Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus Aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Размещено на http://www.Allbest.ru/

03.00.07 - Микробиология;

14.00.30 - Эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Тема:

Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus Aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину

Дмитренко Ольга Александровна

Москва - 2008

Работа выполнена в государственном учреждении - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Брико Николай Иванович

Доктор медицинских наук, профессор Анкирская Алла Семеновна

Доктор медицинских наук, профессор Белобородова Наталья Владимировна

Ведущая организация - ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится 15 февраля 2008 г. в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в конце XX века в борьбе с инфекционными заболеваниями человека, внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем современной медицины, которая приобретает все большую экономическую и социальную значимость. Рост заболеваемости ВБИ связан со значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов, увеличением частоты инвазивных лечебных процедур и методов диагностики, качественными изменениями структуры популяции пациентов

(Прозоровский С.В., Генчиков Л.А., 1994; Покровский В.И. и др. 2000; Семина Н.А., Ковалева Е.П., Акимкин В.Г., Сидоренко С.В., 2006).

Среди возбудителей ВБИ одно из ведущих мест во многих развитых странах мира принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является Staphylococcus aureus. Эпидемиологическая обстановка осложняется в связи нарастанием частоты выделения клинических изолятов золотистого стафилококка, устойчивых к оксациллину (метициллину), сокращенно называемых ORSA или MRSA, которые наряду с устойчивостью ко всем в-лактамным антибиотикам нередко обладают резистентностью и ко многим другим классам антимикробных препаратов (Ayliffe, G.A., 1997; Воyce J.M.,1997; Lowy F.D., 2003). По данным зарубежных исследований MRSA вызывают разнообразные формы внутрибольничной инфекции, включая наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром токсического шока, септический артрит, остеомиелит, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения (Edmond M.B. et al.,1999; Dinges M. M., Orwin P.M. and Schlievert P.M., 2000; Engelmann J.J. et al., 2003).

В конце 80-х годов XX века на основании сходства фенотипических характеристик клинических изолятов MRSA, выделенных во время вспышек ВБИ в разных стационарах, сформировалось представление о способности некоторых госпитальных штаммов MRSA к эпидемическому распространению (Marples R.R., and Cooke E., 1985). Внедрение молекулярных методов типирования в эпидемиологические исследования явилось мощным инструментом идентификации и изучения механизмов формирования эпидемически значимых штаммов прокариот. На стыке микробиологии, молекулярной биологии и эпидемиологии возникло новое направление исследований - молекулярная эпидемиология инфекционных заболеваний, основными задачами которого являются изучение географического распространения различных генотипов патогенных микроорганизмов, их роли в формировании особенностей клинических форм заболеваний, т.е. углубленного изучения паразитарной системы как биологической основы эпидемического процесса инфекционных болезней (Черкасский Б.Л., 2001). Использование молекулярных методов типирования позволило нескольким группам зарубежных исследователей выявить циркуляцию MRSA, сходных по ряду молекулярно-генетических характеристик, не только в стационарах различных городов, но даже стран, расположенных на разных континентах. Такие MRSA в работах английских исследователей получили название эпидемических штаммов (Hookey J.V., Richardson J.F. and Cookson B.D., 1998). В отличие от идентифицированных в Великобритании, выделенные в стационарах некоторых стран Латинской Америки и на европейском континенте, в США и Японии, схожие изоляты MRSA, охарактеризованные американскими исследователями с использованием других молекулярных методов типирования, были названы эпидемическими клонами. Было показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах, в значительной степени обусловлен распространением эпидемических штаммов или клонов MRSA (Ayliffe, G.A., 1997; Oliveira D. et. al., 1998).

Достигнутый на рубеже веков существенный прогресс в изучении молекулярных механизмов резистентности S. aureus к антимикробным препаратам, расшифровка полных нуклеотидных последовательностей геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S. aureus выявили, что этот микроорганизм принадлежит к гетерогенным и полиморфным видам, у которого не только гены антибиотикорезистентности, но и многие гены патогенности присутствуют в хромосоме в составе геномных островов различных типов: островов «патогенности», стафилококковых хромосомных кассет (SCC), профагов. В разных штаммах эти генетические элементы существуют в виде аллельных форм и характеризуются различной степенью мобильности (Kuroda M. et al., 2001; Baba T. et al., 2002). Генетическое разнообразие внутри вида является следствием горизонтального переноса генов, расположенных на мобильных генетических элементах (МГЭ). Стало очевидным, что многие из широко используемых методов молекулярно-генетического типирования не способны выявить наличие МГЭ в хромосоме MRSA, и лишь косвенно отражают различия в геноме тестируемых клинических изолятов.

Несмотря на введение Международной классификации болезней 10-го пересмотра, в РФ до настоящего времени не осуществляется регистрация стафилококковых инфекций. Данные официальной отчетности (ф. №2) не отражают этиологическую роль в развитии ВБИ условно-патогенных микроорганизмов и не позволяют определить частоту инфекций, вызванных MRSA. Вместе с тем с конца 90-х годов в РФ отмечался рост числа научных публикаций, посвященных выделению MRSA в стационарах. Известно, что нарастание доли MRSA среди клинических изолятов S.aureus значительно ограничивает возможности эмпирической антимикробной терапии, сокращает арсенал используемых антибактериальных препаратов, существенно ухудшает качество медицинской помощи, оказываемой населению. В этих условиях назрела неотложная необходимость совершенствования методов микробиологического мониторинга S.aureus, проводимого в отечественных стационарах.

Однако на момент начала нашей работы не существовало общепризнанных методов и схем молекулярно-генетического типирования MRSA, были не известны какие-либо генетические характеристики штаммов MRSA, циркулирующих в стационарах РФ, отсутствовали представления о наличии возможных генетических связей между эпидемическими штаммами и клонами, выделенными в стационарах других стран мира и охарактеризованными с помощью разных молекулярных методов.

Цель работы: исследование геномного полиморфизма как основы молекулярно-генетического мониторинга метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в системе эпидемиологического надзора за возбудителями внутрибольничных инфекций.

Задачи исследования:

1. Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничных инфекций.

2. Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA.

3. Изучение структурного полиморфизма генов хромосомного «ядра» и набора генов, входящих в состав мобильного генетического пула микробной клетки, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность. Определение критериев дифференциации эпидемически значимых штаммов MRSA.

4. Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных S.aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах. Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности.

5. Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S.aureus, циркулирующими в других странах мира. Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA.

6. Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований.

Научная новизна. Разработана схема молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных заболеваний - метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучении молекулярных маркеров двух типов: генов, входящих в состав хромосомного «ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных классов, которая позволяет:

· дифференцировать эпидемические штаммы;

· выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;

· обнаруживать появление новых эпидемических штаммов и изучать механизмы их формирования;

· прослеживать генетические связи между штаммами.

Впервые у метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мобильных генетических элементов (МГЭ), принадлежащих к различным классам.

Впервые показано, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции; получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов.

Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом их заноса из европейских стран. Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ. Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA в Евразии.

Установлено, что в процессе распространения эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить их дальнейшая дивергенция за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки, которая может приводить к формированию новых эпидемических штаммов.

Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC.

Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCmec.

Установлено наличие связи между определенным генетическим «бэкграундом» и присутствием в бактериальной клетке генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах.

Практическая значимость и внедрение. Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus - возбудителей ВБИ.

Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничными инфекциями, вызванными множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами: научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ. Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л.П. Гульченко 23 июля 2006 г.

Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S.aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S.aureus.

Впервые создан музей и банк ДНК эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих на территории РФ, а также музей клинических изолятов метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S. aureus, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Полученные в проведенном исследовании результаты могут быть использованы в работе клинических микробиологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хирургического, акушерско-гинекологического, травматологического профиля, ожоговыми центрами, а также специалистами, осуществляющими эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертационной работы доложены на: VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г.); Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г.); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г.); VII Международной конференции МАКМАХ/ESMID (Москва, 2005 г.); 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г.); VIII Международном конгрессе МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г.); VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии», (Москва, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы.

Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом. Исследования по определению нуклеотидных последовательностей генов coa и spa выполнены в соавторстве с сотрудниками лаборатории «Группа анализа генома» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (рук. к.б.н. Шилов И.А.). Эксперименты по разработке методики выделения ДНК из золотистого стафилококка выполнены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики плазмид ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (рук. член-корр. РАМН, д.б.н., профессор Смирнов Г.Б.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Клинической базой для проведения исследований явились многопрофильные стационары, имеющие в своей структуре отделения: интенсивной терапии и реанимации, хирургические и травматологические, а также специализированные стационары, расположенные в крупных городах с численностью населения, превышающей 500.000 чел., в которых наблюдаются интенсивные миграционные потоки населения.

Бактериальные штаммы. В исследование были включены:

1395 клинических изолятов S.aureus, выделенных в 1998-2002 гг. в стационарах Центрального, Северо-Западного, Поволжского, Южного, Уральского и Восточно-Сибирского федеральных округов России, от пациентов, медицинского персонала, а также и из объектов окружающей среды;

184 клинических изолята S.aureus, устойчивых к оксациллину, выделенных от пациентов в стационарах различных городов CCCР в 1976-1990 гг. (Москва, Минск, Омск, Вологда, Смоленск, Душанбе, Тбилиси);

12 международных штаммов S.aureus, полученных из Референс- лаборатории стафилококковых инфекций Центра народного здравоохранения г. Лондона. (табл. 1).

Согласно рекомендациям BOЗ ВБИ - это любое клинически выраженное заболевание микробного происхождения, поражающего больного в результате госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществляемой им деятельности независимо от того, проявляются или не проявляются симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в больнице. В связи с этим появление клинических признаков инфекции после 48 час. пребывания пациента в стационаре оценивалось как случай ВБИ. Наличие золотистого стафилококка в диагностических титрах или высев микроорганизма из органов, тканей, жидкостей и полостей макроорганизма, которые в норме должны быть стерильными, рассматривалось как подтверждение этиологической роли данного микроорганизма в развитии заболевания. От каждого пациента (за редким исключением) в исследование включали только один изолят S.aureus.

Определение принадлежности к виду S.aureus проводили, используя стандартные методики, описанные в руководствах (Биргер М.О., 1982).

Продукцию стафилококковых энтеротоксинов А и В определяли в реакции непрямой гемагглютинации с помощью стафилококковых энтеротоксических эритроцитарных иммуноглобулиновых диагностикумов, разработанных в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, любезно предоставленных ст.н. сотр., к.б.н. Флуером. Ф.С.

Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом серийных разведений в плотной питательной среде, используя соответствующие методические рекомендации. (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам. Москва, 1976. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Москва, 2004.) В ряде случаев использовали диско-диффузионный метод.

Фаготипирование осуществляли, используя фаги Международного набора (BIS), выпускаемого в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, и фаги экспериментальной коллекции, разработанной при участии автора в Институте для типирования изолятов MRSA (Зуева В.С. и др., 1994), и впоследствии значительно расширенной (Дмитренко О.А. и др., 2003).

Таблица 1

Международные штаммы Staphylococcus aureus

Штамм	Чувствительность к оксациллину	Фаготип	Продукция токсинов
EMRSA-1*	Oxar	85	энтеротоксин A
EMRSA-2	Oxar	85	энтеротоксин A
EMRSA-3	Oxar	75/83A	-
EMRSA-12	Oxar	75/83A	-
PS** 6, NCTC 8509	Oxas	6/47/53/54/75/83A	-
PS 29, NCTC 8331	Oxas	29	энтеротоксин C, TSST-1
PS 52, NCTC 8503	Oxas	52	-
PS 53, NCTC 8511	Oxas	53/75/77/84/85	энтеротоксин B
PS 71, NCTC 9315	Oxas	3C/55/71	TSST-1
PS 95, NCTC 10971	Oxas	95	энтеротоксин B
PS 96, NCTC 10972	Oxas	94/96	энтеротоксин B
ATCC 25923	Oxas	н/д	н/д

Условные обозначения:

Oxa^r - оксациллинрезистентный;

Oxa^s - оксациллинчувствительный;

- продукция токсинов не описана;

* - штаммы EMRSA-1,-2,-3,-12 - эпидемические штаммы MRSA, выделенные в стационарах Великобритании;

** - штаммы PS - метициллинчувствительные штаммы, используемые для размножения бактериофагов Международного набора, относящихся к различным фаговым группам.

Принципиально важной при проведении настоящей работы была необходимость разработать простую и достаточно дешевую методику выделения ДНК из стафилококка, которую в дальнейшем можно было бы предложить для практического использования. В связи с этим разработали методику, в которой в качестве единственного лизирующего агента применяется 6М раствор гуанидина тиоционата вместо дорогостоящего лизостафина. Очистка выделенной ДНК проводится раствором этанола, а не фенол-хлороформной смесью, что позволяет сократить число единиц используемого оборудования. Выделенная таким способом ДНК, как показали проведенные исследования, может храниться в течение нескольких лет при -20?С, не теряя при этом своей активности.

Для амплификации внутренних фрагментов исследуемых генетических структур использовались, как правило, праймеры, уже описанные в научных публикациях. Такой методический прием позволял проводить сравнительный анализ клинических изолятов MRSA и международных штаммов, используя данные, представленные в литературных источниках, а, впоследствии, и компьютерные базы данных.

Амплификацию гена mесA осуществляли с использованием праймеров, предложенных Mehrotra M., Wang G., and Johnson W.M. (2000).

Для амплификации фрагмента коагулазного гена (coa), содержащего вариабельные тандемные нуклеотидные повторы (VNTRs), использовали праймеры, разработанные Hookey J.V., Richardson J. F. and Cookson B.D. (1998) Амплификацию геномной ДНК, электрофорез в агарозном геле, визуализацию продуктов амплификации, условия рестрикции гена, детерминирующего синтез коагулазы, проводили как изложено в работе Дмитренко О.А. и др. (2005).

Рестрикцию амплифицированного фрагмента осуществляли эндонуклеазами Alu1 и Cfo1. Дальнейший анализ проводили на основании определения величины размеров образовавшихся ампликонов, а также числа и величины размеров фрагментов рестрикции (метод ПЦР-ПДРФ).

Амплификацию и последующее секвенирование фрагмента гена coa, расположенного между 979 и 1355 нуклеотидами, содержащего единичные нуклеотидные замены, проводили с использованием праймеров, разработанных с помощью программы «Oligo-4» (Дмитренко О.А. и др., 2005).

Определение типа SCCmec осуществляли на основании результатов амплификации с использованием 7 разных пар праймеров, отобранных из 10, предложенных Okuma K. et. al. (2002), как описано в работе (Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л., 2005).

Для определения наличия генов sea, seb, sec была разработана мультиплексная ПЦР с использованием наборов праймеров, предложенных Mehrotra M., Wang G., and Johnson W.M. (2000). Идентификацию гена tst проводили дополнительно.

Амплификацию вариабельного фрагмента гена spa проводили с использованием праймеров, предложенных Shopsin B. et al. (1999) и Koreen L. et al. (2004).

Выделение из геля и последующую очистку продуктов амплификации генов соа и spa проводили с использованием набора фирмы “Amersham Formacia Biotech” в соответствии с инструкцией производителя.

Секвенирование выполнили на секвенаторе фирмы “Amersham Formacia Biotech” ALFexpress II®.

Анализ нуклеотидного состава полученных последовательностей гена соа провели с использованием программы BLAST на сайте NCBI (http://www.nih.gov.ncbi). Результаты секвенирования гена spa обрабатывали, используя программу Win_DNAsis, сиквенс тип определяли, используя данные web-сайта http://www.ridom.de/spaserver/.

Для амплификации 15 различных генетических локусов золотистого стафилококка были разработаны 2 основные программы и две дополнительные программы для амплификации генетических локусов, которые в дальнейшем подвергались секвенированию.

В работе использовали описательно-оценочный методический подход эпидемиологического анализа. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы StаtCals и таблиц биномиального распределения (Ю. Тюрин, А. Макаров, 2003).

Результаты исследований и их обсуждение

Значение MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций в стационарах РФ

Одной из первостепенных задач настоящего исследования являлось изучение распространенности метициллинрезистентных Staphylococcus aureus в стационарах различных регионов РФ и определение их этиологической значимости в развитии различных форм внутрибольничной инфекции.

Устойчивые к оксациллину изоляты S.aureus были идентифицированы в 15 из 23 стационаров (табл. 2). Частота выделения MRSA колебалась от 0,06% до 80%. Наибольшая частота выделения MRSA отмечалась в стационарах Москвы и Санкт-Петербурга. Вместе с тем, в ряде стационаров, расположенных в крупных городах Южного, Сибирского и Приволжского регионов России MRSA выявлены не были. Доля устойчивых к оксациллину среди всех изученных изолятов S.aureus составила 27,68%. Она превысила частоту выделения MRSA в стационарах стран центральной Европы и, тем более, в лечебных учреждениях Скандинавских стран. (При расчете исключили изоляты S.aureus, выделенные в Дорожной больнице г. Санкт-Петербурга, т.к. среди S.aureus, выделенных в этом стационаре, MRSA обнаружили только у одного носителя из контингента медицинских работников).

Результаты статистической обработки результатов выявили наличие достоверных различий в частоте выделения MRSA в многопрофильных стационарах Москвы (P = 0,000349). Частота выделения MRSA в клиниках ВМА военно-полевой терапии, лор- и глазной была достоверно ниже по сравнению с клиниками хирургического профиля (P = 0,0000000). Частота выделения MRSA в многопрофильных стационарах г. Москвы, а также в ряде хирургических клиник ВМА (общая хирургия, абдоминальная хирургия), оказалась достоверно ниже, чем в ожоговом центре г. Оренбурга (Р <0,05).

Анализ источников выделения возбудителя показал, что, MRSA явились причиной нагноений хирургических и ожоговых ран в 37,7%, заболеваний дыхательных путей - 30,1%, включая пневмонию и трахеобронхит, бактериемий - в 19,6% случаев. Другими источниками возбудителя (12,6%) в ряде случаев были ликвор и экссудат брюшной полости (см. рис. 1).

Таблица 2

Частота выделения метициллинрезистентных S.aureus в стационарах различных регионов РФ

Федеральный округ	Город	Число стационаров	Число изолятов S.aureus
			изученных	устойчивых к оксациллину (%)	вариации числа (%) Oxar изолятов
Центральный	Москва	6	420	127, 30,2% (25,87*-34,87**)	6-40
Поволжский	Саратов, Н. Новгород	2	120	0	0
				0	0
Северо-Западный	Санкт- Петербург	11	575	198, 41,86%*** (37,37-46,45)	0,06-80
Уральский	Оренбург	1	50	70	70
Сибирский	Иркутск	2	160	0	0
Южный	Ростов-на-Дону	1	70	0	0
Всего:	7	23	1395	358 27,68% (19,68-35,66)	0,06-80

Примечание:* - нижняя граница доверительного интервала к вероятности;

** - верхняя граница доверительного интервала к вероятности; (доверительная вероятность 0,05).

Рис. 1. Структура заболеваний, вызванных MRSА

Примечание: N - число источников возбудителя

Летальность при заболеваниях, вызванных MRSA, составила в среднем 31,5%, при этом она была значительно выше в группе лиц старше 40 лет (табл.3). В случае присоединения грамотрицательной микрофлоры или патогенных грибов летальность возрастала до 53,3%.

Таблица 3

Исходы заболеваний, вызванных MRSA, у пациентов стационара травматологического профиля

Состав микрофлоры	Возраст	Число пациентов	Исходы заболеваний
			выздоровление	летальный исход
моноинфекция MRSA	19-40	12	83%	17%
	41-60	7	43%	57%
всего:	19	13 (68,4%)	6 (31,5 %)
ассоциация MRSA с другими с микроорганизмами	19-40	15	60%	40%
	41-60	15	33%	66%
всего:	30	14 (46,6%)	16 (53,3%)
итого:	49	27 (55,1%)	22 (44,8%)

Однако, несмотря на выраженность наблюдаемой тенденции из-за малой численности пациентов в сравниваемых группах выявить достоверных различий нам не удалось. Во всех случаях летальных исходов у пациентов диагностировали развитие сепсиса.

Схожесть эпидемиологической социально-экологической системы, сложившейся в многопрофильных стационарах крупных индустриальных городов, во многом определяемой как демографическим сходством контингента госпитализируемых больных, так и характером и объемом оказываемой медицинской помощи, а также однотипностью используемых антимикробных препаратов, предполагала и однотипность изменений возбудителя в этих условиях. Однако обнаруженные существенные различия в частоте выделения MRSA в таких стационарах, расположенных как в одном, так и в разных регионах РФ, свидетельствовали о необходимости более углубленного изучения гетерогенности популяции возбудителя как компонента паразитарной системы, являющейся биологической основой эпидемического процесса.

Прежде всего, изучили антибиотико- и фагочувствительность как метициллинрезистентных (MRSA), так и метициллинчувствительных (MSSA) изолятов S.aureus, т.е. определили те фенотипические характеристики патогена, которые могут использоваться как маркеры в эпидемиологических исследованиях. Изучение профиля антибиотикорезистентности показало, что более 80% изолятов MRSA, выделенных в 1998-2002 гг., проявляли устойчивость к 5-8 классам антимикробных препаратов, сохраняя чувствительность только к ванкомицину и фузидину натрия (рис. 2).

Сравнение антибиотикочувствительности изолятов, выделенных в 1998-2000 гг., и выделенных в 2001-2002 гг., свидетельствовало о достаточно быстром нарастании числа изолятов, устойчивых к большинству известных антибиотиков, включая макролиды, фторхинолоны и рифампицин (рис. 3). Не обнаружили изолятов, резистентных к ванкомицину и фузидину натрия.

Подавляющее большинство оксациллинчувствительных изолятов S.aureus сохранили чувствительность и к другим классам антимикробных препаратов.

Чувствительность изолятов MRSA и MSSА к фагам Международного набора также была различной. Подавляющее большинство изолятов MRSA были чувствительными к фагам III группы (72,8%). Доминировали изоляты фаготипов 85, 29/85, 77, 77/84/85, 77/83А/85. Среди изолятов, выделенных в 2001-2002 г.г., появились чувствительные к фагам Ш группы в новых, необычных для MRSA сочетаниях: 42Е/77, 29/42Е, 42Е/53/77. Спектр чувствительности изолятов MSSA к фагам был значительно шире. Были обнаружены изоляты, чувствительные к фагам разных групп: I, II, III, V и смешанной (рис. 4).

Рис. 2. Чувствительность к антибиотикам клинических изолятов MRSA, выделенных в 1998-2000 гг.

Условные обозначения: S - чувствительный; S± - умеренно-чувствительный;

R - устойчивый; MR - мультирезистентный;

Cm - хлорамфеникол; Gn - гентамицин;

Doc - доксициклин; Em - эритромицин;

Ln - линкомицин; Cipr - ципрофлоксацин;

Ofl - офлоксацин; Rif - рифампицин.

Рис. 3. Чувствительность к антибиотикам клинических изолятов MRSA, выделенных в 2001-2002 гг.

Условные обозначения: те же, что и на рис. 2.



Рис. 4. Чувствительность изолятов S.aureus, выделенных в 1998-2002 гг., к бактериофагам Международного набора (концентрация 100 ТР).

Типирование с помощью экспериментальной коллекции бактериофагов, специально предназначенной для дифференциации штаммов MRSA, выявило существенные различия между метициллинрезистентными клиническими изолятами S.aureus, выделенными в московских стационарах в 1998 г., и изолятами, выделенными в 1976-1990 гг.

Таким образом, проведение данного раздела работы позволило сделать целый ряд принципиально важных заключений и определить дальнейшее направление исследований. Прежде всего, были подтверждены некоторые общие закономерности, характеризующие MRSA в качестве возбудителей ВБИ: их способность вызывать различные, в том числе и тяжелые инвазивные формы внутрибольничной стафилококковой инфекции (сепсис, менингит, перитонит) у пациентов со сниженной иммунной реактивностью и/или целостностью кожных покровов, мягких тканей или внутренних органов, возникших как результат оперативного вмешательства, травмы или термического поражения.

Вместе с тем, обнаружили, что частота выделения MRSA в сходных по структуре многопрофильных стационарах, расположенных в крупных индустриальных и административных городах различных регионов страны, так и в одном регионе, значительно варьирует. В связи с этим дальнейшие исследования представлялось целесообразным направить, прежде всего, на изучение особенностей популяции возбудителя.

Анализ популяций MRSA и MSSA показал наличие существенных различий между ними как в отношении распространенности детерминант антибиотикорезистентности, так и фагочувствительности, и их гетерогенность, но не позволил определить число циркулирующих штаммов, механизмы, пути и факторы передачи возбудителя в стационарах. Выявленные различия в чувствительности MRSA, выделенных в 1998-2002 гг., и MRSA, выделенных в 1976-1990 гг., к бактериофагам экспериментальной коллекции позволили выдвинуть рабочую гипотезу о появлении новых эпидемических штаммов в стационарах страны.

Геномный полиморфизм клинических изолятов MRSA

Анализ данных литературы свидетельствовал о том, что, несмотря на обилие разработанных молекулярно-генетических методов типирования, ни один из них не учитывает особенностей структурной организации генома MRSA: наличие хромосомного «ядра» и мобильного генетического пула, представленного геномными островами различных классов, интегрированными плазмидами, транспозонами и IS элементами. В этой связи представлялось целесообразным схему типирования MRSA построить таким образом, чтобы она включала как гены хромосомного «ядра», обладающие структурным полиморфизмом, так и гены, расположенные на мобильных генетических элементах (МГЭ), присутствие которых может варьировать от штамма к штамму.

Для изучения геномного полиморфизма, которое и являлось центральной задачей настоящей работы, были отобраны 80 клинических изолятов MRSA, выделенных в 1998-2002 гг. в разных стационарах при различных формах ВБИ, как нетипируемые, так и чувствительные к различным сочетаниям бактериофагов (одинаковым и разным), обладающие сходными и различными профилями антибиотикорезистентности.

Группу сравнения составили 8 изолятов MRSA, выделенных в 1986-1990 гг. в ожоговом центре г. Минска от пациентов с ожогами различной степени тяжести, как чувствительные к фагу 85, так и нетипируемые бактериофагами BIS, которые обладали различными профилями антибиотикорезистентности. Кроме того, в исследование были включены и 2 изолята MRSA, выделенные от новорожденных с клиническим диагнозом омфалит, чувствительные к фагокомплексу 77/85, которые были изолированы в январе и марте 1990 г. в родильном доме г. Омска во время вспышки стафилококковой инфекции, охватившей 11 новорожденных.

Отобранные для молекулярно-генетических исследований изоляты MRSA были тестированы на наличие гена mecA, детерминирующего устойчивость к

В-лактамам, с помощью ПЦР. Bce изоляты образовали продукт амплификации размером 163 н.п., что свидетельствовало о наличии у них гена mecA.

Структурный полиморфизм генов, входящих в состав хромосомного «ядра»

По результатам компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов S.aureus, представленных в геномном банке, а также данных литературы, были выбраны два гена, кодирующие синтез факторов патогенности S.aureus, а именно: ген, кодирующий синтез коагулазы (coa), и ген, кодирующий синтез протеина A (spa), имеющие фрагменты, содержащие различное число тандемных повторов. Наличие различий в длине нуклеотидных повторов в составе названных генов предполагало возможность существования разницы в скорости их изменения и соответствующей дифференцирующей способности маркеров.

Структурный полиморфизм области гена coa, расположенной между 1513 и 2188 нуклеотидами, исследовали методом ПЦР-ПДРФ. Прежде всего, на группе штаммов S.aureus, включавшей как метициллинчувствительные PS штаммы, так эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании, сравнили дифференцирующую способность двух эндонуклеаз: Alu1 и Cfo1. Использование эндонуклеазы Cfo1, оказалось более эффективным, по сравнению с Alu1, и позволило выявить 9 различных профилей рестрикции гена coa у тестируемых штаммов. Однако, подавляющее большинство клинических изолятов MRSА, выделенных в стационарах РФ, по типу рестрикции относились только к двум группам: 4-ой и 5-ой (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма образцов рестрикции коагулазного гена клинических изолятов MRSA, выделенных в стационарах РФ в 1998-2002 гг.

Изоляты каждой группы характеризовались одинаковыми размерами ампликона и специфическими сайтами рестрикции. Отсутствие различий в размерах ампликонов свидетельствовало об отсутствии различий в числе нуклеотидных повторов, а одинаковые сайты рестрикции указывали на структурное сходство этих повторов.

Проведенный дополнительный компьютерный анализ гена соа клинических изолятов S.aureus, представленных в геномном банке, с использованием программы “VECTOR-NTI” выявил наличие в структуре этого гена вариабельного фрагмента в районе между 900-м и 1400-м нуклеотидами, который содержал единичные нуклеотидные замены. В связи с этим было принято решение об изучении данного фрагмента гена coa методом секвенирования.

При сравнении полученных нами результатов секвенирования указанной области гена coa клинических изолятов MRSA, а также штаммов EMRSA-1,-2,-3,-12 с данными секвенирования этого гена у штамма NCTC 8325-4, имевшихся в геномном банке, установили следующее. Во-первых, выбранная нами генетическая мишень является адекватной, поскольку позволяет дифференцировать эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании и охарактеризованные с помощью различных методов; и, во-вторых, клинические изоляты MRSA, выделенные в стационарах РФ, по-видимому, не столь однородны внутри тех двух групп, которые мы выявили по результатам ПЦР-ПДРФ 3ґ-области гена (см. табл. 4).

Таблица 4

Дифференцирующая способность двух различных локусов гена соа

Среди изолятов 4-ой коагулазной группы было выявлено несколько вариантов. Тождественные изоляты выявили в клиниках ВМА, ожоговых центрах гг. Оренбург и Минск. Они оказались сходными со штаммом EMRSA-1. Изоляты, выделенные в больнице им. С.П. Боткина в г. Москве, имели меньшую степень гомологии, которая составляла всего 83-86%. Среди изолятов 5-ой коагулазной группы были изоляты, которые проявляли 98-99% гомологии со штаммом NCTC 8325-4, так и изоляты степень гомологии которых составляла 100%.

Следующим разделом работы было изучение вариабельности гена, кодирующего синтез протеина А. После выравнивания результатов секвенирования с использованием программы WIN_DNAsis были идентифицированы изоляты, содержащие 4, 6, 7 и 10 24-членных нуклеотидных повторов. Дальнейший анализ проводили, используя базу данных spa-сервера, созданную в октябре 2005 г. Согласно этой базе каждому известному типу повторов присвоен определенный номер (номенклатура Ridom) или буква (номенклатура Kreiswirth В.). Сочетания повторов формируют spa профиль. Идентифицированные профили зарегистрированы под определенным номерами, которым присвоено название spa типов.

Было установлено, что все изученные изоляты согласно spa типу можно дифференцировать на два кластера. Первый кластер составили изоляты, отнесенные к 4-ой группе, согласно типу гена соа. Их дифференцировали на два субклона, относящиеся к spa типам t-037 и t-030, различия между которыми характеризовались делецией 6-го повтора, и заменой одного нуклеотида в структуре 5-го повтора (табл.5). Данные секвенирования гена spa позволили нам подтвердить генетическое родство большинства клинических изолятов 4-ой коагулазной группы и штамма EMRSA-1.

Таблица 5

Структурный полиморфизм гена spa тестированных клинических изолятов MRSA и некоторых штаммов EMRSA

Второй кластер составили изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе. Их дифференцировали на 4 субклона, различия между которыми были обусловлены делециями разных нуклеотидных повторов (см. табл.5). При этом клинические изоляты, выделенные в 1998-2002. гг. в разных стационарах, имели профиль нуклеотидных повторов сходный, но не идентичный, обнаруженным у штаммов EMRSA-2 и EMRSA-12. Он также отличался от профиля повторов spa гена клинических изолятов, выделенных в 1990 г. в родильном доме г. Омска.

Было установлено, что MRSA первоначально дифференцированные согласно их соа типу, могли в дальнейшем отличаться структурой гена spa. Вместе с тем, каждый spa тип, обнаруженный у исследуемых клинических изолятов MRSA, был ассоциирован только с единственным coa типом. Выявленная корреляция полученных нами данных coa и spa типирования международных эпидемических штаммов MRSA с результатами их мультилокусного секвенирования, проведенного Enright М. et al. (2002), при котором также исследовались гены хромосомного «ядра», позволила нам установить принадлежность исследуемых изолятов всего лишь к нескольким эпидемическим штаммам, входящим в группу клонального комплекса СС8.

Проведенные эксперименты и последующее сопоставление полученных результатов с данными, представленными на web- сайтах, позволили заключить, что на основании изучения структурного полиморфизма генов coa и spa возможно выявление клонов S.aureus, к которым принадлежат эпидемические штаммы.

Идентификация генов и генных комплексов в составе мобильного генетического пула микробной клетки

Среди многочисленных МГЭ, обнаруженных в геноме S.aureus, наибольший интерес, по нашему мнению, представляли стафилококковые хромосомные кассеты mec (SCCmec) - геномные острова, несущие ген mecA и отсутствующие у MSSA, впервые выявленные в результате полного секвенирования геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S.aureus. Уже во время выполнения настоящей работы японскими исследователями были определены полные нуклеотидные последовательности и частично охарактеризованы несколько аллотипов SCCmec (I, II, Ш, IV), различающихся, как размерами, так и набором генов, составляющих кассеты (Ito T. et al., 2001; Okuma K. et al., 2002). Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих комплекс mec, участвующий в выражении гена mecA; аллотипах генов, кодирующих комплекс рекомбиназ ccrA и ссrB, обеспечивающих кассетам мобильность; а также генов, образующих структурные генетические области, обозначенные как J1, J2 и J3.

В результате проведенных нами исследований впервые было обнаружено, что:

· выделенные в стационарах России клинические изоляты содержат разные типы SCCmec;

· в одной микробной клетке могут присутствовать стафилококковые хромосомные кассеты различных аллотипов;

· существуют стафилококковые кассеты, несущие несколько генных комплексов, кодирующих синтез рекомбиназ различных типов;

· имеются стафилококковые кассеты, не несущие генов комплекса mec.

Было установлено, что изоляты, характеризующиеся одинаковым структурным полиморфизмом коагулазного гена, выделенные в стационарах различных регионов страны, содержат один и тот же тип SCCmec, в то время как изоляты, разных коагулазных групп, содержат разные типы mec ДНК. Клинические изоляты, отнесенные к 4-ой коагулазной группе, содержали SCCmec типа III; кроме того, у некоторых из них была идентифицирована не описанная ранее дефектная копия SCCmec типа IVb, не содержащая комплекса генов mec класса B, специфичных для данного типа кассет. Дополнительной особенностью этой кассеты было наличие области J1b, структура которой отличалась от ранее охарактеризованной Okuma K. et al. (2002), т.к. амплификация со специфичными праймерами приводила к образованию ампликона, размер которого на 200 н.п. был больше ожидаемого. клинический внутрибольничный staphylococcus aureus

Изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе, выделенные в 1998-2002 гг., несли молекулярные маркеры, характерные для кассет двух типов I и IVb. Выделенная из этих изолятов ДНК амплифицировалась с праймерами, выявляющими комплекс mec типа В, два различных комплекса генов, кодирующих синтез рекомбиназ (типов 1 и 2), область J1b, сходную по структуре с обнаруженной в дефектном элементе SCC, идентифицированном в изолятах, отнесенных к 3-ей коагулазной группе. Стабильная ассоциация молекулярных маркеров, присущих двум различным типам SCCmec, во всех изученных изолятах, выделенных в разное время в стационарах, расположенных в различных регионах страны, позволила заключить, что они присутствуют в составе композитного генетического элемента. Позднее композитные генетические элементы SCCmec были идентифицированы и другими исследователями (Chongtrakool P. et al., 2006).

Изоляты 5-ой коагулазной группы, выделенные в 1990 г. в родильном доме г. Омска, содержали SCC mec типа IVb.

Выявленные различия в структуре mec ДНК у клинических изолятов MRSA показали возможность их дифференциации на основании определения типа SCCmeс. Вместе с тем, было установлено, что изоляты, имеющие различный, но близкий профиль повторов spa гена, содержали один и тот же тип SCCmec. Это не позволяло сделать однозначных выводов о тождестве или различиях циркулирующих штаммов и требовало проведения дополнительных исследований.

Следующую группу молекулярных маркеров составили расположенные на МГЭ гены, детерминирующие синтез энтеротоксинов A, B, C и токсина синдрома токсического шока, т.е. те гены, продукты которых, обладают суперантигенной активностью (иначе называются пирогенные токсины суперантигены или PTSAgs), и могут оказать влияние на состояние иммунореактивности макроорганизма.

Проведенные исследования выявили вариабельность в наборе генов, детерминирующих синтез этих токсинов, у клинических изолятов, различающихся по результатам coa и spa типирования. Среди изолятов, выделенных в 1998-2002 гг. и отнесенных к 4-ой коагулазной группе, только единичные несли ген sea. Три из них принадлежали к spa типу t-030 (табл. 6).

Таблица 6

Результаты идентификации генов sea, seb, sec и tst в геноме клинических изолятов MRSA

Дата выделения	Число изученных клинических изолятов	Группа коагулазного гена	Тип SCC mec	Число изолятов, в геноме которых обнаружены гены
				sea	seb	sec	tst
1998-2002	29 51 Всего: 80	4 5	Ш SCC-CI	5 51 56	- - -	1 14 15	- - -
1986-1990	8 2 Всего: 10	4 5	Ш IVb	2 2 4	- 2 2	- - -	- - -

Все изоляты коагулазной группы 5 несли ген sea. Ген sec дополнительно несли изоляты spa типа t-008, тогда как ген seb - изоляты spa типа t-622, выделенные в 1990 г. Ни у одного из исследованных изолятов не обнаружили ген tst. При анализе содержания генов PTSAgs в геноме клинических изолятов MRSA, выделенных при бактериемии, было установлено, что 88% изолятов содержат ген sea (табл. 7). Кроме того, приблизительно треть изолятов дополнительно несли ген sec.

Исследование геномного полиморфизма клинических изолятов MRSA выявило, что каждый из исследованных маркеров позволяет дифференцировать клинические изоляты на группы и поэтому может быть использован для их типирования. Гены хромосомного «ядра» были выявлены у всех изолятов, тогда как гены, расположенные на мобильных генетических элементах, присутствовали в геноме лишь у части изолятов. Наблюдалась стойкая ассоциация молекулярных маркеров, расположенных на «добавочных» элементах, с определенным генетическим «бэкграундом».

Таблица 7

Результаты идентификации генов sea, seb, sec и tst в геноме клинически изолятов MRSA, выделенных при бактериемии

Число изученных клинических изолятов	Группа оагулазного гена	Тип SCCmec	Число изолятов, в геноме которых обнаружены гены
			sea	seb	sec	tst
7	IV	III (IVbd)	3	-	-	-
24	V	SCC-CI (I+IVbd)	24	-	8	-
Всего: 31	27	-	-	-

Поскольку изоляты MRSA, значительно отличающиеся по фенотипическим свойствам, выделенные в различных стационарах, расположенных в нескольких регионах страны, удавалось диффе...