Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов

Размещено на http://www.allbest.ru/

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов

Микшис Наталья Ивановна

Саратов - 2009

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

Член-корреспондент Российской Академии

медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент Российской Академии

наук, доктор медицинских наук, профессор Пименов Евгений Васильевич

Доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич

Доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»

Защита состоится «_____» _________________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46; e-mail: microbe@san.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан ____________________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский

1. общая характеристика работы

Актуальность исследования

Bacillus anthracis - грам-положительный, спорообразующий микроорганизм, вызывающий опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее восприимчивых животных и людей. Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий (Онищенко Г.Г., 2008). Расширение нозоареала патогенного микроорганизма, способного длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде, может привести к увеличению эпидемических проявлений сибиреязвенной инфекции (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Крупнейшая вспышка сибирской язвы в Зимбабве в 1978 - 1979 гг. охватила почти 10 тысяч человек и унесла около 450 жизней (Davies J., 1982, 1983, 1985). В России в период с 2003 по 2007 гг. было зарегистрировано 43 подтвержденных случая заболевания сибирской язвой людей, из них 3 - с летальным исходом (Государственный доклад, 2007; Онищенко Г.Г., 2008). Повышение уровня заболеваемости отмечалось в 2004 году - 16 случаев в 5 областях Российской Федерации (Ясинский А.А. с соавт., 2005).

Высокая патогенность сибиреязвенного микроба в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов, имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Redmond C. et al., 1998; Spencer R., Lightfoot N., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка контаминированной спорами B. anthracis корреспонденции вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек от легочной формы заболевания (Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Brachman P., 2002).

В системе ветеринарных и медико-санитарных мер, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по сибирской язве, центральное место принадлежит вакцинации сельскохозяйственных животных и людей. Наиболее длительный и напряженный иммунитет обеспечивают живые сибиреязвенные вакцины. Однократное подкожное введение одной дозы распространенной в мире ветеринарной вакцины B. anthracis Sterne 34F₂ защищает животных от заражения возбудителем сибирской язвы в течение года (Turnbull P., 1991). В России живая вакцина на основе штамма B. anthracis СТИ-1 используется для профилактики сибирской язвы у людей. В практике ветеринарной медицины применяется штамм B. anthracis 55, полученный специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята (Гаврилов В.А. с соавт., 1997). Существенным недостатком живых вакцин является относительно высокий уровень реактогенности (Turnbull P. et al., 1986; Ivins B. et al., 1990; Stepanov A. et al., 1996). Побочные эффекты связаны с воздействием на организм человека или животного токсичных продуктов жизнедеятельности вакцинных штаммов.

Рекомендованные для иммунопрофилактики живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. В геноме B. anthracis присутствуют высокомолекулярные репликоны - pXO1 и pXO2 (Mikesell P. et al., 1983; Green B. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды pXO2, детерминирующей синтез капсулы. В отсутствие капсулы сибиреязвенный микроб чувствителен к фагоцитозу и при попадании в макроорганизм не способен реализовать свой патогенный потенциал. Плазмида pXO1 содержит детерминанты, кодирующие синтез протективного антигена (ПА), отечного и летального факторов, входящих в состав экзотоксина бинарного действия. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, формируют токсичные комплексы, вызывающие структурные и функциональные изменения в восприимчивом организме (Leppla S., 1991). Вместе с тем, иммуногенный потенциал ПА сибиреязвенного микроба послужил основанием для создания на его основе химических вакцин.

Используемые в США и странах Западной Европы химические вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур B. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull P. et al., 1991). Именно с данными продуктами связывают аллергические реакции, возникающие почти у 30% вакцинированных в США людей (National communicable disease center, 1970; Swanson-Biearman B., Krenzelok E., 2001). Бесклеточные вакцины индуцируют выработку антител в высоких титрах и в ранние сроки, но для поддержания напряженного иммунитета необходимо проведение ревакцинаций.

В России для специфической профилактики сибирской язвы у людей и животных разработана также комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и бесклеточного препарата ПА адсорбированного на геле гидроокиси алюминия (Садовой Н.В. с соавт., 1998; Кожухов В.В. с соавт., 2002).

Достижения биологической и медицинской наук за последние несколько десятилетий изменили представления о средствах специфической профилактики инфекционных болезней. Развитие иммунологии, генетики и биохимии позволило приблизиться к разгадке тайн природы о клеточных и молекулярных механизмах взаимодействия макро- и микроорганизмов. В этих условиях аттенуированные штаммы утрачивают свою актуальность. В конструировании вакцин нового поколения на первый план выходят рекомбинантные технологии.

Кодирующий синтез ПА ген pag клонировали в штаммах различных бактериальных видов: Escherichia coli (Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Vodkin M., Leppla S., 1983; Gupta P. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001); B. subtilis (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Ivins B., Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998(а)); B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000); Francisella tularensis (Дармов И.В. с соавт., 1999); Salmonella typhimurium (Coulson N. et al., 1994; Garmory H. et al., 2003; Stokes M. et al., 2007) и Lactobacillus casei (Zegers N. еt al., 1999). В качестве экспрессирующих систем предлагались также вирусы (Iacono-Connors L. et al., 1991) и трансгенные растения (Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях удалось решить проблемы стабилизации гибридных молекул и оптимизации параметров экспрессии клонированных генов.

Отвечающие современным требованиям профилактические препараты должны разрабатываться с учетом всего арсенала накопленных знаний о структуре, свойствах, молекулярной природе, генетической детерминации, путях синтеза и регуляции факторов патогенности и иммуногенности инфекционного агента. Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы, целью которой является: разработка комплексного подхода к созданию средств специфической профилактики сибирской язвы на основе рекомбинантных технологий.

Задачи исследования:

1. На основании экспериментальных данных о факторах иммуногенности и патогенности возбудителя сибирской язвы хромосомной детерминации создать коллекцию оптимальных реципиентов для генетического конструирования штаммов-продуцентов биологически-значимых антигенов сибиреязвенного микроба.

2. Сконструировать стабильные авирулентные рекомбинантные штаммы-продуценты протективного антигена B. anthracis. Оценить эффективность продукции протективного антигена штаммами с клонированным геном pag.

3. Разработать условия безопасной и экологичной технологии получения протективного антигена сибиреязвенного микроба. Сконструировать стабильный аспорогенный рекомбинантный штамм-продуцент протективного антигена, перспективный для производства основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.

4. Оптимизировать экспериментальную схему выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах in vivo показать возможность применения рекомбинантного протективного антигена для осуществления специфической профилактики сибирской язвы.

5. Оценить иммуногенный потенциал белков S-слоя B. anthracis. Получить эффективные продуценты экскретируемого компонента S-слоя. Выделить, очистить, идентифицировать и охарактеризовать протеины Sap и ЕА1.

6. Изучить иммуногенность и остаточную вирулентность генно-инженерных штаммов в сравнении с лицензированными препаратами живых сибиреязвенных вакцин. Оценить перспективы рекомбинантных штаммов в плане создания на их основе менее реактогенных живых вакцин.

7. Определить основные направления использования генетически сконструированных штаммов и синтезируемых ими биологически значимых белковых продуктов.

Научная новизна исследования:

С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и применением рекомбинантных технологий разработана комплексная экспериментальная система, включающая: а) протеазодефицитные и аспорогенные реципиентные штаммы B. anthracis; б) сконструированные на их основе стабильные, эффективные и безопасные продуценты иммуногенных антигенов; в) перспективные для создания ареактогенной химической вакцины препараты протективного антигена и компонентов S-слоя; г) генно-инженерный штамм B. anthracis, являющийся прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.

Впервые получены стабильные и эффективные генно-инженерные продуценты ПА на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.

Разработаны условия безопасной и экологичной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Сконструирован не образующий спор стабильный рекомбинантный авирулентный штамм B. anthracis, продуцирующий ПА в 4 - 5 раз больше, чем вакцинные штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата ПА, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА_1Spo^-, обеспечивает защиту 100% животных от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования рекомбинантного штамма B. anthracis СТИТПА-1 для создания менее реактогенной и эффективной живой сибиреязвенной вакцины. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 10⁷ спор сконструированных штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/с.

Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя - Sap. Среди природных изолятов и аттенуированных производных B. anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания.

Показано, что условия температурной элиминации плазмид в лабораторных условиях способствуют возникновению спонтанных Sap^- мутаций.

На основании изучения вирулентности изогенных производных B. anthracis 81/1 установлено, что спонтанные мутации, приводящие к сочетанному нарушению протеолитической, гемолитической активности, пигментсинтеза и пигментсорбции не вызывают значительного изменения патогенности штаммов B. anthracis. Спонтанные мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением почти на два порядка степени патогенности штамма для беспородных белых мышей. Результаты изучения вирулентности спонтанных аспорогенных мутантов, инсерционного Spo^- мутанта и сконструированного Spo⁺ трансдуктанта свидетельствуют о влиянии на патогенность продуктов генов, находящихся в непосредственной близости от генов spo оперона или в функциональном взаимодействии с ними.

В основу эффективной селекции протеазодефицитных и аспорогенных штаммов B. anthracis положена выявленная корреляция экспрессии хромосомных признаков - протеолиза, гемолиза, пигментсорбции, пигментсинтеза и спорообразования.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации на изобретения: № 2321628 - рекомбинантный штамм B. anthracis СТИТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ТПА-1 Spo^- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2180349, № 2180916, № 2180917 и № 2180350 - аспорогенные штаммы B. anthracis, являющиеся продуцентами сибиреязвенных антигенов или реципиентами для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов; № 2193597 - способ получения аспорогенных штаммов B. anthracis.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована система штаммов B. anthracis, необходимая для изучения генетической детерминации факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы, направленного конструирования продуцентов биологически-значимых макромолекул, лабораторного и промышленного получения иммуногенных антигенов сибиреязвенного микроба. Она включает 25 бациллярных штаммов, в том числе: а) стабильные и эффективные рекомбинантные продуценты ПА сибиреязвенного микроба - B. anthracis СТИТПА-1 (КМ96), B. anthracis 55ДТПА-1 (КМ95) и B. subtilis WB600ПА-1 (КМ199); б) аспорогенный рекомбинантный продуцент ПА - B. anthracis 55TПА-1Spo^- (КМ97); в) продуценты белка S-слоя (Sap) - B. anthracis Sterne H1 и B. anthracis 71/12H2 (КМ87 и КМ88); г) коллекцию реципиентных бесплазмидных штаммов для экспериментов по генетическому конструированию - B. anthracis 55T (КМ92(2)) и его аспорогенный мутант (КМ92(3)), аспорогенный мутант B. anthracis СТИT (КМ91), инсерционный аспорогенный мутант B. anthracis SterneT (КМ90), спонтанный и инсерционный Sap^- мутанты B. anthracis SterneT (КМ93 и КМ94); д) коллекцию из 11 изогенных штаммов B. anthracis - ди-, моно- и бесплазмидных производных B. anthracis 81/1 (КМ86(1-11)), различающихся по степени выраженности хромосомных признаков: протеолитической, гемолитической активности, способностей к сорбции и синтезу пигмента, спорообразованию; е) спонтанные аспорогенные мутанты вакцинных штаммов B. anthracis Sterne 34F₂ и B. anthracis 55 (КМ89 и КМ92).

Перечисленные штаммы использовались при выполнении НИР "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2001 - 2002 гг.), "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.) в рамках Федеральных целевых научно-технических программ: «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера”, "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники". С применением депонированных штаммов проведены: хоздоговорная НИР с НИИ микробиологии МО РФ - "Получение аспорогенных производных вакцинных штаммов B. anthracis" (2000 г.), а также плановые НИР: "Изучение хромосомных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы" (1997 - 2001 гг.), "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (2006-2008 гг.). Аспорогенные штаммы B. anthracis (КМ89-92) применяются при проведении научно-технических разработок, проводимых в ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ» и ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».

Материалы диссертации вошли в практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (12.12.07 г.).

По материалам диссертации составлены методические документы, одобренные Ученым советом и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»: пособие для научных сотрудников - «Выделение в популяциях Bacillus anthracis фенотипов, различающихся по протолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию» (30.04.99 г.); методические рекомендации - «Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба» (17.04.07 г.) и «Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя» (27.06.07 г.).

Материалы диссертации представлены в лекционных циклах по генетике бактерий - на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб», на биологическом факультете Саратовского Государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С применением комплексного подхода, учитывающего дополнительные сведения о факторах иммуногенности и патогенности B. anthracis и использующего рекомбинантные технологии, создана экспериментальная система для конструирования сибиреязвенных вакцин. Ее компонентами являются: коллекция протеазодефицитных и аспорогенных бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis; генно-инженерные бациллярные штаммы с высокой продукцией биологически активного протективного антигена, в том числе - стабильный аспорогенный продуцент; очищенные препараты рекомбинантного протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба; высокоиммуногенный штамм B. anthracis с клонированным геном pag.

2. Рекомбинантные штаммы B. anthracis СТИТПА-1, B. anthracis 55ДТПА-1 и B. subtilis WB600ПА-1 - безопасные, стабильные и эффективные продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Генно-инженерные штаммы не содержат детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы, сохраняют биологические свойства при пассировании в селективных условиях и секретируют в пять раз больше иммуногенного антигена, чем вакцинные культуры B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.

3. Генно-инженерные штаммы с гибридным репликоном pUB110PA-1 обладают высокой иммунологической эффективностью. Однократная иммунизация биомоделей (мышей линии BALB/с, морских свинок) дозой 3 - 5 10⁷ спор рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИТПА-1и B. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие напряженного иммунитета с высокими значениями титров антител к протективному антигену и эффективно защищает от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.

4. Рекомбинантный аспорогенный штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo^-) при пассировании in vitro не реверсирует к спорообразующему фенотипу и в селективных условиях сохраняет способность к репликации гибридной плазмиды, определяя концепцию экологичной и безопасной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Генно-инженерный штамм синтезирует биологически активный протективный антиген - двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100% кроликов от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.

5. Белки S-слоя B. anthracis являются дополнительными факторами иммуногенности хромосомной детерминации на основании изучения протективных свойств очищенных белковых препаратов и изогенных Sap⁺ и Sap^- штаммов B. anthracis. Спонтанные или индуцированные мутации в штаммах B. anthracis, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на международных конференциях: 3-й международной конференции по сибирской язве (Плимут, Великобритания, 1998), 2-ой международной конференции по молекулярной биологии Bacillus cereus, Bacillus anthracis и Bacillus thuringiensis (Таос, Нью-Мексико, США, 1999), 1-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); на Российских конференциях: 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век» (Саратов, 2004); IX Всероссийской научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); ХХ Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); а также на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998) и ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000-2008).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 48 научных публикациях, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК изданиях, 16 тезисов в сборниках международных и Российских конференций, 7 патентов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 66 отечественных и 250 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 297 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 47-ю рисунками.

2. Содержание диссертации

Материалы и методы. При проведении собственных исследований было использовано 77 штаммов B. anthracis и 3 - B. subtilis, из них 48 - получены в ходе настоящего исследования.

В качестве питательных сред использовали бульон BHI («Difco», США), бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-агар (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости добавляли антибиотики: эритромицин (0,1 мкг/мл и 1 мкг/мл), линкамицин (25 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл), канамицин (25 или 50 мкг/мл), стрептомицин (25 мкг/мл). Для выделения сибиреязвенного токсина и белков S-слоя штаммы B. anthracis выращивали на среде (S-бульоне), предложенной J. Farchaus et al. (1995). Реакцию радиальной диффузионной преципитации ставили на казаминовой среде C. Thorne and F. Belton (1957) с добавлением сибиреязвенного -глобулина или кроличьих анти-ПА антител. Определение протеолитической, гемолитической активностей и способности к сорбции пигмента проводили на оригинальных средах с казеином, эритроцитами барана (кролика, морской свинки) и конго красным, соответственно. Работы с бактериофагом СP51ts45 осуществляли на питательном бульоне Nutrient broth («Difco», США) и средах для размножения, хранения и разведения фага (Thorne C. et al., 1968). В опытах по определению иммуногенности использовали морских свинок весом 300 - 350 г, беспородных белых мышей или мышей линии BALB/с весом 18 - 20 г. Для получения специфических антител к белковым препаратам использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг.

микробиологические и иммунологические методы. Определение видовых признаков сибиреязвенных штаммов проводили согласно регламентирующему документу - «Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей» (М., 1980). Для микроскопического исследования клеток штаммов B. anthracis суточную агаровую культуру засевали в BHI и инкубировали 3 часа с аэрацией при температуре 37 ⁰С. Определение протеолитической активности проводили после инкубации посевов при температуре 37 ⁰С в течение 24 часов. Через 48 часов инкубации на этой же среде регистрировали синтез желтого диффундирующего пигмента. Учет результатов на среде с эритроцитами проводили через 72 часа инкубации при температуре 37 ⁰С. Для оценки признака пигментсорбции культуру B. anthracis инкубировали при температуре 37 ⁰С в течение 18 часов, затем оставляли при комнатной температуре на 48 часов. Способность к споруляции определяли сравнением жизнеспособности прогретых (при температуре 65 ⁰С в течение 30 минут) и непрогретых культур. Дополнительно способность к образованию спор проверяли при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля.

Подготовку споровой взвеси сибиреязвенных культур, определение ЛД₅₀ и иммуногенности штаммов B. anthracis проводили согласно регламенту производства №831-98 вакцины сибиреязвенной живой, а также в соответствии с методическими рекомендациями - «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Индексы иммунитета определяли как отношение ЛД₅₀ заражающей культуры иммунизированных и интактных лабораторных животных. Для получения антител к белкам S-слоя применяли модифицированную схему J. Farchaus et al. (1995). Кроликов иммунизировали четырехкратно очищенными препаратами Sap или ЕА1 в дозе 100 мкг на инъекцию. Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 2 недели.

Генетические и молекулярно-генетические методы. Трансдукцию фагом СР51ts45 проводили согласно процедуре, описанной C. Thorne et al. (1968). Конъюгационные скннрещивания осуществляли на мембранных фильтрах по D. Lereclus et al. (1986) в модификации И.В. Брагина с соавт. (1990). Электростимулируемую трансформацию штаммов B. anthracis проводили по методике С.А. Еремина с соавт. (1990), штамма B. subtilis WB600 - по методу P. Brigidi et al. (1990). Для получения инсерционных мутантов, опосредованных интеграцией Tn917 в хромосому B. аnthracis, использовали разработанную нами ранее методику.

В экспериментах по элиминации резидентных плазмид из клеток B. аnthracis за основу были взяты методики P. Mikesell et al. (1983) и B. Green et al. (1985). Выделение ДНК высокомолекулярного репликона pXO1 осуществляли по методу R. Kaspar, D. Robertson (1987). ДНК плазмиды pUB110 из штамма B. subtilis выделяли с помощью коммерческого набора для выделения и очистки плазмид (QIAGEN, США). Выделение гибридных плазмид из штаммов B. anthracis осуществляли модифицированным способом C. Kado and S. Liu (1981). Результаты электрофорезов в агарозном геле сканировали с помощью гель-документирующей системы ViTran (Биоком, Россия). Полимеразную цепную реакцию в модификации И.Тучкова с соавт. (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательности гена pag. Рестрикцию выделенной плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ферментов Sigma (США) или MBI Fermentas (Литва). Для плазмиды pXO1 - 40 мкг ДНК инкубировали с 10 мкл фермента в 100 мкл рестрикционной смеси в течение 9 часов при температуре 37 ⁰С. После инкубации смесь прогревали при 65 ⁰С в течение 15 минут. Клонирование гена pag осуществляли по стандартным методикам (Маниатис Т. с соавт., 1984) с модификациями. Элюцию 6 т.п.н. фрагмента плазмиды pXO1 осуществляли по методу G. Dretzen et al. (1981). Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методикам, предложенным J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10% полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов. Концентрацию белка в препаратах определяли общепринятыми методами: по М. Брэдфорду (Практическая химия белка, 1989) и спектрофотометрически (Скоупс Р., 1985). Аминокислотный состав белков определяли по методике S. Moore, W. Stein (Практическая химия белка, 1989) на базе института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН России (г. Саратов). Хроматографическую очистку Sap осуществляли в соответствии с рекомендациями J. Farchaus et al. (1995). Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок с помощью SDS-буфера, очищали двухэтапной ионно-обменной хроматографией на гидроксиапатите. ПА выделяли из рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и 55ТПА-1(Spo^-). Хроматографическую очистку ПА проводили согласно рекомендациям C. Quinn et al. (1988) с модификациями. Ионобменную хроматографию препарата осуществляли на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет гель фильтрации на сефакриле 300 НR (Bio-Rad, США).

биофизические методы. Для электронной микроскопии препараты белков S-слоя предварительно дважды диализовали, окрашивали 1,5% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты или 2% раствором уранил-ацетата. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре 56 ⁰С в течение 10 минут. Подготовку препаратов для иммуноэлектронной микроскопии проводили согласно процедуре, описанной J. Farchaus et al. (1995), с собственными модификациями. Все препараты просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Мечение антител коллоидным золотом для иммуноэлектронной микроскопии проводили по методике Л.А. Дыкмана (1996). Регулярность ультраструктуры полученных протеинов подтверждали сканирующей атомно-силовой микроскопией (Коннов Н.П. с соавт., 2002).

Иммунохимические методы. Для анализа иммуноспецифичности препарата проводили иммуноблотинг по методу H. Towbin et al. (1979). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью дот-анализа и твердофазного ИФА (Фримель Г., 1987).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, А.А. Воробьевым (1962). Уровень значимости (Р) для различия между средними значениями вычисляли при помощи t критерия Стьюдента-Фишера.

Экспериментальные основы для создания эффективных сибиреязвенных вакцинных препаратов

Одна из первых задач настоящего исследования - осуществление поиска еще не идентифицированных факторов патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба, детерминируемых хромосомными генами. Прежде всего, нас интересовала перспектива получения оптимального реципиентного штамма B. anthracis для генетического конструирования продуцирующего ПА бациллярного рекомбинанта. Внимание было обращено на признаки протеолиза (Prt), гемолиза (Hly), пигментсорбции (CR), пигментсинтеза (Ydp) и спорообразования (Spo) возбудителя сибирской язвы, по версиям разных авторов коррелирующих с вирулентностью (Цыганкова О.И., 1993; Еремин С.А. с соавт., 1999; Uchida I., 1985; Koehler T. et al., 1992; Worsham P., Sowers M., 1993).

Протестировав 14 штаммов B. anthracis, выявили гетерогенность их популяций, выражающуюся в одновременном присутствии клонов с различной экспрессией перечисленных признаков. Отмечен координированный характер изменения свойств. Клетки, хорошо сорбирующие пигмент из среды роста, как правило, обладали высокой активностью протеолитических, гемолитических ферментов и синтезировали желтый пигмент - фенотип Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺. Отсутствие способности к сорбции конго красного сочеталось с нарушением протеолиза, гемолиза, пигментсинтеза - фенотип Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-. Аспорогенные клоны отличались морфологией колоний и характером роста в жидких питательных средах.

В ходе экспериментов было установлено, что гетерогенность популяций штаммов B. anthracis является следствием диссоциации отдельных клонов с фенотипом Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺. Образование промежуточных форм укладывается в явление фенотипической изменчивости (Головлев Е.Л., 1998). Появление стабильных при пассировании in vitro и in vivo вариантов Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ или Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo^-, скорее всего, результат мутационных событий, завершающих диссоциацию типичного штамма возбудителя сибирской язвы.

Обнаружено различие состава популяций природных вирулентных (преобладание фенотипа Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺) и аттенуированных (преобладание фенотипа Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ или Prt⁺Hly^-CR^-Ydp^-Spo^-) культур сибиреязвенного микроба (рис. 1). Штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis Wright были представлены исключительно клетками, не экспрессирующими тестируемые признаки (Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-).

Рисунок 1. Популяционная гетерогенность штаммов B. anthracis по признакам протеолитической, гемолитической активности и пигментсорбции. По оси абсцисс - обозначения штаммов B. anthracis: 1 - 81/1; 2 - М28; 3 - М29; 4 - И34; 5 - И35; 6 - И36; 7 - И38; 8 - И302; 9 - 17JB; 10 - Sterne 34F₂; 11 - 71/12; 12 - Pasteur; 13 - СТИ-1; 14 - Wright. По оси ординат - количество клонов определенного фенотипа в процентах от общего числа.

На основании изучения популяционных составов ди-, моно- (Cf или T) и бесплазмидных (pf) штаммов B. anthracis, представляющих 8 изогенных систем, установили, что в координации признаков протеолиза, гемолиза, синтеза и сорбции пигментов не участвуют плазмидные гены. Определение механизмов сочетанного изменения свойств заслуживает дальнейшего теоретического осмысления и экспериментального развития. Однако, исходя из задач исследования, приоритет был отдан определению корреляции экспрессии хромосомных признаков с вирулентностью возбудителя сибирской язвы.

С этой целью на основе природного изолята B. anthracis 81/1 сконструировали систему изогенных штаммов, различающихся по составу плазмид и экспрессии хромосомных признаков. Сравнивали вирулентность клонов с диаметрально противоположными фенотипами - Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺, Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺ и Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo^-. Диплазмидные производные тестировали на модели морских свинок, моноплазмидные (pXO1^-pXO2⁺) - белых мышей. В группе диплазмидных штаммов вирулентность изогенного производного с сочетанными нарушениями хромосомных признаков оказалась даже в 2 раза выше вирулентности исходного варианта - Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺. В группе моноплазмидных производных отмечали резкое снижение степени патогенности аспорогенного штамма - в 85 или в 1778 раз - для разных партий животных. Вирулентности клонов с фенотипами Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ и Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺ существенным образом не отличались.

Таким образом, сочетанное нарушение способностей к протеолизу, гемолизу, сорбции и синтезу пигментов - признаков, ассоциируемых ранее с вирулентностью возбудителя сибирской язвы, не приводит к значительным изменениям ЛД₅₀ для лабораторных животных (морские свинки, белые мыши). Спонтанные мутации, характеризующиеся изменением фенотипа на Spo^-, сопровождаются снижением на 2 - 3 порядка уровня патогенности моноплазмидных производных для белых мышей.

Для того, чтобы определить является ли обнаруженный факт общей тенденцией иди единичным случаем, осуществили генетическое моделирование вирулентности. Во-первых, в бесплазмидный аспорогенный вариант изогенной коллекции с помощью трансдукционного переноса ввели репликон pXO2 из донорного штамма B. anthracis. В экспериментах на белых мышах степень патогенности Spo^- трансдуктанта была в 63 раза меньше степени патогенности аналогичной контрольной спорообразующей конструкции. Восстановление функции образования спор посредством трансдукционной передачи хромосомных генов приводило к повышению показателя ЛД₅₀ приблизительно до уровня контрольного штамма. Во-вторых, сконструировали транспозонный аспорогенный мутант и, после генетической передачи в него репликона pXO2, определили значения ЛД₅₀ для белых мышей. В результате Spo^- вариант обладал в 10 раз меньшей вирулентностью, чем Spo⁺ контроль.

Все вышеизложенное позволило заключить, что мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, затрагивают детерминанты, вовлеченные в реализацию патогенных свойств сибиреязвенного микроба. И хотя, не образующие спор штаммы B. anthracis, ввиду значимости споровых антигенов для иммуногенеза, не имеют больших перспектив в плане создания менее реактогенных живых вакцин, они обладают явными преимуществами в качестве безопасных продуцентов иммуногенных антигенов.

Поэтому следующим этапом исследования было получение аспорогенных производных на основе вакцинных штаммов. Принцип селекции Spo^- мутантов базировался на использовании обнаруженной ранее корреляции признаков. В результате проведенных экспериментов удалось получить не образующие спор штаммы - B. anthracis Sterne 34F₂Spo^- (КМ89), B. anthracis 55Spo^- (КМ92), B. anthracis СТИTSpo^- (КМ91), B. anthracis SterneTPrt^-Spo^- (КМ90) и B. anthracis 55TSpo^- (КМ92(3)). Аспорогенность перечисленных культур сохранялась при культивировании in vivo, in vitro и после длительного хранения.

Моноплазмидные Spo^- варианты сибиреязвенных штаммов могут быть использованы как экологичные и безопасные продуценты сибиреязвенных антигенов, бесплазмидные - в качестве основ для их генетического конструирования. Преимущество практического применения аспорогенных культур заключается в нивелировании риска контаминации рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Необходимо отметить, что почти все полученные штаммы, за исключением B. anthracis КМ89, характеризуются низкой активностью протеолитических ферментов, что крайне важно для потенциальных продуцентов белковых антигенов.

Исходя из деградирующего действия собственных протеаз in vitro, возник вопрос - может ли экспрессия признака протеолиза влиять на функциональную активность ПА in vivo? Для ответа на него провели эксперименты с привлечением двух групп изогенных штаммов. Одна включала Prt^-Hly^-CR^- и Prt⁺Hly⁺CR⁺ фенотипы моноплазмидного (pXO1⁺pXO2^-) производного природного изолята B. anthracis 81/1, другая - такие же варианты вакцинного штамма B. anthracis Sterne 34F₂. Морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями тестируемых культур в дозах - 1,25 10⁵ и 8 10⁵ жизнеспособных спор - для изогенных вариантов на основе вирулентного и вакцинного штаммов, соответственно. Через 21 день после иммунизации биомоделей заражали тест-культурой B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского.

В результате, индексы иммунитета Prt⁺ производных вирулентного и вакцинного штаммов даже несколько превосходили показатели протективности изогенных Prt^- культур - в 8,0 и 1,3 раз, соответственно. С другой стороны, в поствакцинальный период от иммунизирующей дозы протеазопозитивных производных штаммов B. anthracis Sterne 34F₂ и 81/1 пало, соответственно, три и две морские свинки из 20-ти. На введение споровой взвеси протеазонегативных культур было по одному случаю летального исхода. Таким образом, собственные протеазы сибиреязвенного микроба могут несколько повышать протективность синтезирующих их штаммов, выступая, по-видимому, в роли дополнительных антигенов. В то же время, их функциональная активность ассоциируется с более высоким уровнем летальности иммунизированных биомоделей.

Обе эти тенденции подтверждают данные сравнительного изучения протективных свойств еще одного вакцинного штамма - B. anthracis СТИ-1, характеризующегося нарушенной способностью к деградации белковых субстратов. Ввиду отсутствия у него протеазопозитивного изогенного варианта, о чем упоминалось выше, сравнение проводили с Prt⁺ и Prt^- производными на основе B. anthracis Sterne 34F₂. В тех же условиях опыта индекс иммунитета B. anthracis СТИ-1 оказался еще меньше (приблизительно в 5 раз) чем у Prt^- варианта B. anthracis Sterne 34F₂. Летальности морских свинок в поствакцинальный период в этом случае отмечено не было.

Неожиданный интерес возник в связи с обнаруженным различием протективной активности двух протеазонегативных культур - B. anthracis Sterne 34F₂ и СТИ-1. Не является ли причиной почти пятикратного превышения индекса иммунитета штамма B. anthracis Sterne 34F₂ (Prt^-) наличие у него дополнительных иммуногенных антигенов? Подтвердить или исключить такую вероятность на данном этапе исследования не представлялось возможным. Однако в продолжение темы появились оригинальные предположения.

Иммунологическая эффективность белков S-слоя возбудителя сибирской язвы

Опыт работы со штаммами B. anthracis Sterne34F₂ и B. anthracis СТИ-1 показывает, что, несмотря на принадлежность к одному виду, они имеют некоторые фенотипические отличия. Наше внимание привлекло сообщение французских авторов, занимающихся исследованием S-слоя сибиреязвенного микроба, о фенотипических особенностях штаммов B. anthracis, дефектных по синтезу одного из компонентов поверхностной паракристаллической структуры. Как известно, S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap и ЕА1. In vitro микроорганизм сначала синтезирует Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на EA1, а освобождающийся протеин выходит в супернатант. Сконструированные I. Etienne-Toumelin et al. (1995) и S. Mesnage et al. (1997) Sap^- мутанты штамма B. anthracis Sterne34F₂ отличались от Sap⁺ клонов более крупными колониями, способностью к оседанию в бульоне в виде комочков и образованию очень длинных клеточных цепочек. Мы провели сравнительное микроскопическое исследование штаммов B. anthracis Sterne34F₂ и B. anthracis СТИ-1. Клетки выращивали в одинаковых условиях в жидкой питательной среде. Изучение с помощью светового микроскопа показало, что средняя длина микробной цепи, представленной клетками B. anthracis СТИ-1, более чем в двадцать раз превосходит таковую штамма B. anthracis Sterne 34F₂.

На основании совпадений феноменологий было сделано предположение, что у вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 нарушена экскреция протеина S-слоя - Sap. Сравнение белковых профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов B. anthracis СТИ-1 и Sterne34F₂ продемонстрирвало их различие. В супернатанте B. anthracis СТИ_1 отсутствовал белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе протеинов S-слоя возбудителя сибирской язвы (94 кДа). Протестировав 9 бесплазмидных штаммов сибиреязвенного микроба, выявили еще 4 культуры, непродуцирующие Sap в среду культивирования.

Анализ результатов белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов выявил также штаммы, активно экскретирующие белок Sap - B. anthracis SterneT, 55T, 71/12pf. Ввиду подверженности компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба протеолитической деградации, селектировали Prt^- варианты перечисленных культур.

Для выделения препаративных количеств белка S-слоя сибиреязвенного микроба, продуцируемого в среду выращивания (Sap), культуру B. anthracis 71/12pfPrt^- засевали в S-бульон и инкубировали при температуре 37 ⁰С с аэрацией в течение 18 часов. Хроматографическую очистку проводили с использованием различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q и гидроксиапатита. Выход белкового продукта составил 60 - 80 мг на 1 литр исходной культуры.

Для выделения компонента S-слоя, прочно связанного с клеточной стенкой (ЕА1), использовали штамм B. anthracis СТИT. Его культуру выращивали в BHI-бульоне при температуре 37 ⁰С с аэрацией в течение 18 часов. Разделение белков клеточного SDS-экстракта проводили при помощи разработанной методики двухэтапной ионообменой хроматографии на гидроксиапатите. Выход составил 80 мг протеина ЕА1 на 1 литр исходной культуры.

Идентификацию выделенных белков в качестве компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба осуществляли биохимическими, электронно-микроскопическими и иммуноэлектронно-микроскопическими методами исследования. Как известно, S-слои микроорганизмов состоят из регулярно организованных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц. Ультраструктуру белковых препаратов, полученных из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt^- и клеточного SDS-экстракта штамма B. anthracis СТИТ, исследовали с помощью электронного микроскопа. При нанометровом разрешении удалось выявить характерное для S-слоя регулярное строение белка - паракристаллическую решетку с упорядоченным расположением цилиндрических пор (рис. 2).

Для белков S-слоев различных микроорганизмов выявлены определенные соотношения аминокислот: значительное количество (40 - 60%) неполярных; равные доли (по 15%) кислых и основных; отсутствие (или наличие долей процента) метионина и цистеина (Sleytr U., 1978, 1997; Sara M., Sleytr U., 1996, 2000). Аминокислотный анализ выделенных нами протеинов показал содержание неполярных аминокислот у Sap - 53,5%, у ЕА1 - 43,3%. Соотношение кислых и основных для Sap - 16,3 и 20%, а для ЕА1 -17,3% и 18,8%. Метионин и цистеин в обоих белковых препаратах обнаружены не были.

Рисунок 2. Электронно-микроскопическая картина ультраструктур белковых препаратов, полученных: А - из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt^- (Sap), увеличение - в 200 000 раз; Б - из SDS-экстракта клеточных стенок штамма B. anthracis СТИT (ЕА1), увеличение - в 150 000 раз.

Локализацию антигенов Sap и ЕА1 на поверхности клеток подтверждали иммуноэлектронной микроскопией со специфичными мечеными антителами. Для этого кроликов иммунизировали очищенными белками Sap и ЕА1. Из кроличьих сывороток получали иммуноглобулины и метили их коллоидным золотом. Иммуносорбцию осуществляли на клеточных образцах 18-часовых культур штаммов B. anthracis SterneT и СТИT. После взаимодействия с антителами к ЕА1 клетки обоих штаммов были почти сплошь покрыты непроницаемой для электронов меткой (рис. 3). Меченые антитела к Sap активно сорбировались на поверхности клеток B. anthracis SterneT и в межклеточном пространстве - на конгломератах экскретируемого штаммом белка. В препаратах B. anthracis СТИT частицы коллоидного золота равномерно распределялась в поле зрения в виде единичных включений или небольших скоплений, специфической сорбции антител не отмечалось.