Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов

Иммунореактивность выделенных препаратов определяли также постановкой иммуноблота с кроличьими антителами к белкам S-слоя. Кроме очищенных протеинов в реакции иммуноблота исследовали культуральные фильтраты штаммов B. anthracis СТИT и SterneT. После окрашивания нитроцеллюлозной мембраны положительную реакцию взаимодействия со специфичными антителами к Sap и ЕА1 регистрировали для обоих белковых образцов и культурального фильтрата штамма B. anthracis SterneT (на уровне электрофоретической подвижности, соответствующей молекулярной массе 94 кДа). Образования иммунных комплексов в препарате культурального фильтрата штамма B. anthracis СТИT не отмечалось. Имевшие место перекрестные реакции между антигенами S-слоя возбудителя сибирской язвы объясняются высокой степенью их сродства.

Рисунок 3. Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штаммов B. anthracis СТИT (А) и B. anthracis SterneT (Б), обработанных мечеными антителами к белкам S-слоя - ЕА1 (А) и Sap (Б) (увеличение в 20000 и 25 000 раз).

На основании изложенного выше, протеины, выделенные из штаммов B. anthracis 71/12pfPrt^- и B. anthracis СТИT, по молекулярной массе, формируемым ультраструктурам, аминокислотному составу и расположению на клеточной поверхности идентифицированы как компоненты S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Высказанное нами предположение о нарушении у штамма B. anthracis СТИT продукции белка Sap подтвердилось данными иммуноэлектронной микроскопии и иммуноблота со специфичными антителами.

Изучение протективности очищенных препаратов Sap и ЕА1 проводили на модели морских свинок. Лабораторных животных иммунизировали очищенными препаратами Sap, ЕА1, и для сравнения - вакцинным штаммом B. anthracis. Контрольных животных оставляли интактными. Антигены вводили подкожно двукратно в дозе 25 и 50 мкг в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию споровой культурой B. anthracis Sterne 34 F₂ осуществляли однократно в дозе 1. 10⁶ спор. После периода, необходимого для формирования иммунитета (21 день), биомоделей заражали штаммом B. anthracis 2^ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах 1 · 10² - 1 · 10⁷ КОЕ.

В результате, значения ЛД₅₀ тест-заражающей культуры для морских свинок, иммунизированных белками Sap и ЕА1, оказались в 36,9 и 3,3 больше, чем тот же показатель для интактных животных. Преимущество в защитной способности в данном эксперименте принадлежало Sap. Иммуногенность вакцинного штамма, продуцирующего ПА, вполне предсказуемо почти на три порядка превышала иммуногенность белковых препаратов. Однако обращало на себя внимание, что даже в отсутствие основного иммуногена сибиреязвенного микроба, компоненты S-слоя в определенной степени защищали лабораторных животных.

Изучение влияния белков S-слоя на развитие адаптивного иммунитета in vivo осуществляли с использованием изогенной системы Sар⁺ и Sар^- вариантов B. anthracis SterneT. Мы предположили, что нарушение продукции Sар у штамма B. anthracis СТИ-1 - следствие спонтанных Sap^- мутаций, возникающих в процессе культивирования микроорганизма или температурной элиминации плазмид. Смоделировав в опыте соответствующие условия (42,5 ⁰С), осуществили поиск спонтанных Sap^- мутантов в популяции одного из вновь полученных бесплазмидных клонов. Прямая селекция по культурально-морфологическим признакам (как было предложено ранее) дала положительный результат. В данном случае для отбора 4-х спонтанных мутантов было протестировано всего 100 произвольных клонов. Отсутствие продукции белка Sар подтверждали данными белкового электрофореза, иммуноблота и иммуноэлектронной микроскопии.

Для изучения влияния Sap^- мутации на протективные свойства микроорганизма репликон pXO1 из донорного штамма B. anthracis передали посредством конъюгации в изогенные антибиотикорезистентные реципиенты на основе исходного штамма B. anthracis SterneT и его спонтанного Sap^- мутанта - B. anthracis SterneTSap⁺Sm^r и B. anthracis SterneTSap^-Sm^r. морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями трансконъюгантов в концентрации 1 · 10⁶ КОЕ. Через 21 день опытных и контрольных животных заражали культурой B. anthracis 2^ая вакцина Ценковского. Индекс иммунитета штамма на основе Sap^- мутанта оказался в 3 раза меньше индекса иммунитета Sap⁺ варианта. То есть, in vivo белок S-слоя способен усиливать протективную активность продуцирующего ПА штамма сибиреязвенного микроба.

В совокупности результаты, полученные при изучении защитных свойств белковых препаратов Sар и ЕА1, а также изогенных Sар⁺ и Sар^- штаммов B. anthracis, дают основания расценивать компоненты S-слоя возбудителя сибирской язвы как дополнительные факторы иммуногенности хромосомной детерминации. Это обстоятельство необходимо учитывать при селекции или конструировании штаммов сибиреязвенного микроба, претендующих на роль живых вакцин.

Конструирование бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба

В создании вакцин нового поколения приоритет отдается рекомбинантным технологиям. Генетическое конструирование позволяет манипулировать детерминантами синтеза и регуляции факторов иммуногенности и патогенности микроорганизмов, оказывая опосредованное действие на те или иные звенья иммуно- и патогенезов. Трудности возникают на пути обеспечения выраженной экспрессии клонированных генов и стабильности воспроизведения чужеродной генетической информации.

В успешном конструировании безопасных продуцентов иммуногенных антигенов немаловажную роль играет выбор реципиентной культуры и векторной плазмиды. На наш взгляд, для клонирования гена pag оптимальными системами являются протеазодефицитные бациллярные штаммы. Исходя из перспектив использования рекомбинантных штаммов для промышленного производства ПА, поиск реципиентов остановили на генетически охарактеризованном штамме близкородственного бактериального вида - B. subtilis WB600, и бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В качестве вектора, способного стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов, решили использовать плазмиду pUB110, характеризующуюся мультикопийностью, небольшим размером и наличием надежного селективного маркера. Выделенную из штамма B. anthracis Sterne 34F₂ плазмиду pXO1 обработали ферментом BamHI. Образовавшиеся рестрикты, размером от 4 до 25 т.п.н., разделили электрофоретически. Присутствующий среди фрагментов ДНК участок (6 т.п.н), содержащий ген pag (Vodkin M., Leppla S., 1983), элюировали из агарозного геля и лигировали с векторной плазмидой pUB110. Лигированный материал передали при помощи электростимулируемой трансформации в реципиентные клетки B. anthracis СТИT. Антибиотикорезистентные клоны селектировали на среде с сибиреязвенным -глобулином. Для трансформантов с положительной реакцией диффузионной преципитации изучали белковый состав культуральных фильтратов и плазмидные профили выделенных ДНК. После нескольких пассажей в селективных условиях был отобран клон, стабильно наследующий гибридный репликон. Рестрикционный анализ сконструированной плазмиды pUB110PA (~10,5 т.п.н.) показал ее соответствие теоретически возможному варианту включения фрагмента pXO1 в вектор pUB110 (рис. 4). По данным белкового электрофореза и реакции преципитации на среде с сибиреязвенным -глобулином рекомбинантный штамм B. anthracis СТИTПА продуцировал основной иммуноген сибиреязвенного микроба на уровне вакцинной культуры B. anthracis СТИ-1. Прецеденты создания более эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов ПА (Ivins B., Welkos S., 1986; Cohen S. et al., 2000) предопределили продолжение экспериментов.

Как известно, в процессе трансформации бациллярных штаммов с высокой частотой образуются делеционные производные гибридных молекул ввиду особенностей механизмов проникновения экзогенных молекул ДНК в компетентные клетки бацилл (Щелкунов С.Н., 1994; Hahn J., Dubnau D., 1985). Вероятно, с подобными рекомбинационными событиями мы столкнулись, пытаясь переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазмиду, стратегию клонирования и реципиентный штамм использовали те же, что и в первом случае. Однако при осуществлении селекции на среде с -глобулином были обнаружено несколько клонов, дающих необычно большие зоны диффузионной преципитации - почти в 10 раз превышающие значения, установленные для штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis СТИTПА. Интересно, что только часть селектированных трансформантов активно синтезировала ПА. Совершенно неожиданно среди изолированных рекомбинантов с большими зонами преципитации выявили клоны, продуцирующие белок S-слоя - Sap. Напомним, что реципиентный штамм не экскретировал Sap.

Рисунок 4. Схемы получения гибридных плазмид pUB110РА и pUB110РА_1. Стрелками обозначено начало и направление транскрипции гена pag.

Детерминация синтеза белков S-слоя осуществляется хромосомными генами, а регуляция - локализованными на pXO1 областями atxA и pagR. Возможно, в нашем случае в процессе клонирования произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции генов pag и sap - pagR область, находящуюся в непосредственной близости от структурного гена pagА (Hoffmaster A., Koehler T., 1999(а); Mignot T. et al., 2003). В то же время, восстановление способности к экскреции белка S-слоя у части трансформантов свидетельствует об интактности гена sap в штамме В. anthracis СТИТ и вовлеченности в мутационный процесс структур, отвечающих за секрецию антигена.

Определяя электрофоретическую подвижность гибридных ДНК, обнаружили репликон, размером 6,5 т.п.н., что на 4 т.п.н. меньше ожидаемого значения (рис. 4). Рестрикционный анализ ДНК плазмиды, обозначенной как pUB110PA_1, выявил протяженную делецию, распространяющуюся на нуклеотидные последовательности pUB110 и, возможно, область pagR. Наличие клонированного гена подвердили, осуществив ПЦР с праймерами на последовательности детерминанты синтеза ПА. Положительными следствиями произошедшей в pUB110PA_1 делеции стали, с одной стороны - стабильное функционирование генетической конструкции в составе клеток B. anthracis, с другой - высокий уровень продукции ПА штаммом В. anthracis СТИТПА-1, содержащим pUB110PA_1.

Успешный опыт воспроизвели на других реципиентах. Гибридный репликон pUB110PA-1 выделили из штамма В. anthracis СТИТПА-1 и электростимулируемой трансформацией передали в штаммы В. anthracis 55ТPrt^- и В. subtilis WB600. Изолированные трансформанты по результатам проведенного тестирования содержали плазмиду pUB110PA-1 и локализованный в ее составе ген pag. Клонированный ген хорошо экспрессировался в бациллярных клетках.

При помощи биохимических (белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов) и иммунохимических (реакция радиальной диффузной преципитации, иммуноблот, дот-анализ и твердофазный ИФА) методов исследования осуществили сравнительную оценку секреции ПА рекомбинантными штаммами и вакцинными культурами. Необходимые для иммунохимических реакций анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА, выделенным из штамма B. antracis СТИТПА-1. В результате проведенных исследований все генно-инженерные конструкции, вне зависимости от реципиентной основы, обладали одинаково высоким уровнем продукции ПА. В этой связи, необходимо вспомнить, что в эксперимент были взяты только реципиенты с низкой активностью протеолитических ферментов. На основании данных дот-анализа установлено, что продукция ПА штаммами B. anthracis СТИТПА-1 и B. anthracis 55ТПА-1 в 10 и 6 раз превышала его секрецию клетками соответствующих вакцинных культур - B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА: 80 - 90 мкг/мл - для рекомбинантов, и 15 - 20 мкг/мл - для вакцин. Высокая продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1, вероятнее всего является следствием увеличения числа копий гена pag за счет мультикопийности вектора, а также делеции в pagR области, отвечающей за негативную регуляцию синтеза ПА.

Для сконструированных штаммов B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 изучали стабильность репликации гибридной плазмиды in vitro и in vivo. Многократное пассирование культур рекомбинантных штаммов в присутствии селективного антибиотика не приводило к утрате репликона pUB110PA_1. В отсутствие селективного давления у всех штаммов отмечали постепенное нарастание темпов элиминации гибридной плазмиды после третьего суточного пассажа. После трехкратных пассажей рекомбинантных культур in vivo все исследованные культуры содержали плазмиду pUB110PA-1. Стабильность гибридного репликона, на наш взгляд, обеспечена правильным выбором вектора pUB110 и делецией сравнительно большой части нуклеотидных последовательностей в результате рекомбинационных изменений.

Совокупность свойств созданных штаммов B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 обуславливает их перспективность в качестве рекомбинантных продуцентов ПА сибиреязвенного микроба. Они могут быть использованы как для лабораторного, так и промышленного получения ПА, так как обладают высоким уровнем продукции ПА, низкой активностью протеолитических ферментов и стабильны при пассировании in vitro и in vivo. По сравнению с вакцинными штаммами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 рекомбинантные культуры секретируют в 5 раз больше иммуногенного антигена.

В соответствии с современной концепцией технология производства химических сибиреязвенных вакцин должна не только отвечать требованиям биологической безопасности, но и быть экологичной. Имея в виду данное обстоятельство, на следующем этапе исследования поставили задачу создания рекомбинантного продуцента ПА, промышленное и лабораторное культивирование которого не будет сопряжено с риском контаминации помещений и оборудования спорами возбудителя сибирской язвы, чрезвычайно устойчивых к действию факторов внешней среды и дезинфицирующих агентов.

С целью конструирования стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis с высоким уровнем продукции ПА и низкой активностью протеолитических ферментов, осуществили генетическую передачу гибридной плазмиды pUB110PA-1 в аспорогенный протеазодефицитный бесплазмидный реципиентный штамм B. anthracis 55ТPrt^-Spo^-. Исследование изолированных антибиотикорезистентных трансформантов на наличие рекомбинантного репликона pUB110PA-1, клонированного гена pag и активность протеолитических ферментов во всех случаях дало ожидаемые результаты. В процессе изучения стабильности трансформантов было отобрано три клона, сохраняющих гибридную плазмиду в селективных условиях и в течение нескольких пассажей (не более 3-х суток) на средах без антибиотика.

Сравнительную оценку уровней продукции ПА аспорогенными трансформантами проводили с помощью белкового электрофореза концентрированных препаратов культуральных фильтратов, реакции радиальной диффузной преципитации и дот-анализа с анителами к ПА. По результатам всех тестов Spo^- рекомбинанты секретировали больше ПА, чем исходный штамм B. anthracis 55. Один из клонов по уровню продукции ПА соответствовал спорообразующим генно-инженерным штаммам. На основании данных твердофазного ИФА клетки B. anthracis 55ТПА-1(Spo^-) экскретировали около 80 мкг/мл ПА.

На модели данного штамма оптимизировали технологию выделения и очистки рекомбинантного ПА. Прежде всего, внесли некоторые коррекции в процесс культивирования. В исследовательских целях штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo^-) выращивали на богатой питательной среде (S-бульоне) в атмосфере с повышенным содержанием СО₂, то есть, моделируя условия секреции ПА in vivo. Для промышленных масштабов среда с высоким содержанием дорогостоящих фирменных компонентов - триптона и дрожжевого экстракта, слишком затратна. В качестве альтернативы S-бульону предложен бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Наиболее важным оказалось наблюдение, что в отличие от культур, содержащих pXO1, продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1 (в том числе и аспорогенным) не зависит от СО₂, ввиду отсутствия у них области, детерминирующей синез СО₂ - зависимого транскрипционного регулятора - AtxA (Koehler T. et al., 1994; Hoffmaster A., Koehler T.,1997; Mignot T. et al., 2003).

Выделение ПА осуществляли из 24 часовой бульонной культуры B. anthracis 55ДТПА-1(Spo^-), выращенной с аэрацией при температуре 37 ⁰С. Культуральный фильтрат очищали при помощи ионообменой хроматографии на Macro Prep 50Q, и гель-фильтрации с использованием Sephacryl-HR300 (рис.5). В результате удалось достичь почти полного освобождения образца от сопутствующих примесей. Специфичность выделенного белка подтверждали постановкой реакции иммуноблота с антителами к ПА. Выход составил 12,8 мг препарата ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Получение высокоочищенного препарата ПА, не содержащего сопутствующих антигенов сибиреязвенного микроба, является важным шагом на пути конструирования профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов, отвечающих современным требованиям.

Перспективы практического использования рекомбинантных бациллярных штаммов и синтезируемых ими иммуногенных антигенов

антиген сибиреязвенный микроб вакцина

Рисунок 5. Результаты хроматографической очистки ПА, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного продуцента B. anthracis 55ДТПА-1Spo^-. Треки: 1 - культуральный фильтрат B. anthracis 55ДТПА-1Spo^-; 2 - этап очистки на Macro Prep 50Q; 3 - маркеры молекулярных масс (116,0; 97,0; 66,0; 45,0; 29,0 кДа); 4 - 11 - этап хроматографии на колонке с Sephacryl-HR300.

В задачи заключительного раздела исследования входило изучение биологических свойств рекомбинантного ПА. Оценку протективной активности генно-инженерных штаммов проводили с использованием различных биомоделей. Иммунизацию осуществляли однократно, подкожно. Иммунизирующая доза тестируемых штаммов для мышей линии BALB/с составила 3 10⁷ спор, морских свинок - 5 10⁷. Через 21 день опытных и интактных животных заражали тест-штаммом B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах.

На модели мышей линии BALB/с тестировали культуры B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакцинными препаратами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В поствакцинальный период пало 50% линейных мышей, иммунизированных штаммом B. anthracis 55. Препарат B. anthracis СТИ-1 в иммунизирующей дозе вызвал развитие летального процесса у одной особи. Рекомбинантные штаммы не обладали остаточной вирулентностью. Ввиду превышения допустимого порога летальности при иммунизации, индекс иммунитета и ЛД₅₀ для штамма B. anthracis 55 не определяли. Значение ЛД₅₀ тест-штамма для интактных мышей составило 6,8 10³ спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 6,8 10⁵ спор - для B. anthracis СТИТПА-1; 4,6 10⁵ - для В. subtilis WB600ПА-1; и 3,2 10⁵ спор - для В. anthracis 55ТПА-1. Тот же показатель ЛД₅₀ для контрольного штамма B. anthracis СТИ-1 оказался сопоставимым со значениями, установленными для рекомбинантов - 8,6 10⁵ спор тест-штамма. Соответственно, индексы иммунитета распределились в следующем порядке: для B. anthracis СТИ-1 - 125,9; B. anthracis СТИТПА-1 - 100,0; В. subtilis WB600ПА-1 - 68,1; для В. anthracis 55ТПА-1 - 46,4.

На модели морских свинок изучали протективную активность штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакциной B. anthracis СТИ-1. В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма B. anthracis СТИ-1 пало семь животных из двадцати взятых в эксперимент (35%). Летальности лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными штаммами, отмечено не было. Для интактных животных значение ЛД₅₀ тест-штамма составило 1,3 10³ спор. Для морских свинок, иммунизированных штаммами B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, этот показатель оказался на 4 порядка выше - 3,2 10⁷ спор. Вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 обеспечивал более эффективную защиту морских свинок - ЛД₅₀ тест-штамма - 2 10⁸ спор. Индекс иммунитета коммерческой вакцины составил 158480. Индексы иммунитета штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 оказались одинаковыми - 25117, при требовании не менее 20000 для культуры, претендующей на роль сибиреязвенной вакцины. С одной стороны, различие в значениях индексов иммунитета рекомбинантов и контрольного штамма объяснимо техническими особенностями подготовки спор в лабораторных и промышленных условиях. С другой, оно может являться следствием отсутствия у генно-инженерных штаммов детерминант, обуславливающих cинтез ОФ и ЛФ (Pezard C. et al., 1995).

Для подтверждения способности рекомбинантных штаммов вызывать иммунологическую перестройку в организме иммунизированных животных, определяли динамику титра антител. В иммуноферментном анализе исследовали сыворотки крови, взятые на 24-е, 28-е, 32-е и 36-е сутки после введения им дозы 5 10⁷ спор тестируемых штаммов B. anthracis СТИДТПА-1 и B. anthracis СТИ-1. Кроме того, исследовали напряженность иммунитета через два, три, три с половиной и четыре месяца от начала эксперимента. Проанализировав данные, полученные для двух групп животных (по три особи на штамм), выявили следующие закономерности. Титры анти-ПА антител у морских свинок, иммунизированных штаммом B. anthracis СТИДТПА-1, в среднем были выше, чем у биомоделей вакцинированных B. anthracis СТИ-1. В случае рекомбинантного штамма B. anthracis СТИДТПА-1 титр антител к ПА нарастал к 36-му дню. В случае B. anthracis СТИ-1 максимальный титр отмечали на 32-е сутки, к 36-му дню происходило некоторое его уменьшение. Начиная с 2 месяцев после иммунизации, титры анти-ПА антител в обеих группах постепенно снижались до средних значений 1:1024 - для вакцинного штамма, и 1:512 - для рекомбинантного. В таком соотношении они оставались до конца 4-го месяца наблюдения.

Все вышеиложенное свидетельствует о высокой иммунологической эффективности сконструированных штаммов. Рекомбинантные штаммы выгодно отличаются от контрольных вакцинных препаратов, ввиду отсутствия у них остаточной вирулентности в отношении использованных в экспериментах биомоделей. На основании сравнения индексов иммунитета, первенство в обеспечении защиты лабораторных животных принадлежит штамму B. anthracis СТИДТПА-1. На наш взгляд, его «родословная» в сочетании с приобретенными в результате генетического конструирования преимуществами являются основанием расценивать данный рекомбинантный штамм как прототип эффективной и безопасной сибиреязвенной вакцины.

Помимо определения иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов изучали протективную активность белкового препарата ПА, выделенного из аспорогенного продуцента B. anthracis 55ДТПА-1(Spo^-). Лабораторных животных (кроликов) иммунизировали очищенными сибиреязвенными антигенами - ПА и ЕА1, в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Белок S-слоя ЕА1 добавляли в некоторых случаях к ПА, исходя из его иммуногенногенного и иммуномоделирующего действия. Инъекции осуществляли парентерально, двукратно с интервалом в 14 дней. Кроликам первой группы вводили по 50 мкг ПА, второй - по 50 мкг каждого из белков - ПА и ЕА1, третьей - 5 · 10⁷ спор штамма B. anthracis СТИ_1 (однократно). Контрольную группу оставляли интактной. В конце поствакцинального периода определяли титры антител к ПА в сыворотках крови иммунизированных животных. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствовали о формировании напряженного иммунитета во всех случаях. Выявлены более высокие титры анти-ПА антител у кроликов, иммунизированных белковыми препаратами. Через 21 день после последней инъекции животных заражали 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1. Все интактные особи пали от сибиреязвенной инфекции на третьи сутки. Кролики, иммунизированные ПА или ПА + ЕА1, а также споровой взвесью вакцинного штамма - выжили. Признаков заболевания не отмечали ни в одном из случаев.

Способность рекомбинантного ПА в сравнительно небольшой дозировке обеспечивать защиту 100% биомоделей от заражения вирулентным штаммом B. anthracis предопределяет главное направление его практического использования - создание средств специфической профилактики сибирской язвы. Высокоочищенный белковый препарат с ярко выраженными протективными свойствами по праву претендует на роль основного компонента современной химической вакцины. Существенный уровень защиты лабораторных животных при одновременном введении ПА и белка S-слоя является серьезным поводом для продолжения работ по совершенствованию рецептуры сибиреязвенной вакцины.

Таким образом, проведенные нами исследования заложили прочный фундамент в успешное решение актуальной задачи получения эффективных и ареактогенных сибиреязвенных вакцин, соответствующих реалиям и возможностям 21-го века.

Преимущества использования генно-инженерных продуцентов заключаются в безопасных и экологичных технологиях получения ПА сибиреязвенного микроба. На основе очищенного рекомбинантного иммуногенного антигена возможно создание менее реактогенных химических вакцин. Сконструированный штамм B. anthracis СТИТПА-1 является оптимальной моделью для улучшенной живой сибиреязвенной вакцины. Экономический эффект от внедрения соответствующих профилактических препаратов будет связан с повышением эффективности вакцинации против сибирской язвы и снижением частоты возникновения побочных реакций.

Выводы

1. С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы и применением рекомбинантных технологий разработаны экспериментальные основы для решения проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин. Многокомпонентная система включает: коллекцию реципиентных штаммов B. anthracis для генетического конструирования, представленную бесплазмидными производными с низкой активностью протеолитических ферментов, нарушением экскреции белка Sap и отсутствием способности к образованию спор; высокоиммуногенные и низкореактогенные генно-инженерные бациллярные штаммы; спорообразующие и аспорогенные рекомбинантные продуценты протективного антигена; высокоочищенные препараты протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба.

2. На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных бациллярных штаммов созданы генно-инженерные продуценты - B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, по уровню синтеза протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходящие вакцинные культуры B. anthracis СТИ_1 и B. anthracis 55. Рекомбинантные штаммы содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-1 (6,5 т.п.н.) и стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo.

3. Сконструированные генно-инженерные штаммы обладают высокой иммунологической эффективностью: в иммунизирующей дозе (3 10⁷ спор) они обеспечивают защиту мышей линии BALB/с от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 10⁷ спор штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Штаммы с клонированным геном pag не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/с и морских свинок, в отличие от вакцинных культур B. anthracis 55 и B. anthracis СТИ-1. Созданный на основе B. anthracis СТИ-1 штамм B. anthracis СТИТПА-1 является прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.

4. Для создания безопасных и экологичных технологий производства сибиреязвенных профилактических и диагностических препаратов сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - B. anthracis 55ТПА-1(Spo^-). Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-1, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов. Уровень продукции ПА аспорогенным рекомбинантом составляет около 80 мкг/мл.

5. Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерными продуцентами. Из аспорогенного штамма B. anthracis 55ТПА-1(Spo^-) получен препарат протективного антигена, перспективный в качестве основного компонента химической сибиреязвенной вакцины. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного протективного антигена обеспечивает защиту 100% кроликов от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

6. Бесплазмидные производные штаммов B. anthracis при культивировании in vitro различаются по способности к экскреции белка S-слоя - Sap. Получены экспериментальные доказательства нарушения продукции Sap у штамма B. anthracis СТИT. В качестве источников белка Sap предложены протеазонегативные штаммы B. anthracis SterneTPrt^- и 2^ая вакцина Ценковского pf Prt^-. На основании изучения протективных свойств очищенных препаратов белков S-слоя и изогенных Sap⁺ и Sap^- штаммов B. anthracis установлено, что белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенными факторами сибиреязвенного микроба при определяющей роли протективного антигена.

7. Получены высокоочищенные препараты белков S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Протеины идентифицированы как компоненты S-слоя B. anthracis на основании молекулярных масс, выявленной паракристаллической ультраструктуры, особенностей аминокислотного состава, иммунореактивности и локализации на поверхности клетки.

8. На основании результатов экспериментов по моделированию вирулентности установлено, что спонтанные или индуцированные Spo^- мутации в штаммах B. anthracis приводят к снижению на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей. Выяснено отсутствие влияния экспрессии хромосомных признаков протеолиза, гемолиза, пигментсорбции и пигментсинтеза на вирулентность сибиреязвенного микроорганизма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Микшис Н.И., Степанов А.С., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Выделение спонтанных мутантов вирулентного штамма Bacillus anthracis с координированными изменениями синтеза хромосомных генов и влияние плазмидного состава на частоту их образования // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тезисы докладов 2-ой Всероссийской конференции. - Саратов, 1998. - С. 48.

2. Степанов А.С., Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Изучение феномена внутриштаммовой гетерогенности возбудителя сибирской язвы // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тезисы докладов 2-ой Всероссийской конференции. - Саратов, 1998. - С. 66.

3. Mikshis N., Yeremin S., Shevchenko O., Bolotnikova M., Stepanov A. Influence of chromosome mutations on Bacillus anthracis virulence // 3^rd Internetional Conference on Anthrax (19 - 21 September). University of Plymouth. England. - 1998. - P. 61.

4. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В., Болотникова М.Ф., Липницкий А.В., Барков А.М. Влияние спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность возбудителя сибирской язвы // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных болезней. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С. 165-166.

5. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф., Михеева Т.А., Степанов А.С. Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis // Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. № 1722 - В.98.

6. Степанов А.С., Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Выяснение участия детерминантов, локализованных в составе хромосомы B. anthracis, в реализации патогенных свойств возбудителя сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1999. - № 1. - С. 20-23.

7. Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1999. - № 4. - С. 25-28.

8. Микшис Н.И., Степанов А.С., Шевченко О.В., Еремин С.А. Изучение феномена внутриштаммовой гетерогенности возбудителя сибирской язвы //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1999. - № 3. - С. 78-79.

9. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В., Болотникова М.Ф. Выделение спонтанных мутантов Bacillus anthracis, различающихся по протеолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 1999. - С. 13.

10. Mikshis N., Bolotnikova M., Yeremin S., Popov Yu. Search of Bacillus anthracis chromosome determinants of virulence // The 2^nd International workshop of the molecular biology of Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis. Taos, New Mexico, USA (August 11-13). - 1999. - P. 10.

11. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В. Изучение вирулентности рекомбинантного штамма Bacillus anthracis, полученного в результате трансдукционной передачи хромосомных генов из штамма Bacillus cereus // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000. - № 4. - С. 12-15.

12. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дармов И.В., Дроздов И.Г. Получение аспорогенных штаммов B. anthracis // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2001. - С. 8.

13. Попов Ю.А., Микшис Н.И. Сибиреязвенные вакцины // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - №1(83). - С. 21-36.

14. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Получение спонтанных и индуцированных аспорогенных мутантов Bacillus anthracis // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2002. - С. 16-17.

15. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П. Изучение хромосомных факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2002. - С. 29-30.

16. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В., Дармов И.В. Патент РФ на изобретение № 2180349 - штамм Bacillus anthracis КМ89 - продуцент сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №7 от 10.03.2002 г.

17. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180916 - штамм Bacillus anthracis КМ92 - продуцент сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №9 от 27.03.2002 г.

18. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180917 - штамм Bacillus anthracis КМ90 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №9 от 27.03.2002 г.

19. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180350 - штамм Bacillus anthracis КМ91 - основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №7 от 10.03.2002 г.

20. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2193597 - способ получения аспорогенного штамма Bacillus anthracis (варианты) // Бюллетень №33 от 27.11.2002 г.

21. Микшис Н. И., Болотникова М. Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Еремин С. А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Получение аспорогенных штаммов Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2003. - № 1. - С. 3-11.

22. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Корсакова А.Ю., Данилова Т.В., Микшис Н.И., Мантуров А.О., Кузнецов О.С., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Трансмиссионная электронная и сканирующая силовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 2(88). - С. 34-36.

23. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Подборонова Н. В., Полунина Т.А. Выделение белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 1 (87). - С. 48 - 50.

24. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А. Характеристика белков S-слоя возбудителя сибирской язвы // Молодые ученые в медицине: Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции. - Казань, 2004. - С. 130.

25. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Болотникова М.Ф., Киреев М.Н. Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 156 - 157.

26. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Иммуноэлектронная микроскопия для характеристики белков S-слоя Bacillus anthracis // Материалы ХХ Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2004. - С. 238.

27. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Электронно-микроскопическое исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Материалы ХХ Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2004. - С. 239.

28. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Клонирование pag гена в протеазо-дефицитных бациллярных штаммах // Молекулярная медицина и биобезопасность: Материалы 1 Международной конференции.- Москва, 2004. - С. 131 -133.

29. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Иммуногенность белков S-слоя Bacillus anthracis // Молекулярная медицина и биобезопасность: Материалы 1 Международной конференции. - Москва, 2004. - С. 130-131.

30. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Дроздов И.Г. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 22-32.

31. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов с клонированным геном pag // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005. - С. 164-166.

32. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Клюева С.Н. Иммунологическая эффективность генетически сконструированных бациллярных штаммов, продуцирующих протективный антиген сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2005. - Вып. 2(90). - С. 58 -59.

33. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Корсакова А. Ю., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Шулепов Д.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Брандзишевский Ю.В., Полунина Т.А. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2005. - С. 41.

34. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Киреев М.Н., Попов Ю.А. Выделение и очистка протективного антигена из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis // Окружающая среда и здоровье: Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Суздаль, 2005 г. - С. 212-213.

35. Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А. Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Суздаль, 2005 г. - С. 164-167.

36. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Сравнение уровней продукции протективного антигена вакцинным и рекомбинантными штаммами Bacillus anthracis // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005. - С. 166-168.

37. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Корсакова А.Ю., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Щуковская Т.Н., Киреев М.Н., Брандзишевский Ю.В., Коннов Н.П. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2006. - С. 51.

38. Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В, Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Селекция стабильных и эффективных рекомбинантных продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - Вып. 1 (91). - С. 38-41.

39. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 1. - С. 29 -32.

40. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Экспрессия гена синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба в рекомбинантных бациллярных штаммах // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 84.

41. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Конструирование рекомбинантного аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 83-84.

42. Попов Ю.А., Микшис Н.И. Перспективы создания новых вакцинных препаратов для профилактики сибирской язвы // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 91-92.

43. Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Попов Ю.А., Микшис Н.И. Оценка приобретенного иммунитета против сибирской язвы по степени повреждения лейкоцитов крови in vitro анатоксином // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 1 (97). - С. 81-85.

44. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Получение высокоочищенного препарата протективного антигена из рекомбинантного аспорогенного штамма Bacillus anthracis // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы Межгосударственной научно-практической конференции. - Саратов, 2007. - С. 320-321.

45. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Комплекс методических подходов к определению протективного антигена сибиреязвенного микроба // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2007. - С. 16.

46. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 3. - С. 15-21.

47. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Кудрявцева О.М. Патент РФ на изобретение № 2321628 - рекомбинантный штамм B. anthracis СТИТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюллетень №10 от 10.04.2008 г.

48. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. Патент РФ на изобретение № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ТПА-1 Spo^- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюллетень №10 от 10.04.2008 г.

Размещено на Allbest.ru