Клинико-экспериментальное обоснование использования иммуномодуляторов в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Клинико-экспериментальное обоснование использования иммуномодуляторов в комплексной терапии наружного генитального эндометриоза

Павлов Роман Владимирович

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

академик РАМН, заслуженный деятель

науки РФ, доктор медицинских наук,

доктор медицинских наук,

профессор Савицкий Геннадий Александрович

профессор Гайдуков Сергей Николаевич

профессор Назаров Петр Григорьевич

Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита диссертации состоится «___» ____________200 г в ___ часов на заседание диссертационного совета Д 001.021.01 при ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д.3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Автореферат разослан «___»__________________200 г.

Ученый секретарь

кандидат медицинских наукКузьминых Татьяна Ульяновна

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. В последние годы наметился рост в заболеваемости генитальным эндометриозом. Согласно современным данным, наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) диагностируется у 30% женщин репродуктивного возраста, при этом на аутопсийном материале частота его выявления достигает 53,7%. Среди пациенток, страдающих синдромом тазовых болей, эндометриоз выявляется в 38,8% случаев, среди больных с бесплодием - в 50%. По данным Американского общества фертильности, за последние 10 лет экономические затраты на лечение больных эндометриозом увеличились на 61% (Л.В. Адамян, В.И. Кулаков 1998, В.П. Баскаков, Ю.В. Цвелев, Е.Ф. Кира 2002, Г.А. Савицкий, С.М. Горбушин 2002, P. Vigano, F. Parazzini, E. Somigliana, P. Vercellini 2004, X. Gao, et al. 2006).

Наиболее распространенная схема лечения НГЭ в виде хирургического удаления очагов эндометриоза с последующей гормональной терапией, при ее высокой себестоимости и частоте побочных эффектов, не обладает достаточной эффективностью в снижении рецидивов заболевания, полной ликвидации его клинических проявлений и в наступлении беременности у больных с бесплодием. Подобное положение определяет актуальность разработки новых методов лечения этого заболевания с учетом всех сторон его патогенеза, в том числе роли иммунной системы и ангиогенеза (Э.К. Айламазян, С.А. Сельков, М.И. Ярмолинская 1997, М.И. Ярмолинская 1997, A.W. Nap, et al. 2004, D.L. Olive, S.R. Lindheim, E.A. Pritts 2004, A.K. Schroder, K. Diedrich, M. Ludwig 2004).

С учётом современных представлений о характере иммунных нарушений при НГЭ применение иммуномодулирующих препаратов является важным этапом в комплексной терапии этой патологии. Исследование роли иммунной системы на качественно новом уровне позволило рекомендовать использование селективной стимуляции иммунной системы с применением активирующих цитокинов и их ансамблей, а благодаря технологии рекомбинантных ДНК некоторые цитокины стали доступны в количествах, достаточных для их клинического изучения и последующего медицинского применения, в том числе для лечения НГЭ (М.И. Ярмолинская 1997, В.С. Корсак, с соавт. 2002, С.А. Сельков, М.И. Ярмолинская 2004, T.M. D'Hooghe, et al. 2004, D.L. Olive, S.R. Lindheim, E.A. Pritts 2004).

В то же время селективная иммунотерапия применялась в качестве дополнения к стандартному послеоперационному гормональному лечению НГЭ в немногочисленных исследованиях, что не позволяет объективно оценить все ее достоинства и недостатки в терапии этого заболевания. По нашему мнению, комплексное изучение роли иммунной системы и ангиогенеза в патогенезе НГЭ позволит не только получить новые данные о механизме возникновения этого заболевания, но и разработать качественно новую схему лечения эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии.

Цель исследования. Экспериментальная и клиническая разработка патогенетически обоснованных схем цитокинотерапии в комплексном лечении наружного генитального эндометриоза.

Задачи исследования

Оценить особенности клинического течения НГЭ с учетом макроскопических особенностей эндометриоидных гетеротопий.

Определить пролиферативную активность клеток эктопического эндометрия (площадь ядер, плоидность клеток, активность областей ядрышковых организаторов) в эндометриоидных очагах с разными макроскопическими особенностями.

Изучить особенности васкуляризации (диаметр и площадь капилляров, пролиферативная активность клеток эндотелия) и клеточного состава лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий с различной пролиферативной активностью эктопического эндометрия.

Изучить субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови и перитонеальной жидкости (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25) больных НГЭ в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Определить продукцию цитокинов (ИЛ1в, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНОб, ИФНг) мононуклеарными клетками периферической крови и перитонеальной жидкости больных НГЭ, а также уровень этих цитокинов в нативной перитонеальной жидкости и ткани эндометриоидных гетеротопий в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Оценить ближайшие (течение послеоперационного периода и иммунокоррегирующий эффект) и отдаленные (клинический эффект, снижение уровня СА125, наступление беременности и рецидива заболевания) результаты противорецидивной терапии НГЭ интерфероном-б2b (Реафероном-ЕС) и генноинженерным аналогом эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкином) в клинике.

Научное значение настоящего исследования. Изучены показатели общего и местного иммунитета у больных НГЭ, особенности цитокинового обмена и активность ангиогенеза в эндометриоидных гетеротопиях в зависимости от пролиферативной активности клеток их эпителия. Подтверждена роль иммунной системы и ангиогенеза в возникновении и прогрессировании НГЭ, выявлены возможные точки приложения селективной иммунотерапии для профилактики рецидивов заболевания. Впервые в эксперименте in vivo изучена эффективность и механизм действия интерферона-2 и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (ИЛ2) в отношении экспериментального эндометриоза у крыс. Предложена патогенетически обоснованная и экспериментально подтвержденная комплексная схема лечения наружного генитального эндометриоза с использованием интерферона-б2 (Реаферона-ЕС) и генноинженерного аналога эндогенного интерлейкина-2 (Ронколейкина), проведена оценка ее эффективности. Доказано, что предлагаемые схемы селективной иммунотерапии НГЭ улучшают течение послеоперационного периода, в отношении противорецидивного и клинического эффекта не уступают гормональной терапии с использованием агонистов ГнРГ, не обладая побочными эффектами последней, а в отношении восстановления фертильности у больных с бесплодием превосходят общепринятую схему лечения в два раза.

Теоретическое и практическое значение результатов работы. Полученные иммунологические и морфологические данные углубляют имеющиеся сведения о роли иммунной системы и ангиогенеза в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизме действия цитокинов в отношении регресса очагов эндометриоза и обосновывают целесообразность использования селективной иммунотерапии в комплексном лечении этого заболевания. Полученные клинические данные позволяют предлагать к широкому применению эффективные и безопасные схемы комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии, не уступающие по эффективности общепринятым методам, а по восстановлению фертильности у больных с бесплодием превосходящие их в два раза.

Апробация работы и внедрение результатов в практику. Основные результаты исследований вошли в отчет по научно-исследовательской работе Ставропольской государственной медицинской академии и ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН за 2005 - 2008 гг. Материалы исследований используются в учебном процессе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в Ставропольской государственной медицинской академии и в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН.

Основные положения работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на севере» (Архангельск, 2006), на итоговых конференциях молодых ученых и студентов Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, 2006, 2007, 2008), на краевой клинической конференции акушеров-гинекологов (Ставрополь, 2007, 2008), на 9-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2007), на 3-м Международном научном конгрессе «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (Ст-Петербург, 2007), на II-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008), на Объединенном иммунологическом форуме (Ст-Петербург, 2008), на III-м международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009).

Предлагаемая схема лечения НГЭ применяется на практике в гинекологических отделениях Ставропольского краевого клинического перинатального центра и Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи.

Основные положения диссертации изложены в 21 научной работе (11 из них опубликованы в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ), в практических рекомендациях, а также в материалах российских и международных конференций и форумов.

Основные положения, выносимые на защиту

Клинические проявления наружного генитального эндометриоза и частота ассоциированного с ним бесплодия определяются не только степенью распространения заболевания, но и пролиферативной активностью эпителия эндометриоидных гетеротопий.

Пролиферативная активность эпителия эндометриоидных гетеротопий находится в прямой зависимости от степени их васкуляризации, активности перитонеальных макрофагов и уровня провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости и ткани гетеротопий.

Лечение экспериментального эндометриоза у крыс с применением монотерапии интерфероном- и генноинженерным аналогом ИЛ2 ведет к полному регрессу очагов эндометриоза более чем в половине случаев.

В основе регресса очагов эндометриоза на фоне проводимой селективной иммунотерапии лежит увеличение активности Т-лимфоцитов и естественных киллеров при одновременном снижении активности макрофагов и степени васкуляризации эндометриоидных гетеротопий.

Селективная иммунотерапия, включенная в комплексное лечение наружного генитального эндометриоза, улучшает течение послеоперационного периода, не отличается по противорецидивному и клиническому эффекту от терапии НГЭ агонистами ГнРГ, не обладает побочными эффектами последних, позволяет в 3 раза снизить частоту возникновения спаечного процесса малого таза после хирургического вмешательства, в 2 раза увеличить частоту наступления беременностей у пациенток с бесплодием и значительно снизить себестоимость лечения больных.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 103 работы отечественных и 372 работы зарубежных авторов. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 91 таблицей, 34 фотографиями и 5 рисунками.

2. Содержание работы

Общее количество больных НГЭ, находившихся под нашим наблюдением с 1999 по 2008 гг., составило 835 человек. С целью подбора клинически однородной группы для проведения основной части исследования всем больным проводилось общеклиническое обследование и лечебно-диагностическая лапароскопия. Клиническое обследование больных включало в себя сбор анамнеза, проведение гинекологического исследования, УЗИ органов малого таза, определение в периферической крови уровня СА125. Лечебно-диагностическая лапароскопия проводилась с помощью оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия). Степень распространения НГЭ определялась в баллах по пересмотренной классификации Американского общества фертильности r-AFS.

На основании полученных клинических и эндоскопических данных было отобрано 150 больных НГЭ, сопоставимых по возрасту, жалобам, анамнезу, гинекологической и экстрагенитальной патологии, у которых проводилось морфометрическое исследование удаленных очагов эндометриоза и иммунологическое исследование периферической крови (ПК), перитонеальной жидкости (ПЖ) и ткани эндометриоидных гетеротопий.

В ходе изучения пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, степени васкуляризации и характера лейкоцитарной инфильтрации все очаги ЭБ были разделены на три группы: I группа - 30 гетеротопий «красного» цвета, II группа - 44 гетеротопии «черного» цвета, III группа - 26 гетеротопий «белого» цвета. Эндометриоидные кисты яичников (ЭКЯ) в зависимости от их микроскопического строения были разделены на две группы: I группа - железисто-кистозный вариант (ЖКВ) (35 препаратов) и II группа - кистозный вариант (КВ) (45 препаратов).

Для проведения морфологического исследования гистологические препараты, фиксированные в 10% нейтральном формалине и 96% охлажденном этаноле, окрашивались гематоксилином-эозином, по Ван-Гизону, Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и азотнокислым серебром. Системный морфометрический анализ удаленных препаратов выполнялся с помощью микротелефотометрического анализатора изображения с использованием программы «ВидеоТест-Морфо» («Истра-ВидеоТест», Россия).

Пролиферативная активность клеток эктопического эндометрия и эндотелия капилляров оценивалась на основании критериев, предложенных Г.Г. Автандиловым (1996): высота эндометриоидных клеток, средняя площадь ядер эндометриоидных и эндотелиальных клеток, плотность распределения ДНК в ядрах клеток, параметры активности областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) (среднее количество, средняя площадь, суммарная площадь ОЯОР в ядре клетки). Степень васкуляризации очагов эндометриоза оценивалась на основании подсчета процента площади просвета сосудов в 1 мм² образца ткани, средней площади просвета капилляра и показателей пролиферативной активности эндотелиальных клеток капилляров. В лейкоцитарных инфильтратах очагов ЭБ и ЭКЯ подсчитывалось количество нейтрофилов, эозинофилов, плазматических, тучных клеток, лимфоцитов и макрофагов.

Перед проведением иммунологического исследования все больные II - III степени распространения НГЭ (100 женщин) в зависимости от степени пролиферативной активности эктопического эндометрия гетеротопий были разделены на две группы: I группа - 30 больных с высокой пролиферативной активностью клеток эндометриоидных гетеротопий и II группа - 70 больных с низкой пролиферативной активностью клеток эктопического эпителия. Контрольную группу составили 30 женщин репродуктивного возраста, без признаков НГЭ и сопутствующей гинекологической патологии, с двухфазным менструальным циклом, поступивших для выполнения хирургической стерилизации.

Объем иммунологического исследования включал: изучение относительного и абсолютного количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ПК и ПЖ (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25 - лимфоциты) методом проточной цитометрии на проточном цитометре Bio Rad («Brute-HS», США), с использованием антител, конъюгированных с флуоресциинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE) («Caltag Laboratories», США). Изучение продукции ИЛ1, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8, ФНО, ИФН изолированными МНК ПК и ПЖ, тканью эндометриоидных гетеротопий in vitro, а также определение уровня этих цитокинов в нативной ПЖ осуществлялось методом твердофазового иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетном фотометре «Labsystems iEMS Reader MF» (Финляндия) с использованием наборов «ВекторБест» и «Протеиновый контур» (Россия) согласно прилагаемым к наборам методикам.

Перед использованием селективной иммунотерапии НГЭ в клинике, с целью оценки ее эффективности и безопасности, а также для уточнения возможного механизма действия, предлагаемая схема с применением рекомбинантного крысиного интерферона-б2 и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина) была апробирована в эксперименте in vivo на 40 крысах линии Vistar с моделированным экспериментальным эндометриозом (ЭЭ). В качестве контрольной группы использовались 20 животных с ЭЭ, не получавших специфического лечения.

Модель ЭЭ была воспроизведена путем аутотрансплантации фрагментов левого маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки. Через 10 дней после трансплантации маточного рога все животные были разделены на 3 группы: I группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился генно-инженерный аналог ИЛ2 «Ронколейкин» («Биотех», Россия), в дозировке 8 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; II группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость вводился рекомбинантный крысиный 2-интерферон («Sigma-Aldrich», США), в дозировке 15 000 ЕД на 1 кг, трехкратно, с интервалом через 1 день; III группе (20 животных) в асептических условиях в брюшную полость по обозначенной схеме вводился стерильный физиологический раствор.

Оценка эффективности проводимой терапии ЭЭ осуществлялась через 40 дней от начала эксперимента на основании сравнения следующих морфологических критериев: наличие эндометриоидных желез в трансплантате, объем трансплантата, площадь эндометриоидных желез, пролиферативная активность клеток эндометриоидного эпителия.

Кроме этого, с цель уточнения возможного механизма действия селективной иммунотерапии на очаги ЭЭ оценивались: клеточный состав ПЖ, степень васкуляризации очагов ЭЭ, интенсивность и состав лейкоцитарной инфильтрации очагов ЭЭ.

После апробации селективной иммунотерапии в эксперименте была проведена оценка эффективности интерферона-б2b (Реаферона-ЕС, «Вектор-Медика», Россия) и генноинженерного аналога ИЛ2 (Ронколейкина, «Биотех», Россия) у 80 больных НГЭ, составивших основную группу. В качестве группы сравнения использовались 40 больных НГЭ, получавших в послеоперационном периоде агонист ГнРГ (Бусерелин-депо, ЗАО «Фарм-Синтез», Россия).

Все больные основной и контрольной группы были сопоставимы по возрасту, анамнезу, предъявляемым жалобам, данным иммунологического исследования ПК, объему хирургического вмешательства и равноценности общего медикаментозного комплекса. У всех больных диагноз НГЭ был подтвержден гистологически. Обязательным условием включения больных в эксперимент было предварительное удаление очагов эндометриоза во время выполнения лечебно-диагностической лапароскопии, а также отсутствие у них аутоиммунных заболеваний и аллергических реакций.

После удаления очагов НГЭ все больные были разделены на две основные и контрольную группу: I группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Ронколейкин в количестве 500 000 ЕД. В дальнейшим этим больным Ронколейкин вводился на 2-е, 4-е, 8-е, 12-е, 16-е, 20-е, 24-е, 28-е сутки после операции внутривенно, капельно в количестве 500 000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Ронколейкином составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 4 500 000 ЕД. II группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ в брюшную полость вводился Реаферон-ЕС в количестве 1 000 000 ЕД. В дальнейшим этим больным Реаферон-ЕС вводился на 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 13-е, 16-е, 19-е, 22-е, 25-е, 28-е сутки после операции внутримышечно, в количестве 1 000 000 ЕД на одно введение. Таким образом, курс лечения Реафероном-ЕС составлял 1 месяц, а суммарная доза препарата 11 000 000 ЕД. III контрольной группе (40 больных) после хирургического удаления очагов НГЭ получали «Бусерелин-Депо», каждые 28 дней по 3,75 мг внутримышечно в течение 6 месяцев.

Оценка эффективности терапии НГЭ проводилась по следующим критериям: иммунокорригирующий эффект (иммунограммы ПК через 1 и 6 месяцев после операции); особенности течения послеоперационного периода; наличие осложнений, связанных с применением иммунокорригирующий и гормональной терапии (в течение 1 и 6 месяцев соответственно); клинический эффект в отношении болевого синдрома, нарушений менструального цикла, психоэмоциональной сферы и уровня СА125 в периферической крови на протяжении 12 месяцев наблюдения после завершения противорецидивной терапии НГЭ; частота наступления беременностей у пациенток с бесплодием в течение 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии; наличие рецидива НГЭ по данным контрольной лапароскопии, выполняемой в случае отсутствия беременности через 12 месяцев после завершения иммунокорригирующей и гормональной терапии.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программ «Primer Biostatistic 4.03. for Windows» и «Microsoft Excel 97 for Windows». Для всех изучаемых показателей определялось среднее значение и ошибка среднего; сравнение качественных параметров в исследуемых группах проводилось с помощью непараметрических методов ², ² с поправкой Йетса; сравнение количественных показателей - с помощью критерия Манна-Утни и Стьюдента, сравнение показателей до и после лечения проводилось с помощью критерия Вилкоксона. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Клиническая и эндоскопическая характеристика больных наружным генитальным эндометриозом

В ходе проведения лапароскопического вмешательства было установлено, что наиболее часто эндометриоидные гетеротопии локализовались на брюшине маточно-прямокишечного углубления (68,9%), крестцово-маточных связках (59,3%) и яичниках (71,7%). Сочетание различных локализаций эндометриоидных очагов при НГЭ наблюдалось в 86,7% случаев, у 7 пациенток был диагностирован эндометриоз толстого кишечника. В 64,8% случаях ЭБ сочетался с ЭКЯ, у 312 (37,4%) больных был выявлен выраженный спаечный процесс в малом тазу.

Макроскопически эндометриоидные гетеротопии выглядели в виде петехий, пузырьков, папул и пятен. Размеры поверхностных гетеротопий варьировали от 1 до 5 мм в диаметре. Для инфильтративных форм были характерны более обширные поражения и инвазивный рост в подбрюшинную клетчатку.

Несмотря на большое разнообразие визуальных проявлений НГЭ, в зависимости от цвета очаги ЭБ и яичников можно было условно разделить на «белые», «красные» и «черные», а также их различные сочетания. Среди монохромных очагов ЭБ наиболее часто встречались «черные» (30,5%), на втором месте по частоте распространения были «красные» (10,9%) очаги, и наиболее редко встречались гетеротопии «белого» (1,6%) цвета. Среди комбинаций очагов эндометриоза разного цвета наиболее часто встречалось сочетание «красных» и «черных» (26,8%) и «черных» и «белых» (20,6%) гетеротопий. Комбинации «красных», «черных» и «белых» (8,26%), а также «красных» и «белых» очагов (1,3%) встречались достаточно редко.

При определении проходимости маточных труб у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, было установлено, что отсутствие проходимости обеих маточных труб наблюдалось только в 23,3% случаев. В 26,8% случаев была непроходима только одна маточная труба, а в 49,8% обе маточные трубы были проходимы.

На основании количества, локализации, глубины инвазии эндометриоидных гетеротопий, а также с учетом степени выраженности спаечного процесса и проходимости маточных труб у 492 больных НГЭ (58,9%) была выявлена I - II степень распространения заболевания, а у 343 (41,1%) диагностирован НГЭ III - IV степени.

При изучении влияния макроскопических особенностей очагов эндометриоза брюшины на клинические проявления НГЭ установлено, что в случае наличия «красных» эндометриоидных гетеротопий частота выявления болевого синдрома в виде дисменореи, тазовой боли, не связанной с менструацией, боли в крестце и диспареунии, была достоверно выше (94,4%), чем у больных с «черными» и «белыми» очагами (77,3%, р<0,001). При наличии «красных» гетеротопий достоверно возрастала и интенсивность болевого синдрома. Боль как «интенсивную» расценивали 42,4% пациенток с «красными» очагами НГЭ в отличие от 22,7% больных с «черными» и «белыми» гетеротопиями (р<0,001). Кроме увеличения интенсивности болевого синдрома, у больных с «красными» очагами НГЭ частота бесплодия была достоверно выше (37,9%), чем у больных с «белыми» и «черными» очагами (31,1%, p<0,05).

Таким образом, на тяжесть клинических проявлений НГЭ оказывает влияние не только степень распространения заболевания, но и макроскопические особенности эндометриоидных гетеротопий. В пользу этого предположения указывает и тот факт, что наличие «красных» очагов эндометриоза и их сочетаний с гетеротопиями другого цвета достоверно чаще наблюдалось при распространенных формах НГЭ (54,8%), чем при I - II степени заболевания (42,1%, р<0,001).

Согласно полученным данным, в группе пациенток с «красными» очагами эндометриоза уровень СА125 выше 35 МЕ/мл определялся в 55,7% случаев, а в группе больных с «черными» и «белыми» гетеротопиями в 46,8% (р<0,05).С учетом того, что СА125 - маркер пролиферации эпителиальных клеток, полученные данные являются дополнительным подтверждением высокой активности НГЭ именно при наличии «красных» очагов.

Морфологическая характеристика очагов эндометриоза брюшины и эндометриоидных кист яичников

В процессе морфометрического анализа показателей пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия установлено, что при ЖКВ эндометриоза яичников эпителиальные клетки имеют достоверно большую высоту (14,05±1,20 мкм) и площадь ядер (15,43±1,34 мкм²), чем при КВ (9,12±1,25 мкм и 8,28±1,14 мкм², p<0,05). Эпителиальные клетки «красных» и «черных» очагов ЭБ имели одинаковую высоту (14,43±1,19 мкм и 13,43±1,08 мкм) и площадь ядер (15,81±1,22 мкм² и 14,75±1,34 мкм²), которая достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников и была достоверно выше, чем у эпителия «белых» очагов ЭБ (9,48±1,21 мкм и 10,14±1,87 мкм²) и КВ эндометриоза яичников (9,121,25 мкм и 8,28±1,14 мкм²).

При определении показателей активности ОЯОР было установлено достоверное увеличение их количества, средней и суммарной площади в ядрах эпителиальных клеток ЖКВ эндометриоза яичников (2,87±0,13, 1,29±0,06 мкм², 3,70±0,17 мкм²) по сравнению с КВ (1,60±0,11, 1,09±0,03 мкм², 1,74±0,11 мкм²). Средняя площадь одного ОЯОР и суммарная площадь ОЯОР в ядрах клеток эпителия «красных» очагов ЭБ (1,32±0,06 и 3,85±0,18 мкм²), не отличаясь от клеток ЖКВ эндометриоза яичников, была достоверно выше, чем в «черных» (1,18±0,04 и 3,32±0,15 мкм²) и «белых» очагах ЭБ (1,12±0,03 и 2,35±0,12 мкм²).

При анализе площади сосудистого русла в строме ЭКЯ установлено ее достоверное снижение при КВ (7,16±1,02%) по сравнению с ЖКВ (13,40±0,80%). Площадь микроциркуляторного русла в «красных» очагах ЭБ (13,78±1,08%) достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников и была достоверно выше, чем в «черных» (10,97±0,68%), «белых» очагах ЭБ (8,05±0,74%) и КВ эндометриоза яичников. При определении средней площади просвета капилляров в строме ЭКЯ установлено его уменьшение при КВ (72,06±5,70 мкм²) по сравнению с ЖКВ (118,90±8,38 мкм²). Средняя площадь просвета капилляра в «красных» гетеротопиях (120,10±6,75 мкм²) достоверно не отличалась от ЖКВ эндометриоза яичников, превышая таковую в «черных» (98,12±6,60 мкм²), «белых» (75,12±7,25 мкм²) очагах ЭБ и КВ эндометриоза яичников.

При морфометрическом определении пролиферативной активности клеток эндотелия капилляров установлено достоверное увеличение площади их ядер в ЖКВ эндометриоза яичников (11,80±0,80 мкм²), «красных» (11,94±0,76 мкм²) и «черных» (10,63±0,43 мкм²) очагах по сравнению с КВ эндометриоза яичников (8,95±0,51 мкм², p<0,01) и «белыми» очагами ЭБ (8,78±0,74 мкм², p<0,01). Средняя и суммарная площадь ОЯОР в ядрах эндотелия ЖКВ эндометриоза яичников (0,81±0,06 и 1,68±0,15 мкм²) и «красных» очагах ЭБ (0,84±0,08 и 1,72±0,17 мкм²) была достоверно выше, чем в «черных» (0,64±0,06 и 1,25±0,12 мкм²), «белых» (0,56±0,06 и 1,07±0,09 мкм²) очагах и КВ эндометриоза яичников (0,52±0,05 и 0,96±0,08 мкм²).

При изучении интенсивности лейкоцитарной инфильтрации эндометриоидных очагов установлено, что количество лейкоцитов в строме ЭКЯ и очагов ЭБ достоверно не зависело от их варианта. При анализе популяционного состава лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий установлено, что в строме ЖКВ эндометриоза яичников и «красных» очагах ЭБ достоверно больше макрофагов (6,46±0,36 и 7,12±0,42%) и меньше лимфоцитов (89,90±0,55 и 80,57±0,64%), чем в строме КВ эндометриоза яичников (3,51±0,57 и 88,98±1,15%), «черных» (5,22±0,28 и 85,14±0,98%) и «белых» очагах ЭБ (2,95±0,31 и 90,63±0,66%).

Таким образом, наибольшей высотой клеток, площадью ядер, количеством, средней и суммарной площадью ОЯОР на одно ядро клетки, а следовательно, и пролиферативной активностью, обладают клетки эпителия «красных» очагов ЭБ и ЖКВ эндометриоза яичников, а наименьшими морфологическими показателями пролиферативной активности обладают клетки КВ эндометриоза яичников и «белых» очагов ЭБ. Наибольшая степень васкуляризации характерна для «красных» очагов ЭБ и ЖКВ эндометриоза яичников. В несколько меньшей степени васкуляризированы «черные» очаги ЭБ, и наименьшие показатели васкуляризации характерны для «белых» очагов ЭБ и КВ эндометриоза яичников. В составе лейкоцитарных инфильтратов очагов эндометриоза с высокой пролиферативной активностью эпителия достоверно возрастает количество макрофагов и снижается количество лимфоцитов. Анализируя полученные морфологические данные, можно утверждать, что увеличение степени васкуляризации и количества макрофагов в строме эндометриоидных очагов сопровождается увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Особенности иммунного статуса и обмена цитокинов у больных наружным генитальным эндометриозом

Согласно полученным данным, в ПК больных НГЭ, по сравнению со здоровыми женщинами, достоверно снижается относительное количество CD3, CD4, CD8, СD16 и CD25-лимфоцитов, а количество моноцитов достоверно возрастает. При этом изменение количества всех перечисленных субпопуляций МНК ПК достоверно более выражено у пациенток с высокой пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия (табл. 1).

Таблица 1. Субпопуляционный состав МНК ПК больных НГЭ, (Mm)

Таблица 2. Уровень продукции цитокинов in vitro МНК ПК больных НГЭ, (Mm)

При изучении особенностей продукции цитокинов МНК ПК было установлено, что они продуцируют достоверно большее количество ИЛ1 и ФНОб. Продукция ИЛ6 и ИЛ8 МНК ПК больных НГЭ достоверно выше, чем у здоровых женщин, при этом она возрастает с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Уровень секреции ИЛ4 и ИЛ2 МНК ПК больных НГЭ не отличается от показателей нормы, а продукция ИФН достоверно снижается (табл. 2).

Таблица 3. Субпопуляционный состав МНК ПЖ больных НГЭ, (Mm)

При изучении ПЖ у больных НГЭ было установлено увеличение ее «клеточности» за счет макрофагов, прогрессирующее с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Количество CD3, CD4, CD16 и CD25-лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ достоверно снижается. При этом если количество CD3 и CD4 лимфоцитов в ПЖ больных НГЭ не зависит от пролиферативной активности эндометриоидных клеток гетеротопий, то количество CD16 и CD25-лимфоцитов достоверно снижается с ее увеличением. Необходимо отметить, что в отличие от ПК в ПЖ больных НГЭ изменение относительного количества иммунокомпетентных клеток сопровождается изменением их абсолютного содержания (табл. 3).

Таблица 4. Уровень продукции цитокинов in vitro МНК ПЖ больных НГЭ, (Mm)

Согласно полученным данным, МНК ПЖ больных НГЭ in vitro продуцируют большее количество ИЛ1в, ФНОб, ИЛ6 и ИЛ8 и меньшее количество ИЛ2 и ИФНг, чем МНК ПЖ здоровых женщин. При этом, если степень снижения продукции ИЛ2 не зависит от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, то увеличение продукции ИЛ1в, ФНОб, ИЛ6, ИЛ8 и снижение ИФНг прогрессирует с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия (табл. 4).

При изучении уровня цитокинов в нативной ПЖ больных НГЭ и в ткани эндометриоидных гетеротопий было установлено достоверное увеличение уровня ИЛ1в, ФНОб, ИЛ4, ИЛ6, ИЛ8 и снижение ИЛ2 и ИФНг, прогрессирующее с увеличением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

Таким образом, в ПК и ПЖ больных НГЭ отмечается активация макрофагального звена иммунитета, на что указывает увеличение количества макрофагов, а также уровня продукции МНК ПК и ПЖ ИЛ1, ФНО, ИЛ6 и ИЛ8 при одновременном снижении активности Т-клеточного звена иммунитета и ЕК, подтверждением чего является уменьшение относительного количества CD3, CD4, CD8, CD16 и CD25-лимфоцитов, а также уровня продукции ИФН и ИЛ2. Согласно полученным данным, в ПЖ больных НГЭ отмечается более выраженное угнетение активности Т-клеточного звена иммунитета и ЕК, на что указывает снижение не только относительного, но и абсолютного количества основных субпопуляций лимфоцитов.

Необходимо отметить, что при НГЭ не только МНК ПЖ продуцируют высокое количество ИЛ1в, ФНОб, ИЛ6, ИЛ8 и низкое количество ИЛ2 и ИФНг, но и сама ткань эндометриоидных гетеротопий характеризуется аналогичным цитокинообразованием. Изменение в продукции цитокинов МНК ПЖ и тканью эндометриоидных гетеротопий закономерно сопровождается увеличением уровня провоспалительных цитокинов, обладающих проангиогенных действием (ИЛ1, ФНО, ИЛ6 и ИЛ8), и снижением уровня противоопухолевых цитокинов (ИЛ2 и ИФН) в нативной ПЖ. Подобные изменения в цитокиновом составе ПЖ, наряду с уменьшением количества иммунокомпетентных клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксичностью, определяют увеличение ее проангиогенной и снижение противоопухолевой активности, что может являться одной из причин прогрессирования НГЭ.

Оценка эффективности селективной иммунотерапии экспериментального эндометриоза у крыс

Учитывая обнаруженное снижение активности Т-клеточного и ЕК звена противоопухолевого иммунитета, а также дефицит в продукции ИФН и ИЛ2 у больных НГЭ, патогенетически обоснованным подходом в селективной иммунотерапии этого заболевания представляется использование интерферонотерапии или применение экзогенного ИЛ2 человека, в частности, в форме отечественных препаратов Реаферона-ЕС и Ронколейкина. Кроме этого, принимая во внимание преимущественно локальный характер иммунных нарушений при НГЭ, целесообразно проведение селективной иммунотерапии на местном уровне.

Для подтверждения этого заключения на доклиническом этапе, в эксперименте in vivo, нами оценивалась эффективность, безопасность и возможный механизм действия местного применения Ронколейкина и крысиного б2-интерферона в качестве селективной иммунотерапии экспериментального эндометриоза (ЭЭ) у крыс.

Согласно полученным данным, при аутотрансплантации фрагмента маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки ЭЭ развивается в месте трансплантации в 100% случаев. При этом макроскопически очаги ЭЭ на поверхности париетальной брюшины выглядят как участки красного (8 из 20 случаев) или черного (12 из 20 случаев) цвета с кистами, заполненными прозрачным или геморрагическим содержимым.

При визуальном сравнении участков трансплантатов у крыс, получавших селективную иммунотерапию, красные участки встречались в 4 случаях из 40, в 14 случаях выявлялись белые очаги, которых не было у животных контрольной группы.

При обзорной микроскопии на фоне лечения 2-интерфероном у 10 крыс (50,0%), а на фоне лечения Ронколейкином у 12 (60,0%) в области места трансплантации маточного рога эктопический эндометрий отсутствовал, что позволило нам сделать вывод о полном регрессе эндометриоидных гетеротопий у этих животных.

Основными гистологическими вариантами регресса очагов ЭЭ были полное его замещение соединительной тканью (9 крыс, получавших Ронколейкин, и 5 - 2-интерферон) или мультикистозная дегенерация (3 крысы, получавшие Ронколейкин, и 2 - 2-интерферон). Некроз очага ЭЭ не развился ни у одной крысы, получавшей Ронколейкин, зато наблюдался у 2 животных, получавших 2-интерферон.

В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади, степень выраженности которой не зависит от используемого препарата. Так, средняя площадь эндометриоидных желез у животных, не получавших лечение, составляла 11,291,94% от площади трансплантата, на фоне применения Ронколейкина она уменьшалась до 6,011,06%, а на фоне приема 2-интерферона - до 5,961,47% (р<0,001).

Высота эпителия очагов ЭЭ животных, не получавших лечение, составляла 14,100,74 мкм, площадь ядер - 19,970,76 мкм², количество ОЯОР в ядре - 2,630,16, средняя площадь одного ОЯОР - 1,610,09 мкм², суммарная площадь ОЯОР в ядре - 3,170,32 мкм². На фоне применения цитокинотерапии все эти показатели пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, в случае его наличия, достоверно уменьшаются, и степень этого уменьшения также не зависит от используемого препарата. Так, после применения Ронколейкина высота эктопического эпителия уменьшается до 8,680,58 мкм, площадь ядер - до 15,581,44 мкм², количество ОЯОР в ядре - до 2,050,07, средняя площадь одного ОЯОР до -1,060,04 мкм², суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 2,110,10 мкм² (р<0,05). На фоне введения 2-интерферона высота эктопического эпителия уменьшается до 10,900,86 мкм, площадь ядер - до 15,000,97 мкм², количество ОЯОР в ядре - до 2,100,12, средняя площадь одного ОЯОР - до 1,360,08 мкм², суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 2,420,08 мкм² (р<0,05).

При анализе степени васкуляризации очагов ЭЭ было выявлено достоверное снижение всех ее параметров у животных, получавших селективную иммунотерапию. В участках трансплантатов маточного рога крыс, не получавших лечение, процент площади просвета сосудов от площади трансплантата составлял 10,790,70%, средняя площадь просвета капилляра составляла 107,979,73 мкм², площадь ядер эндотелиальных клеток - 10,330,64 мкм², средняя площадь одного ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток была 0,740,09 мкм², а суммарная площадь ОЯОР в ядре - 1,350,08 мкм². После применения Ронколейкина процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,110,95%, средняя площадь просвета капилляра - до 77,306,00 мкм², площадь ядер эндотелиальных клеток - до 8,690,36 мкм², средняя площадь одного ОЯОР - до 0,530,05 мкм², суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 0,860,11 мкм² (р<0,05). На фоне введения 2-интерферона процент площади сосудов от площади трансплантата уменьшался до 8,001,00%, средняя площадь просвета капилляра - до 63,385,53 мкм², площадь ядер эндотелиальных клеток - до 7,910,41 мкм², средняя площадь одного ОЯОР - до 0,540,04 мкм², суммарная площадь ОЯОР в ядре - до 0,830,05 мкм² (р<0,05).

Согласно полученным данным, на фоне проводимой иммунотерапии в участках трансплантации маточного рога возрастает интенсивность лейкоцитарной инфильтрации за счет лимфоцитов, а количество макрофагов в составе лейкоцитарных инфильтратов достоверно снижается. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов, инфильтрирующих область трансплантата, приходится 91,690,95% клеток, а на долю макрофагов - 2,000,25%. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов увеличивается до 95,800,85%, а макрофагов снижается до 0,830,17% (р<0,05). На фоне введения 2-интерферона процент лимфоцитов увеличивается до 93,990,57%, а макрофагов снижается до 1,290,14% (р<0,05).

На фоне проводимого лечения изменяется не только состав лейкоцитарных инфильтратов участков трансплантации маточного рога, но и состав ПЖ экспериментальных животных. Так, у животных, не получавших лечение, на долю лимфоцитов в ПЖ приходилось 45,740,69% клеток, а на долю макрофагов - 33,611,16%. После применения Ронколейкина процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 57,980,96%, а макрофагов снизился до 25,370,88% (р<0,05). На фоне введения 2-интерферона процент лимфоцитов в ПЖ увеличился до 55,881,08%, а макрофагов снизился до 28,620,84% (р<0,05).

Таким образом, на фоне внутрибрюшного введения 2-интерферона полный регресс очагов ЭЭ у крыс происходит в 50% случаях, а на фоне введения Ронколейкина - в 60%. В случае сохранения эндометриоидных желез на фоне проводимой иммунотерапии происходит достоверное уменьшение их площади и снижение пролиферативной активности клеток эндометриоидного эпителия.

Выявленные изменения в составе лейкоцитарных инфильтратов очагов ЭЭ и ПЖ животных, получавших иммунотерапию, позволяют предположить, что возможным механизмом действия 2-интерферона и Ронколейкина, ведущим к регрессу ЭЭ, может являться увеличение противоопухолевой активности лимфоцитов и уменьшение проангиогенной активности макрофагов. Дополнительным подтверждением этого предположения можно считать снижение степени васкуляризации очагов ЭЭ и уменьшение активности эндотелиальных клеток на фоне проводимого лечения.

Эффективность комплексного лечения наружного генитального эндометриоза с использованием селективной иммунотерапии

Учитывая положительные результаты селективной иммунотерапии эндометриоза, полученные в эксперименте, на завершающем этапе диссертационного исследования нами была проведена апробация предлагаемого метода комплексной терапии НГЭ в клинике.

Согласно нашим данным, в группе больных, получавших Ронколейкин, интенсивность и продолжительность болевого синдрома в послеоперационном периоде была меньше, чем в группах больных, получавших Реаферон-ЕС и Бусерелин-депо. Так, если в группе, получавшей Ронколейкин, в первые сутки после операции болевой синдром, требующий медикаментозного вмешательства, наблюдался у 17 больных, то в группах, получавших Реаферон-ЕС и не получавших иммунотерапию, - у всех пациенток.

Для больных, получавших Ронколейкин и Реаферон-ЕС, в послеоперационном периоде характерно наличие температурной реакции, которая была более выраженной как по продолжительности (в контрольной группе 1-2 дня, в основной - 2-4 дня), так и по интенсивности (в контрольной группе максимальное повышение температуры до 37⁰,5 С, в основной, получавшей Ронколейкин, - до 38⁰,1 С, Реаферон-ЕС - до 38⁰,6 С). Подобная температурная реакция являлась побочным эффектом цитокинотерапии и существенно не влияла на общее самочувствие больных.

В течение месяца селективной иммунотерапии Ронколейкином и Реафероном-ЕС у части больных наблюдались «цитокиновые реакции» в виде гипертермии, озноба и боли в месте инъекции, все они носили кратковременный характер, как правило, не требовали медикаментозной коррекции, не оказывали существенного влияния на общее состояние больных и прекращались сразу после завершения лечения.

В отличие от «цитокиновых реакций» клинические проявления, характерные для гипоэстрогении, развивающейся в течение 6 месяцев на фоне приема Бусерелина-депо (аменорея, чувство приливов жара, снижение либидо, эмоциональная лабильность, сухость влагалища, боли в спине при физической нагрузке), негативно сказывались на общем состояние больных.

До начала лечения показатели иммунной системы ПК между группами достоверно не отличались и полностью соответствовали ранее выявленной иммунной дисфункции. В ПК больных НГЭ всех групп было выявлено увеличение количества моноцитов, снижение относительного количества CD3, CD4, CD8, CD16 и CD25-лимфоцитов, увеличение продукции МНК ПК in vitro ФНО, ИЛ1, ИЛ6 и ИЛ8 и снижение продукции ИФН.

Через 1 месяц после операции у больных, получавших Бусерелин-депо, не наблюдалось существенных изменений в клеточном составе и цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток ПК. У женщин, получавших вовремя и после лапароскопии селективную иммунотерапию, сразу после завершения курса лечения относительное количество CD3, CD4, CD8-лимфоцитов ПК не отличалось от нормальных значений, а относительное количество CD16 и CD25-лимфоцитов достоверно возрастало. При этом увеличение относительного количества CD16-лимфоцитов было более выраженным в группе, получавшей Реаферон-ЕС, а CD25-лимфоцитов - в группе, получавшей Ронколейкин.