Структурная реорганизация слуховой коры при височной эпилепсии

Подобные изменения сосудистого русла головного и спинного мозга человека описаны при гипертонической болезни (Мотавкин и др., 1994; Мчедлишвили, 1968; Карлов, 1990; Ганнушкина, 1973) и в условиях коллатерального и редуцированного кровообращения (Ганнушкина, 1973). Авторы отмечают гиалиноз стенок мелких артерий и вен головного и спинного мозга, экстрасосудистые и интрамуральные плазморрагии, периваскулярный отек, стаз в венах и капиллярах.

Сходство в патоморфологии при поражении сосудистого русла в эпилептогенном очаге и при артериальной гипертензии обусловлено, вероятно, общими механизмами, ведущими к срыву компенсации регуляции мозгового кровообращения (Мчедлишвили, 1968; Janigro, 1999; Spenser, 2007). Известна роль магистральных и пиальных артерий в нормальных условиях и при сосудистой патологии (Мчедлишвили, 1968, 1973; Ганнушкина, 1973; Stannless et al., 1997). В опытах на кошках с внутрикаротидным введением стрихнина показано, что на фоне судорожной активности и усиленного притока крови в мозг наблюдается сужение магистральных сосудов и расширение пиальных артерий, что наблюдается как при эпилепсии, так и при артериальной гипертензии (Janigro, 1999; Cornford et al., 1998).

В отличие от пиальных артерий характерными особенностями мелких артерий коры мозга является сужение их просвета при экстремальных условиях (Ингвар, Мчедлишвили, 1966). На наших препаратах постоянно отмечается сужение и деформация радиальных артерий и артериол неокортекса, просвет некоторых из них полностью закрыт, в части сосудов отмечаются явления стаза, который дополнительно создает повышенное сопротивление в микрососудах. Если уменьшение просвета не очень значительное, то вследствие небольшой протяженности этих артерий (по сравнению с пиальными) это может заметно не увеличивать сосудистое сопротивление. Однако в некоторых случаях сужение внутримозговых сосудов -- особенно мелких артерий -- бывает настолько значительным, что не может не создавать препятствия для перемещения эритроцитов, и вызывает резкое ослабление кровоснабжения ткани мозга. Сужение просвета прекапиллярных артериол и капилляров на 50% и больше ведет к тому, что в нем уже не могут проходить даже деформированные эритроциты (Meyer, Waltz, 1959). Данное обстоятельство обусловливает значительное повышение сопротивления для тока крови в очаге эпилептиформной активности и дефицит его кровоснабжения.

Несмотря на то, что по данным ЭЭГ и МРТ пациенты, мозг которых мы изучали, имели эпилептический очаг в одной гемисфере, наши исследования показали практически симметричное поражение сосудов слуховой коры обоих полушарий. Важно отметить, что височная доля является классическим примером зоны обширного смежного кровоснабжения (Шмидт, 1975). Данные литературы свидетельствуют о наличии немногочисленных, но достаточно крупных артерио-артериальных анастомозов в височной доле человека (Ганнушкина, 1973). Структуры височной доли получают питание как из системы внутренней сонной артерии (средняя мозговая артерия), так и системы позвоночных артерий (задняя мозговая артерия). Согласно концепции И.В. Ганнушкиной (1973) о коллатеральном и редуцированном коллатеральном кровообращении, локальный кровоток изменяется не только в зоне поврежденной артерии, но также затрагивает все ее анастомозы и артерии зон смежного кровоснабжения. Вероятно, это в известной степени объясняет факт возникновения вторичных повреждений внутримозговых сосудов и мозговой ткани в контралатеральном полушарии в условиях гемодинамических нарушений при судорожной активности.

Наиболее вероятной причиной возникновения недостаточности кровоснабжения неокортекса в очаге судорожной активности является резкое сужение просвета мельчайших внутримозговых сосудов, которое обусловлено вполне отчетливыми микроскопическими изменениями сосудистых стенок. Наши исследования показали, что при парциальной эпилепсии у человека в значительной степени страдает микроциркуляторное русло. Капилляры мозга имеют извитой ход с колбообразными расширениями, в которых задерживаются форменные элементы крови. При импрегнации этих сосудов обнаруживается утолщение их стенок, развитие аргирофильных волокон, запустевание просветов, капиллярофиброз. Местами импрегнация открывает пакеты, состоящие из множества причудливо переплетенных капилляров с фиброзно утолщенными стенками.

При электронной микроскопии нами установлено, что просвет микрососудов деформирован, образует складки, наблюдается вакуолизация и расслоение сосудистой стенки, очаги периваскулярной деструкции нервной ткани. Отмечается увеличение микровыростов и открытых межклеточных контактов, утолщение базальной мембраны и потеря ею фибриллярной структуры. Ядра эндотелиальных клеток деформированы, цитоплазма выглядит отечной. Базальная мембрана рыхлая, неравномерная по толщине с очагами расщепления и включениями электронноплотных частиц. Нередко базальная мембрана расслаивается и образует многокамерные пространства, в которых расположены перициты и ножки астроцитов. Периваскулярные отростки астроцитов выглядят отечными и содержат множество вакуолей.

Результаты наших исследований подтверждаются данными литературы (Гайкова, Новожилова, 1998; Новожилова, Гайкова, 1996, 1997; Гайкова, 2001; Stannless et al., 1996, 1997; Janigro, 1999). Авторами отмечено, что у кошки уже через 30 сек. после аппликации стрихнина обнаруживаются изменения в мышечных клетках, которые производят впечатление неравномерно набухших и впячиваются в сосудистый просвет. При более длительном воздействии (5-10 мин.) медия корковых артерий местами начинает расслаиваться продольно, а в дальнейшем описанные изменения стенок нарастают, причем стенка как бы гомогенизируется и утолщается, неравномерно суживая просвет (Мчедлишвили и др., 1973; Зенков, 2002).

Известно, что показатель интенсивности транскапиллярного обмена коррелирует с активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) (Черток, 1985). В микроциркуляторном русле головного мозга человека с височной эпилепсией при реакции на ЩФ мы обнаружили достоверное снижение длины капилляров и площади обменной поверхности (на 6,8% и на 4,6% соответственно) (таблица 1, 2). Диаметр микрососудов напротив незначительно увеличивается: на 2,24% (таблица 1). Данные, отражающие динамику гистофизиологии капилляров мозга человека, показывают, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий объема крови в капиллярном русле и количества крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра в контроле и в эпилептическом мозге (таблица 3) интенсивность транскапиллярного обмена в последнем случае значительно падает (таблица 4). Возрастает количество «функционально интактных» капилляров, которые при реакции на ЩФ на препаратах не визуализируются. Достоверно снижается количество капилляров с высоким и средним уровнем активности фермента на 37,4% и 23,7% соответственно. Количество капилляров с низким уровнем ЩФ напротив возрастает на 37,9%.

Таблица 1. Длина и диаметр капилляров в 1 мм² нервной ткани (*P<0,05)

Таблица 2. Площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм² нервной ткани (*P<0,05)

Таблица 3. Количество и объем крови в единице поверхности в 1 мм² нервной ткани (*P<0,05)

Таблица 4. Активность щелочной фосфатазы в 1 мм² нервной ткани (P<0,05)

Исследование ранних изменений сосудистого русла при экспериментальном эпилептогенезе выявило полнокровие внутримозговых сосудов и подоболочечные мелкоточечные кровоизлияния более чем в 71,4 % случаев. Значительных морфологических изменений в сосудистой стенке слуховой коры эпилептизированных крыс нами не отмечено, однако атонию артериол и диапедезные кровозлияния мы наблюдали довольно часто. Отмечается некоторая извитость сосудистой сети головного мозга крысы и начальные явления фиброза. Ранняя стадия экспериментального эпилептогенеза у крысы характеризуется увеличением всех морфометрических показателей микроциркуляторного русла височной доли, что вероятно направлено на восполнение энергетических затрат при эпилептическом статусе и более эффективное снабжение мозга кислородом (таблица 5, 6, 7). Однако при подсчете микрососудов с различной степенью активности ЩФ мы обнаружили такую же динамику, как и в слуховой коре головного мозга человека с длительно текущей височной эпилепсией (таблица 8). Количество капилляров с высоким уровнем активности ЩФ снижается на 16,44%. Капилляры с умеренной активностью ЩФ выявляются реже на 17,4%. Количество капилляров с низким уровнем активности ЩФ, напротив, значительно возрастает: на 31,79%. Максимальная активность ЩФ в капиллярном русле височной коры крысы при каинатном киндлинге зафиксирована нами на 7-е сутки эксперимента, однако средние значения активности фермента в связи с увеличением функционально неактивных капилляров никогда не достигали контрольных величин.

Таблица 5. Длина и диаметр капилляров (в 1 мм² нервной ткани (P<0,05))

Таблица 6. Площадь обменной поверхности капилляров (в 1 мм² нервной ткани (P<0,05))

Таблица 7. Количество и объем крови в единице поверхности (в 1 мм² нервной ткани (P<0,05))

Таблица 8. Активность щелочной фосфатазы (в 1 мм² нервной ткани (* достоверно по сравнению с контролем, P<0,05))

Литературные данные указывают на наличие в очаге судорожной активности не только относительного, но и абсолютного дефицита кровоснабжения. Было показано, что после местной аппликации стрихнина на кору головного мозга кошек кровоток в ней усиливался в среднем на 45 %, а затем начинал ослабевать, хотя судорожные разряды, как правило, сохранялись значительно дольше. Сопоставление интенсивности кровообращения с количеством судорожных разрядов в коре показало, что первое ослаблялось в среднем в четыре раза быстрее, чем судорожная активность. Обычно последняя обнаруживалась в коре в течение многих минут после того, как усиление кровотока не только исчезало, но он становился значительно меньше исходного (Spenser, 2007; McNamara, 1994).

Таким образом, нами установлено, что при височной эпилепсии происходит реорганизация всех структурных элементов сосудистой сети слуховой коры человека и крысы. Длительно текущая эпилепсия способствует грубым морфологическим перестройкам артерий, вен и капилляров. В наибольшей степени страдает функция микроциркуляции, что выражается в снижении практически всех ее морфометрических показателей.

Ранний эпилептогенез характеризуется умеренными морфологическими изменениями. В отличие от материала мозга человека, морфометрия капиллярного русла эпилептизированных крыс показала компенсаторное увеличение объема крови в капиллярном русле. Однако даже на ранних стадиях эпилептогенеза функция микроциркуляции страдает, что отражается в снижении активности щелочной фосфатазы в капиллярах мозга и увеличение количества функционально неактивных микрососудов. Последнее обстоятельство обусловливает нарастание гипоксии ткани мозга и ишемии нейронов и способствует формированию эпилептогенных цепей.

Энергетический дисбаланс нейронов в очаге эпилептиформной активности. Потребление кислорода тканью мозга в нормальных условиях составляет 3,3-3,5 мл на 100 г/мин, причем весь имеющийся в мозге кислород расходуется за 7-10 секунд. Это позволяет считать, что основным поставщиком энергии в мозге является аэробное окисление глюкозы до СО₂ и Н₂О, а снижение внутриклеточного содержания АТФ всего на 25-30% ведет к падению интенсивности всех энергозависимых функций клетки на 75-80% от исходной величины (Danial et al., 2003). Гликолитический распад глюкозы с образованием молочной кислоты дает не более 7 % энергии (Ганнушкина, 1973; Телушкин, Ноздрачев, 1999).

Мысль о том, что интенсивность мозгового кровотока соответствует величине локального метаболизма и функциональной активности, была высказана впервые почти 120 лет назад в классической статье Роя и Шеррингтона (1890). Адекватное кровоснабжение подразумевает соответствие между интенсивностью капиллярного кровообращения и метаболической потребностью ткани, окружающей капилляры (Cornford et al., 1998; Briellmann et al., 2007). Наши исследования микроциркуляторного русла показали, что на фоне гиперфункции эпилептических нейронов в очаге эпилептиформной активности существует дефицит притока артериальной крови, что ведет к неадекватному кровоснабжению ткани мозга и отражается на энергетическом статусе нейроцитов.

Корректно исследовать энергетическую функцию нервных клеток при эпилепсии представляется возможным лишь при использовании экспериметального эпилептогенеза. Наиболее ранние изменения, которые нам удалось зафиксировать при становлении феномена гипервозбудимости на каинатной модели эпилепсии у крысы, касаются разбалансировки в работе двух систем: получения и использования энергии. Учитывая, что в наибольшей степени поражаются нейроны на уровне афферентного входа, т.е в слоях II-III слуховой коры крысы, именно здесь мы исследовали активность окиредуктаз и гидролаз, что позволило нам установить четкую корреляцию между активностью данных энзимов и синтетическими возможностями клетки.

Митохондрии являются своего рода энергетическими станциями нейронов. По оценкам разных авторов митохондрии утилизируют до 95-99% поступающего в клетку кислорода (Inoue et al., 2007). Под воздействием агрессивных агентов при синдроме гипервозбудимости функция этого компартмента страдает, что ведет к нарушению процессов окислительного фосфорилирования.

Важнейшими звеньями окислительной системы являются сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза, расположенные соответственно в начале и в конце дыхательной цепи. Данные окиредуктазы организованы в кристах митохондрий комплексными ансамблями с правильными промежутками. Важно отметить, что превращение сукцината в фумарат посредством сукцинатдегидрогеназы является единственной дегидрогеназной реакцией цикла лимонной кислоты, в ходе которой осуществляется прямой перенос водорода с субстрата на флавопротеин без участия NAD⁺ (Henshall, 2007; Мари и др., 1993). По активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы можно судить об уровне энергетических функций клетки, состоянии цикла Кребса и редокс-процессах в нейроне.

Заметные изменения активности сукцинатдегидрогеназы наблюдаются спустя трое суток от начала эксперимента (таблица 9). К этому времени отмечается уменьшение величины цитоплазматических гранул и снижение интенсивности их окраски, что особенно заметно в клетках с эктопированным ядром. В таких элементах интенсивно синие гранулы лежат кольцом вокруг прозрачного ядра. Максимальное угнетение активности энзима нами отмечены на 7-е сутки от начала каинат-индуцированного эпилептического статуса. В этот период цитоплазма нейронов выглядит в значительной степени обесцвеченной, так как содержит минимальное количество мелких гранул голубого или лилового цвета.

Таблица 9. Активность сукцинатдегидрогеназы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ед. опт. пл., Р<0,05)

Изменение активности цитохромоксидазы во многом сходны с изменениями сукцинатдегидрогеназы Таблица 10). На 3-и сутки от начала каинатного киндлинга активность цитохромоксидазы снижалась как в мелких, так и крупных нейронах. В цитоплазме уменьшалось количество гранул. В части нейронов ядро занимало краевое положение. На 5-е сутки от начала эксперимента угнетение функций фермента становится более очевидным. Цитоплазма поврежденных нейронов содержит мелкие бледно-голубые и фиолетовые гранулы диформазана.

Таблица 10. Активность цитохромоксидазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ед. опт. пл., Р<0,05)

Нами отмечено, что падение активности окислительных ферментов при феномене гипервозбудимости коррелирует с состоянием митохондрий в клетках с поврежденными профилями. Мы обнаружили, что к 5-7 суткам от начала эпилептического статуса по мере углубления процесса умирания и вакуолизации цитоплазмы количество крист в митоходриях резко уменьшается.

Сходные данные получены при ишемическом поражении неокортекса. Исследование функции митохондрий показало, что эффективность окислительного фосфорилирования при ишемии уменьшается, а уменьшение поглощения О₂ срезами ишемизированной коры можно объяснить повреждением белков-ферментов, активирующих реакции окисления и/или истощением запасов энергетического материала. (Завалишин, Захарова, 1996; Лукьянова, 2000; Раевский, 1996; Akcali et al., 2005; Cheung et al., 2007; Danial, Korsmeyer, 2004; Кометиани и др.,1969). В ответ на снижение концентрации О₂ в неокортексе происходит кратковременное усиление, а затем подавление активности НАД·Н-оксидазного пути окисления. Как следствие происходит нарушение переноса электронов на участке НАД·Н-СоQ и сопряженного с ним процесса окислительного фосфорилирования. При увеличении тяжести и/или длительности гипоксии нарушение транспорта электронов распространяется от субстратного к цитохромному участку дыхательной цепи - на область цитохромов b-c и, наконец, к цитохромоксидазе, которая в условиях аноксии практически инактивируется (Лукьянова, 2000).

Кислая и щелочная фосфатазы (КФ и ЩФ) активно участвуют в гидролитических процессах фосфорных соединений при различных физиологических и патологических состояниях. Явные изменения активности кислой и щелочной фосфатаз отмечены нами уже через сутки от начала каинатного киндлинга. В 1-3-и сутки от начала эпилептического статуса регистрируется повышение активности энзимов, а далее на всем протяжении эксперимента нами отмечено падение активности гидролаз в нейронах слоев II-III височной коры крысы (рис. 1, 2).

Рис. 1. Активность кислой фосфатазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы.

Рис. 2. Активность щелочной фосфатазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы.

Повышение активности кислой и щелочной фосфатаз на 1-3-и сутки эксперимента мы связываем с усиленным потреблением энергии для реализации пластичности нервных сетей при эпилептогенезе (восстановление утраченных связей и активный коллатеральный рост). Стоит отметить, что в отмирающих клетках активность энзимов неуклонно падает, подобная динамика отмечена нами на 5-е сутки от начала эксперимента, а на 7-е сутки количество подобных клеточных элементов практически совпадает с результатами исследования погибающих клеток в эпилептическом очаге рутинными гистологичесими и иммуноцитохимическими методами.

Наши исследования показали, что альтерация нейронов в очаге эпилептиформной активности сочетается с изменением активности окислительных ферментов, кислой и щелочной фосфатаз. Гиперфункция нейроцитов эпилептического очага, направленная на восстановление утраченных связей и реактивный коллатеральный рост ведет к неспецифическим клеточным реакциям, а именно к дисфункции ферментативных клеточных систем. При эпилептическом статусе эффективность работы митохондрий может регулироваться несколькими лимитирующими скорость дыхания факторами: доступностью АДФ и субстратов, возможностями самой дыхательной цепи при насыщающих количествах всех субстратов и компонентов и доступностью кислорода. В условиях гипоксии и окислительного стресса при эпилептической эксайтотоксичности неизбежно страдает каждое из этих звеньев, что отражается на активности митоходриальных оксидаз. Снижение активности окислительных ферментов дыхательной цепи - сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, которое максимально выражено на 5-7-е сутки эксперимента указывает на поражение энергетической функции митохондрий при синдроме гипервозбудимости. На этом фоне значительно возрастает энергопотребление и связанные с ним гидролитические процессы. На ранних этапах эпилептогенеза отмечается активация кислой и щелочной фосфатаз, которые очевидно участвуют в гидролизе макроэргических соединений необходимых для восполнения энергетических затрат на разрастание отростков, гипертрофию клеточных тел и терминальных пуговок синапса. Однако по мере прогрессирования эпилептогенеза при продолжающемся статусе судорожных припадков в условиях неадекватного кровоснабжения активность фосфатаз постоянно снижается, что указывает на альтерацию жизненноважных функций нейрона и по времени совпадает с появлением наибольшего количества погибших элементов II-III слоев височной коры.

Таким образом, мы склонны рассматривать обнаруженную нами диссоциацию между продуцированием и использованием энергии в очаге эпилептиформной активности как одно из важнейших патогенетических звеньев эпилептогенеза.

Известно, что полярность мембраны нейронов поддерживается за счет деятельности ионного насоса, требующего адекватного энергетического обеспечения. Митохондриальная дисфункция эпилептизированных нейронов ведет к нарушению активного транспорта ионов в результате дефицита энергии и, следовательно, к нестабильности клеточных мембран. Вероятно, именно это обстоятельство объясняет почему современные эпилептологи зачастую рассматривают эпилептическую болезнь как своеобразную форму каналопатий (Зенков, 2002; Дудина, 2003; Зенков, Ронкин, 2004; Chang and Lowenstein, 2003; Dudina, 2006; Zhu et al., 2007). Склонность нейронов в очаге эпилептиформной активности к деполяризации способствует нарастанию пароксизмальной активности и поражению нейронов вследствие глутаматной цитотоксичности (Дудина и др., 2006; Smyth, Deshmukh, 2007). Альтерация локальной гемодинамики в эпилептическом очаге усугубляет расстройство метаболической генерации энергии, необходимой для ремоделирования нервных сетей в ответ на эпилептогенные стимулы, замыкая, таким образом, порочный круг (Мухин, Петрухин, 2005; McNamara, 1994; Lopez et., 2007).

Патоморфология корковых нейронов при эпилепсии. Гиперфункция эпилептических нейронов в условиях дефицита кровоснабжения и митохондриальной недостаточности ведет к структурной реорганизации слуховой коры. Комплекс морфологических изменений при височной эпилепсии складывается из дистрофических процессов и разрастания нервных элементов с образованием атипичных клеток и новых структур.

Мы обнаружили, что очаг эпилептиформной активности и зона его проекции характеризуется высокой степенью клеточной атипии. При эпилептизации мозга выявляется два типа изменения нейронов. Один тип характеризует дистрофию, некроз и апоптоз клеток. Другой вызывает гиперпродукцию дендритов, гипертрофию синаптических терминалей, избыточный синтез базофильного вещества, что рассматривается в качестве компенсации на утрату значительного числа нейронов. Кроме того, избыточные разрастания, вероятно, формируют новые пути для реализации эпилептического припадка, и играет, таким образом, определенную роль в патогенезе заболевания.

При исследовании височной коры людей с парциальной эпилепсией в анамнезе обнаружено, что основные патологические изменения сосредоточены в слоях II, III и IV коркового отдела слухового анализатора. Нами установлено, что морфологическим перестройкам подвергаются преимущественно крупные интернейроны, а также пирамидные клетки слоев III и V.

На препаратах импрегнированных по Гольджи и Кахалю обращает на себя внимание некоторая мозаичность поражения: на фоне морфологически полноценных клеточных элементов располагаются нейроны с причудливой геометрией тел и отростков. Аномальные нейроциты располагаются отдельно либо группируются в кластеры по 5-8 и более клеток и занимают площадь диаметром 200-410 мкм.

Отдельные группы клеток столь гиперимпрегнированны, что напоминают лохматые спутанные клубки, в которых с трудом удается идентифицировать клеточные тела и арборизацию их дендритов. Дендриты гипертрофированны, с неровными контурами и варикозными утолщениями. Особенно сильно страдает шипиковый аппарат дендритов, часть из них полностью лишена шипиков, что соотносится с данными литературы (Douglas, Martin, 2004). Так авторами отмечено, что характерной особенностью эпилептического мозга является альтерация главным образом аксодендритических связей и преобладание аксосоматических, характеризующихся лёгкостью запуска мембранных потенциалов (Зенков, 2002; Карлов, 2003; Барашкова и др., 2006; Glass, Dragunow, 1995; Douglas, Martin, 2004; Spenser, 2007).

Молекулярные механизмы, защищающие нейроны от excite-токсичности, являются частью «надсинаптической» антиэпилептической системы, которая реализуется через пластические изменения нервных связей, бурный коллатеральный рост и синапсомодификацию, что способствует значительному изменению естественной арборизации нейроцитов (Дудина, 2003; Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002; Котляр, 1986; Calcagnotto et al., 2002; Dalby, Mody, 2001; Douglas, Martin, 1990). В височной доле головного мозга человека с парциальной эпилепсией нами отмечено увеличение количества и гиперплазия отростков нейронов, гипертрофия концевых пуговок синапса и трансформация их в шаровидные образования. Большинство концевых утолщений имеет гомогенный интенсивный черный или коричневый цвет. Гипертрофия синапсов, очевидно, связана с редукцией их численности при становлении феномена гипервозбудимости и массовой гибелью клеточных элементов в очаге эпилептиформной активности.

Вероятно, синапсомодификацию при височной эпилепсии можно отнести к адаптационной синаптической пластичности, которая обусловлена длительной активацией существующих функциональных систем мозга и появлением новых функциональных систем мозга в процессе адаптации к эпилептогенным стимулам (Степанов, Семченко, 2000; Семченко и др., 2008). В результате отмечается устойчивая реорганизация активных синапсов и нейронных сетей, которая реализуется через активацию долгосрочных гено- и фенотипических механизмов. Изменения экспрессии факторов транскрипции являются одним из наиболее важных этапов в каскаде клеточно-молекулярных событий, участвующих в долговременных перестройках активности клеток мозга при киндлинге (Годухин, 2005; Semyanov, Kullmann, 2001). Наиболее ранний ответ генома, или первая волна экспрессии генов, на внеклеточный стимул обычно вовлекает усиление транскрипции и трансляции факторов транскрипции семейства генов раннего ответа (ГРО). Индукция ГРО может опосредовать связь между периодическими кратковременными внеклеточными стимулами и долговременными структурно-функциональными изменениями в мозге, ассоциированными с развитием киндлинга. Так, по данным Годухина (2005) раскачивающая стимуляция миндалины или гиппокампа вызывает билатеральную экспрессию ГРО: с-foc, с-jun, jun B, jun D и Кгох-2 в коре и лимбических областях мозга.

Проявления синаптической пластичности на уровне нейрона зависят от функционального состояния, типа нейрона и существенно отличаются в различных отделах его дендритного дерева (Douglas, Martin, 1990, 2004; Gabbott, Bacon, 1996; Glass, Dragunow, 1995; Kisvarday et al., 1990). На уровне синапса пластичность проявляется изменением его формы, типа и эффективности передачи импульса (Семченко и др., 2008). Особое значение имеет реорганизация взаимоотношений между специфическими сенсорными и неспецифическими возбуждающими и тормозными системами мозга. Так, более высокая пластичность синапсов молекулярного слоя неокортекса, где преобладают восходящие неспецифические и возвратные возбуждающие проекции, ведет к подавлению тормозных систем и способствует распространению возбуждения по коре мозга (Степанов, Семченко, 2000).

Снижение судорожной реакции в цепях нейронов к систематически предъявляемым эпилептогенным стимулам развивается в результате временных структурных преобразований в активированных синапсах: привыкания, депотенциации или длительной депрессии (Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002). Концепция взаимосвязи механизмов физиологической и патологической нейропластичности базируется на данных о сходстве электрографических и молекулярных механизмов, лежащих в основе длительной потенциации (LTP), дегенерации, повреждения и ишемии (Калеменев и др., 2000; Котляр, 1986; Collingridge, 2003). Эти процессы развиваются в глутаматергических синапсах, инициируя изменения внутриклеточной сигнализации, что ведет к стойким изменениям длительности эффективности синаптической передачи (Douglas, Martin, 2004; Ito, 2001).

LTP в условиях патологии может выступать в качестве триггера эпилептогенеза (Дудина, 2003). Согласно современным представлениям, киндлинг, LTP и LTD (длительная депрессия) находятся в состоянии динамического равновесия и образуют континуум, который обеспечивает преемственность между физиологическими и патологическими формами нейропластичности (Степанов, Семченко, 2000; Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002).

LTD и LTP - сбалансированные и взаимообратимые явления. Равновесие между ними нарушают эпилептогенные факторы. Они необратимо смещают его в сторону LTP, после чего процесс выходит из под контроля тормозных механизмов. Нерегулируемая патологическая форма LTP приводит к запуску киндлинга, перевозбуждению нейронов и их гибели.

Поражение нейронов объективно подтверждается данными количественного анализа, выявляющего существенную редукцию клеток. По сравнению с контролем количество клеточных элементов в слоях II-IV снижается в среднем на 23,4 % (рис. 3). Кроме того, в ткани мозга постоянно выявляются очаги глиальной пролиферации.

При окрашивании толуидиновым синим, выявляются темные, сморщенные клетки с явлениями гиперхроматоза ядра и цитоплазмы. Встречаются нейроны с полной, средней, слабой или частичной гиперхромией вещества Ниссля. Ядра таких нейронов фрагментированы или сегментированы.

Рис.3. Редукция клеточных элементов височной коры человека при эпилепсии по сравнению с контролем.

Наряду со сморщенными клетками в очагах эпилептического поражения постоянно выявляются набухшие клетки, плохо воспринимающие основной краситель. В цитоплазме нейронов наступает распад хроматофильных глыбок на более мелкие и бледно окрашенные зерна, главным образом в центре тела клетки. Вероятно, хроматолиз опосредуется гиперфункцией, регенерацией, реактивным коллатеральным ростом и глубоким нарушением обмена в клетке с первичным подавлением окислительных процессов (Keller et al., 2007). Массовая гибель клеточных элементов в эпилептическом очаге способствует пролиферации глиальных элементов, нарушая, таким образом, цитоархитектонику неокортекса и соотношение массы клетки и ее поверхности, усугубляя действие патологических факторов. Картины классического первичного раздражения, обнаруженные нами в височной коре головного мозга человека при парциальной эпилепсии могут быть обусловлены не только неадекватной гипервозбудимостью нейронов в результате массивного выброса квантов глутамата, но и, очевидно, прямым повреждением аксонов.

Морфологическая картина раннего эпилептогенеза у экспериментальных животных мало отличается от ремоделирования нейронных сетей у человека с парциальной эпилепсией. В височной коре крыс нами обнаружены очаги тканевой деструкции, очевидно, связанные с гибелью нейронов, набуханием и отеком нейропильного пространства и дегенерацией волокон. Важно отметить, что гиперимпрегнированные нейроны появляются уже через 2,5 часа от начала эпилептического статуса, их количество возрастает к исходу первых суток и на 3-и сутки закономерно снижается. Наибольшая плотность гиперимпрегнированных клеток регистрируется в слоях II-IV височной коры крысы. Поражение нейронов носит отчетливый очаговый характер.

При окрашивании толуидиновым синим в нейронах отмечается как растворение тигроида и исчезновение ядра, что можно рассматривать как явные признаки некроза, так и сморщенные клетки с маргинальным расположением ядерного хроматина, количество которых превалирует над некротическими. Они располагаются во всех слоях коры, иногда в субкортикальном белом веществе, но чаще концентрируются в виде дискретных «островков» диаметром 150-300 мкм в слоях II-IV.

Для идентификации отдельных клеточных хемотипов, участвующих в эпилептогенезе мы проследили в эксперименте динамику поражения ГАМК-ергических нейроцитов, содержащих кальций-связывающие белки, которые выступают показателем интенсивности метаболических процессов в терминалях ГАМК-ергических интернейронов. Известно, что кальций-связывающие белки утилизируют избыток Ca²⁺, возникающий при массивной активации NMDA-каналов, и, таким образом, предотвращают развитие окислительного стресса и эксайтотоксичности и защищают клетки от перевозбуждения и гибели (Celio, 1990; Caillard et al., 2000).

Иммуноцитохимия кальретинина, кальбиндина и парвальбумина в височной коре интактного мозга крысы позволила идентифицировать непирамидные клетки с полиморфной соматодендритной организацией. Хорошо контурируются тела нейронов, начальные сегменты их дендритов и иногда вторичиные или третичные отростки. Все слои коры пронизывают вертикальные или косо направленные фрагменты иммунопозитивных волокон, принимающие на субпиальном уровне горизонтальную ориентацию.

Каинатный киндлинг ведет к значительному разрежению иммунореактивных нейронов во всех слоях неокортекса эпилептизированных крыс (рис. 4). По сравнению с контролем количество кальбиндин-иммунопозитивных элементов снизилась на 5,3%, кальретинин-содержащих клеток - на 5,1% и парвальбумин-иммунореактивных клеток - на 3,3%.

Рис. 4. Количественная характеристика кальретинин-, кальбиндин- и парвальбумин-иммунопозитивных нейронов в височной коре головного мозга крысы в норме и при каинатном киндлинге. На оси абсцисс указан кальций-связывающий белок. На оси ординат - указан % от общего числа нейронов. Иммунореактивные клетки подсчитывались на площади среза ткани мозга в 1 мм².

Нами установлено, что наиболее устойчивыми к эпилептогенным стимулам являются парвальбумин-иммунореактивные тормозные интернейроны, к которым относятся корзинчатые клетки и клетки-канделябры. Именно этих подтипы образуют наиболее многочисленную популяцию тормозных интернейронов и с их редукцией связывают развитие эпилепсии (DeFelipe, 1999; Ribak, 1985; Ribak, Bakay, 1999; Ribak et al., 2000; Дудина, 2003; Дудина и др., 2006). В височной коре человека корзинчатые клетки выступают интеграторами аксо-соматического торможения для различных по величине и медиаторной ёмкости пирамидных клеток (Douglas, Martin, 2004; Kisvбrday et al., 1993). Уникальность клеток-канделябров обусловлена наличием специализированных образований - картриджей, которые устанавливают контакт на инициальном сегменте аксона пирамидного нейрона и, таким образом модулируют интегрированные принципальным нейроном импульсы, предупреждая избыточную глутаматергическую передачу (Kisvбrday et al., 1990; Thom et al., 2000).

Нами отмечено, что у эпилептизированных крыс парвальбуминовые корзинки располагаются чаще в слоях II/III, однако в инфрагранулярных слоях, где в контроле обнаруживается их наибольшее количество, они практически не встречаются. Можно полагать, что корзинчатые нейроны вовлекаются в формирование патологической гипервозбудимости, главным образом, в популяциях крупных пирамидных нейронов, развивающих кортико-кортикальные ипси- и контрлатеральные проекции.

Наряду с редукцией клеток-канделябров мы регистрировали значительное снижение количества их аксонных окончаний (картриджей), которое вероятно обусловливает гипофункцию интернейронов с акркадным ветвлением аксонов и неэффективность аксо-аксонального торможения (DeFelipe, 1999).

Наименее устойчивыми к эпилептогенным стимулам в слуховой коре крысы при подведении каината оказались кальбиндин-иммунореактивные нейроциты. В слое I нами зарегистрировано снижение количества веретеновидных и биполярных нейронов, которые отвечают морфологической характеристике нейронов Кахаля-Ретциуса (Marin-Padilla, 1998). Кроме того, в супрагранулярных слоях мы наблюдали редукцию клеток малой величины (15 мкм) с бедной дендритной арборизацией, которые мы квалифицировали как нейроглиеформные клетки (Lund, Lewis, 1993; Conde et al., 1994; Gabbott, Bacon, 1996). Последние принимают участие в торможении и избирательной настройке нейронных ансамблей на уровне микромодульной (интра- и интерламинарной) организации коры.

По устойчивости к цитотоксическим эффектам при каинатном киндлинге кальретинин-иммунореактивные нейроны, к которым относят поздно разряжающиеся (late spiking cells) двухбукетные клетки (Kawaguchi, 1995) занимают промежуточное положение, их количество снизилось по сравнению с контролем на 5,1%.

Таким образом, становится очевидным, что, в результате запуска эпилептиформной реакции страдают как интра- так и интерламинарные связи интернейронов, контролирующие активность пирамидных клеток как на локальном уровне, так и в составе крупномасштабных сетей. Хотя в латеральном торможении принимают участие возвратные аксонные коллатерали проекционных нейронов инфрагранулярных слоев, крупные корзинчатые нейроны, ингибируя внутриколончатые тормозные интернейроны (мелкие корзинки и двухбукетные клетки), вызывают непрямую дезингибицию или фасилитацию пирамид родительской колонки (Kisvarday et al., 1990).

Феномен фасилитации, т.е. облегчения и гиперактивации пирамидных клеток, имеет большое значение для понимания гистофизиологии патологической гипервозбудимости. Установлено, что аксон корзинчатого нейрона может покидать свое корковое поле, вступать в белое вещество и через мозолистое тело достигать соседнего полушария (Дудина и др., 2006; Douglas, Martin, 2004). Подобные корзинчатые нейроны конвергируют на ипсилатеральные пирамиды и одновременно тормозят контралатеральные корзинчатые нейроны, дезингибируя пирамиды противоположного полушария (Douglas, Martin, 2004). Участие ассоциативных длинноаксонных систем тормозных интернейронов в синхронизации межполушарной активности предположительно указывает на специфическое значение тормозных функций в формировании феноменов зеркальных очагов и вторичного коркового эпилептогенеза (Jacobs et al., 2000; Sutula, 2001; Теу1ег et al., 2001).

Кроме того, наряду со снижением количества тормозных интернейронов редукция пирамидных клеток слуховой коры в эпилептическом мозге нарушает естественную цитоархитектонику неокортекса. В этой связи на первый план выходит взаимное торможение в паре или кластерах реципрокно связанных ГАМК-ергических нейронов, что в свою очередь способствует синхронизации пирамидных нейронов и их эпилептизации (Dalby, Mody, 2001; Markram et al., 2004; Scharfman, 2002).

Апоптоз в структурах височной доли при эпилепсии. Итак, нами установлена существенная редукция клеточных элементов слуховой коры при парциальной эпилепсии у человека и экспериментальных животных. Нас интересовал, какой механизм гибели клеток превалирует в эпилептическом очаге: некроз и/или апоптоз. В современной литературе весьма активно обсуждается вопрос о роли некроза и апоптоза в эпилептогенезе (Завалишин, Захарова, 1996; Годухин, 2005; Дзугаева и др., 2006; Лю Б., Лю М., 2006; Araki et al., 2002; Chen et al., 2007; Greene et al., 2007; Henshall, 2007; Henshall et al., 2004, 2005). Безусловно, и мы не могли обойти эту проблему. Следует отметить, что подавляющее количество работ посвящено биохимическим аспектам апоптоза при парциальной эпилепсии у человека и животных. Морфологических работ, дающих четкую картину удельной доли апоптоза в эпилептогенном очаге нам не встретилось.

Для решения этой задачи мы использовали как рутинные гистологические методики, так и электронную микроскопию и современные иммуноцитохимические методы (пероксидазный метод TUNEL).

При окрашивании срезов слуховой коры больных с височно-долевой эпилепсией толуидиновым синим и железным гематоксилином Вейгерта сморщенные нейроциты с сегментированными ядрами обнаружены нами преимущественно в слоях II-III. Небольшое количество подобных клеточных элементов отмечается также в слоях IV и V. Нейроны с морфологическими признаками апоптоза расположены как небольшими группами по 2-3 клетки, так и кластерами. Отдельные препараты характеризуются очаговым расположением погибших клеток, которые сплошь усеивают поле зрения. Отметим, что в основном это крупные интернейроны, хотя довольно часто такая картина наблюдается и в пирамидных нейронах слоев III, IV и V. Электронная микроскопия подтвердила данные рутинных морфологических методик и позволила идентифицировать классические стадии апоптоза в корковых нейронах височной доли.

Для первой стадии характерна агрегация и маргинация ядерного хроматина. Контуры ядра становятся неровными. Иногда в центральной части ядра обнаруживаются мелкие гранулы хроматина. Цитоплазма нейроцитов становится конденсированной. Конденсация цитоплазмы и образование выпячиваний на поверхности клетки (блеббинг) обусловливает увеличение соотношения площади поверхности к ее объему. По данным Kondratyev, Gale (2004) и Henshall (2007) глутаматная цитотоксичность, сопутствующая эпилептическому припадку, ведет к массивному поступлению ионов Са²⁺ и активации цистеиновых и сериновых протеаз. Последние расщепляют белки цитоскелета и наряду со сшивками белковых молекул под действием трансаминазы приводят к появлению пузырей и гофрированию мембраны при апоптозе.

Во второй стадии происходит образование ограниченных мембраной апоптозных телец различной конфигурации: от округлой до неправильной. Количество, размер и состав этих образований варьируют. Через дефекты ядерной оболочки хроматин может выходить в цитоплазму нейрона и свободно в ней располагаться. Третья стадия характеризуется фагоцитозом апоптозных телец. При этом воспалительная реакция, которая постоянно обнаруживается при некрозе, отсутствует. И, наконец, четвертую стадию мы определяли по наличию остаточных телец.

Пероксидазный метод TUNEL подтвердил данные световой микроскопии. При наличии эпилептогенного очага в структурах височной доли головного мозга человека основная масса TUNEL-позитивных нейронов сосредоточена в слоях II и III височной коры. Пораженные нейроциты расположены отдельно на фоне относительно сохранных клеток либо образуют кластеры по 2-5 и более нейронов. В отдельных случаях TUNEL-позитивные нейроны сплошь усеивают поле зрения.

В контрольных препаратах височной и зрительной коры апоптотические клетки встречаются не чаще, чем 1-2 на 500-600 клеток. Совершенно иной паттерн гибели клеточных элементов наблюдается в очаге эпилептиформной активности. На тот же объем нейроцитов в височной коре эпилептического мозга нами обнаружено до 4-9 TUNEL-позитивных элементов, а в отдельных участках до 35-40% клеток являются TUNEL-позитивными.

Таким образом, нами установлено, что эпилептогенный очаг характеризуется интенсивным апоптозом нервных клеток. Степень наибольшего скопления апоптотических клеток наблюдается на уровне афферентного входа (слои II-III). При синдроме гипервозбудимости в височной коре головного мозга человека путем апоптоза погибают преимущественно крупные интернейроны, а также пирамидные клетки слоев III и V.

При исследовании апоптотических клеток в неокортексе эпилептизированных крыс прослеживаются четкие очаги поражения височной коры. TUNEL-позитивные элементы располагаются как по одиночке, так и кластерами. Однако, в отличие от материала мозга человека, височная кора крысы при каинатном киндлинге в основном характеризуется наличием крупных кластеров из множества TUNEL-позитивных клеток. Подобные группы визуализируются преимущественно во II-IV слоях височной коры крысы, что соотносится с результатами, полученными при окрашивании ткани мозга толуидиновым синим. Отдельные кластеры из 6-9 клеток встречаются также в слое I и V.

Экспериментальный эпилептогенез показал, что в целом эпилептогенный очаг мозга крысы характеризуется более высоким уровнем апоптоза по сравнению с тканью мозга человека, и отдельные срезы поражают количеством TUNEL-позитивных клеток, а апоптотический индекс здесь достигает 50%.

Полученные данные позволяют нам заключить, что интенсивность апоптоза в эпилептическом очаге и зоне его проекции не зависит от длительности заболевания. Более того, апоптотический индекс при каинат-индуцированной эпилепсии у животных зачастую превышает таковой у человека при данной патологии. Вероятно, это свидетельствует в пользу того, что гибель клеток путем апоптоза происходит именно в иктальном и/или раннем постиктальном периоде, когда наиболее выражены нарушения микроциркуляции, энергетический дисбаланс (а функция апоптоз-индуцирующих белков семейства Bcl-2 напрямую зависит от уровня окислительного фосфорилирования) и процессы адаптационной и репаративной синаптической пластичности.

NO как апоптоз-индуцирующий фактор. Полученные нами материалы по распределению NO-синтезирующих энзимов свидетельствуют о неоднозначном участии NO-ергической компоненты в цитотоксическом поражении нейронов при височной эпилепсии у человека и экспериментальных животных. Они показывают как общие, так и специфические источники монооксида азота, которые формируют различные пулы нейронов, эндотелиоцитов и глиальных элементов головного мозга (таблица 11, 12).

Таблица 11. Показатели гистохимической активности NADPH-d в структурах височной коры человека при парциальной эпилепсии (в ЕОП, (P<0,05))

В исследованном нами патологическом материале височной коры человека выявляется картина редукции численности NADPH-d-позитивных интернейронов, которые практически не маркируются или имеют очень низкую активность энзима. Нейропиль коры приобретает плотное диффузное окрашивание, где только в весьма редких случаях можно идентифицировать волокна и терминальные образования. Профили нейронов сильно повреждены. Наблюдается деформация клеточных тел и извитость отростков с варикозными утолщениями. Микрососудистая система коры и подкоркового белого вещества имеет интенсивную реакцию с NADPH-d. На отдельных участках серого вещества можно обнаружить «островки» астроцитарной пролиферации с высокой активностью NADPH-d.

Существенной особенностью NADPH-d-позитивного окрашивания в зонах эпилептического повреждения коры у человека является наличие высокой активности энзима в цитоплазме пирамидных нейронов, чего мы не наблюдали в интактном мозге. Эти нейроны имеют диаметр 25-30 мкм и локализуются обычно во II-III слоях коры. В слое V изредка выявляются более крупные клетки, размер которых достигает 40-50 мкм в поперечнике. Кроме того, нейроны в очаге гипервозбудимости экспрессируют iNOS.

Таблица 12. Показатели активности NADPH-d в структурах височной коры крыс при каинатном киндлинге (в 1 мм² нервной ткани (P<0,05))

При экспериментальном эпилептогенезе типологический паттерн NADPH-d-позитивных нейронов по сравнению с интактным мозгом крысы остается без изменений, однако количество окрашенных клеток и степень активности фермента существенно увеличивается в ответ на введение каината. При этом активность NADPH-d в структурах височной коры также варьирует на разных стадиях эксперимента. Если судить по количеству и оптической плотности формазанового преципитата, пик активности нейронального и эндотелиального пулов фермента приходится на первые сутки от введения каината. В этот период на срезах визуализируются исключительно непирамидные клетки и интенсивно прокрашенные микрососуды, а в нейропиле между ними - обилие NADPH-d -позитивных астроцитов. На 3-и - 7-е сутки отмечается значительная редукция NADPH-d-позитивных интернейронов. Среди NO-ергических непирамидных клеток в слуховой коре крысы мы, как правило, регистрировали веретеновидные и биполярные подтипы. Реже выявляются крупные мультиполяры с низкой и умеренной степенью окрашивания на NADPH-d. Большинство NADPH-d-позитивных клеток располагается на периферии очагов. Почти все корковые астроциты реагируют на iNOS, которая постоянно маркирует их с 1 по 7 день эксперимента. iNOS также выявляется в небольшой субпопуляции интернейронов III/IV слоев.