .81-82.

9. Мамиев О.Б., Коханов А.В. Специфичность аутоантител у женщин в гестационном периоде // Сборник докладов IV съезда врачей и провизоров Калмыцкой АССР. - Элиста. - 1990. - С.91-92

10. Гончарова Л.А., Коханов А.В., Корнеев Н.В. Значение иммунохимических исследований в процессе хирургического лечения ортопедических больных // Хирургия на пороге XXI века. Труды АГМА - Астрахань. - 2000. Т.18. - С.157-163.

11. Коханов А.В., Костина Л.А., Коханов С.В., Основин С.А. Эмбриональные костно-хрящевые протеины: возможности в диагностике, профилактике и терапии // Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза человека в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины. Материалы международной конференции. Астрахань. - 2000. - С.83-84.

12. Коханов А.В., Костина Л.А., Шац Е.И., Корнеев Н.В. Острофазовые белки и аутоантитела к тканевым антигенам как маркеры хронических деструктивно-пролиферативных процессов костной ткани // Хирургия на пороге XXI века. Труды АГМА - Астрахань. - 2000. Т.18. - С. 225-230.

13. Коханов А.В., Мирошников В.М., Костина Л.А., Суринков Д.Б. Иммунохимический мониторинг в процессе хирургического лечения травмы опорно-двигательного аппарата // Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза человека в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье населения. Актуальные проблемы биологии и медицины. Материалы международной конференции. Астрахань. - 2000. - С. 232-233.

14. Безрукавникова Н.В., Никулина Д.М., Коханов А.В., Григорьева Т.А. Иммунохимические маркеры в клинической оценке дисгормональных заболеваний и гормонзависимых опухолей // Материалы пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». - Медицинская иммунология - С-Пб. - 2001. - Т.3. - №2. - С. 263.

15. Коханов А.В., Мирошников В.М., Суринков Д.Б., Коханов С.В. Стадиоспецифические антигены в оценке эффективности лечения больных с переломами длинных костей методом МДМ - терапии // Материалы пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001». - Медицинская иммунология - С-Пб. - 2001. - Т.3. - №2. - С. 323.

16. Коханов А.В., Гончарова Л.А., Костина Л.А. Иммунохимические маркеры в оценке и прогнозировании результатов лечения детей с травмами и заболеваниями опорно-двигательного аппарата // Актуальные проблемы педиатрии. Труды АГМА. - Астрахань. - 2001. Т.23. - С.95-97.

17. Коханов А.В., Гончарова Л.А., Суринков Д.Б., Костина Л.А. Особенности антигенного и изоферментнорго спектров костной ткани в процессе перинатального остеогенеза. // Материалы 78-й итоговой конференции АГМА - Астрахань. - 2001. Т.22. - С.94-97.

18. Суринков Д.Б., Коханов А.В. Маркеры репаративной регенерации, иммунного статуса и адаптационных реакций у больных с переломами длинных костей на фоне мезодиэнцефальной модуляции // Материалы конференции молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний». - Астрахань-Москва. - 2001. - С.144-146.

19. Асфандияров Р.И., Лазько А.Е., Коханов А.В. Изомеры щелочной фосфатазы и остеогенез // Морфология. - 2002. - Т. 121 - №2-3. - С. 13

20. Демичев Н.П., Резаев А.А., Суринков Д.Б., Коханов А.В. Влияние мезодиэнцефальной модуляции на иммунологические показатели крови у больных с переломами длинных костей // Вестник новых медицинских технологий. - 2002. - Т.IX - №2. - С. 46-47.

21. Демичев Н.П., Резаев А.А., Суринков Д.Б., Коханов А.В. Коррекция иммунологических нарушений у больных с переломами длинных костей методом мезодиэнцефальной модуляции // Современные технологии лечения и реабилитации повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы. Материалы VII съезда травматологов-ортопедов Республики Беларусь, Гомель, 3-5 октября 2002 г. - Минск. - 2002. - С. 159-161.

22. Демичев Н.П., Резаев А.А., Суринков Д.Б., Коханов А.В. Мезодиэнцефальная модуляция как метод повышения адаптации больных с переломами длинных костей // Международный медицинский журнал. - 2002. - Т.8 - №3. - С. 94-95.

23. Демичев Н.П., Резаев А.А., Суринков Д.Б., Коханов А.В. Содержание мочевины в сыворотке крови больных с переломами длинных костей на фоне мезодиэнцефальной модуляции // Труды АГМА - Астрахань. - 2002. Т.24. - С.199-204.

24. Коханов А.В., Мирошников В.М., Суринков Д.Б., Демичев Н.П. Онкомаркеры при физиологической и патологической консолидации переломов длинных костей // Материалы III съезда биохимического общества РАН. С-Пб. - 26 июня - 1 июля 2002. С.180-181.

...