Клиническая оценка и внедрение новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря

Размещено на http://www.allbest.ru/

6

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт- Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

На правах рукописи

14.00.40 - урология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Клиническая оценка и внедрение новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря

ДАНИЛЬЧЕНКО Д.И.

СанктПетербург 2008

Работа выполнена на кафедре урологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Аль-Шукри Сальман Хасунович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Александров Валерий Павлович

доктор медицинских наук, профессор Комяков Борис Кириллович

доктор медицинских наук, профессор Горелов Андрей Игоревич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита диссертации состоится «____»____________2009 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д.208.090.05 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» по адресу: 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.6/8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова».

Автореферат разослан «____»____________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного cовета, доктор медицинских наук, доцент Мясникова Марина Олеговна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Рак мочевого пузыря (МП) является самым частым новообразованием мочевыводящих путей (Лопаткин Н.А., 1998; Матвеев Б.П. и соавт., 2001; Jemal A. и соавт., 2004). Несмотря на активные разработки методов ранней диагностики, хирургической тактики, эффективных схем комбинированного лечения, химио- и иммунопрофилактики, остаётся большой частота рецидивирования (27-81%) и прогрессирования (24-38%) первичного и рецидивного рака мочевого пузыря (Воробьев Д.В и соавт., 2002; Аль-Шукри С.Х. и соавт., 2000; Grimm M.O. и соавт., 2003). Для разработки новых высокоэффективных диагностических и лечебных подходов при раке МП необходимо более детальное и глубокое изучение биологических особенностей этого вида опухоли.

Наиболее точным стандартным методом постановки диагноза уротелиальной карциномы является биопсия слизистой МП с последующим патоморфологическим исследованием (Лопаткин Н.А., 2003; May F. и соавт., 2003; Mitropoulos D. и соавт., 2005). Инвазивный характер биопсии и невозможность диагностики в реальном времени и на живых тканях делает актуальным поиск малоинвазивных и дистанционных диагностических методик диагностики рака.

Цитологическое исследование мочи является традиционным рутинным методом диагностики уротелиальной карциномы, используемым в клинической практике (Матвеенко А.А. и соавт., 2002; Raab S.S. и соавт., 2007). Данное исследование мочи имеет высокую чувствительность только при низкодифференцированном раке мочевого пузыря (Гориловский Л.М., 2002; Su C.C. и соавт., 2007). Недостаточная чувствительность данной методики при дифференцированном раке заставляет разрабатывать новые методы с использованием опухолевых маркеров, содержащихся в моче.

Перспективным количественным методом оценки агрессивности опухолей в настоящее время считается определение эндогенных ферментов протеолиза (Kader A.K. и соавт, 2006). В процессе инвазии злокачественных новообразований происходит протеолитическое разрушение базальной мембраны слизистой оболочки МП опухолевыми клетками. К эндогенным ферментам, участвующим в этом процессе, относятся матрикс - металлопротеазы (ММП). Экспериментальные исследования in vitro и in vivo показали, что при раке рост концентрации ММП взаимосвязан с инвазией и метастазированием (Forsyth P.A. и соавт., 1999; Naylor M.S. и соавт., 1994 ; Sier S.F. и соавт., 1996). Однако, данные об эффективности ММП, полученные этими исследовательскими группами, оказываются противоречивыми. Выявление объективных показателей рецидивирования и прогрессирования рака мочевого пузыря, путём определения концентрации ММП в моче больных с опухолью является актуальным в разработке неинвазивных диагностических методик. Цитологическое исследование и диагностические маркеры свидетельствуют о наличие рака, но не определяют локализацию опухоли. Это заставляет развивать оптические методики диагностики новообразований мочевого пузыря.

Среди оптических методов диагностики уротелиальных карцином «золотым стандартом» остаются цистоскопия и гистологическое исследование кусочков ткани, взятых при щипковой биопсии или резекции. Несмотря на применение современных цистоскопов, при стандартной цистоскопии часто не удаётся распознать плоские формы или мелкие сателлиты опухоли (Комяков Б.К. и соавт., 2004; Лопаткин Н.А. и соавт., 2004; Vцgeli T.A., 1992). Рандомная биопсия подозрительных участков слизистой мало информативна и может вызывать реимплантацию раковых клеток (May F. и соавт., 2003; Taguchi I. и соавт., 1998). Гистологическая постановка диагноза возможна только ex vivo и не позволяет интраоперационно, динамически контролировать абластичность проводимой операции. Всё это заставляет проводить клинико-экспериментальные исследования по внедрению различных оптических методов, обладающих высокой разрешающей способностью и специфичностью при установке диагноза во время эндоскопического исследования. Комплексное использование таких методов, как определение ММП, фотодинамическая диагностика, оптико-когерентная томография, конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, позволяют соответственно определить наличие и локализацию опухоли, глубину её прорастания и дифференцировку раковых клеток. Эти одновременно применяемые методы называют «оптической биопсией» (Koenig F. и соавт., 2003).

В последние годы разработаны различные варианты светового маркирования уротелиальных карцином с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) (Аль-Шукри С.Х. и соавт., 2000; Хролович А.Б. и соавт., 2005; Kennedy J.C. и соавт., 1992). После инстилляции АЛК, благодаря красному свечению опухоль легко определяется, её границы становятся чёткими. Это особенно важно, когда опухоль имеет плоскую форму или микросателлиты, которые часто пропускаются при обычной эндоскопии. Не все специалисты единодушны в эффективности применения АЛК в диагностике рака (Miller K. и соавт., 1998). Они относят к недостаткам высокий процент ложноположительных результатов, большой разброс данных специфичности и чувствительности флюоресцентной цистоскопии в различных исследовательских группах и отсутствие отдалённых результатов применения ФДД. Поэтому, несомненно актуально, проведение исследований по определению чувствительности и специфичности АЛК- метода, усовершенствованию техники и повышению эффективности фотодинамического исследования в онкоурологии, а также получению отдалённых результатов применения АЛК- флюоресценции во время трансуретральной резекции МП.

Важным направлением изучения структуры биологических тканей является оптическая когерентная томография (ОКТ) (Fercher A.F. и соавт., 1993). Цель современной медицинской науки в области ОКТ - получить прижизненное изображение тканей на клеточном уровне, приблизить качество изображения к гистологическому, сохранить глубину проникновения излучения до нескольких миллиметров, подвести источник света на глубину живого изучаемого биологического объекта. Наиболее перспективно применение ОКТ на тканях, имеющих слоистое строение, а также в тех случаях, когда решающим при постановке диагноза является строение поверхностного слоя (до 2 мм). Результаты, полученные научными группами в разных странах мира (Гладкова Н.Д. и соавт., 2002; Brand S. и соавт., 2000; Gerckens U. и соавт., 2003), свидетельствуют о необходимости сконцентрировать дальнейшие изыскания на конструировании принципиально нового эндоскопа с использованием ОКТ, создании математической программы по оценке получаемого сигнала, проведении исследования на прижизненных тканях, сравнении получаемого изображения ОКТ с гистологической картиной этих же участков тканей мочевого пузыря.

В последние годы появились работы по использованию конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (КСЛМ) для получения изображения на клеточном уровне живых биологических тканей (Michael C.W. и соавт., 1997). Современная КСЛМ позволяет получить изображения с разрешением 0,5-1,0 мкм. Существующий классический процесс фиксации тканей для гистологического исследования часто изменяет конфигурацию и положение отдельных участков ткани, искажая истинное изображение. Кроме этого стандартным способом можно получить только фиксированную картину тканей ex vivo. Предварительные исследования F. Koenig и соавт., (2003) показали, что КСЛМ позволяет получить высоко разрешающее изображение внутриклеточного строения стенки мочевого пузыря крыс in vivo. Несмотря на невозможность использования у пациентов в настоящее время эндоскопического варианта КСЛМ, этот метод, несомненно, требует дальнейшей разработки с использованием тканей мочевого пузыря после биопсии и цистэктомии.

Таким образом, разработка новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря является актуальной проблемой, что определило необходимость выполнения настоящего исследования.

Цель работы. Клиническая оценка комплексного использования новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря.

Задачи исследования:

1. Изучить диагностическую ценность показателей ММП-2 и ММП-9 в моче для определения наличия рака мочевого пузыря, глубины инвазии и степени дифференцировки.

2. Повысить чувствительность и специфичность АЛК- флюоресцентной цистоскопии в диагностике рака мочевого пузыря, а также оценить прогностическое значение в отношении риска рецидивирования и прогрессирования поверхностного переходно-клеточного рака мочевого пузыря после ТУР.

3. Разработать методику проведения оптико-когерентной томографии мочевого пузыря, провести сравнительный анализ изображений нормальных и неопластически трансформированных тканей при ОКТ и гистологическом исследовании, оценить чувствительность и специфичность ОКТ-цистоскопии при диагностике и определении степени местного распространения рака.

4. Изучить возможность использования конфокальной сканирующей лазерной микроскопии в определении степени дифференцировки рака мочевого пузыря.

5. Обосновать необходимость и возможность комплексного применения традиционных и малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря in vivo.

Научная новизна. Доказано, что определение новых онкомаркеров ММП-2 и ММП-9 мочи является высокочувствительной методикой диагностики карцином мочевого пузыря и их концентрация зависит от стадии роста и степени дифференцировки клеток опухоли. Впервые установлено, что показатели уровня ММП-2 и ММП-9 применимы для динамического контроля за течением рака мочевого пузыря, для ранней диагностики рецидивов и могут быть дополнительным прогностическим фактором опухолевого прогресса.

Найдены высокоэффективные технические приёмы проведения фотодинамической диагностики рака мочевого пузыря, позволяющие повысить чувствительность и специфичность выявления уротелиальных неоплазий, особенно плоских, мелких форм опухоли и карциномы in situ. Применение фотодинамической диагностики во время трансуретральной резекции поверхностного рака позволяет более точно диагностировать и удалять все части опухоли. В рандомизированном исследовании впервые доказано, что более абластично проведённая операция, благодаря применению красного флюоресцентного маркирования, приводит к значительному снижению риска рецидивирования и прогрессирования уротелиальной карциномы, которое сохраняется на протяжении пятилетнего срока послеоперационного наблюдения.

Установлено, что ОКТ исследование даёт на тканевом уровне двухмерное изображение внутреннего строения слизистой оболочки мочевого пузыря, сходное с гистологическим изображением. Анализ полученных результатов показал, что с помощью ОКТ- эндоскопии с большой достоверностью можно определять диспластические и раковые изменения уротелия. Это делает возможным в реальном времени распознавать наличие опухоли и границы инвазии рака без получения материала для гистологического исследования. Установлено, что чувствительность и специфичность распознавания рака мочевого пузыря методом эндоскопической ОКТ значительно выше, чем при стандартной цистоскопии. Впервые найдены специфические показатели оптических свойств тканей мочевого пузыря, используемые в разработанной ЭВМ-программе «Tomo View 1.0», которые позволяют повысить точность распознавания рака мочевого пузыря.

Выявлены возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, позволяющей проводить исследование живых тканей слизистой мочевого пузыря на клеточном уровне и количественно оценивать элементы её внутриклеточного строения, форму, размеры, структуру ядер клеток и определять степень дифференцировки раковых клеток.

Предложена новая методика постановки диагноза рака мочевого пузыря при помощи «оптической биопсии», объединяющей в себе визуальные способы диагностики in vivo: ФДД, ОКТ, КСЛМ и позволяющей без биопсии ставить диагноз, близкий к патоморфологическому. Решено несколько конструктивных задач и проведено теоретическое и практическое обоснование создания устройства, объединяющего оптические методики, необходимые для проведения оптической биопсии рака мочевого пузыря.

Практическая значимость работы. Использование новых онкомаркеров в диагностике рака мочевого пузыря позволяет неинвазивным способом более точно осуществлять его диагностику и проводить контроль рецидивирования заболевания. Данная методика ориентирует уролога в выборе объёма оперативного или консервативного лечения и в прогнозировании заболевания.

Фотодинамическая диагностика помогает урологу найти все участки неоплазии слизистой оболочки мочевого пузыря и повысить абластичность проводимой трансуретральной резекции опухоли. Применение АЛК- диагностики во время ТУР приводит к снижению количества рецидивов опухоли и уменьшению числа повторных операций, что, в свою очередь, снижает стоимость лечения, необходимого для пациента.

Оптико-когерентная томография позволяет врачу во время эндоскопического исследования определять истинные границы опухоли внутри слизистой мочевого пузыря и глубину инвазии без взятия материала для гистологического исследования. Визуальные данные внутреннего строения позволяют отказаться от проведения неприцельной и небезопасной биопсии и дают возможность точнее контролировать границы резекции удаляемой опухоли.

Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия позволяет урологу во время исследования живых тканей мочевого пузыря определять степень дифференцировки клеток уротелия, что может определить ход проводимой операции и прогноз заболевания.

Используемые методы диагностики: ФДД, ОКТ, КСЛМ являются малоинвазивными методиками, которые совместно могут дополнить стандартную биопсию и позволить избежать излишнюю травматизацию рандомной биопсии, уменьшить риск реимплантации раковых клеток и снизить риск возникновения осложнений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ферменты протеолиза ММП-2 и ММП-9 мочи являются высокочувствительными онкомаркерами наличия рака мочевого пузыря, определение их концентрации позволяет судить о глубине инвазии и степени дифференцировки рака, а также прогнозировать клиническое течение заболевания.

2. Новые приёмы проведения фотодинамического маркирования во время цистоскопии позволяют повысить чувствительность и специфичность выявления поверхностного рака мочевого пузыря, снизить риск его рецидивирования в ранние и поздние сроки наблюдения после трансуретральной резекции и уменьшить риск прогрессирования заболевания.

3. Эндоскопическая ОКТ дает возможность получить интравитальное изображение внутреннего строения слизистой оболочки мочевого пузыря, является высокочувствительным методом диагностики рака мочевого пузыря, который позволяет также определить границы и глубину инвазии опухоли.

4. Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия позволяет определить размеры и оценить форму клеток и клеточных ядер при раке мочевого пузыря, что дает возможность уточнить степень его дифференцировки на этапе получения опухолевой ткани при оперативном вмешательстве.

5. Дополнение традиционных методов диагностики рака мочевого пузыря новыми малоинвазивными методиками позволяет повысить ее чувствительность и специфичность, дает возможность получить информацию о глубине инвазии и степени дифференцировки новообразования, а также приводит к снижению риска рецидивирования и прогрессирования рака в послеоперационном периоде.

Личный вклад автора. Научный материал, представленный в диссертационной работе, был получен непосредственно автором в период с 1998 по 2007 годы. Автор лично участвовал в обследовании, лечении и наблюдении больных со злокачественной опухолью мочевого пузыря, а так же в проведении всех экспериментальных и клинических исследований, описанных в диссертационной работе. Автор самостоятельно провёл статистический анализ собранного научного материала.

Внедрение работы. Разработанные в диссертации малоинвазивные методы диагностики рака мочевого пузыря внедрены в работу клиники урологии Медицинского Университета «Шарите» (10117, г. Берлин, Германия, Шаритеплатц, д.1). На основе результатов докторской диссертации «Клиническая оценка и внедрение новых малоинвазивных методов диагностики рака мочевого пузыря» разработаны курс лекций и практических занятий, используемые в процессе постдипломного обучения на кафедрах урологи ГОУ ВПО СПб ГМУ им. акад. И.П.Павлова (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.6/8) и Медицинского Университета «Шарите» Берлина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Российской онкологической конференции (Москва, 2000), научно-практической конференции: «Туберкулёз и рак мочевой системы: вопросы дифференциальной диагностики и лечения» (Новосибирск, 2002), научно-практической конференции: «Диагностика и комбинированное лечение больных раком мочевого пузыря» (Москва, 2002), международной биомедицинской конференции «BiOS 2003» (Сан-Хосе, США, 2003), всемирном конгрессе лазерной медицины «ISLM» (Мюнхен, Германия, 2003), V Всероссийской научно-практической конференции по онкоурологии (Обнинск, 2003), VII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2003), XI конференции по лазерной оптике «LO'2003» (СПб, 2003), международной конференции фотобиологии «Photonics West» (Сан-Хосе, США, 2004), Российско - Германской научно-практической конференции по урологии (СПб, 2004), научном заседании общества урологов Берлина (Берлин, Германия, 2004), 16 симпозиуме по экспериментальной урологии (Любек, Германия, 2004), 35 конгрессе немецкого общества медицинской физики (Лейпциг, Германия, 2004), международной конференции оптической физики «OSAV'2004», (СПб, 2004), III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004), 56 конгрессе общества немецких урологов (Висбаден, 2004), международной конференции оптических технологий, биофизики и медицины «SPIE» (Саратов, 2004), IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005), урологической конференции «Современные технологии диагностики и лечения заболеваний мочеполовой системы» (Новосибирск, 2005), XX конгрессе Европейской Ассоциации урологов (Стамбул, Турция, 2005), 100 конгрессе Ассоциации Американских урологов (Сан-Антонио, США, 2005), IV международном урологическом симпозиуме (Н. Новгород, 2006), 90 конгрессе общества немецких патологов (Берлин, Германия, 2006), урологической конференции университета Шарите «Поверхностный рак мочевого пузыря» (Берлин, Германия, 2006), 4 международной конференции «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (СПб, 2007), 59 конгрессе общества немецких урологов (Берлин, 2007), XXIII конгрессе Европейской Ассоциации урологов (Милан, Италия, 2008), 103 конгрессе Ассоциации Американских урологов (Орландо, США, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 научная работа: 21 публикация в ведущих российских и зарубежных научных журналах, рекомендованных ВАК, по теме диссертации на соискание ученой степени доктора наук по специальности урология, написано 4 главы в монографиях, получено 1 свидетельство на изобретение ЭВМ-программы, получен сертификат Европейской Ассоциации урологов за лучшее научное сообщение в разделе диагностики рака мочевого пузыря на европейском урологическом конгрессе (Турция, Стамбул, 2005).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 226 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, в котором приведено 293 источника, в том числе 34 работы на русском языке и 259 работ на иностранных языках. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 78 рисунками.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Совместно с клиникой урологии Медицинского Университета «Шарите» г. Берлина (Германия) нами проведено обследование и лечение 418 больных. У 275 пациентов был установлен рак мочевого пузыря, у 18 - доброкачественная неоплазия мочевого пузыря, у 72- острый или хронический цистит. Контрольную группу из 53 человек, составили пациенты, у которых не был выявлен рак МП, но которые лечились в клинике урологии по поводу варикоцеле, половой дисфункции, аденомы предстательной железы, недержания мочи или мочекаменной болезни. Среди обследованных больных: 281 человек - мужчины (67,2%) и 137 человек - женщины (32,8%). 220 (75%) пациентов с опухолью МП были старше 60 лет. В зависимости от применяемой диагностической методики рака мочевого пузыря все пациенты были распределены на следующие 5 подгрупп (табл. 1): подгруппа по изучению применения матрикс - металлопротеазы мочи (ММП), подгруппа по использованию АЛК- фотодинамической диагностики во время цистоскопии (ФДД), подгруппа изучения эффективности АЛК- флюоресцентной детекции во время трансуретральной резекции рака мочевого пузыря (ФДД+ТУР), подгруппа использования оптико-когерентнаой томографии во время цистоскопии (ОКТ) и подгруппа применения конфокальной сканирующей лазерной микроскопии во время операции по удалению уротелиальной карциномы (КЛМ).

Таблица 1 Распределение обследованных больных по формам заболевания в различных подгруппах исследования

В ММП-подгруппе исследования по изучению применения матрикс - металлопротеазы мочи для диагностики рака мочевого пузыря мы провели обследование у 130 пациентов. Они были разделены на 3 группы: группу больных с переходноклеточным раком МП (n=71 / 55%), группу больных с циститом (n=14 / 11%) и контрольную группу (n=45 / 34%). В моче каждого пациента однократно определяли концентрацию ММП-2 и ММП-9. Полученные относительные показания ММП сопоставляли с концентрацией креатинина в моче для устранения разницы диуреза пациентов. В результате были получены абсолютные значения ММП мочи, необходимые для дальнейшего сравнения по группам. Параллельно этим исследованиям мочу больных подвергали стандартным исследованиям: определяли pH, количество лейкоцитов, эритроцитов, белка, креатинина. Кроме того, мочу всех больных исследовали на наличие раковых клеток.

В ФДД-подгруппе исследования по определению чувствительности и специфичности АЛК- фотодинамической диагностики при помощи флюоресцентной эндоскопии были обследованы пациенты с подозрением на первичную или рецидивную опухоль мочевого пузыря. При этом сравнивали чувствительность и специфичность детекции уротелиальных карцином с помощью стандартной методики при белом свете и АЛК-флюоресцентной цистоскопии при синем свете (л ~ 410 нм). С этой целью проводили сравнение путём взятия биопсий из мест эндоскопических находок при белом освещении и флюоресцирующих участков и сравнивали их с результатами гистологического исследования.

В ФДД+ТУР-подгруппе для доказательства снижения частоты рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря благодаря применению АЛК- флюоресцентной детекции было проведено рандомизированное клиническое исследование в двух группах (рис. 1). Для этого были обследованы 115 пациентов с опухолью мочевого пузыря, которым требовалось проведение трансуретральной резекции (ТУР). Все пациенты были рандомизированы в группу А (гр. А) и в группу Б (гр. Б). Всем пациентам гр. А была проведена ТУР при белом освещении, пациентам гр. Б - с применением АЛК- индуцированной флюоресцентной детекции. Пациентов обеих групп, у которых был обнаружен поверхностный рак (Ta, T1 G1-3) мочевого пузыря, в дальнейшем наблюдали в течение 5 лет. Через 6 - 8 недель всем пациентам гр. А и гр. Б была проведена повторная ТУР с применением АЛК- индуцированной флюоресценции. Через 3, 6, 12, 24, 36, 48, и 60 месяцев пациентам проводили амбулаторное или стационарное обследование и цистоскопия.

Рисунок 1: Принципиальная схема исследования по определению частоты рецидивирования рака мочевого пузыря при использовании АЛК-фотодинамической диагностики во время ТУР

В ОКТ-подгруппе для определения чувствительности и специфичности оптико-когерентной томографии при помощи ОКТ- эндоскопии было обследовано 100 пациентов с опухолью, воспалением, дисплазией, гиперплазией или другими заболеваниями МП. Всем пациентам проводили стандартную цистоскопию и ОКТ- исследование здоровых и изменённых участков слизистой оболочки МП. В дальнейшем осуществляли сравнение путём взятия биопсий из мест эндоскопических и ОКТ- находок и сопоставляли их с результатами гистологического исследования. Определили чувствительность и специфичность стандартной цистоскопии и эндоскопической оптико-когерентной томографии для диагностики рака МП.

В КСЛМ-подгруппе была проведена конфокальная сканирующая лазерная микроскопия нативных тканей МП взятых у 20 пациентов во время эндоскопического исследования или оперативного вмешательства на мочевом пузыре по поводу рака. Данные макроскопического видеоизображения стенки МП сравнивали со стандартным гистологическим и КСЛМ- изображением.

Результаты исследований оценивали статистической программой SPSS 10,0 (SPSS Sofware, Mьnchen) с помощью тестов: Chi Quadrat, Fichers Exact, Kaplan-Meier, Log Rank, Tarone-Ware, Breslow, Kruskal-Wallis, Mann-Whitney-U.

Результаты исследования.

· Диагностическая ценность определения ММП-2 и ММП-9 в неинвазивном определении злокачественности рака мочевого пузыря.

Определение уровня ММП-2 и ММП-9 в моче проводили методом цимографии. Раздельный анализ в группах больных раком мочевого пузыря, цистита и контроля показал отсутствие статистически достоверного влияния факторов пола и возраста на концентрацию ММП-2 и ММП-9, выделяемых с мочой. Значения показаний ММП-2 и ММП-9, определённые методом цимографии для контрольной группы, для пациентов с воспалением и опухолью мочевого пузыря были статистически обработаны и графически представлены на рисунке 2. Рисунок иллюстрирует статистически достоверное увеличение значений показателей ММР-2 и ММР-9 в моче пациентов страдающих раком мочевого пузыря (278,7g/g креатинина и 405,4 g/g креатинина) по сравнению с группой контроля (83,5g/g креатинина и 92,1 g/g креатинина).

При поверхностной уротелиальной карциноме (Та, Т1) также выявлен повышенный уровень концентрации обеих ММП, но статистически достоверными были более высокие показатели только для ММП-9. Концентрация ММП-2 и ММП-9 в моче в подгруппе пациентов с инвазивным раком мочевого пузыря (Т2) была выше (887,4 g/g креатинина и 1050,0 g/g креатинина) на статистически достоверную величину (соответственно p< 0,05 и p< 0,01), чем в подгруппе больных с поверхностной карциномой уротелия (153,2 g/g креатинина и 229,8 g/g креатинина). Разница показателей ММП внутри подгруппы пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря (между Та и Т1) была статистически недостоверной и составила для ММП-2 p= 0,3 и для ММП-9 p= 0,4. Различия в уровне концентрации ММП-2 и ММП-9 в подгруппе больных с инвазивной уротелиальной карциномой (между Т3 и Т4) тоже оказались недостоверными при p= 0,1 для обеих ММП.

При раке мочевого пузыря с дифференцировкой клеток G1, G2 и G3 выявлен более высокий уровень концентрации ММП-2 (112,4g/g креатинина, 198,6 g/g креатинина и 493,1 g/g креатинина) и ММП-9 (232,8 g/g креатинина, 262,7 g/g креатинина и 554,3 g/g креатинина) мочи в сравнении со средней концентрацией этих онкомаркеров в контрольной группе.

Рисунок 2: Содержание ММР-2 и ММР-9 в моче у пациентов с переходноклеточным раком мочевого, с циститом и контрольной группы

Средние значения указаны горизонтальной линией. Достоверность различий показателей к контрольной группе отмечена по следующей схеме: b = p< 0,01; c = p< 0,001.

Статистически достоверные различия величин исследованных протеаз были выявлены только у пациентов с более низкой дифференцировкой рака (G2 и G3) по сравнению с показателями контрольной группы. При этом показатель статистического различия для ММП-2 был соответственно р< 0,05 и р< 0,001, а для ММП-9 - р< 0,01 и p< 0,001. Анализ этих результатов указывает на тенденцию увеличения уровня ММП-2 и ММП-9 в моче с повышением степени злокачественности опухолевого процесса в мочевом пузыре. томография мочевой пузырь гистологический

Мы установили чувствительность и специфичность методики определения ММП-2 и ММП-9 для диагностики рака МП. Эти данные были сопоставлены с результатами чувствительности цитологического исследования мочи у больных этой же группы (табл. 2).

Таблица 2 Сравнительная характеристика чувствительности методики определения ММП-2, ММП-9 мочи и цитологического исследования мочи при диагностике рака мочевого пузыря

Анализ показал, что чувствительность цитологического исследования мочи (62%) для всех групп пациентов с уротелиальной карциномой превышала чувствительность методики ММП-2 (51%) и ММП-9 (37%). При этом для инвазивных форм рака МП чувствительность ММП-2 - методики превышает чувствительность стандартного цитологического исследования мочи. Наибольшая разница выявлена при раке мочевого пузыря в стадии инвазии Т3, Т4, где чувствительность определения ММП-2 составила 70%, ММП-9 - 60%, а цитологического исследования мочи - только 33%. Для злокачественных опухолей мочевого пузыря с глубиной прорастания Т2 чувствительность методики ММП-2 была 89%. Специфичность методики ММП-2 и ММП-9 для диагностики рака МП составила 95%.

· Клиническое значение фотодинамической диагностики для малоинвазивного определения локализации рака мочевого пузыря.

На основании анализа полученных данных нами была определена чувствительность и специфичность АЛК- флюоресцентной диагностики. У 104 пациентов было проведено 343 биопсий. При проведении цистоскопии при синем свете у 88 из 104 пациентов был выявлен рак мочевого пузыря или дисплазия, которые давали интенсивное красное свечение. Все опухоли МП при синем свете давали красное свечение. Из 202 участков мочевого пузыря с истинно-положительной флюоресценцией в 36 случаях была выявлена дисплазия, 23 случая классифицированы как карцинома in situ, 143 - как переходно-клеточный рак мочевого пузыря различной стадии (TaG1- n= 28; TaG2- n= 77; T1G1- n= 6; T1G2- n= 18; T1G3- n= 10; T2G3- n= 4). Только в 6 участках был ложно-отрицательный результат, т.е. при раке или дисплазии МП не отмечалась красная флюоресценция. В 82 из 343 участков мочевого пузыря с отсутствием красного свечения не было найдено неоплазии или признаков дисплазии. Среди них в 42 случаях слизистая была без изменений, в 36 - с явлениями цистита, в 4 - с признаками гиперплазии. В 15% случаев (52 из 343) красная флюоресценция была ложно-положительной. Она присутствовала в участках с явлениями цистита. За счёт флюоресцентного красного свечения в 21% случаев мы обнаружили участки опухоли, которые не были видны при обычном освещении. Это были микросателлиты, плоские и периферические участки опухоли. Анализ полученных результатов исследований, с учётом технических особенностей ФДД, выявил чувствительность цистоскопии с АЛК-индуцированной флюоресценцией для диагностики уротелиальных карцином в 97% и специфичность - 61%. Эти показатели превышают соответственно на 19% и 30% возможности стандартной цистоскопии. Технически корректное проведение флюоресцентной цистоскопии и приобретённый опыт позволили повысить специфичность данной методики на 9%. Наши исследования показали, что период освоения новой методики составляет 10 - 15 исследований. В течение этого времени достигается наибольшая эффективность использования методики и правильная оценка относительно субъективной видеоинформации.

· Влияние фотодинамической диагностики во время ТУР мочевого пузыря на риск возникновения рецидивов опухоли.

В рамках вышеописанного проспективного, рандомизированного протокола было обследовано и лечилось 115 пациентов с поверхностной злокачественной опухолью мочевого пузыря, которые находились под нашим наблюдением на протяжении 5 лет (табл. 3).

Таблица 3 Результаты пятилетнего наблюдения за больными раком мочевого пузыря

Обозначения: ?Mann-Whitney-тест

° Fisher exact-тест

† статистически достоверный результат

Время наблюдения за пациентами в группе стандартного лечения варьировало от 23 до 61 месяца и его медиана составила 39 месяцев. В АЛК- группе время наблюдения за пациентами колебалось от 25 до 61месяца, а его медиана была 42 месяца. Анализ продолжительности безрецидивного периода в сравниваемых группах показал достоверное (р= 0,015) увеличение времени до возникновения первого рецидива после первичной ТУР. При этом медиана безрецидивного периода в группе А составила 5 месяцев, а в АЛК-группе - 12 месяцев. За всё время наблюдения пациентов в группе стандартного лечения было выявлено 82 случая (от 1до 5) рецидивов, а в группе с флюоресцентной диагностикой - 61 случай (от 1 до 4). Количество повторных ТУР в АЛК- группе было на 32 меньше, чем в группе стандартного лечения (р= 0,03). В сравниваемых группах было выявлено статистически достоверное (р = 0,04) снижение частоты прогрессирования рака мочевого пузыря. В группе стандартного лечения у 9 из 51 пациентов (18%) выявлено прогрессирование заболевания, а в АЛК-группе- у 4 из 51- (8%). При этом результат гистологического исследования, полученного при повторной ТУР, свидетельствовал о повышении глубины инвазии (Т) или степени злокачественности (G) уротелиальной карциномы. Количество пациентов, получавших внутрипузырную терапию после выявленного первичного рецидива, было практически одинаковым в обеих группах и составило в группе А -12 человек, а в АЛК-группе - 13. У троих пациентов в каждой группе при повторной ТУР был выявлен регресс заболевания за счёт снижения глубины прорастания опухоли или повышения степени дифференцировки раковых клеток. Цистэктомия проведена 4 пациентам в группе А и 3 - в АЛК группе. За период наблюдения умерло по 3 пациента в каждой группе. За всё время наблюдения у пациентов, получавших стандартное лечение, выявлено 38 (75%) первичных рецидивов, тогда как у больных, которых оперировали под АЛК- флюоресцентным контролем, рецидивы наблюдали реже - 30 (59%) случаев.

Изучение 5-летнего безрецидивного выживания методом Kaplan-Meier показывает статистически достоверное преимущество флюоресцентной методики операции над стандартной (рис. 3).

Рисунок 3: Анализ безрецидвной выживаемости после стандартной ТУР(Гр. А) и ТУР c фотодинамическим контролем (Гр. Б АЛК) методом Kaplan-Meier

Представленные данные свидетельствуют о более выраженном преимуществе АЛК- методики на ранних сроках наблюдения. Анализируя риск рецидивирования рака МП у пациентов при наблюдении до 5 лет, нами выявлено равномерное повышение количества рецидивов. Частота рецидивирования в группе стандартного лечения с 61% через год повысился до 75% через 5 лет, а в АЛК-группе с 43% - до 59%. Преимущество новой методики лечения со временем сократилось, но осталось достоверным. Эти результаты подтверждает анализ с применением Kaplan-Meier теста. Так при Breslow-тесте, который характеризует начальные результаты, р = 0,0013, а при Log-Rank-тесте, который характеризует в большей степени конечные результаты, p = 0,02. Флюоресцентная методика не может влиять на этиологические факторы возникновения опухоли, поэтому она не препятствует появлению новых рецидивов в отдалённые сроки после первичной операции. Наши данные свидетельствуют о возникновении одинакового числа рецидивов рака мочевого пузыря в обеих группах исследования на поздних стадиях наблюдения.

Проведена оценка стоимости лечения с применением ФДД. Однократное проведение фотодинамического исследования с использованием раствора 1,5 гр. АЛК и с амортизацией специальной оптической аппаратуры приводит к дополнительным расходам в пределах 70-100 €. Однако, новая тактика лечения требует меньшего количества необходимых повторных операций. Всем пациентам группы со стандартным лечением за весь период наблюдения с 1998 по 2003 год было проведено 150 повторных трансуретральных резекций МП, а такому же количеству больных АЛК- группы таких повторных операций проведено 118. Разница статистически достоверная (р= 0,03). При подсчёте количества операций в год на одного пациента, в группе стандартного лечения было проведено 1,3 операции, а в группе с АЛК-диагностикой -0,94. Разница составляет 25%. Таким образом, несмотря на применение более дорогой флюоресцентной диагностики при раке МП, пациент может экономить до 350€ в год за счёт снижения количества необходимых повторных операций.

· Малоинвазивное определение границ распространения и глубины распространения рака мочевого пузыря методом оптико-когерентной томографии.

ОКТ исследование во время цистоскопии выполнено у 100 пациентов с подозрением на опухоль мочевого пузыря. Им проведено 1187 ОКТ-измерений. У всех пациентов были исследованы здоровые участки и с карциномой слизистой оболочки МП, а так же области с различными патологическими изменениями, такими как цистит, папиллома, дисплазия, метаплазия, послеоперационный рубец мочевого пузыря. ОКТ изображение рассматривали параллельно с гистологической картиной удалённой из этого места ткани и таким образом интерпретировали результаты.

У 6 пациентов была выявлена карцинома in situ. Цистоскопическая картина при раке in situ показывала отсутствие специфических черт и была абсолютно нормальной, либо выявляла участки гранулярной или бархатистой гиперемированной слизистой оболочки. Во всех случаях диагноз карцинома in situ был установлен на основании морфологического метода исследования. На 40 ОКТ снимках сis отмечали неравномерное утолщение уротелиального слоя и отсутствие в нём всякой слоистости. На поперечных томограммах была хорошо видна внутриуротелиальная переходная зона между опухолью и неизменённым уротелием. Утолщенный край опухоли располагался внутри эпителиального слоя и имел аморфную мозаичную структуру. Он постепенно становился тоньше с переходом в неизменённый эпителиальный слой. Кроме этого на ОКТ- изображениях определяли характерный для сis момент слущивания опухолевой ткани с базальной мембраны. На сравнительных фотографиях видно совпадение поперечного изображения формы карциномы in situ по ОКТ и гистологическому изображению. По ОКТ- снимку поверхностного рака in situ выявлено отсутствие признаков инвазии за счёт целостной базальной мембраны и характерного ровного наружного контура собственной пластинки. Под опухолевым утолщением снова видны неизменённые подлежащие ткани в виде слоистости подслизистой оболочки стенки мочевого пузыря. У 7 пациентов был выявлен инвазивный переходноклеточный рак мочевого пузыря. При инфильтративном раке мочевого пузыря на 48 ОКТ- снимках найдено полное нарушение структуры и отсутствие всякой слоистости. Глубина изображения была значительно уменьшена, благодаря быстрому затуханию хаотичных А-сканов. Под аморфной, мозаичной областью отсутствовали неизмененные слои подслизистой оболочки. Во всех случаях отсутствовала граница прохождения базальной мембраны, свидетельствующей об инвазии опухоли через собственную пластинку мочевого пузыря. ОКТ-изображение и патоморфологическая картина в виде аморфной структуры, были всегда сходны за счёт беспорядочной инвазии раковых клеток и стромальных элементов опухоли в подслизистый и мышечный слой мочевого пузыря.

В работе по изучению ОКТ проводили сравнение чувствительности и специфичности стандартной цистоскопии и эндоскопической оптико-когерентной томографии для диагностики рака мочевого пузыря. Полученные данные показали, что во время стандартной цистоскопии в 41 из 159 участков слизистой (26%) с дисплазией / неоплазией были ложно-отрицательные результаты, т.е. не была заподозрена опухоль. При этом, во время совместного применения цистоскопии и ОКТ количество нераспознанных участков с дисплазией/ неоплазией было только 15 из 159 проб (9%). В нераспознанных стандартной цистоскопией 26 участках с неоплазией (16%) были найдены признаки внутреннего строения тканей, которые характерны для опухолевого процесса слизистой мочевого пузыря. Эти участки могли бы стать потенциальными источниками возникновения резидуальной опухоли. Во время обычной цистоскопии в 88 из 267 участках без неоплазии (26%) результаты были ложно-положительными, т.е. в них была заподозрена опухоль. При совместном применении цистоскопии и ОКТ таких участков было всего 38 (14%). В 50 участках (19%) цистоскопия дала основание заподозрить наличие опухоли МП. Однако, во время ОКТ были найдены признаки внутреннего строения слизистой мочевого пузыря, позволяющие исключить рак. Расчёт полученных результатов, изображённых на рисунке 4, показал, что ОКТ- эндоскопия с большой достоверностью коррелирует с диспластическими и раковыми изменениями уротелия. Чувствительность ОКТ- цистоскопии составила 90%, а стандартной цистоскопии - 74% (p< 0,05). Специфичность ОКТ цистоскопии была 86%, а для стандартной цистоскопии - 67% (p< 0,05).

Рисунок 4: Чувствительность и специфичность стандартной и ОКТ- цистоскопии

По результатам наших исследований важнейшим преимуществом ОКТ- цистоскопии является то, что в 16% случаев уротелиальная опухоль была найдена благодаря ОКТ. Во время исследования было показано, что ориентация в мочевом пузыре через ОКТ- эндоскоп не является проблематичной даже при снижении резкости стандартного видеоизображения и даёт дополнительную информацию о внутреннем строении слизистой оболочки мочевого пузыря. Черно-белое изображение тканей методом ОКТ, полученное в нашей работе на томографе Sirius- 713, несёт информацию о форме и структуре ткани, но уступает цветному гистологическому изображению в наглядности. Без дополнительной информации различить доброкачественное и злокачественное утолщение уротелия очень сложно. В связи с этим была разработана вспомогательная компьютерная программа Tomo View 1.0 для анализа и оценки ОКТ- изображений. Эта ЭВМ- программа применяется параллельно или вместо программы OCT-Eval 1,0, используемой с томографом Sirius-713. С целью повышения наглядности обычное ОКТ- изображение было подвергнуто теневому преобразованию с добавлением цветности и наложением на оригинальное изображение. Созданная программа Tomo View 1.0 имеет несколько режимов обработки изображения, каждый из которых позволяет подчеркнуть определенные аспекты структуры исследуемой ткани. Данная ЭВМ-программа была адаптирована под характерные особенности строения стенки мочевого пузыря в норме и патологии.

Метод теневого наложения основан на усилении величины рассеивания соседних участков по вертикали, которые имеют разную величину на глубину и одинаковую по горизонтали. Этот метод позволил более чётко отграничить уротелиальный слой от собственной пластинки и определить местоположение и целостность базальной мембраны, которая слабо выявляется стандартной ОКТ при воспалительных явлениях мочевого пузыря. При выраженном экссудативном и послеоперационном цистите при исходной оптико-когерентной томограмме часто плохо видна или полностью отсутствует горизонтальная направленность белых узких полосок фибриновых волокон собственной пластинки. При теневом наложении внутрислойная горизонтальная структурность становится более отчётливой в сомнительных местах или становится различимой в тех участках, где формирующаяся слоистость вообще не определялась, а расценивалась как аморфная структура как при опухоли. При этом становятся различимыми и резкими мелкие сосуды, которые в опухолевой ткани никогда не видны. По известным литературным данным, метод теневого наложения для повышения качества ОКТ- изображения ранее не применялся.

Методика цветового наложения использует эффект определения коэффициента рассеивания разных биологических сред. Коллагеновая, фиброзная, мышечная ткань и уротелий имеют разный коэффициент рассеивания света. Связывая степень рассеивания и цветность, можно придать каждому из этих видов тканей определённый цвет, который был бы похож на цвет при гистологическом изображении. Этим способом мы попытались получить цветное ОКТ изображение. Серо-розовый оттенок уротелия стал отличаться по цвету от собственной пластинки, которая приобрела красно-розовые тона. Поверхностный мышечный слой получился зеленовато-розовым. Капилляр с внутренним содержимым окрасился интенсивно-зелёным цветом. Дополнительная цветовая окраска дала усиление контрастности слоёв и облегчает глазу возможность сконцентрироваться на оценке структуры внутри слоя и различий между ними.

ОКТ, по сравнению с обычной эндоскопией, даёт важную дополнительную информацию о поперечном внутреннем строении стенки мочевого пузыря. Без взятия биопсии можно определить наружный и внутренний край поверхностной опухоли. Учитывая, что все начальные стадии заболеваний мочевого пузыря связаны с изменениями в слизистом и подслизистом слое, толщина которых не превышает 1,5 мм, это делает возможным изучение ранней патологии методом эндоскопического ОКТ. В зависимости от особенностей полученного снимка, врач может выбрать один из режимов программы Tomo View 1.0, который помогает цветом и формой подчеркнуть слоистость нормальных тканей и, в сомнительных ситуациях стандартного ОКТ-режима, исключить или подтвердить наличие опухоли. Данные режимы фильтрации визуализируют различия оптических свойств тканей по рассеиванию и преломлению инфракрасного когерентного излучения. После регистрации программы Tomo View 1.0 в Федеральной службе по интеллектуальной собственности и патентам от 01. октября 2007 (№2007614173), она внедрена в клиниках урологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова и Медицинского Университета «Шарите», Берлина, где используется для анализа ОКТ- изображений в качестве дополнительного инструмента в постановке диагноза.

· Диагностические возможности конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для малоинвазивного определения степени дифференцировки рака мочевого пузыря.

КСЛМ- исследование было проведено на нативном материале, полученном от 20 пациентов во время ТУР мочевого пузыря или при цистэктомии по поводу рака МП. У всех пациентов при стандартном патологоанатомическом исследовании был установлен переходноклеточный рак мочевого пузыря. У 8 (40%) больных был установлен инвазивный (Т2, Т3), а у 12 (60%) - поверхностный (Та, Т1) рак МП. У всех 20 пациентов были выявлены и исследованы папиллярные участки рака мочевого пузыря. При гистологическом исследовании папиллярная опухоль чаще всего являлась высокодифференцированной. На КСЛМ- изображении такой опухоли видно увеличение количества слоёв уротелия и нарушение их рядности. Чётко определяется клеточный полиморфизм, при котором клетки уротелия имеют разнообразную неправильную форму. Ядра клеток неоднородно увеличены и имеют разную интенсивность окрашивания, за счёт различной степени свечения. Под белым тяжом тонкой и неповреждённой базальной мембраны виден однорядный слой стенки капилляра, состоящий из плотно прилегающих друг к другу эндотелиальных клеток.

У 6 (30%) из 20 пациентов была найдена карцинома in situ. Во всех этих случаях карцинома in situ была выявлена не как самостоятельное заболевание, а как сопутствующее папиллярному низкодифференцированному раку мочевого пузыря. На КСЛМ- изображениях было видно увеличение количества слоёв уротелия. Ядра клеток значительно увеличены во всех слоях и имели деформированную и неправильную форму с выраженной интенсивной окраской за счёт выраженного свечения. Базальный слой клеток так же имел признаки полиморфии и неплотно прилегал к базальной мембране.

Наше исследование показало возможность проведения КСЛМ нативных тканей МП, позволяющей определять степень дифференцировки клеток уротелия. Эта методика позволяет получать изображение, сходное с микроскопической картиной, полученной по результатам исследования биоптатов. На гистологических снимках, изображающих умеренно дифференцированный папиллярный рак мочевого пузыря, различимы поверхностный слой больших "зонтичных" клеток, слои уротелия с ядрами, изменёнными в разной степени и слой мелких клеток базального слоя. КСЛМ- изображение позволяет судить о размере и форме ядер клеток, особенно в поверхностном слое.

Во время патоморфологического исследования при высоко злокачественном раке МП во всех слоях уротелия можно видеть клетки на разных стадиях митоза. Конфокальная микроскопия даёт чёткую информацию о ядрах клеток базального слоя, которые определяются в виде белых пятен, в сравнении с гистологической картиной, где они видны в виде тёмных пятен. В отличие от гистологического, конфокальное изображение даёт более ясное представление о форме ядер и их внутренней структуре. На КСЛМ-снимках удаётся обнаружить особенности строения низкодифференцированного и высокодифференцированного рака мочевого пузыря. Клетки с низкой дифференцировкой обеспечивают более сильное контрастирование ядер, чем клетки рака с высокой дифференцировкой. При этом наши данные позволили видеть различия формы ядер и митотического рисунка внутри ядер.