Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00.16 - патологическая физиология

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции

Зима А.П.

Томск - 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, Рязанцева профессор Наталья Владимировна доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Новицкий

Заслуженный деятель науки РФ Вячеслав Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Степовая профессор Елена Алексеевна доктор медицинских наук, Дыгай профессор, академик РАМН Александр Михайлович доктор медицинских наук, Шкурупий профессор, академик РАМН Вячеслав Алексеевич

Ведущая организация:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук (г. Москва)

Защита состоится «___» __________2009 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «___» __________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Суханова Г.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема персистентных вирусных инфекций приобретает все большую актуальность в современной медико-биологической науке и практическом здравоохранении в связи с возросшей заболеваемостью, их широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов профилактики. Особо следует подчеркнуть трудность прогнозирования характера течения заболевания, выявления предрасположенности/резистентности к развитию хронических форм инфекции, отсутствие молекулярных технологий предупреждения развития осложнений: дегенеративных, фибротических и опухолевых процессов. Актуальным аспектом практической медицины остается недостаточная эффективность противовирусной терапии, а также отсутствие четких предикторов эффективности проведения дорогостоящих лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту. Принципиально важно, что растет число вялотекущих, стертых и бессимптомных форм вирусных инфекций [Воробьев А.А. и соавт., 2000; Покровский В.И. и соавт., 2000; Шевченко Ю.Л., 2000; Пименов Е.В. и соавт., 2003; Ивашкин В.Т., 2004; Hoffman H.R., 2006; Львов Д.К., Злобин В.И., 2007; Kneisson V.M. et al., 2007].

Эволюция инфекционной патологии ставит перед медициной новые задачи, обусловливая необходимость расширения и углубления фундаментальных исследований процессов в системе патоген-хозяин. Представления о патогенезе инфекционных заболеваний человека весьма динамичны. В настоящее время многие вопросы, касающиеся молекулярной патофизиологии инфекций, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, остаются открытыми. В частности, до конца не установлены факторы, определяющие разные исходы болезни: от полной элиминации инфекта и бессимптомного носительства до трансформации в прогредиентную хроническую форму с формированием осложнений (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома в случае вирусного гепатита С, парезы, параличи и аутоиммунные процессы при клещевом энцефалите). Это обосновывает необходимость проведения фундаментальных исследований, направленных на идентификацию общих и специфических для конкретной нозологии молекулярно-генетических факторов, определяющих ключевые фенотипические характеристики заболевания - от исхода взаимодействия патогена и организма человека до риска развития тяжелых форм заболевания и его осложнений, вероятности адекватного ответа на лекарственную терапию.

На современном этапе медицинских знаний нет сомнений в том, что форма течения инфекционного процесса определяется сложным комплексом взаимодействия патогена и организма человека. Известно, что особенности формирования и течения хронической инфекции обусловлены, с одной стороны, гетерогенностью самого патогена (вирулентность, контагиозность, лекарственная устойчивость), а, с другой, - определяются состоянием иммунной системы организма, от адекватности функционирования которой зависят характер течения и исход заболевания [Richardson M.M., 2006; Holden A.F. et al., 2007]. Факт формирования расстройств иммунного реагирования при развитии вирусных инфекций установлен давно. Известно, что возбудители инфекционных заболеваний обладают иммуномодулирующей активностью, вызывая иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых связана непосредственно с характером и тяжестью инфекционного процесса и зависит от преморбидного фона пациента [Долгих В.Т., 2000; Павлович С.А., 2001; Субботин А.В. и соавт., 2002; Чуйкова К.И., 2002; Ивашкин В.Т. и соавт., 2004; Серов В.В. и соавт., 2004; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. Особо следует акцентировать внимание на том, что флавивирусы, в том числе вирус гепатита С (hepatitis C virus - HCV) и вирус клещевого энцефалита (tick-borne encephalitis virus - TBEV), способны размножаться в эффекторных клетках иммунной системы, реализуя тем самым механизмы «ускользания» от иммунного надзора [Букринская А.Г., 1986; Погодина В.В. и соавт., 1986; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Пименов Е.В. и соавт., 2003].

Особую роль в дизрегуляции функционирования иммунной системы при развитии инфекционного процесса играют нарушения межклеточной сигнализации. Известно, что в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими в ходе реализации противоинфекционной защиты клетками макроорганизма важное значение принадлежит биологической мультисистеме - цитокин-рецепторной сети [Ярилин А.А., 1999; Фрейдлин И.С. и соавт., 2001; Хаитов Р.М., 2001; Симбирцев А.С., 2004]. В современной мировой литературе существуют данные, свидетельствующие о том, что возбудители могут использовать разные молекулярные механизмы, опосредующие изменение роли системы цитокинов в межклеточной кооперации иммуноцитов. В основе этого могут лежать как непосредственное воздействие патогенов на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами и рецепторный аппарат лимфоцитов, так и опосредованное их влияние путем супрессии внутриклеточных сигналов активации, механизмов сигнальной трансдукции и транскрипции [Ивашкин В.Т. и соавт., 2000; Кетлинский С.А., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Gomez I. et al., 2004; Nelson B.H., 2004; Best S.M. et al., 2005; Smith P.L. et al., 2005; Boettler T. et al., 2005; Bolacchi F. et al., 2006; Werme K. et al., 2008].

Высказывается предположение о генетически детерминированных нарушениях коммуникативных рецепторзависимых взаимодействий эффекторных клеток, а, следовательно, формирования иммунного ответа и элиминации инфекта. Установлено, что гены цитокинов и их рецепторов в популяции человека характеризуются аллельным полиморфизмом и наличием изоформ, что определяет их способность модулировать направление иммунного ответа и лежит в основе предрасположенности к саморазрешающейся инфекции или развитию хронического инфекционного процесса [Al Sharif F. et al., 1999; Рахманова А.Г. и соавт., 1999; Цой Р.М., 2001; Сенников С.В. и соавт., 2002; Ракова И.Г., Коненков В.И., 2004; Бархаш А.В. и соавт., 2005; Richardson et al., 2005; Коненков В.И. и соавт., 2006; Фрейдин М.Б. и соавт., 2006; Авдошина В.В. и соавт., 2007; Коненков В.И. и соавт., 2007; Chen T.Y. et al., 2007; Hennig B.J. et al., 2007; Lund R.J. et al., 2007; Persico M. et al., 2007; Hegazy D. et al., 2008].

Изучение механизмов, определяющих связь генотипа или аллельного варианта и клинических особенностей инфекционных заболеваний, является одним из приоритетных направлений молекулярной медицины. Многие вопросы, касающиеся молекулярно-генетических основ предрасположенности и резистентности организма к инфекции, являются дискутабельными. Накопленные в обозначенной тематике факты, однако, зачастую носят сугубо феноменологический характер. В связи с этим представляется весьма актуальным оценить ассоциированность предрасположенности/резистентности организма человека к персистентному течению флавивирусных инфекций с рядом аллельных вариантов генов иммуноцитокинов и их рецепторов. Анализ распространенности различных аллелей генов интерлейкинов и их рецепторов среди пациентов с хронической персистенцией вирусов семейства Flaviviridae позволит установить общие факторы, определяющие связь между индивидуальным молекулярно-генетическим профилем системы межклеточной кооперации и характером течения инфекционного процесса. В то же время логично предположить существование совокупности специфических молекулярно-генетических маркеров для каждого конкретного заболевания. Полученные в указанном аспекте фундаментальные знания не только дополнят существующие на сегодняшний день представления о механизмах генетически детерминированной предрасположенности и резистентности организма человека к хроническому течению Flaviviridae-инфекции, но и могут послужить основанием для разработки иммуногенетических подходов для ранней диагностики, прогноза, лечения и профилактики заболеваний.

Цель исследования: установить молекулярные механизмы дизрегуляции цитокинопосредованной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae.

Задачи исследования:

1. Оценить продукцию цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFб и IFNг) мононуклеарными лейкоцитами крови и направленность Th1/Th2-поляризации иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита).

2. Дать комплексную оценку состояния рецепторного аппарата (IL2R, IL4R, IL10R, TNFR, sTNFR, IFNR) лимфоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae.

3. Установить общие закономерности и особенности изменений цитокинопосредованной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хроническом вирусном гепатите С и клещевом энцефалите в зависимости от нозологической принадлежности инфекта, клинического течения инфекции.

4. Выявить молекулярно-генетические механизмы дизрегуляции цитокиновой системы при хронической Flaviviridae-инфекции у лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири.

Научная новизна. Впервые с привлечением современных гематологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования представлены знания фундаментального характера о роли генетически детерминированных механизмов дизрегуляции системы цитокинов в формировании длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae.

Показано, что у пациентов с хроническим носительством вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита) развивается дисбаланс цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови, опосредующий поляризацию иммунного ответа в направлении Th2, что подтверждается фактом обнаружения угнетения продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (IL2, IL2R, IL12, TNFб, TNFR) и увеличения - Th2-цитокинов (IL4, IL4R, IL10, IL10R) и комплиментарных им рецепторов (IL2R и TNFR).

Установлено, что характер и направленность изменений продукции и рецепции цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFб, IFNг) не зависят от этиологического варианта флавивирусной инфекции и согласуются с концепцией типовых механизмов развития инфекционного процесса.

Показано, что при остром клещевом энцефалите возрастает продукция мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (TNFб, IL2, IFNг), в то время как длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается дисбалансом продукции и рецепции цитокинов эффекторными клетками крови. Установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов и их рецепторов при персистенции TBEV определяются активностью инфекционного процесса.

Впервые комплексно и в сравнительном аспекте представлена характеристика системы цитокинов и их рецепторов у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита, сопровождающейся остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении, пациентов с бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита и больных хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение). Установлено, что цитокиновый статус крови у пациентов с длительной антигенемией TBEV и больных хроническим клещевым энцефалитом характеризуется однонаправленными различной степени выраженности изменениями продукции и рецепции основных иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFб, IFNг).

Выявлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С слабовыраженной и умеренной степени активности (на основании определения полуколичественного гистологического индекса активности - индекс Knodell), изменения в системе цитокинов и их рецепторов носят однонаправленный характер, при этом являются более выраженными в отношении изменения продукции Th2-цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности.

Впервые проведено исследование полиморфизма генов цитокинов и рецепторов (IL2, IL4, IL4R, IL10, IL12, TNFб) у лиц европеоидной популяции с хронической Flaviviridae-инфекцией, проживающих на территории Западной Сибири. Определено, что полиморфизмы в промоторных регионах генов IL10 и IL4RA50 обладают протективным эффектом в отношении HCV-инфекции; генов TNFA, IL12p40 и IL4RA50 - в отношении длительной антигенемии TBEV. Предрасположенность к развитию хронического вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10; клещевой нейроинфекции ? с C/C генотипом промоторного региона A-1188C гена IL12p40, Val/Ile генотипом промоторного региона Ile-50Val гена IL4R, полиморфизмами в промоторных регионах Q-576R гена IL4R и C-592A гена IL10.

Теоретическая и практическая значимость. Впервые установлены закономерности нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита). Определена важная роль в этом процессе нарушения продукции и рецепции иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFб, IFNг), регулирующих баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Установлены иммуногенетические факторы, обладающие протективным эффектом и определяющие риск прогрессирования и хронизации вирусного гепатита в отношении длительной персистенции вирусов гепатита С и антигенемии вируса клещевого энцефалита.

Положения исследования могут служить основанием для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования длительной персистенции вирусов в организме. Полученные фундаментальные знания представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения клещевого энцефалита и вирусного гепатита С, а также технологии персонализированной коррекции дизрегуляции цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови с целью проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений и своевременной профилактики развития хронических форм инфекции, а также осложнений, возникающих при длительной вирусной персистенции.

Положения, выносимые на защиту:

1. При хронических вирусных инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С), развивается типовой дисбаланс системы цитокинов.

2. Преимущественная активация Th2-пути иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) выражается в угнетении продукции IL2, IL12 и TNFб, увеличении секреции IL4 и IL10 мононуклеарными лейкоцитами крови.

3. Длительная персистенция вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) сопровождается дисбалансом продукции IL2, IL4, IL10 и TNFб, а также презентации на лимфоцитах комплиментарных им рецепторов (IL2R, IL4R, IL10R и TNFR1), опосредующим нарушение межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови.

4. Интра- и интернозологическая (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) оценка нарушений функционирования системы цитокинов при хронической Flaviviridae-инфекции демонстрирует однонаправленность, но различную степень их выраженности.

5. Среди лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири, степень риска прогрессирования и хронизации вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10 (С/А генотип); клещевого энцефалита ? A-1188C гена IL12p40 (C/C генотип), Ile-50Val гена IL4R, Q-576R гена IL4R, C-592A гена IL10; резистентность к заболеванию хроническим вирусным гепатитом С ? C-592A гена IL10 (C/С генотип) и Ile-50Val гена IL4RA50; в отношении длительной антигенемии TBEV ? G-308A гена TNFA, A-1188C гена IL12p40 (А/А генотип), Ile-50Val гена IL4R.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); V Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); III российский конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004); VI конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Анталия, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 100-летию со дня рождения А.Г. Панова «Современное состояние проблемы нейроинфекций» (Санкт-Петербург, 2005); Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет.» (Новосибирск, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); ХII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практическая конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке» (Томск, 2006); Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); Съезде неврологов Сибирского федерального округа (Ярославль, 2006); 15 Российско-Японский Симпозиуме медицинского обмена «Москва-2007» Пути развития и перспективы (Благовещенск, 2007); II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита», Москва, 15-16 ноября 2007.

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (разделы «Патофизиология системы крови», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), микробиологии (разделы «Рабдо- и арбовирусы», «Возбудители гепатитов»), кафедры фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии («Инфекция и иммунитет»), а также в лекционном курсе по инфекционным болезням для студентов лечебного, педиатрического и медико-биологического факультетов Сибирского государственного медицинского университета.

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4), «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), «Роль генетически детерминированных реакций системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7), а также результаты научно-исследовательских работ «Молекулярные механизмы предрасположенности и резистентности организма человека к персистентным бактериальным и вирусным инфекциям» РИ-112/001/158 (Государственный контракт от 05.09.2005 г. № 02.445.11.7110), «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы» 2006-РИ-112.0/001/384 (Государственный контракт от 09.06.2006 г. № 02.445.11.7419), «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма» (Государственный контракт от 27.02.07 г. № 02.512.11.2040), «Молекулярно-генетические основы управления адаптационной реактивностью системы крови человека при инфекции» (Государственный контракт от 05.06.2007 г. № 02.512.11.2112), в выполненных в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006, 2007-2012 годы».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 16 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, 28 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 97 таблицами. Библиографический указатель включает 534 источника (203 - отечественных и 351 - иностранных).

2. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 311 человек (188 мужчин и 123 женщины в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст - 33±3 лет), инфицированных вирусами клещевого энцефалита и гепатита С. Обследованные пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач - Заслуженный врач РФ канд. мед. наук В.М. Шевелев, заведующий отделением - канд. мед. наук, доцент Н.С. Бужак), в терапевтическом отделении медико-санитарной части «Строитель» г. Томска (главный врач - Н.Н. Бартфельд, заведующий отделением - О.В. Буров), гастроэнтерологическом отделении Томской областной клинической больницы (главный врач - Заслуженный врач РФ Б.Т. Серых, заведующий отделением - С.Ю. Стан) и инфекционном отделении городской больницы №3 г. Томска (главный врач - канд. мед. наук М.А. Лукашев, заведующий отделением - Г.В. Западаева).

Набор клинического материала осуществлялся при непосредственном участии заведующего кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора А.В. Лепехина, заведующего кафедрой терапии ФУВ и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Э.И. Белобородовой и профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук Н.Г. Жуковой.

Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, аутоиммунные, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и прием гепатотоксических лекарств.

В зависимости от этиологического фактора и ведущей органной патологии обследованные пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 196 человек, инфицированных вирусом клещевого энцефалита, ко второй - были отнесены 115 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.

Контрольной группой служили 80 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (54 мужчины и 26 женщин в возрасте от 20 до 42 лет, средний возраст - 29±4 лет).

Согласно клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2002], все обследованные пациенты с антигенемией вируса клещевого энцефалита были разделены на следующие группы:

I группа - 25 пациентов с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита (манифестная лихорадочная формы средней степени тяжести);

II группа - 89 пациентов с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита);

III группа - 75 пациентов с длительной антигенемией TBEV, сопровождавшейся остаточными проявлениями клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита);

IV группа - 7 больных, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение).

Первую группу обследованных лиц составили пациенты с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита. Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А84.0 МКБ-10) в острый период заболевания верифицировался на основании данных оценки неврологического статуса, определения уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита в клеще (35%) и крови у пациентов (100%) методами непрямой реакции гемагглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА), специфических антител классов IgM (87%) и IgG (74%) к антигену TBEV (ИФА), обнаружения вирусной РНК в крови методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также результатов инструментальных исследований.

Лабораторное обследование пациентов с клещевым энцефалитом осуществлялось в диагностическом центре ФГУП Микроген «НПО Вирион» в г.Томске. При этом 12,6% обследованных лиц проходили плановую противоэнцефалитную вакцинацию; 85,7% обратившихся на пункты серопрофилактики было проведено введение специфического иммуноглобулина с целью экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита. Инкубационный период оказался весьма вариабельным (от нескольких часов до 60 дней и более) и продолжался в среднем 10,2±0,9 сут. Клиническая картина обследованных пациентов с острой антигенемией TBEV характеризовалась гипертермией различной степени тяжести от 37,2 до 39,6є С (длительность - от 3 до 7 дней). Заболевшие предъявляли жалобы на головную боль, общую слабость, тошноту, мышечные и суставные боли разной локализации, сонливость. У больных отмечались явления менингизма без воспалительных изменений цереброспинальной жидкости, но со значительным повышением внутричерепного давления. В клинической картине острого периода инфекции обращали на себя внимание нарушения со стороны вегетативной нервной системы в виде дистального гипергидроза, стойкого красного дермографизма и лабильности артериального давления. У пациентов была обнаружена рассеянная неврологическая симптоматика в виде легкого центрального пареза мимических мышц, неравномерности кожных и глубоких рефлексов, непостоянных симптомов орального автоматизма, нарушения конвергенции и болезненности точек выхода тройничного нерва.

У лиц, отнесенных ко II группе [пациенты с длительным (более 6 мес после острого периода нейроинфекции) бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита], при наличии в крови вирусной РНК клиническая картина начального периода заболевания практически редуцировалась. Пациенты во время обследования активно жалоб не предъявляли, каких-либо патологических изменений со стороны неврологического и соматического статуса выявлено не было. Следует отметить, что при различных физических и/или эмоциональных нагрузках у незначительного числа обследованных (13,2%) выявлялись клинические признаки астенического синдрома.

III группу составили лица с остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода инфекционного процесса). Основными резидуальными явлениями были симптомы, входящие в рамки стойкого астено-вегетативного синдрома (быстрая утомляемость, раздражительность, нарушение концентрации внимания, снижение инициативы и ухудшение памяти, нарушение аппетита, расстройства сна, головокружение, слабость и эмоциональная лабильность), упорные головные боли, особенно к окончанию рабочего дня и после эмоционального напряжения. В неврологическом статусе выявлялись рассеянные органические микрознаки: слабость конвергенции, легкий центральный парез мимической мускулатуры, анизорефлексия глубоких брюшных рефлексов. Из вегетативных расстройств обращали на себя внимание бледность кожных покровов, гипергидроз дистальных отделов конечностей, повышенная общая потливость. Пациенты с остаточными проявлениями клещевого энцефалита характеризовались наличием тревожности и дистимическими нарушениями, частота встречаемости которых была существенно ниже по сравнению с периодом острой антигенемии, однако значительно выше по сравнению с аналогичным показателем у лиц с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV.

Клиническая история пациентов IV группы, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение), продолжалась более 8 мес после стационарного лечения лихорадочной формы острого клещевого энцефалита. Ведущим симптомом данной формы инфекции являлось наличие вялых параличей мышц шеи, плечевого пояса и конечностей (преимущественно верхних). Ретроспективный анализ выявил наряду с длительной антигенемией TBEV появление новой очаговой неврологической симптоматики, характерной для клещевого энцефалита. По срокам развития у всех пациентов диагностировалась прогредиентная форма хронического клещевого энцефалита. У больных регистрировалось нарастание возникших ранее парезов мышц шеи, плечевого пояса, при этом сухожильные и периостальные рефлексы с ног были повышенными. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности. У 33,3% пациентов обнаруживались амиотрофии, протекающие со снижением или полной утратой рефлексов. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности чаще по сегментарному типу. У 75,0% лиц была выявлена нейросенсорная тугоухость, 50,0% обследованных страдали вегетативными кризами.

В программу обследования были включены 115 пациентов, страдающих вирусным гепатитом С (по МКБ-10 рубрика В18.2 - хронический вирусный гепатит С). Все пациенты представляли группу риска по инфицированию возбудителем гепатита С (в анамнезе были оперативные вмешательства с переливанием крови, лечебные инъекции многоразовыми шприцами, лечение и удаление зубов, эпизоды наркомании, сексуальные контакты с больными вирусными гепатитами, работа с препаратами крови и больными у медицинских работников). Давность заболевания составляла от 1 года до 16 лет (в среднем 5±2 года).

Анамнестически у всех пациентов были определены сроки и источник инфицирования, оценивались жалобы, характер течения заболевания и объективные признаки. Проводились общий и биохимический анализ крови, оценка иммунного статуса. В клинике пациенты проходили ультрасонографическое исследование органов брюшной полости для исключения сопутствующей патологии, а также сцинтиграфическое исследование печени, выявившее умеренное диффузно неравномерное накопление радиофармпрепарата в паренхиме органа, характерное для воспалительного процесса.

Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на наличии клинико-инструментальных симптомов (гепато-, спленомегалия), клинико-лабораторных синдромов (холестаза, цитолиза, мезенхимально-воспалительного). Этиологическая верификация диагноза проводилась путем выявления в крови РНК вируса гепатита С (HCV) (метод ПЦР), серологических маркеров HCV (анти-HCV Ig к cor, С-протеину, неструктурным белкам NS-3, NS-4, NS-5, анти-HCV IgM) (метод ИФА).

С целью морфологического подтверждения диагноза и определения степени активности воспалительного процесса с использованием гистологического индекса активности по A. Knodell [1981] и стадии фиброза по U. Desmet [1995] всем пациентам проводилась пункционная биопсия печени по Mengini. По данным морфологического анализа полученного биопсийного материала, различали минимальную (1-3 балла), слабовыраженную (4-8 баллов), умеренную (9-13 баллов) и выраженную степени активности воспалительного процесса (более 13 баллов).

В соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анжелесе (1994) [Ивашкин В.Т., 1995], были выделены следующие группы. По степени активности воспалительного процесса: I группа - больные хроническим гепатитом С умеренной степени активности воспалительного процесса в печени; II группа - больные хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности. По стадии фиброза печени: I группа - больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 1; II группа - больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 2.

Анализ клинической картины у больных хроническим вирусным гепатитом умеренной степени активности показал, что наиболее часто выявлялся астено-вегетативный синдром (87,8%). Диспептический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 65,9% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) обнаруживался у больных хроническим гепатитом С в 45,2% случаев. В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. При анализе биохимических показателей крови ведущим синдромом был цитолиз. У больных хроническим гепатитом С повышение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) отмечалось в 77,4% случаев. Мезенхимально-воспалительный синдром (увеличение значений СОЭ, тимоловой пробы, повышение уровня г-глобулинов) по частоте встречаемости среди обследованных данной категории находился на втором месте.

Пациенты с хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности характеризовались отсутствием клинической симптоматики поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Из серологических маркеров HCV-инфекции у них выявлялся анти-HCV IgG. Эпизодически они получали курсы общеукрепляющей терапии. Трудовая деятельность не страдала.

Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 Ед/мл).

У пациентов с длительной персистенцией вирусов клещевого энцефалита, гепатита С, а также у здоровых доноров проводили комплексное сравнительное исследование иммунофенотипического статуса лимфоцитов, выявление особенностей продукции мононуклеарными лейкоцитами крови иммунорегуляторных цитокинов, анализ спонтанной и индуцированной in vitro рецепции цитокинов лимфоцитами, а также анализ полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов (табл. 1).

Определение общего количества лейкоцитов крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+) проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2002]. Результаты выражали в относительных и абсолютных значениях.

Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из цельной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (с=1,077 г/см3) [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37є и 5% СО2 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 (“Вектор-Бест”, Новосибирск), 10% инактивированная эмбриональная телячья сыворотка (“Биолот”, Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина) без митогена или с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (“Difco”, Германия) для активации лимфоцитов [Хаитов Р.М. и соавт., 1995]. Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL2, IL4, IL10, IL12, TNFб, IFNг) и астворимого рецептора к TNFб в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Biosource», Бельгия, «Cytimmun», США). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм.

Таблица 1 Распределение здоровых доноров и пациентов с клещевым энцефалитом, гепатитом С в соответствии с использованными методами исследования

№n/n	Методы исследования	Группы обследованных
		Здоровые доноры	Пациенты с антигенемией вируса клещевого энцефалита	Пациенты с хроническим вирусным гепатитом С
1	Определение количества лимфоцитов крови, экспрессирующих CD3-, CD4-, CD8-, CD22- и CD56-маркер, цитохимическим методом	19	21	45
2	Исследование содержания в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови цитокинов (IL2, IL4, IL10, IL12, TNFб, IFNг) и растворимого рецептора первого типа к TNFб с использованием иммуноферментного анализа	25	65	32
3	Определение количества рецептор-позитивных (IL2R, IL4R, IL10R, TNFбR, IFNгR) лимфоцитов крови методом проточной лазерной цитофлуориметрии	15	63	19
4	Дифференцированная оценка количества CD4+- и CD8+-лимфоцитов крови, экспрессирующих рецепторы к цитокинам (IL2R, IL4R, IL10R, TNFбR, IFNгR), методом проточной лазерной цитофлуориметрии	10	12	10
5	Исследование полиморфизма генов цитокинов и рецепторов (IL2, IL4, IL4R, IL10, IL12, TNFб) методом полимеразной цепной реакции	48	84	62

Оценку презентации мембраносвязанных форм рецепторов к IL2, IL4, IL10, TNFб и IFNг на лимфоцитах крови проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам, меченных флуоресцентными метками. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на лимфоцитах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий осуществляли на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 1).



Рис. 1. Распределение лимфоцитов по интенсивности флуоресценции в FL1-канале (оценка содержания TNFR1+-клеток, меченных FITC, в гейте лимфоцитарных клеток).

а - принцип автоматического выделения гейта лимфоцитов по показателям малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеивания;

б - одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте лимфоцитарных клеток по FL1-каналу (слева от оси - несветящиеся клетки, справа - FITC-положительные лимфоциты)

ДНК выделяли по инструкции, предлагаемой производителем тест-системы (“Лаборатория МЕДИГЕН”, Россия). Метод выделения основан на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропной соли (гуанидинизотиоцианат) на частицы силикагеля [Boom R. et al., 1991]. Генотипирование аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов (G-308A TNFA, T-330G IL2, C-590T IL4, Ile50Val IL4R, Q-576R IL4R и C-592A IL10) осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эппендорф» путем полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 2), и учитывая применение нами амплификатора «Tercik MC2» («ДНК- технология», Россия).

Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Шапиро-Вилка). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (у), ошибка среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). С целью попарного сравнения показателей в исследованных группах применяли критерий Манна-Уитни для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследованными показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) [Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001].

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий ч2 Пирсона и точный тест Фишера. Обработку результатов генетических исследований осуществляли с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI) [Флейс Дж., 1989].

Таблица 2 Характеристика исследованных полиморфизмов генов цитокинов

Ген	Полимор-физм	Структура праймера	Температура отжига (С)	Фермент рестрикции
TNFA	G-308A	5'- aggcaataggttttgagggccat -3' 5'- acactccccatcctcccggct -3'	57	Bsp19 I (Nco I)
IL2	T-330G	5'-tattcacatgttcagtgtagttct-3' 5'- acattagcccacacttaggt -3'	48	Mae I
IL4	C-590T	5'- cagggagagccaatcagt-3' 5'- atgatgtccagactccaggatct -3'	57	Bsm FI
IL4R	Ile-50Val	5'- gcg agt gga aga tga atg gt -3' 5'- cgc tgg gct tga agg ag - 3'	65	Rsa I
IL4R	Q-576R	5'- cccccaccagtggctacc-3' 5'- gccccaaacccacatttc -3'	93	Msp I
IL10	C-592A	5'- atccaagacaacactactaa -3' 5'- taaatatcctcaaagttcc -3'	54	Rsa I
IL12	А-1188C	5'- ctgatccaggatgaaaatttgg -3' 5'- cccatggcaacttgagagctgg -3'	62	Taq I

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Система цитокинов и их рецепторов в межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae Исследования особенностей реагирования системы иммунитета на различные антигенные структуры как в норме, так и при патологических процессах свидетельствуют о том, что существующий в организме баланс показателей клеточного звена иммунитета является одним из важнейших условий поддержания эффективного иммунного ответа на внедрение многообразных патогенов. Ключевая роль принадлежит иммунокомпетентным клеткам крови, в частности лимфоцитам и моноцитам/макрофагам [Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2004; Ярилин А.А., 2004].

В проведенном нами исследовании была предпринята попытка выявить общие закономерности и особенности цитокинопосредованной межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови при персистентном течении Flaviviridae-инфекции.

При рассмотрении фундаментальной проблемы взаимоотношения вируса и организма человека посредством концентрации внимания на роли в этом процессе цитокинопосредованного взаимодействия иммунокомпетентных клеток на первый план выходят ряд вопросов: являются ли изменения системы цитокинов отражением реактивности организма (в т.ч. иммунной системы) на вторжение патогена или неполноценный противовирусный иммунный ответ может быть генетически детерминирован; каковы молекулярные механизмы предрасположенности организма человека к хроническому течению (бессимптомному вирусоносительству) флавивирусных инфекций; возможен ли в перспективе переход к персонализированной профилактике и терапии вирусных инфекций на основе идентификации молекулярных механизмов повреждения?

Особенности состояния системы IFN-IFNR мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Известно, что ведущую роль в защите организма от вирусной агрессии играют интерфероны, обладающие противовирусным, иммуномодулирующим и антипролиферативным эффектами [Ершов Ф.И., 1998; Кузнецов В.П., 1998; Ройт А. и соавт., 2000; Samuel C.E., 2001; Кадагидзе З.Г., 2003; Maldonado R.A. et al, 2004].

Нами было установлено, что in vitro как в покое, так и при стимуляции ФГА мононуклеарные лейкоциты крови у пациентов с острой антигенемией TBEV секретировали значительно более высокие концентрации IFN, чем клетки у здоровых людей (рис. 2). Обнаруженный факт увеличения продукции IFNг мононуклеарными лейкоцитами, на наш взгляд, мог быть обусловлен рядом причин. С одной стороны, возрастание синтеза IFN можно рассматривать как универсальную реакцию иммунной системы, направленную на элиминацию вируса путем нарушения работы вирусного генома и вирусных протеинов [Samuel C.E., 2001; Вершинина М.Ю. и соавт., 2003; Nobuhiro F. et al., 2004; Bonjardim C.A., 2005]. С другой стороны, протективный эффект IFNг обусловлен в значительной степени его иммуномодулирующей активностью, нежели непосредственно противовирусным действием. Роль IFNг в противовирусном иммунном ответе связана с его активирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов, прямую цитотоксичность Т-лимфоцитов, антителоопосредованный лизис инфицированных клеток макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами [Samuel C. E., 1988, 1991, 2001; Павлова Л.Е. и соавт., 2000; Sun P. et al., 2006; Keller B.C. et al., 2006; Park G.S. et al., 2007].

Формирование иммунного ответа в условиях длительной персистенции вирусов является сложным и многокомпонентным процессом. Так, нами было установлено, что длительная персистенция HCV и TBEV сопровождается также повышением продукции IFN мононуклеарными лейкоцитами крови относительно соответствующих показателей у здоровых индивидов. При этом у больных с хронической HCV-инфекцией имело место возрастание и числа IFN-R+-лимфоцитов (рис. 2, 3).

Таким образом, в остром периоде флавивирусной инфекции мы отмечали высокий потенциал иммунокомпетентных клеток крови продуцировать IFNг. Однако иммуномодулирующая и антирепликативная способность этого противовирусного цитокина оказалась недостаточной для элиминации вируса. На наш взгляд, хроническое течение инфекции само по себе является доказательством того, что противовирусный иммунитет оказывается нерезультативным для естественного завершения инфекции.

Вероятно, неэффективность действия интерферонов является следствием нарушения трансдукции сигналов активации от цитокина. В последние годы в литературе появились сообщения, что вирусы семейства Flaviviridae обладают способностью ингибировать внутриклеточный каскад трансдукции сигнала (Jak/STAT) в ответ на действие IFN [Levy D.E., Darnell J.E., 2002; Best S.M. et al., 2005; Palmer D.R. et al., 2005; Lin R.J. et al., 2006; Park G.S. et al., 2007; Werme K. et al., 2008]. Высказываются предположения, что NS5 вирусов семейства Flaviviridae либо связывается с субъединицами рецептора к IFN, вызывая нарушение их пространственной конформации, и, следовательно, блокируя реализацию внутриклеточных эффектов, либо сам непосредственно выступает в роли вирусного эквивалента ? негативного регулятора белковой фосфатазы тирозина, удаляя фосфатные группы от каталитических доменов JAK [Best S.M. et al., 2005]. B.G. Neel, N.K. Tonks [1997] и M.M. Brierley, E.N. Fish [2002] высказывалось предположение, что вирусы комплекса клещевого энцефалита активируют SOCS-белки, подавляя тем самым действие интерферонов.

Особенности состояния системы TNFб-TNFR мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Особую роль в формировании специфического иммунного ответа, развивающегося при действии различных патогенных агентов - носителей чужеродной генетической информации, играет TNFб. Общеизвестно, что в физиологических условиях TNFб функционирует как иммунорегуляторный медиатор и обеспечивает пролиферацию и дифференцировку разных типов клеток, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, участвует в регуляции апоптоза [Кашкин К.П., 1998; Блохин Б.М. и соавт., 1999; Логинов А.С., 2001; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Симбирцев А.С., 2004; Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004; Wang L. et al., 2007]. TNFб, являясь одним из основных цитокинов, обладающих провоспалительной функцией, запускает "цитокиновый каскад" в очаге воспаления, увеличивая продукцию IL1, IL2, IL6, IL10 и INFг, которые в свою очередь оказывают влияние на экспрессию TNFб и его рецептора [Zylberberg H. et al., 1999; Kim K. et al., 2000; Зубова С.Г., 2001; Barash J. et al., 2003]. Таким образом, TNFб опосредует не только реализацию неспецифического иммунного ответа, но и выступает в качестве индуктора дифференцировки Th0 в Th1, модулируя тем самым направление специфического иммунного ответа в сторону преобладания клеточного звена резистентности [Luster M.I. et al., 1994; Ihle J.N., 1995; Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Roitt E.I. et al., 1998; Friedman S.L., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2003].

...