Значение вирусных инфекций в патологии, связанной с нарушениями противоинфекционной защиты, и методы их выявления

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.00.36 - аллергология и иммунология

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Значение вирусных инфекций в патологии, связанной с нарушениями противоинфекционной защиты, и методы их выявления

Мальчиков Игорь Александрович

Екатеринбург - 2007

Работа выполнена в лаборатории вирусных инфекций ФГУН "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, на кафедре хирургической стоматологии и на кафедре внутренних болезней № 2 ГОУ ВПО "Уральская государственная медицинская академия" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Нина Поликарповна Глинских

доктор медицинских наук, профессор Ирина Александровна Тузанкина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Кокорев Валерий Серафимович

доктор медицинских наук, доцент Гусев Евгений Юрьевич

Ведущее учреждение: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва

Защита диссертации состоится на заседании диссертационного совета Д 004.027.01 при Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, д.106. Факс (343) 374-47-34

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С.Ковалевской, д.22/20), с авторефератом диссертации - на сайте ВАКа Министерства образования и науки РФ

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор И.А. Тузанкина

Список сокращений

A-аномалия, N- норма

АГ - антиген

АД- аденовирус

АТ - антитело

АФ- атипичные формы

АФЛС- антифосфолипидный синдром

ВНЧС- височно-нижнечелюстной сустав

ВПГ- вирус простого герпеса

ВГ- вирус гриппа

ВТ- веерная текстура

ВУИ- внутриутробная инфекция

ГВИ- герпетическая вирусная инфекция

ГГВИ-генитальные герпетические вирусные инфекции

ДЛП - двулучепреломляющие среды

Дв - веточковые дендриты

Дкор- коралловые дендриты

Дм -дендриты с массивными ветвями

До- октаэндрические дендриты

ЖКЛ- жидкокристаллические линии

ИБС- ишемическая болезнь сердца

ИДС- иммунодефицитные состояния

ИК- игольчатые кристаллы

ИФА - иммуноферментный анализ

КК - клеточная культура

КД- конфокальные домены

КН- кристаллические налеты

КПТ- комплекс конфокальной и полигональной

текстур

КТ- конфокальная текстура

КТ-ВТ- конфокальная и веерная текстуры

ЛЭЧ-4 (81)- диплоидные клеточные штаммы

легкого эмбриона человека

ЛПВП- липопротеиды высокой плотности

МБ- маслянистые бороздки

МБ-ВТ- маслянистые бороздки и веерная текстура

МБ-КТ- маслянистые бороздки и конфокальная

текстура

MDСK - перевиваемая культура клеток почки собаки

МФ- миелиновые формы

МФ-КТ- миелиновые формы и конфокальная

текстура

МФ-МБ - миелиновые формы и маслянистые

бороздки

НДЛП - недвулучепреломляющие среды

НДСТ - недифференцированная дисплазия

соединительной ткани

НИФ - непрямой иммунофлуоресцентный метод

ОА- остеоартроз

ОДА- опорно-двигательный аппарат

ОКР- специфическая окраска текстуры

ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции

ПГ- парагрипп

ПИФ - метод прямой иммунофлуоресценции

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПМ- поляризационная микроскопия

ПТ- полигональная текстура

ПЦР- полимеразная цепная реакция

РА- ревматоидный артрит

РеА- реактивный артрит

РС- респираторный синцитиальный вирус

РЖ- ротовая жидкость

РИФ- реакция иммунофлуоресценции

РНГА- реакция непрямой гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

СОПН - слизистая оболочка полости носа

СОПР - слизистая оболочка полости рта

СФ - сферолиты

СФм - сферолиты мелкие

СФс - сферолиты средние

СФк - сферолиты крупные

СФг - гигантские сферолиты

СФв - веточковые сферодендриты

СФр - радиальные сферодендриты

СФи - сферолиты искаженной формы

СФД - сферодендриты

СФДм - сферодендриты мелкие

СФДс - сферодендриты средние

СФДк - сферодендриты крупные

СЖ - синовиальная жидкость

ТЦД - тканевое цитопатическое действие

ТФ - трипельфосфаты

ФПН - фетоплацентарная недостаточность

ФИТЦ - флуоресцеинаизотиоционат

ФЭЧ - культура клеток кожно-мышечной

ткани эмбриона человека

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦПД - цитопатическое действие вируса

ЭМ - электронная микроскопия

Vero - клетки нормальной почки обезьяны

Общая характеристика работы

Актуальность. Одной из серьезных проблем современности являются нарушения взаимоотношений микро- и макроорганизмов, которые во многом определяются состоянием окружающей среды, а также произошедшими изменениями эндоэкологического равновесия в пользу вирусного микроокружения. Вследствие этого персистирующие вирусные инфекции рассматриваются не только как инфекционное заболевание, но и как проявление глубоких генетических нарушений внутренней среды организма человека, ведущих к необратимым для него, как биологического вида, последствиям (Черешнев В.А., 2000). Существует мнение о том, что в развитии многих патологических состояний ведущая роль принадлежит вирусам, однако, продолжается поиск доказательств характера их участия - либо в роли этиологического фактора, либо триггера (Цинкернагель Р.М., 2005). Значительная роль во взаимодействии организма с внешней средой принадлежит иммунной системе. Известно, что иммунитет - это комплекс реакций, направленных на поддержание постоянства внутренней среды организма. Его дисбаланс приводит к развитию иммунопатологических состояний - синдрому нарушений противоинфекционной защиты, аллергии, аутоиммунным и пролиферативным процессам (Петров Р.В., 1989). Реакции иммунной системы на различные этиологические факторы правомерно рассматривать как ведущие и формирующие основное звено патогенеза инфекционного процесса (Черешнев В.А. с соавт., 2006, Сепиашвили Р.И., 2003).

Вирусные инфекции, приводя к развитию иммунопатологических процессов, способствуют развитию патологических состояний во многих системах организма. Это особенно важно в критические периоды развития человека - антенатальный, период раннего детства и старения.

В настоящее время важное значение приобретает оценка происходящих иммунологических изменений при развитии инфекционных процессов и патологических состояний с ними связанных. Особенно при различных физиологических состояниях, определяющих здоровье поколений, одним из которых является беременность. Баланс иммунологических факторов может обеспечивать как физиологическое течение беременности, так и защиту организма женщины и плода от вирусной инфекции. Но некоторые изменения, в том числе дисбаланс выработки активных форм кислорода нейтрофилами и продукции противовирусных цитокинов клетками иммунной системы, приводят к патологии беременности, проявляющейся в преждевременном её прерывании, задержке внутриутробного развития плода. При этом недостаточная иммунокомпетентность женщин является одной из причин внутриутробного инфицирования плода (Ганковская Л.В. с соавт., 2006; Соловьева А.С. с соавт., 2006; Зуйков И.А. с соавт., 2006).

В последние десятилетия внимание исследователей все чаще привлекает наличие связи инфекционных агентов, включая вирусы, с формированием различных воспалительных процессов, в том числе при заболеваниях опорно-двигательного аппарата (ОДА), широкое распространение которых наблюдается с развитием цивилизации (Никонова Е.П., 2000: Ивашкин В.Т., 2005; Cai X.Y. et.al., 2003; Regev E. et.al.,2003). Заболевания, поражающие крупные и мелкие суставы, в частности височно-нижнечелюстной сустав (ВНЧС), составляют проблему в клинической практике. Они могут приводить к длительной нетрудоспособности из-за частых обострений, принимать хроническое течение (Насонова В.А., 2000; Фоломеева О.М., 2001). Но имеющиеся в настоящее время данные недостаточно отражают этиопатогенетическую роль отдельных вирусов и их возможных сочетаний. В проводимых исследованиях зачастую не учитываются активность и локализация патологических процессов, диагностика которых требует постоянного совершенствования. Вопросы влияния различных видов возбудителей на клинические проявления и особенности течения болезней, на характер иммунного ответа, до сих пор остаются окончательно не решенными (Королев М.А., 2001; Соколова Л.А., 2002). Для решения вопросов о возможности распространении воспалительного процесса в суставах и торпидности к терапевтическим мероприятиям необходимо получение объективных данных об этиопатогенезе заболеваний ОДА.

Используемые в настоящее время методы выявления этиопатогенетических факторов имеют ряд недостатков - они весьма дорогостоящи, информативность их повышается лишь при комплексном повторном их применении в динамике патологического процесса. В этой ситуации особую значимость приобретают иммунологические исследования, помогающие выявить и проанализировать взаимосвязь вирусных агентов с развитием, как инфекционных заболеваний, так и индуцируемых ими патологических процессов, происходящих в макроорганизме, а также предупредить осложненное течение заболеваний путем своевременной и целенаправленной коррекции терапевтических комплексов.

Таким образом, высокая социально-экономическая значимость и широкая распространенность патологии беременности и детей раннего возраста, а также заболеваний ОДА, существующие недостатки в их диагностике, делают актуальными исследования этиопатогенеза указанных состояний и поиска новых информативных и экономичных методов их диагностики. иммунологический инфекционный патологический

Цель исследования. Определение значения вирусных инфекций в развитии патологических процессов при нарушениях противоинфекционной защиты организма и разработка новых инструментально-диагностических способов их выявления.

Задачи исследования:

1. В эксперименте на животных оценить возможность вовлечения опорно-двигательного аппарата (ОДА) в инфекционный процесс, связанный с респираторными и герпетическими вирусами.

2. Определить морфологические признаки возможного присутствия вирусных агентов респираторной и герпетической группы в синовиальной жидкости с оценкой их роли в поражении суставов методом электронной микроскопии.

3. Оценить различия морфотекстур биологических жидкостей больных с различными патологическими процессами опорно-двигательного аппарата, развившимися при участии респираторных и герпетических вирусов, методом поляризационной микроскопии.

4. Дать характеристику иммунологическому профилю больных с патологией опорно-двигательного аппарата, имеющих клинико-лабораторное подтверждение наличия респираторной, герпетической инфекции и выявить специфические иммунологические изменения у больных с различными заболеваниями ОДА.

5. Охарактеризовать состояние иммунной системы женщин во время беременности и оценить роль персистирующих вирусных агентов респираторной, герпетической групп в формировании патологии плода.

6. Дать сравнительную оценку состояния иммунной системы детей раннего возраста, имеющих нарушения противоинфекционной защиты, и их матерей, с оценкой роли вирусных агентов в формировании патологии.

Научная новизна.

Впервые получены данные, свидетельствующие об инфицировании суставов респираторными и герпетическими вирусами, которые могут рассматриваться не только как триггерные, но и как этиологические факторы при развитии различной патологии опорно-двигательного аппарата.

Впервые методом электронной микроскопии в синовиальной жидкости больных с поражениями опорно-двигательного аппарата обнаружены вирусы герпеса.

Получены новые данные о том, что на фоне нарушения противоинфекционной защиты у беременных, при инфицировании их респираторными вирусными агентами, происходит реактивация персистирующих в организме женщины герпесвирусов, что приводит к вовлечению в инфекционный процесс социально значимых возбудителей, таких как вирусы гриппа и энтеровирусы Коксаки группы В, наряду с бактериальными и грибковыми инфекционными агентами.

Представлены новые данные о специфических изменениях иммунологического профиля, развивающихся в различные периоды беременности у женщин, а также у детей раннего возраста на фоне респираторной, герпетической и энтеровирусной инфекций.

Определено значение вирусных агентов в развитии инфекционной патологии новорожденных и детей раннего возраста, развившейся на фоне синдрома нарушений противоинфекционной защиты и индуцируемой патологией матери.

Проведена оценка иммунологического профиля матерей, имеющих новорожденных и детей раннего возраста с синдромом нарушений противоинфекционной защиты.

Определено место внутриутробного инфицирования детей в структуре инфекционных заболеваний новорожденных и детей раннего возраста, госпитализированных в стационарные отделения с синдромом нарушений противоинфекционной защиты.

На основе поляризационной микроскопии разработаны диагностические морфотекстурные тесты для использования в комплексной диагностике патологии опорно-двигательного аппарата, определены отличия частоты встречаемости морфологических текстур при различных инфекционных процессах вирусной этиологии.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований продемонстрировали необходимость использования клинико-анамнестического обследования и иммунологического исследования больных различными заболеваниями, ранее не относимыми к инфекционным, для выявления вирусиндуцированных процессов, имеющих эпидемиологическую значимость в силу их распространенности, в целях определения стадии активности патологического процесса, характера нарушений противоинфекционной защиты организма и индуцированных вирусами аутоиммунных процессов. Использование в практической деятельности данных таких исследований дает возможность предупредить развитие осложнений, выработать эффективные меры терапевтической и профилактической направленности.

Полученные нами новые данные о роли инфекционных вирусных агентов в развитии патологии ОДА, позволят использовать их для определения спектра терапевтических вмешательств, направленных на повышение эффективности проводимого лечения.

Выявленные данные о том, что изменения клеточных иммунологических параметров - ведущий механизм в патогенезе развития заболеваний ОДА герпетической этиологии, открывают практическую перспективу повышения эффективности планируемого лечения за счет включения в терапевтический комплекс иммунотропных препаратов, прицельно действующих на клеточные механизмы противоинфекционной защиты.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у иммунокомпрометированных женщин, не подготовленных к беременности профилактическими мероприятиями, обеспечивающими ее физиологическое течение, встреча с инфекционными агентами во время беременности заканчивается развитием инфекционного заболевания, что увеличивает риск инфицирования плода и угрозу прерывания беременности.

Выявленные факты, свидетельствующие о том, что у детей, родившихся от матерей с респираторными, герпетическими и энтеровирусными инфекциями, достоверно чаще наблюдались недоношенность и пороки развития, такие как врожденные пороки сердца, атрезия прямой кишки и пищевода, расщелины неба и д.р., позволяет направить мероприятия по предупреждению их развития в сторону профилактики инфекций и улучшению функционирования иммунной системы.

Использование метода поляризационной микроскопии позволит получать более экономичным и менее трудозатратным путем подтверждение наличия специфических изменений при различных заболеваниях опорно-двигательного аппарата, протекающих с участием респираторных и герпетических вирусов. Получаемые результаты исследований могут быть применены в комплексном диагностическом процессе, а также в качестве скринингового метода получения диагностически значимой информации, определяющей последующий выбор тактики лечения больных. Они могут быть использованы при дальнейших исследованиях в области вирусологической и клинической иммунологии.

Положения, выносимые на защиту:

Вирусные агенты респираторной и герпетической группы непосредственно участвуют в полиорганном патологическом процессе с поражением различных систем организма, в т.ч. опорно-двигательного аппарата, сопровождаясь функциональными нарушениями клеточных и гуморальных параметров иммунной системы.

2. Перенесенная беременными женщинами респираторная инфекция может приводить к иммунодепрессивному состоянию, что ведет к обострению герпетической инфекции, персистирующей в организме, и способствует развитию осложнений беременности, преждевременных родов, патологическому их течению, формированию пороков развития у детей и синдрома нарушений противоинфекционной защиты, что сопровождается изменениями в структуре тимуса и микст - инфицированием бактериальными и грибковыми агентами.

3. Спектр актуальных вирусных агентов при патологических состояниях беременности достоверно различен.

4. Биологические жидкости организма человека и животных характеризуются специфическими морфотекстурными особенностями, визуализирующими физико-химическое состояние многокомпонентных коллоидных систем, состоящих из липидов, полипептидов, белков и солей, выявляемыми методом поляризационной микроскопии, результаты которого, в комплексе с другими лабораторными методами, могут служить маркёрами патологии опорно-двигательного аппарата, протекающей с участием инфекционных вирусных агентов.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику работы городского ревматологического отделения ЦГБ № 6 г. Екатеринбурга и стоматологической клиники ГОУ ВПО "Уральская государственная медицинская академия". Материалы диссертации вошли в учебные программы для студентов и врачей факультета усовершенствования врачей хирургической стоматологии ГОУ ВПО "Уральская государственная медицинская академия".

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на итоговой научно-практической конференции ЕНИИВИ (Екатеринбург, 1999); VII Всероссийском съезде стоматологов (М., 2001); 1 общероссийском конгрессе стоматологов (Пермь, 2001); VII Всероссийской научно-практической конференции (М., 2001); на III съезде ревматологов России (Рязань, 2001); 1 конференции иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001); научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" (Москва, 2002); 4 Всероссийской научно-практической конференция "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Тверь,2002); объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004); Всероссийском стоматологическом форуме "Дентал-ревю" (Москва, 2005); научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической гнатологии" (Тюмень, 2005); V Всероссийском конгрессе "Эстетика в стоматологии, новые технологии в стоматологии" (Екатеринбург, 2005); окружной научно-практической конференции "Актуальные аспекты вирусных инфекций в современный период" (Екатеринбург, 2007), 8-ой международной летней школе им. J. Humphrey "Immunology and Viral Infection" (Москва, 2007).

Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 48 печатных работах. В том числе в 5 изданиях, рекомендованных ВАК, издан "Атлас текстур биожидкостей кристаллов при патологии суставов", получено 4 патента на изобретение, 2 свидетельства о депонировании и регистрации произведения - объекта интеллектуальной собственности.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы, включающего 426 источников, в том числе 276 отечественных и 150 зарубежных. Работа иллюстрирована 34 рисунками, 15 таблицами, 3 схемами и 2 приложениями.

Материалы и методы

Работа проводилась в течение 1998-2006 гг. Объем выполненных исследований представлен на схеме 1. В экспериментальных исследованиях использовано 150 беспородных белых мышей, на биологическом материале которых проведено 2392 лабораторных теста.

В клинических наблюдениях обследовано 785 человек. Проведено 18523 лабораторных теста, 1146 инструментально-диагностических и 1626 морфологических исследований.

Экспериментальные исследования. Для моделирования гриппозной инфекции были сформированы следующие группы:

- группа Iа - мыши массой 10-12 г (n=30), которых инфицировали под эфирным наркозом интраназально по 0,05 мл аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А/PR/8/34 (H1N1);

- группа Iб - контрольные мыши массой 10-12 г (n=30), которым интраназально вводили физиологический раствор в объеме 0,05 мл.



Для моделирования герпетической инфекции были сформированы:

- группа IIа - мыши массой 20-22 г (n=30), которые были инфицированы внутрибрюшинно ВПГ с инфекционным титром 4,5 lg ТЦП 50/мл: в объеме 0,2 мл - для воспроизведения острой герпетической инфекции;

- группа IIб - мыши (n=30) доза вируса 4,5 lg ТЦП 50/мл в 0,02 мл, для моделирования хронической герпетической инфекции, была подобрана предварительно опытным путем и доведена до объема 0,2 мл физиологическим раствором;

- группа IIв - контрольные животные (n=30), которым внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 0,9% физиологического раствора.

Для исследования использовали ткани легких, головного мозга, печени, почек, селезенки и суставов, с последующим их патолого-морфологическим анализом. Отбор биожидкостей и органов осуществляли в динамике на 2-е,5-е,7-е,10-е,15-е,25-е,30-е и 45-е сутки с момента инфицирования. Методом поляризационной микроскопии проведены исследования ротовой жидкости, сыворотки крови, мочи (всего 598 исследований). В РИФ - с целью обнаружения антигенов вирусов гриппа и герпеса (всего 900 исследований).

Клинико-лабораторные обследования больных с патологией ОДА с вовлечением ВНЧС (n=380) проводились в ревматологических отделениях ГКБ №6, ОКБ №1, а также амбулаторно в артрологическом центре стоматологической клиники Уральской государственной медицинской академии г. Екатеринбурга (всего 7812 исследований).

При формировании клинических групп больных с патологией ОДА учитывались следующие факторы:

а) наличие лабораторно подтвержденных вирусных инфекций в РИФ, РТГА, РСК, ИФА, ПЦР;

б) достоверно верифицированный в процессе всестороннего медицинского обследования клинический диагноз;

в) наличие артритов периферических суставов;

г) исключение других артритов (септический артрит, Лайм-артрит и спондилоартропатии).

д) для РА и ОА - наличие II, III и IV рентгенологических стадий заболевания по Келгрену;

е) для РА - подтверждение активности патологического процесса по острофазовым белкам и показателю СОЭ;

ж) при РеА наличие урогенитальной инфекции в стадии ремиссии, а также наличие факторов, свидетельствующих о предшествующих инфекциях (заболевания, возникшие в пределах 4-х недель до клинических проявлений артрита);

з) информированное согласие пациентов на проведение исследований.

Критерии исключения из исследования:

а) наличие острых и обострение хронических (кроме респираторных и герпетических) инфекционных заболеваний;

б) тяжелая сопутствующая патология сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, пищеварения, печени, системы крови;

в) отсутствие достоверных критериев для постановки диагноза РеА, РА, ОА, НДСТ;

г) для РА - отсутствие данных, подтверждающих активность процесса по острофазовым белкам и показателю СОЭ;

д) наличие бактериальной инфекции (при проведении исследований методом поляризационной микроскопии);

е) несоблюдение протокола исследования, отказ больного или его родственников от проведения дополнительных методов обследования.

С патологией ОДА обследовано 302 пациента, которые были распределены на 4 группы.

Группа I - больные ревматоидным артритом (РА) с вовлечением ВНЧС (n=76). Диагноз РА ставили с учетом диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации (1987), а при его формулировке использовали классификацию РА, предложенную Институтом ревматологии (1989).

Группа II - больные реактивным артритом (РеА) с вовлечением ВНЧС (n=77). Диагноз РеА формулировали с учетом диагностических критериев, принятых на III международном Конгрессе (Берлин, 1995) согласно международной классификации болезней МКБ-10 (Москва, 1996).

Группа III - больные с остеоартрозом (ОА) с вовлечением ВНЧС (n=74).

Группа IV - пациенты с недифференцированной дисплазией соединительной ткани (НДСТ) с вовлечением ВНЧС (n=75). Диагноз ОА и НДСТ выставляли в соответствие с международной классификацией болезней МКБ-10 (Москва, 1996).

Исследование иммунологического профиля проведено у 86 больных с диагнозом реактивный, ревматоидный артрит и остеоартроз, у которых клинически и лабораторно подтверждено наличие респираторной или герпетической инфекций. Сформированы 3 группы больных, каждая из которых состояла из трех подгрупп, выделенных по наличию или отсутствия вирусной инфекции.

Группа I - больные "ревматоидным артритом" (n=46): 1.1. - РА с герпетической инфекцией (n=16); 1.2. - РА с респираторной инфекцией (n=14); 1.3. - РА без этих инфекций (n=16).

Группа II - больные "реактивным артритом" (n=48): 2.1. - РеА с герпетической инфекцией (n=16);. 2.2.- РеА с респираторной инфекцией (n=15); 2.3. - РеА без этих инфекций (n=17).

Группа III - больные "остеоартрозом" (n=44): 3.1. - ОА с герпетической инфекцией (n=15); 3.2. - ОА c респираторной инфекцией (n=14); 3.3. - ОА без этих инфекций (n=15).

Контрольная группа - здоровые доноры (n=78) отделения переливания крови, не имевшие достоверных отличий по полу и возрасту с основными группами, а также без нарушений иммунитета, респираторных и герпетических инфекций на момент исследования. Материалы от лиц указанной группы были использованы для контроля исследований методом поляризационной микроскопии (n=62) и иммунологических параметров (n=30).

Клинико-лабораторные обследования беременных женщин проводили в отделении дородовой подготовки и в консультативной поликлинике при ГУНИИ ОММ г. Екатеринбурга (всего 3534 исследований). В результате клинико-анамнестического подбора и лабораторного исследования были сформированы группы беременных женщин, имеющих лабораторно подтвержденную герпесвирусную (n=45), респираторную (n=48) и энтеровирусную (n=33) инфекции.

Группу сравнения составили 33 женщины, которые во время беременности вышеуказанными инфекциями не болели. Обследованные группы беременных женщин по возрастной характеристике, соматическому статусу, акушерско-гинекологическому анамнезу и срокам беременности были сопоставимы между собой.

Клинико-лабораторные обследования детей с инфекционной патологией, имеющих признаки синдрома нарушений противоинфекционной защиты, и их матерей, проведены у госпитализированных в отделения патологии новорожденных и детей раннего возраста ОКДБ № 1 г. Екатеринбурга (всего 6547 исследований). Были сформированы группы матерей и их детей:

- группа Iа состояла из детей с герпетической инфекцией (n=31);

- группа Iб - дети с респираторной инфекцией (n=28);

- группа Iв - с энтеровирусной инфекцией (n=23).

- группа Iг - без указанных инфекций (n=48).

Группу IIа составили матери с герпетической инфекцией в стадии обострения (n=39);

- группу IIб - с респираторной инфекцией (n=33);

- группу IIв - с энтеровирусной инфекцией (n=27);

- группу IIг составили 50 матерей без указанных инфекций.

Обследованные группы были сопоставимы между собой.

Методы клинико-лабораторных исследований. В соответствии с поставленными задачами у больных осуществляли определение наличия респираторных, герпетических и энтеровирусных инфекций лабораторными методами.

Для реакции иммунофлуоресценции использовали наборы НИИЭМ им. Гамалея РАМН, г. Москва - флуоресцирующие глобулины к антигенам вирусов гриппа А, В, парагриппа, аденовируса, респираторно-синцитиальному (РС), простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирусу (ЦМВ) - (5495 исследований).

Уровень специфических антител в сыворотке крови к респираторным вирусам определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (4710 исследований), связывания комплемента (РСК) (785 определений) с использованием диагностикумов предприятия по производству диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН, г. С-Петербург.

Серологические исследования по определению уровня специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови к герпетическим вирусам проводили на оборудовании для иммуноферментного анализа (ИФА) фирм "Labsystems" (Финляндия) и "Abbott" (США) с использованием диагностических иммуноферментных систем "Вектор ВПГ(ЦМВ)-IgМ-стрип" и "Вектор ВПГ(ЦМВ)-IgG-стрип", выпускаемые ЗАО "Вектор-Бест" (пос. Кольцово, Новосибирская обл.) - 1570 определений.

Выявление ДНК ВПГ и ЦМВ - методом полимеразной цепной реакции с использованием оборудования и диагностических наборов НП фирмы института физической и химической медицины "Литех" (г. Москва) -1900 тестов.

Для индикации наличия вирусов в синовиальной жидкости больных с патологией ОДА методами РИФ и РН использовали культуры клеток ЛЭЧ 4 (81), ФЭЧ, Vero, MDСK из коллекции клеточных культур Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (312 исследований). Анализ и фоторегистрацию препаратов осуществляли на электронном микроскопе "ЭМВ-100ЛМ" при 28000-кратном увеличении.

В качестве материалов для поляризационной микроскопии с поляризационными насадками МБИ-6 и микрофотонасадками МФН-10У 4.2 при 200-кратном увеличении использовали: сыворотку крови, синовиальную жидкость, носовой секрет, ротовую жидкость и мочу (1900 определений).

Выполнено 4344 лабораторных иммунологических тестов, включающих определение популяций и субпопуляций лимфоидных клеток методом иммунофлуоресценции с использованием панели ФИТЦ-меченных моноклональных антител к мембранным CD-рецепторам. Исследования выполнены на проточных цитометрах FACScan (Becton Dickinson) и FС-500 (Becman-Coulter). Определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1964). Определение общего IgE - методом ИФА. Окислительно-восстановительную функцию (активность НАДФ-оксидазной системы) нейтрофилов оценивали с помощью НСТ-теста по стандартной методике. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов оценивали в тестах спонтанного и стимулированного микробными полисахаридами (зимозаном) фагоцитоза с латексными частицами. Оценку уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови, проводили методом преципитации в полиэтиленгликоле по общепринятой методике.

Результаты и их обсуждение

Проведено комплексное исследование, состоящее из экспериментального и клинико-лабораторного блоков исследований.

При выполнении экспериментальных исследований, мы учитывали возможность возникновения патологических изменений многих систем организма в результате действия респираторных и герпетических вирусов, включая патологические процессы в суставах.

В группе Iа (мыши с экспериментальной гриппозной инфекцией) при патолого-морфологическом исследовании были выявлены выраженные изменения в легких, печени и суставах.

В органах респираторного тракта наблюдались типичные патологоанатомические изменения, характерные для этой инфекции - дистрофия и некробиоз эпителия трахеи и бронхов с последующим отторжением клеток в просвет дыхательных путей.

В печени животных наблюдалась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, вакуольная дистрофия печеночных клеток с очаговым некробиозом и некрозом.

В тканях суставов фаза экссудативного воспаления синовиальной оболочки сопровождалась мукоидным набуханием. Отмечалась гиперплазия ворсин. Все это свидетельствует о роли вируса гриппа как инициатора сложнейших каскадных механизмов, ведущих к поражению всего организма.

В группе IIа (животные с экспериментальной острой герпетической инфекцией) патолого-морфологическое исследование органов подтвердило типичные патолого-анатомические изменения, соответствующие их клиническим проявлениям.

В легких - отек перибронхиальных и периваскулярных пространств, циркуляторные нарушения, развитие мелкоочаговой, затем крупноочаговой пневмонии.

В белом веществе головного мозга развивались периваскулярные инфильтраты. Мягкая мозговая оболочка была отечна, полнокровна и инфильтрирована лимфоидными, лимфогистиоцитарными и лимфолейкоцитарными элементами.

В печени наблюдалась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, распространенная вакуольная дистрофия печеночных клеток с очаговым некробиозом и некрозом. В очагах некробиоза отмечалась значительная гистиоцитарная и макрофагальная инфильтрация. Наблюдалась краевая вакуолизация и некробиоз гепатоцитов.

В почках имели место мелкие и крупные лимфоидные инфильтраты в интерстициальной ткани со сдавлением канальцев, а также дистрофические изменения канальцевого эпителия, полнокровие клубочковых и стромальных капилляров.

В синовиальной оболочке суставов определяли признаки отечности, очаговую десквамацию и некроз структур. В эпифизарных пластинках сустава - интерстициальный отек.

Данные наблюдения также доказывали способность ВПГ вызывать аналогичные, множественные, системные процессы.

В группе IIб (животные с экспериментальной хронической ВПГ-инфекцией) при патолого-морфологическом исследовании в легких пролонгировались циркуляторные нарушения в виде гиперемии и кровоизлияний, выраженным отеком перибронхиальных и периваскулярных пространств. В просвете альвеол наблюдали скопления отечной жидкости, продуктов распада некротизированных клеток и лейкоцитов. Наблюдалась интерстициальная пневмония.

В головном мозге наблюдались репаративные процессы соследами глиофиброзной пролиферации. Процессы резорбции и пролиферации затухали в динамике наблюдения.

В печени сохранялась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, в очагах некробиоза - гистоцитарная и макрофагальная инфильтрация.

В почках усиливались дистрофические изменения канальцевого эпителия, оставалось полнокровие клубочковых и стромальных капилляров.

В тканях суставов мышей обнаружено разрастание грануляционной ткани в субинтимальном слое, мукоидное набухание структур хрящевого матрикса, очаговая деструкция хондроцитов. Наблюдалось разрушение хряща с образованием узур, трещин и секвестров, что указывало на усугубление патологических процессов, приводящих к необратимым изменениям. Это, может быть связано с прямым и длительным воздействием вируса на ткань пораженного органа. Необходимо учитывать тот факт, что персистенция герпесвирусов в органах создает патогенетически неблагоприятные условия для функционирования последних, а также является одной из причин развития вторичных иммунных нарушений и состояний с этим связанных.

Столь выраженные изменения, происходящие в тканях и системах организма, не могли не повлиять на физико-химические свойства биожидкостей. Поэтому нами были проведены исследования последних, позволившие оценить возможность использования поляризационного метода для выявления в организме экспериментальных животных процессов, наблюдаемых при развитии респираторных и герпетических инфекций.

Достоверные отличия от контрольных показателей получены в следующих случаях.

У мышей, инфицированных вирусом гриппа, в сыворотке крови были выявлены средние сферодендриты и скелетные дендриты. В моче были найдены достоверные отличия по измененным сферолитам и трипельфосфатам;

У мышей, инфицированных ВПГ, в сыворотке крови появлялись такие структурные признаки, как средние сферолиты, средние, крупные сферодендриты, тонкие и скелетные дендриты. В ротовой жидкости - визуализировались маслянистые бороздки и веерные текстуры, аномальные связи "маслянистые бороздки-веерные текстуры" (МБ-ВТ), атипичные формы "веера". При исследовании мочи выявлены измененные и гигантские сферолиты и трипельфосфаты.

Полученные результаты продемонстрировали информативность поляризационно-микроскопического метода, который может быть использован в диагностическом процессе различных заболеваний в качестве дополнительного метода получения информации, что позволило нам применить его в дальнейшем для исследования биоматериалов различных групп больных.

Клинико-иммунологическая характеристика больных с патологией ОДА при наличии у них вирусных инфекций

Получены данные о том, что вирусы, особенно герпетической группы, служат триггерным фактором развития патологии ОДА, а в ряде случаев (РеА) в качестве этиологических факторов. У больных РеА, обследованных серологическими методами, определено диагностически значимое увеличение титров антител в сыворотке крови к вирусам гриппа в 26% случаев, к другим респираторным вирусам - 28,6%. Антитела IgM-класса к ВПГ - в 24,6%, к ЦМВ - 29,8% случаев. У больных РА - 21,1%, 19,7%, 17,8% и 17,8% случаев соответственно.

При исследовании синовиальной жидкости методом клеточных культур с индикацией антигенов вируса в РИФ у больных РеА вирусный агент респираторной этиологии обнаружен в 50,5%, герпетической - у 45,5% случаев. У больных РА и ОА (40,5%, 43,5% и 39,1%, 32,4% случаев соответственно). В материале синовиальной жидкости больных РеА достоверно чаще определяли антигены герпесвирусов по сравнению с больными других групп.

Чрезвычайно сложно трактовать данные, оценивающие те виды инфекций, которые относятся к персистирующим формам, например герпетическую инфекцию, учитывая их неоднозначность. Также трудно прогнозировать тяжесть и спектр осложнений со стороны различных органов и систем организма после перенесенного инфекционного заболевания, в частности гриппозной этиологии. Поэтому представлялось важным сопоставить результаты, полученные нами с помощью разных лабораторных методов выявления данных инфекций у больных с патологией ОДА, для чего проведено сравнение частоты выявления антигенов и антител к респираторным и герпетическим вирусам различными лабораторными методами.

Оказалось, что выявление антигенов вирусов гриппа А (12,9%), парагриппа (9,1%), ВПГ (66,8%) методом люминесцентной микроскопии чаще наблюдалось в группе больных РеА. Реже всего - у пациентов с НДСТ (6,7%, 6,7%,52,0) (р<0,05).

По данным ИФА, антитела IgM класса к ВПГ и ЦМВ чаще всего выявлялись у больных РеА (24,6% и 29,8% случаев) (р<0,05), реже - у больных НДСТ (2,7% к ВПГ, отсутствие к ЦМВ). Достоверно высокий уровень антител IgG класса (1:3200>) к ВПГ определялся у больных РеА, РА и ОА (p<0,05).

Чаще всего ДНК герпетических вирусов в биожидкостях определялась у больных РеА (ДНК ВПГ - 64,9%, ДНК ЦМВ -29,7%).

Обнаружение антигенов и высоких титров антител к респираторным и герпетическим вирусам различными лабораторными методами у больных РеА, РА, ОА свидетельствует о взаимосвязи патогенеза этих заболеваний с вирусной инфекцией.

При этом, реактивный артрит (РеА) можно рассматривать как воспалительный процесс вирусной этиологии в активной стадии заболевания, протекающий на фоне выраженного синдрома нарушений противоинфекционной защиты, для которого характерно: политопность инфекционных поражений, упорство или атипичность течения заболеваний, торпидность к терапевтическим мероприятиям, наличие множества этиологически значимых инфекционных агентов, в том числе бактериальных, грибковых (Петров Р.В. с соавт, 2002, Сепиашвили Р.И., 2003).

Подтверждения этому были получены проведенными иммунологическими исследованиями, выделением вирусов из синовиальной жидкости методом клеточных культур и обнаружением их методом электронной микроскопии. Вирусный агент при РеА выступал в роли этиологического фактора.

Ревматоидный артрит (РА) - другое патологическое состояние, которое можно рассматривать как хронический иммунопатологический процесс аутоиммунного характера, возникающий у больных, перенесших острое воспалительное заболевание, о чем свидетельствовало проведенное иммунологическое исследование. В данном случае процесс носил иммуноопосредованный характер, а вирусы играли роль триггера.

Недостоверные отличия уровня антител к ВПГ (>1:3200) в сыворотке крови пациентов НДСТ и контрольной группы позволили говорить об отсутствии связи данного заболевания с герпесвирусной инфекцией.

Факт обнаружения антигенов вирусов в культурах клеток с синовиальной жидкостью наблюдаемых больных может свидетельствовать о присутствии данных инфекционных агентов в полости суставов и, вследствие этого, развитии индуцированных вирусами патологических изменений, что было подтверждено электронной микроскопией. В культурах клеток с синовиальной жидкостью больных РеА, РА были выявлены сформированные вирусные структуры, которые идентифицированы нами как принадлежащие герпетическому вирусу. Эти частицы находились в процессе репродукции, которая наблюдалась преимущественно у внутренней поверхности ядерной мембраны с нарушением ее целостности и выходом вирионов в перинуклеарное пространство и цитоплазму. Методом электронной микроскопии в синовиальной жидкости у больных с патологией ОДА респираторные вирусы не были обнаружены, хотя методом клеточных культур в этих же образцах биожидкостей они были выявлены.

Это может объясняться тем, что процесс инфицирования при гриппе происходит достаточно быстро, поэтому уловить высокую концентрацию патогена в суставе, необходимую для выявления методом электронной микроскопии, не всегда представляется возможным. При этом изменения воспалительного характера обнаруживались в тканях суставов. Такие патолого-морфологические данные были получены нами при проведении экспериментальных исследований на лабораторных животных.

При анализе иммунологических параметров здоровых лиц и лиц с патологией ОДА выявлено следующее (рис.1).

У больных РА в зависимости от наличия инфекции выявлены следующие достоверные иммунологические особенности:

- при герпесвирусной инфекции - уменьшение количества лейкоцитов, относительного количества лимфоцитов, концентрации IgA, IgM в сыворотке крови, относительного количества CD3+ и CD4+лимфоцитов, субпопуляционного индекса, НСТ-теста стимулированного, увеличение таких показателей, как СОЭ, уровень ЦИК, сывороточной концентрации IgG, CD8+лимфоцитов, НСТ-теста спонтанного, т. е. происходило снижение фагоцитарных функций и числа иммунокомпетентных клеток, активация гуморальных параметров иммунитета;

- при респираторной инфекции - уменьшение относительного количества CD3+, CD4+лимфоцитов, увеличение общего количества лейкоцитов, СОЭ, ЦИК, концентрации сывороточных IgM и IgG, т. е. наблюдался дисбаланс клеточных и гуморальных параметров иммунитета;

- без вирусной инфекции - выявлено уменьшение количества CD3+ и CD4+лимфоцитов, увеличение ЦИК, содержания IgM в сыворотке крови; у этих больных основным диагностическим критерием являлось также наличие в сыворотке крови ревматоидного фактора - аутоантител IgM-класса.

У больных РеА в зависимости от наличия инфекции выявлено следующее.

При герпетической инфекции - выявлено снижение количества лейкоцитов, лимфоцитов, концентрации IgA, IgM, относительного числа CD3+, CD4+ лимфоцитов, субпопуляционного индекса, функциональной активности нейтрофилов, увеличение СОЭ, уровня ЦИК, относительного числа CD8+ лимфоцитов, т. е. данные свидетельствуют о нарушениях функциональной активности иммунокомпетентных клеток, снижении их числа, активизация цитотоксической активности, что создает условия для персистирования инфекционных агентов и хронизации процесса. Утяжеление течения воспалительного процесса сопровождалось снижением субпопуляционного индекса за счет повышения числа CD8+лимфоцитов.

При респираторной вирусной инфекции наблюдалось увеличение общего количества лейкоцитов, показателя СОЭ, уровня ЦИК, сывороточных IgM и IgG, НСТ-теста.

Без вирусной инфекции - выявлено снижение количества лейкоцитов, увеличение ЦИК, концентрации IgM в сыворотке крови, т.е. полученные в этой группе сравнения результаты иммунологических исследований подтвердили участие иммунных механизмов в развитии РеА, но иммунокомпетентность пациентов обеспечила более легкое течение заболеваний и отсутствие участия вирусных агентов в развитии патологического процесса, имеющего, по-видимому, конституциональную обусловленность.



У больных ОА в зависимости от наличия инфекции было выявлено следующее.

При герпесвирусной инфекции наблюдалось уменьшение количества CD4+лимфоцитов, субпопуляционного индекса, НСТ-теста стимулированного, увеличение СОЭ, ЦИК, CD8+лимфоцитов, т.е. иммунные нарушения у больных ОА могли способствовать затяжному течению заболевания со склонностью к рецидивам и развитию осложнений на фоне персистирующей герпетической инфекции.

При респираторной инфекции имело место увеличение ЦИК и НСТ-теста, что было вполне адекватно при респираторных инфекциях.

У больных без вирусной инфекции не выявлено каких-либо изменений иммунологических параметров.

Среди причин разнородности больных с одной и той же нозологической формой патологии ОДА и наличию той или иной вирусной инфекции, были выявлены определенные особенности состояния иммунной системы. Сравнительный анализ результатов иммунологического обследования больных с герпетической или респираторной инфекцией с больными, не имевшими этих инфекций, позволил выделить достоверный спектр отличий иммунологического профиля больных.

При ревматоидном артрите у больных с герпетической инфекцией, в отличие от больных, не имевших вирусных инфекций, были отмечены достоверные различия по общему количеству лейкоцитов (лейкопения), увеличению ЦИК и СОЭ, снижению НСТ-теста и сывороточного IgM. Эти изменения, по сравнению с нормативными данными, были более значительными, чем у больных, не имевших герпетической инфекции (р<0,05);

При респираторной инфекции в группе больных РА отмечены в основном изменения показателей клеточного состава периферической крови, которые не имели достоверных отличий от показателей больных РА без вирусной инфекции, за исключением СОЭ и ЦИК (p>0,05), что отражало адекватную реакцию компетентного организма на респираторную вирусную инфекцию.

В группе больных с другой патологией ОДА - РеА при герпетической инфекции наблюдалось изменение концентрации IgM, НСТ-теста стимулированного по сравнению с больными РеА без инфекции (р<0,05).

При респираторной инфекции у больных РеА отмечены изменения показателей клеточного состава периферической крови, которые не имели достоверных отличий от значений показателей больных из группы сравнения (p>0,05), за исключением общего количества лейкоцитов - наблюдался лейкоцитоз и ускоренная СОЭ (p<0,05).

У больных ОА с герпесвирусной инфекцией отличия от группы сравнения касались только увеличения СОЭ и ЦИК (p<0,05), как и у больных РА с респираторной вирусной инфекцией, что может свидетельствовать об иммунокомпетентности больных ОА и отсутствии иммунопатологических процессов в патогенезе заболевания.

При респираторной инфекции у больных ОА достоверные изменения иммунологических параметров отсутствовали (p>0,05).

Различными исследователями высказывается предположение о том, что депрессия клеточного звена иммунной системы - ведущий механизм в патогенезе заболеваний ОДА при герпетической инфекции. В этих условиях пролонгированное воздействие герпесвирусов не только индуцирует иммунодепрессивное состояние организма, но и усугубляет его, что приводит к учащению рецидивов и генерализации инфекции, наблюдавшейся у больных обследуемых групп (Пирумян А.Г., 2000; Кузьмина Н.М., 2001; Cai X.Y., 2003).

Результаты проведенных нами исследований, а также данные других авторов (Соколова Л.А., 2002; Belin V. et.al., 2003, Yang X.Y., 2003, Арямкина Л.Л., 2006;) позволили определить значение вирусных агентов как триггерного фактора при развитии патофизиологических процессов у ряда больных с патологией ОДА. В роли провоцирующего фактора могут выступать респираторные вирусы, основное свойство которых - индукция воспалительных реакций в различных органах.

Полученные доказательства этиологической роли герпетических вирусов в развитии ряда заболеваний, традиционно не относимых ранее к инфекционным. Главной особенностью этих вирусов является способность к длительному внутриклеточному паразитированию, что может привести к аутоиммунным нарушениям. Патогенетические аспекты таких взаимодействий представлены на схеме 2.



Указанные вирусные агенты, имея свойство вмешиваться в обменные процессы, происходящие в клетках, разрушают их, приводя к нарушениям гомеостаза. Этому также способствуют генетические факторы и неблагоприятный преморбидный фон макроорганизма, находящегося в среде обитания, которой является современное урбанизированное общество с высоким риском токсикогенного влияния на организм стрессов и гипокинезии.

Возникающие иммунные нарушения и изменения неспецифической резистентности организма тесно взаимосвязаны в своем функционировании, дополняя друг друга. Это приводит к нарушениям противоинфекционной защиты, развивается гиперчувствительность аллергического и неаллергического типа, аутоиммунные и пролиферативные процессы. У лиц, генетически детерминированных к развитию иммуносупрессорного состояния, имеющих предпосылки для развития частых инфекционных и соматических заболеваний, депрессий, в том числе иммунодепрессии, с очагами хронических инфекций, может развиться тяжелая соматическая патология. У них отмечаются более тяжелые последствия, такие как инвалидизация с профнепригодностью.

В клинической практике приходится решать сложную задачу - несмотря на различия клинических форм, определить этиопатогенез основного заболевания как можно в более ранние сроки. В связи с этим, особое значение приобретает разработка экспресс методов диагностики различного рода патологических состояний, в том числе, направленных на идентификацию инфекционных процессов, особенно в случаях отсутствия патогномоничных симптомов возникающих инфекций или сглаженных, атипичных форм заболеваний (Львов Д.К., 2000; Высоцкий В.В., 2005; Кутырев В.В. с соавт., 2005). Использование возможностей новых технологий для определения различных патологических состояний организма, служащих вспомогательными методами диагностики, - рациональный путь совершенствования диагностического процесса.

...