Иммунопатогенез и иммунологические критерии прогрессирования хронического вирусного гепатита С

Исследование субпопуляций естественных киллеров (CD3-CD16+56+, CD3-CD8+), выполняющих цитотоксическую функцию в противовирусном и противоопухолевом иммунитете, показало, что изменение количества CD3-CD16+56+ NK клеток в зависимости от стадий ХГС не носило закономерного характера. По сравнению со здоровыми лицами, содержание CD3-CD16+56+ NK клеток на начальных стадиях заболевания несколько снижалось, а затем повышалось у больных с тяжелым фиброзом. У пациентов с циррозом печени (Ф 4), в целом, наблюдалось уменьшение числа CD3-CD16+56+ лимфоцитов. В то же время, при проведении отдельного анализа у больных группы Ф 4, с различной степенью компенсации цирроза, было выявлено снижение медианы относительного содержания CD3-CD16+56+ NK клеток у больных с компенсированным циррозом (Ме=3,15) и увеличение значений количества NK клеток на стадии декомпенсированного цирроза (Ме=11,6). По мере прогрессирования заболевания, характеризующегося возрастанием степени фиброза печени, было обнаружено постепенное снижение содержания CD3-CD8+ NK-лимфоцитов, хотя достоверных отличий между группами в уровне этих клеток не было установлено. По сравнению со здоровыми лицами зафиксировано статистически значимое (p<0,05) уменьшение абсолютного числа CD3-CD8+ клеток практически на всех стадиях ХГС (Ф 2, Ф 3, Ф 4). Снижение в ПК количества NK-клеток, позитивных по CD8-антигену (CD3-CD8+), может быть использовано в качестве дополнительного критерия прогрессирования заболевания у больных ХГС. В свою очередь, содержание в ПК CD3-CD16+56+ NK-клеток на разных стадиях хронического гепатита, изменялось у больных ХГС как в сторону снижения, так и повышения. По-видимому, уменьшение уровня субпопуляций естественных киллеров (CD3-CD8+, CD3-CD16+56+), а также Т-киллеров (CD3+CD16+56+) на начальных стадиях ХГС могло быть связано с дефицитом основного активатора NK-клеток ? IL-2, либо с миграцией NK-клеток в печень, со снижением их содержания в ПК. В связи с этим, можно предположить, что у больных со слабым и умеренным фиброзом печени (Ф 1, Ф 2), ввиду снижения эффективности цитотоксического Т-клеточного ответа, обусловленного смещением иммунного баланса в сторону Th2, основную роль в уничтожении инфицированных вирусом гепатоцитов играют NK-клетки и Т-киллеры. Выявленная тенденция к увеличению числа NK-клеток (CD3-CD16+56+) на поздних стадиях заболевания (Ф 3, стадия декомпенсированного цирроза) совпадает с данными литературы, свидетельствующими об увеличении NK-клеток в ПК больных ХГС и наличии прямой корреляции между содержанием этих клеток и ИГА, а также фиброзом печени [Panasiuk A. et al., 2003]. В связи с этим, возрастание уровня естественных киллеров (CD3-CD16+56+) у пациентов с компенсированным циррозом печени может служить маркером прогрессирования болезни, характеризуя переход из компенсированного в декомпенсированный цирроз печени. Обнаруженное увеличение в ПК CD3-CD16+56+ NK клеток у больных с декомпенсированным циррозом, по-видимому, обусловлено активацией и увеличением, как в сыворотке крови, так и в ткани печени уровня цитокинов Th1, в частности IFN-, являющегося, наряду с IL-2, основным индуктором цитотоксической активности различных субпопуляций киллерных клеток.

Количественные изменения субпопуляций естественных киллеров могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 4 и 5).

Таблица 4

Характеристика частоты изменений содержания субпопуляций NK-клеток периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Примечание: N ? норма в 90%-100% случаев; ^ ? выше нормы в 15-30% случаев; ^^ ? выше нормы в 30-60% случаев; ^^^ ? выше нормы в более чем 60% случаев; v ? ниже нормы в 15-30% случаев; vv ? ниже нормы в 30-60% случаев; vvv ? ниже нормы в более чем 60% случаев

Наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного количества субпопуляции NK-клеток с фенотипом CD3-CD8+ ХГС (таблица 5).

Таблица 5

Изменения уровней субпопуляций NK-клеток периферической крови у больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания

Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей ? "N" ? значения соответствуют "норме"; ^ ? повышение значений показателя на 10% выше нормы; v ? уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; vv ? уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; vvv ? уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

При изучении В-клеточного звена иммунной системы статистически значимые (p<0,05) различия, связанные с повышением относительного содержания CD19+ В-лимфоцитов в ПК больных ХГС, были обнаружены при сравнении групп Ф 2-Ф 4 со здоровыми лицами. Это согласуется с исследованиями других авторов [Mаммаев С.Н., 2001; Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Morita K. et al., 2005]. В то же время, достоверных отличий в количестве В-лимфоцитов между группами больных с ХГС не было зафиксировано. При проведении сравнительного анализа между больными с компенсированным (Ме=8,8%) и декомпенсированным (Ме=12,8%) циррозом (группа Ф 4) было выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение относительного числа CD19+ В-клеток у пациентов с декомпенсированным циррозом печени. Кроме этого, у больных этой группы (Ф 4) установлена прямая корреляция между процентным содержанием СD19+ клеток и степенью компенсации цирроза (r=0,71; p=0,019). Считается, что повышение в ПК больных ХГС количества СD19+ В-лимфоцитов свидетельствует о сдвиге иммунного ответа в сторону Тh2 [Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Mаммаев С.Н., 2001; Morita K. et al., 2005]. По данным ряда авторов, развитие Th2 ответа при ХГС (неэффективного для полной элиминации вируса) является неадекватной реакцией иммунной системы [Жукова, 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. В других работах активацию гуморального звена иммунитета при ХГС объясняют как реакцию организма, направленную на снижение воспалительной активности и сдерживание развития цирроза [Racanelli V. et al., 2001]. По данным наших исследований, несмотря на некоторое повышение СD19+ В-лимфоцитов у больных ХГС, отмечалось постепенное снижение относительного числа CD3-CD25+ активированных В-лимфоцитов. У больных с тяжелым фиброзом (Ф 3) наблюдалось статистически значимое снижение (р<0,05) количества CD3-CD25+ клеток, как по сравнению с пациентами со слабым фиброзом (Ф 1), так и со здоровыми лицами. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что у больных ХГС с высокой степенью фиброза, несмотря на увеличение содержания В-клеток, число активированных В-лимфоцитов не повышается [Ni J. et al., 2003]. По-видимому, это связано с разобщением процессов пролиферации В-лимфоцитов и их активации антигенами HCV, в связи, с чем происходит накопление в периферической крови наивных неактивированных В-клеток. При сравнительном анализе групп больных ХГС (Ф 1-Ф 4) по количеству В-лимфоцитов, экспрессирующих СD95-антиген (CD19+CD95+), статистически значимых различий выявлено не было. В то же время, относительное содержание CD19+CD95+ лимфоцитов у больных на всех стадиях ХГС было достоверно выше (р<0,05), чем у здоровых лиц. Повышение CD19+CD95+ В-клеток в группах Ф 1 и Ф 2 наблюдалось в 46,2% случаев, Ф 3 и Ф 4 - в 30% и 22,2%, соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что частота выявления увеличенного содержания CD95-позитивных В-клеток понижается с ростом степени фиброза. Также, как и в случае прямой взаимосвязи содержания CD95+ лимфоцитов с уровнем CD25+ Т-хелперов и ЦТЛ, с помощью корреляционного анализа была обнаружена положительная умеренная связь (r=0,48; р=0,001) между содержанием CD95+ лимфоцитов и активированных СD3-CD25+ В-клеток. На основании этого, можно предположить, что повышенная экспрессия CD95-антигена служит целям контроля субпопуляции активированных лимфоцитов.

Таким образом, можно констатировать, что на начальных стадиях ХГС происходит смещение иммунного баланса в сторону Тh2-ответа, что является одной из составляющих механизма, препятствующего повреждению печени цитотоксическими лимфоцитами и сдерживающего развитие фиброза. При низкой концентрации антигена В-клетки выполняют, главным образом, роль АПК, так как другие типы антигенпредставляющих клеток не могут захватить достаточное для представления количество антигенного материала [Ройт А., 2000]. Поскольку в данном исследовании у больных ХГС со слабым (Ф 1) и умеренным фиброзом (Ф 2) низкая вирусная нагрузка наблюдалась в 52,9% и 40% случаев, соответственно, можно предположить, что у этих пациентов роль АПК выполняли, главным образом, В-лимфоциты. Представляя антиген, В-клетки стимулировали нулевые Т-хелперы к дифференцировке в Th2-клетки, вырабатывающие цитокины необходимые для дальнейшей реализации В-клеточного иммунитета. В то же время, повышение количества В-лимфоцитов у больных с высокой степенью фиброза, по-видимому, происходило за счет аккумуляции наивных В-клеток, так как число активированных В-лимфоцитов не увеличивалось, а снижалось. В этой связи, увеличение В-клеток на начальных стадиях болезни можно считать благоприятным, а на поздних стадиях - неблагоприятным признаком, характеризующим прогрессию заболевания. В свою очередь, уменьшение относительного числа активированных В-лимфоцитов (CD3-СD25+) у больных ХГС, по-видимому, следует расценивать как прогностически неблагоприятный признак.

Количественные изменения со стороны субпопуляций В-клеток могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 6 и 7).

Таблица 6

Характеристика частоты изменений содержании субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Примечание: N ? норма в 90%-100% случаев; ^ ? выше нормы в 15-30% случаев; ^^ ? выше нормы в 30-60% случаев; ^^^ ? выше нормы в более чем 60% случаев; v ? ниже нормы в 15-30% случаев; vv ? ниже нормы в 30-60% случаев; vvv ? ниже нормы в более чем 60% случаев

Таблица 7

Изменения уровней субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови у больных ХГС, как критерии прогрессирования заболевания

Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей ? "N" ? значения соответствуют "норме"; ^^ ? повышение значений показателя на 20% выше нормы; ^^^ ? повышение значений показателя на 30% выше нормы; v ? уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; vv ? уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; vvv ? уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

Из таблицы 7 видно, что наиболее значимым для прогноза течения заболевания является снижение относительного содержания субпопуляции активированных В-клеток с фенотипом CD3-CD25+.

Определение концентраций иммуноглобулинов классов M, A, G и подклассов IgG (IgG1-IgG4) в сыворотке крови показало, что максимальные концентрации IgМ, IgА и IgG отмечались у больных с циррозом печени. Статистически значимые различия (p<0,05) в содержании IgG и IgM у пациентов с циррозом (Ф 4) были зафиксированы по сравнению с другими больными ХГС (Ф 1-Ф 3) и группой здоровых лиц. В результате корреляционного анализа были установлены прямые статистически значимые умеренной силы взаимосвязи между стадией заболевания и концентрацией IgA (r=0,26; p=0,018), а также IgG (r=0,24; p=0,027). Определение подклассов IgG (IgG1-IgG4) в сыворотке крови проводилось только у больных на начальных стадиях ХГС (Ф 1, Ф 2). При сравнении этих групп было обнаружено достоверное различие (p<0,05), связанное с повышением концентрации подклассов иммуноглобулина G (IgG2, IgG3 и IgG4) у пациентов с умеренным фиброзом (Ф 2). Поиск корреляций между стадией заболевания и содержанием в сыворотке крови различных подклассов IgG позволил обнаружить прямую различной силы корреляционную зависимость концентраций IgG2, IgG3 и IgG4 от выраженности фиброза в печени. При этом наиболее сильная взаимосвязь наблюдалась между степенью фиброза печени и уровнем IgG3 (r=0,43; p=0,000), а также были выявлены прямые умеренные статистически значимые корреляции содержания IgG2 (r=0,32; p=0,005) и IgG4 (r=0,38; p=0,007) подклассов с фиброзом в печени. Полученные в результате сравнительного и корреляционного анализов данные свидетельствовали о нарастающей активации В-клеточного иммунного ответа по мере прогрессирования HCV-инфекции. В то же время, статистически значимых корреляционных взаимосвязей между содержанием В-лимфоцитов (CD19+), активированных В-лимфоцитов (CD3-CD25+) с одной стороны и уровнями иммуноглобулинов основных классов IgA, IgG и IgM с другой, не было обнаружено.

Максимальные значения уровней ЦИК всех трех видов наблюдались у больных с циррозом печени (Ф 4). Только у этих пациентов, по сравнению с другими группами больных ХГС (Ф 1-Ф 3), отмечалось статистически значимое увеличение уровней как среднемолекулярных, так и низкомолекулярных ЦИК, которые превышали пределы нормы у больных группы Ф 1 в 56,3%, Ф 2 - в 47,8%, Ф 3 - в 60%, а Ф 4 - в 100% случаев. При анализе взаимосвязи степени фиброза и содержания различных типов ЦИК в сыворотке крови были выявлены прямые умеренные корреляционные связи уровней среднемолекулярных (r=0,37; p=0,007) и низкомолекулярных (r=0,26; p=0,047) ЦИК и стадии заболевания. Известно, что низкомолекулярные ИК могут избегать захвата фагоцитами, так как менее эффективно фиксируют комплемент и, за счет этого, хуже связываются с рецепторами для комплемента на мембранах эритроцитов. В результате чего они способны циркулировать в крови более длительное время и образовывать депозиты под эндотелием сосудов, так как в отличие от высокомолекулярных ЦИК, могут проникать сквозь базальную мембрану [Фрейдлин И.С. и соавт., 1999]. В связи с этим, выявленное повышение в сыворотке крови уровня низкомолекулярных ИК у больных ХГС может быть одним из условий развития у этой категории больных иммунопатологических реакций, что согласуется с литературными данными об ассоциации HCV-инфекции с рядом аутоиммунных заболеваний [Лесняк О.М. и соавт., 1999].

Изменения гуморальных факторов В-клеточного звена иммунной системы также могут служить дополнительными лабораторными критериями прогрессирования ХГС (таблица 8 и 9). Из таблицы 9 видно, что наиболее значимым для прогноза заболевания у больных ХГС является нарастание в сыворотке крови концентраций иммуноглобулинов классов А, G, подклассов IgG (IgG2-IgG4) и всех типов ЦИК (таблица 9).

Таблица 8

Характеристика частоты изменений концентраций иммуноглобулинов классов М, А, G, подклассов IgG (IgG1-IgG4) и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Примечание: N ? норма в 90%-100% случаев; ^ ? выше нормы в 15-30% случаев; ^^ ? выше нормы в 30-60% случаев; ^^^ ? выше нормы в более чем 60% случаев; v ? ниже нормы в 15-30% случаев; vv ? ниже нормы в 30-60% случаев; vvv ? ниже нормы в более чем 60% случаев

В целом, полученные данные свидетельствуют об активации В-клеточного звена иммунной системы, связанной с прогрессированием ХГС, и тесной взаимосвязи изменений гуморального иммунитета, обусловленных иммунопатогенезом заболевания. Они согласуются с данными большинства исследователей, подтверждая выводы об увеличении количества В-лимфоцитов (CD19+) в периферической крови и наличии обратной корреляции между содержанием всех циркулирующих В-клеток и частью В-клеток, экспрессирующих активационные маркеры [Лесняк О.М. и соавт., 1999; Racanelli V. et al., 2001; Ni J. et al., 2003; Morita K. et al., 2005]. Этот рост общего числа В-лимфоцитов у больных ХГС связывают с активацией гуморальных факторов иммунной системы и сдвигом в сторону Тh2 ответа [Mаммаев С.Н., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Наследникова И.О. и соавт., 2005; Morita K. et al., 2005]. Выявленные в процессе исследования снижение содержания активированных В-лимфоцитов (СD3-CD25+) в ПК, повышение концентраций IgA, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, а также уровней средне- и низкомолекулярных ЦИК в сыворотке крови, коррелирующие со степенью фиброза печени у больных ХГС, позволяет сделать вывод о возможности их использования в качестве иммунологических критериев прогрессирования хронической HCV-инфекции.

Таблица 9

Изменения концентраций иммуноглобулинов классов А, G, подклассов IgG (IgG2-IgG4) и ЦИК в сыворотке крови у больных ХГС как критерии прогрессирования заболевания

Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей ? ^ ? повышение значений показателя на 10% выше нормы; ^^ ? повышение значений показателя на 20% выше нормы; ^^^ ? повышение значений показателя на 30% выше нормы

Известно, что цитокины являются продуктами активированных клеток иммунной системы и действуют как растворимые медиаторы межклеточных взаимодействий. Покоящиеся клетки практически не продуцируют цитокины. В данном исследовании в сыворотке крови больных ХГС с различной степенью фиброза были изучены изменения следующих цитокинов: IFN-, IFN-, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10 и TNF-. В результате было установлено, что у больных ХГС по мере прогрессирования заболевания отмечалось повышение содержания в сыворотке крови IFN-, IL-10 и TNF-. Увеличение концентрации IFN- было характерно, в основном, для более поздних стадий заболевания (Ф 3, Ф 4), что подтверждалось статистически значимыми различиями между группами больных ХГС Ф 1 и Ф 4 (р<0,05), а также Ф 2 и Ф 4 (р<0,05). Значения медианы (Ме) уровня IFN- в исследуемых группах составили: здоровые - Ме=7,43 пг/мл, Ф 1 - Ме=9,96 пг/мл, Ф 2 - Ме=11,86 пг/мл, Ф 3 - Ме=12,1 пг/мл, Ф 4 - Ме=21,02 пг/мл. Была выявлена прямая статистически значимая связь (r=0,25; р=0,05) между степенью фиброза и содержанием IFN-. Полученные результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что уровень IFN- в сыворотке крови при циррозе печени и ГЦК превышает таковой при ХГС [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Navas S., Martin J., 1998; Huang Y.S. et al., 1999; Kawakami Y. et al., 2001]. Также есть данные, что прогрессирующее повреждение печени при ХГС коррелирует с увеличением уровня внутрипеченочных цитокинов Th1-типа (IFN-) [Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. Учитывая тот факт, что изменение баланса цитокинов Th1/Th2 на локальном и системном уровне носит однонаправленный характер, определение сывороточной концентрации IFN- в динамике у конкретного больного можно использовать как маркер прогрессирования ХГС.

Такие же закономерности были характерны для уровней IL-10, концентрация которого в сыворотке крови увеличивалась с ростом степени фиброза. Об этом свидетельствовали статистически значимые различия между группами Ф 1 и Ф 4 (р<0,05), а также достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием IL-10 и стадией заболевания (r=0,25; р=0,048). Наряду с этим наблюдалась тенденция к возрастанию частоты случаев отклонения от нормы концентрации IL-10 на поздних стадиях заболевания (Ф 1 - в 9%, Ф 2 - в 36,4%, Ф 3 - в 35,7% и Ф 4 - в 55,6% случаев). Полученные данные согласуются с результатами других авторов [Наследникова И.О. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Abaily B. et al., 2003] и позволяют рекомендовать определение сывороточной концентрации IL-10 для дифференцирования стадий заболевания.

У больных ХГС обнаружено связанное с ростом степени фиброза печени повышение содержания TNF- в сыворотке крови. Так, статистически значимые различия в концентрации TNF- были установлены между группами больных ХГС Ф 1 и Ф 2 (р<0,01), Ф 1 и Ф 3 (р<0,05), Ф 1 и Ф 4 (р<0,01). При корреляционном анализе выявлена прямая сильная взаимосвязь между степенью фиброза и уровнем TNF- (r=0,41; р=0,000). На основании этих данных, которые также согласуются с литературными [Логинов А.С. и соавт., 2003; Собчак Д.М. и соавт., 2004; Красавцев Е.Л. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005], можно сделать вывод, что определение в динамике содержания TNF- в сыворотке крови больных ХГС может быть использовано как лабораторный критерий дифференциальной диагностики заболевания.

При анализе содержания IL-4 и IL-1 в сыворотке крови больных ХГС статистически значимых отличий между различными группами больных ХГС не было выявлено. В тоже время, у значительной части больных отмечалось увеличение концентрации этих цитокинов. Так, в группах Ф 1-Ф 4 повышение содержания IL-4 наблюдалось у 63,6%, 30%, 57,1% и 25% больных ХГС, а уровня IL-1 ? в 22,2%, 23,5%, 50% и 28,6% случаев, соответственно. Несмотря на отсутствие значимых отличий между больными ХГС групп Ф 1-Ф 4, установлена прямая корреляционная взаимосвязь между степенью фиброза и содержанием IL-1 (r=0,25; р=0,041). На основании этих данных, согласующихся с литературными [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Логинов А.С. и соавт., 2003; Красавцев Е.Л. и соавт., 2005; Скляр Л.Ф. и соавт., 2005] можно предположить, что увеличение концентрации IL-1 в сыворотке крови больных (Ф 1, Ф 2) отражает прогрессию ХГС на начальных стадиях заболевания.

Уровни цитокинов могут быть использованы в качестве дополнительных критериев дифференцирования стадий ХГС (таблица 10).

Таблица 10

Характеристика частоты изменений концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХГС на различных стадиях заболевания

Примечание: N ? норма в 90%-100% случаев; ^ ? выше нормы в 15-30% случаев; ^^ ? выше нормы в 30-60% случаев; ^^^ ? выше нормы в более чем 60% случаев; v ? ниже нормы в 15-30% случаев; vv ? ниже нормы в 30-60% случаев; vvv ? ниже нормы в более чем 60% случаев

Изменения концентраций IL-10, TNF- и IFN- в сыворотке крови на любой стадии ХГС могут рассматриваться в качестве критериев прогноза заболевания (таблица 11).

Таблица 11

Изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови у больных ХГС, как критерии прогноза заболевания

Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей ? ^ ? повышение значений показателя на 10% выше нормы; ^^ ? повышение значений показателя на 20% выше нормы; ^^^ ? повышение значений показателя на 30% выше нормы

Поскольку IL-4 и IL-10 являются цитокинами Th2-типа и участвуют в реализации В-клеточного иммунитета, можно сделать предположение о доминировании гуморального иммунного ответа у больных ХГС, имеющих повышенные концентрации этих цитокинов в сыворотке крови. Полученные данные свидетельствуют о высокой продукции противовоспалительных цитокинов в условиях персистенции HCV, что согласуется с результатами других авторов [Логинов А.С. и соавт., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Приймяги Л.C. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М. и соавт., 2003; Fan X.G. et al., 1998]. По-видимому, на начальных этапах заболевания биологическое значение функциональных изменений в иммунной системе, обусловленных преобладанием продукции интерлейкинов Th2-типа, состоит в сдерживании репликации вируса, а также ограничении интенсивности и распространенности воспаления в печени. В свою очередь, на поздних стадиях ХГС, продолжающееся повышение уровней IL-4 и IL-10, вызванное постоянной антигенной стимуляцией, реализуется активным фиброгенезом и прогрессированием заболевания. Нарастание уровней цитокинов Тh2-типа (IL-4 и IL-10) часто было взаимосвязано с увеличением концентрации таких провоспалительных цитокинов как IL-1 и TNF-. Более выраженное повышение уровня провоспалительных цитокинов на поздних стадиях ХГС (у больных групп Ф 3, Ф 4) отмечалось и другими исследователями, обнаружившими их увеличение у больных с циррозом печени и ГЦК [Дьяченко А.А. и соавт., 2001; Huang Y.S. et al., 1999].

Таким образом, рост концентраций IL-1в и TNF-б происходил в соответствии со степенью выраженности патологического процесса в печени и, вероятно, прогрессией ХГС, в целом. Обнаруженное в результате исследования увеличение у больных ХГС концентрации в сыворотке крови цитокинов Th2-типа (IL-4, IL-10), провоспалительных цитокинов (IL-1в, TNF-б), связанное с возрастанием степени фиброза, позволяет использовать их в качестве дополнительных лабораторных критериев прогноза заболевания. Повышение IFN- (цитокина Th1-типа) на поздних стадиях ХГС (Ф 3, компенсированный цирроз) свидетельствует о его возможном участии в патогенезе повреждений печени при хронической HCV-инфекции. Необходимо еще раз отметить, что IFN-, (также как и IL-2) является основным индуктором цитотоксической активности различных субпопуляций киллерных клеток, среди которых, могут быть клоны аутореактивных эффекторных клеток, участвующих в реализации аутоиммунных реакций. В связи с этим, определение концентрации IFN- также может служить признаком прогрессирования болезни.

Роль нейтрофилов в противовирусном иммунитете реализуется участием в модуляции иммунных реакций через синтез и продукцию иммуномодуляторных цитокинов. Изучая изменения функциональной активности нейтрофилов, можно охарактеризовать воздействие вирусов и оценить устойчивость организма к бактериальной инфекции [Тотолян, Фрейдлин И.С., 2000]. Исследования показали, что по сравнению со здоровыми лицами для всех больных ХГС (группы Ф 1-Ф 4) было характерным незначительное повышение активности кислородзависимых систем бактерицидности (НСТ) и снижение переваривающей функции нейтрофилов (ПЗФ). Наиболее значимым было постепенное снижение значений лизосомально-катионного теста (ЛКТ) по мере прогрессирования фиброза печени у больных ХГС. Это подтверждалось статистически достоверными различиями (р<0,05) между больными групп Ф 1 и Ф 4. Анализ показал, что с ростом степени фиброза ФЧ статистически значимо уменьшалось (r=-0,26; p=0,016), а ПЗФ - увеличивался (r=0,25; p=0,025). В результате корреляционного анализа были установлены статистически значимые обратные умеренные взаимосвязи между процентным содержанием в ПК нейтрофилов и уровнем спонтанного НСТ теста (r=-0,27; p=0,018), и ЛКТ (r=-0,25; p=0,032). Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХГС в ответ на снижение в ПК количества нейтрофилов происходит компенсаторное повышение активности кислородзависимых и кислороднезависимых систем бактерицидности фагоцитов. Таким образом, при изучении активности систем бактерицидности нейтрофилов было установлено, что у больных ХГС наблюдается активация кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов. На начальных стадиях заболевания (Ф 1, Ф 2) отмечается усиление активности кислороднезависимых систем бактерицидности и поглотительной способности нейтрофилов. В дальнейшем, по мере прогрессирования фиброзного процесса происходит их постепенное снижение до нормы и затем ниже. В тоже время, отмечалась прямая корреляция между уровнем ПЗФ и стадией заболевания. Так, у больных с высокой степенью фиброза (Ф 3 и Ф 4) переваривающая способность нейтрофилов достоверно увеличивалась по сравнению с пациентами с начальными стадиями фиброза печени (Ф 1, Ф 2). По-видимому, это связано с компенсаторным повышением функциональной активности нейтрофилов на поздних стадиях заболевания.

Настоящее исследование продемонстрировало, что расширенный вариант иммунологического обследования (таблица 12) позволяет использовать изменения иммунной системы для дифференцирования стадий ХГС. Так, ключевыми иммунологическими показателями при дифференцировании I и II стадии ХГС являются IgG3, IL-10, CD3-CD25+ (рисунок 1). Для дифференциальной диагностики III стадии ХГС и компенсированного цирроза печени необходимо определять содержание CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, TNF-б, IFN-г, IgM, IgG (рисунок 2). Для дифференциации степени компенсации цирроза печени у больных ХГС необходимо исследовать содержание CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+CD4+/CD3+CD8+ (рисунок 3). На основании первичного иммунологического обследования можно определить преобладающий характер иммунного ответа (Th1- или Th2-типа) и прогнозировать вероятный темп прогрессирования заболевания (рисунок 4). Выявленные в настоящем исследовании связи между факторами иммунной системы и степенью фиброза, позволяют использовать характерные изменения некоторых иммунологических показателей в качестве критериев прогрессирования заболевания (таблица 13).

Таблица 12

Характеристика частоты изменений наиболее информативных иммунологических показателей у больных ХГС на различных стадиях заболевания (расширенный вариант иммунологического обследования)

Примечание: N норма в 90%-100% случаев; ^ выше нормы в 15-30% случаев; ^^ выше нормы в 30-60% случаев; ^^^ выше нормы более 60% случаев; v ниже нормы в 15-30% случаев; vv ниже нормы в 30-60% случаев; vvv ниже нормы более 60% случаев

Таблица 13

Перечень иммунологических критериев прогрессирования заболевания у больных ХГС

Примечание: Прогностически неблагоприятные величины показателей ? "N" ? значения соответствуют "норме"; ^ ? повышение значений показателя на 10% выше нормы; ^^ ? повышение значений показателя на 20% выше нормы; ^^^ ? повышение значений показателя на 30% выше нормы; v ? уменьшение значений показателя на 10% ниже нормы; vv ? уменьшение значений показателя на 20% ниже нормы; vvv ? уменьшение значений показателя на 30% ниже нормы

В настоящее время возраст в момент инфицирования рассматривается многими исследователями в качестве наиболее весомого предиктора течения HCV-инфекции. Установлено, что при заражении в возрасте старше 40 лет отмечаются более быстрые темпы прогрессии ХГС с реализацией в цирроз печени [Ильина Е.Н. и соавт., 2001; Царегородцева Т.М. и соавт., 2003; Poynard T. et al., 1997]. В настоящем исследовании у больных возрастной группы 40-60 лет были выявлены статистически значимые корреляции между возрастом пациента и содержанием CD3+CD16+56+ Т-киллеров (r=0,41; p=0,000), активированных Т-хелперов CD4+CD25+ (r=0,33; p=0,038), цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+HLA-DR+ (r=0,31; p=0,049) ПК, а также уровнем в сыворотке крови низкомолекулярных ЦИК (r=0,33; p=0,023).

Наряду с этим, повышение низкомолекулярных ЦИК также сочеталось с ростом активности АлАТ (r=0,30; р=0,039) и высокой вирусной нагрузкой (r=0,49; р=0,02). Эти данные свидетельствуют о том, что более быстрое прогрессирование заболевания у больных старше 40 лет связано с активацией Т-клеточного иммунитета.

Помимо изучения изменений иммунной системы у больных ХГС с различной степенью фиброза проводилось иммунологическое исследование пациентов с генотипами HCV 3а и 1b. В литературе отсутствуют данные о взаимосвязи субтипа HCV c исследованными в представленной работе иммунологическими параметрами.

В результате изучения Т-клеточного звена иммунной системы было установлено, что у больных ХГС с генотипом HCV 1b по сравнению с пациентами, имеющими субтип HCV 3а, отмечалось статистически значимое повышение содержания активированных СD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов (р<0,05) и CD3+CD16+56+ Т-киллеров (р<0,05). Этот факт был подтвержден данными корреляционного анализа, зафиксировавшим у пациентов с генотипом HCV 1b наличие взаимосвязи с более высоким содержанием CD3+CD16+56+ Т-киллеров (r=0,29; р=0,05) и CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов (r=0,37; р=0,011), в отличие от больных с субтипом HCV 3а. Исследование В-клеточного звена иммунной системы показало, что по сравнению с больными с генотипом HCV 3а у пациентов c субтипом HCV 1b статистически значимо (p<0,05) увеличивалась концентрация среднемолекулярных ЦИК. Поиск корреляций показал, что более высокие уровни всех типов ЦИК ассоциировались с генотипом HCV 1b. Таким образом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у больных с генотипом HCV 1b наблюдаются более выраженные изменения иммунной системы: увеличение содержания CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, ЦИК всех типов, по сравнению с больными ХГС, имеющими субтип HCV 3а. Как уже было показано, именно, эти факторы иммунной системы были связаны со степенью выраженности фиброза и старшим возрастом. Вполне вероятно, что выявленные в результате исследования изменения иммунной системы у больных ХГС с генотипом HCV 1b обусловлены большей степенью выраженности фиброза и возрастными особенностями, характерными для этой группы больных.

Выводы

1. Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности у больных ХГС со слабой и умеренной степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, а также CD3-CD16+56+, CD3-CD8+ естественных киллеров, повышением CD3+CD95+ субпопуляций Т- и CD19+, CD19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgM, IgG, IgG3, IL-1в, TNF-б, IL-4, IL-6, IL-10, ЦИК всех типов и нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровней кислородзависимой бактерицидности, активности неферментных лизосомально-катионных белков, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.

2. Изменения иммунной системы у больных ХГС с тяжелой степенью фиброза печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, снижением в периферической крови уровней CD3-CD25+ субпопуляций В-лимфоцитов и CD3-CD8+ естественных киллеров, повышением уровней CD3+CD95+ субпопуляции Т- и CD19+, CD19+CD95+ субпопуляций В-лимфоцитов, содержания IgА, ЦИК всех типов, IL-1в, TNF-б, IL-4, IL-10, а также нарушениями функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющимися повышением уровня кислородзависимой бактерицидности, поглотительной способности и снижением завершенности фагоцитоза.

3. Изменения иммунной системы у больных ХГС с циррозом печени характеризуются достоверным, по сравнению со здоровыми лицами, повышением в периферической крови уровней CD3+CD4+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+ субпопуляций Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов, снижением CD3+CD8+, CD3-CD25+, CD3-CD8+ лимфоцитов, уровня спонтанного НСТ-теста, повышением содержания IgG, IgА, IgM, ЦИК всех типов, IL-1в, TNF-б, IFN-г, IL-10.

4. Изменения иммунной системы у больных ХГС с субтипом HCV 1b характеризуются достоверным, по сравнению с больными ХГС с генотипом HCV 3а, повышением количества CD3+CD16+56+ Т-киллеров, активированных CD3+HLA-DR+ Т-лимфоцитов, высоко-, средне- и низкомолекулярных ЦИК.

5. Особенностями иммунопатогенеза ХГС со слабой и умеренной степенями фиброза печени является доминирование гуморального типа иммунного ответа, проявляющегося ростом числа (CD19+) В-лимфоцитов, иммуноглобулинов М, G и его подклассов G2, G3, G4, ЦИК, цитокинов Th2 профиля (IL-4, IL-10), сопровождающееся снижением количества CD3+CD16+56+ Т-лимфоцитов и CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ субпопуляций NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.

6. Особенностями иммунопатогенеза ХГС на стадии цирроза печени, по сравнению со стадией тяжелого фиброза, являются повышение содержания CD3+CD4+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, уровней иммуноглобулинов M, G, ЦИК всех типов, TNF-б, IFN-г, а также снижение числа CD3+CD8+ Т-лимфоцитов и CD3-CD8+, CD3-CD16+56+ субпопуляций NK-клеток.

7. У больных ХГС на стадии развития декомпенсированного цирроза печени возникают достоверные, по сравнению с больными ХГС с компенсированным циррозом печени, дифференциально-диагностически значимые изменения иммунной системы: снижение уровня CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ и повышение уровня CD3+CD4+ субпопуляций Т-лимфоцитов.

8. У больных ХГС отмечаются патогенетически значимые изменения иммунной системы, характеризующиеся взаимосвязью процессов активации, что отражается возрастанием уровней активированных CD8+CD25+, CD4+CD25+, CD8+HLA-DR+, CD4+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, и апоптоза иммунокомпетентных клеток, проявляющегося увеличением числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (CD3+CD95+).

Практические рекомендации

1. В целях дифференциальной диагностики между ХГС со слабым фиброзом и ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется использовать "Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на I и II стадии заболевания", включающий определение в периферической крови содержания IgG3, IL-10, CD3-CD25+. Для прогнозирования перехода ХГС со слабым фиброзом в ХГС с умеренным фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, IgG2, IgG3, IgG4, ЦИК всех типов, TNF-б, IL-10.

2. Для прогнозирования перехода ХГС с умеренным фиброзом в ХГС с тяжелым фиброзом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, ЦИК всех типов, IL-10.

3. В целях дифференциальной диагностики между ХГС с тяжелым фиброзом и ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется использовать "Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии тяжелого фиброза и компенсированного цирроза печени", включающий определение в периферической крови содержания CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, TNF-б, IFN-г, IgM, IgG. Для прогнозирования перехода ХГС с тяжелым фиброзом в ХГС с компенсированным циррозом печени рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, IgА, IgG, ЦИК всех типов, TNF-б, IFN-г, IL-10.

4. В целях дифференциальной диагностики ХГС с различной степенью компенсации цирроза печени рекомендуется использовать "Алгоритм дифференциальной иммунодиагностики ХГС на стадии компенсированного и декомпенсированного цирроза печени", включающий исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+ субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+. Для прогнозирования перехода стадии компенсированного цирроза в стадию декомпенсированного цирроза печени у больных ХГС рекомендуется исследование в периферической крови содержания CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD16+56+, CD3+HLA-DR+субпопуляций Т-лимфоцитов, определение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, CD3-CD25+ субпопуляции В-лимфоцитов, CD3-CD8+ NК-клеток, IgА, IgG, ЦИК всех типов, TNF-б, IFN-г, IL-10.

5. Первичное иммунологическое обследование больных ХГС рекомендуется проводить по расширенному варианту обследования. В целях установления доминирующего типа иммунного ответа у таких больных, достаточно использования сокращенного варианта иммунологического обследования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жданов К.В. Некоторые клинико-иммунологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С / К.В. Жданов, О.И. Кошиль, Ю.В. Лобзин, С.Л. Мукомолов, К.Д. Жоголев, В.Ю. Никитин // Новые направления в гепатологии: Тез. Фальк симп. №92. - СПб., 1996. - С.202.

2. Лобзин Ю.В. Некоторые клинико-лабораторные и морфологические изменения у бессимптомных носителей вирусов гепатитов В и С/ Ю.В. Лобзин, К.В. Жданов, С.Л. Мукомолов, О.И. Кошиль, К.Д. Жоголев, С.С. Бацков, В.С. Чирский, В.Ю. Никитин, Н.В. Бельгесов, П.П. Коршунов // Инфектология. Достижения и перспективы: Тез. докл. юбил. науч. конф., посвящ. 100-летию первой в России кафедры инфекционных болезней. - СПб., 1996. -С.81-82.

3. Жданов К.В. Маркеры активной вирусной репликации у больных со скрыто протекающими формами вирусных гепатитов В и С / К.В. Жданов, Ю.В. Лобзин, С.Л. Мукомолов, О.И. Кошиль, К.Д. Жоголев, С.С. Бацков, В.С. Чирский, В.Ю. Никитин, Н.В. Бельгесов, П.П. Коршунов // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1997. - Т.7, №5, Прилож.4. - С.145.

4. Никитин В.Ю. Состояние системы иммунитета и интерфероновый статус у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Е.Г. Богданова // Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика: Материалы науч. конф. с междунар. участием. - СПб., 1999. - С.90.

5. Новик А.А. Состояние иммунной системы у больных хроническими вирусными гепатитами В и С / А.А. Новик, В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Н.Х. Дулатова // Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф. - СПб., 1999. - С.214-216.

6. Цыган В.Н. Оценка иммунного статуса у больных хроническими гепатитами В и С / В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.Д. Жоголев, К.В. Жданов, Н.Х. Дулатова // Russian J. Immunol. - 1999. - Vol.4, Suppl.1. - P.160.

7. Цыган В.Н. Клинико-иммунологическая характеристика больных хроническими вирусными гепатитами В и С / В.Н. Цыган, В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, К.Д. Жоголев, И.А. Сухина // Мед. иммунология. - 2000. - Т.2, №2. - С.202.

8. Никитин В.Ю. Изучение особенностей иммунопатогенеза латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Мед. иммунология. - 2001. - Т.3, №2. - С.229-230.

9. Никитин В.Ю. Изучение клинико-иммунологических особенностей латентных форм хронических вирусных гепатитов В и С / В.Ю. Никитин, К.В. Жданов, И.А. Сухина // Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении: Тез. докл. V Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2001. - С.101.

10. Никитин...