Характеристика и регуляция кардиального пейсмекерного канала If/HCN, разработка научных подходов к созданию биологических пейсмекеров

Изучение механизмов функционирования и регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток. Определение патогенеза нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровне калия.

Рубрика Медицина
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 19.01.2018
Размер файла 654,8 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Характеристика и регуляция кардиального пейсмекерного канала If/HCN, разработка научных подходов к созданию биологических пейсмекеров

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.06 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ЗАГИДУЛЛИН Науфаль Шамилевич

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» и Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова

Научные консультанты: доктор медицинских наук профессор Цыган Василий Николаевич

доктор медицинских наук профессор Белевитин Анатолий Борисович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Васильев Андрей Глебович

доктор медицинских наук профессор Войцицкий Анатолий Николаевич

доктор медицинских наук профессор Нифонтов Евгений Михайлович

Ведущая организация - Государственное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, г.Москва.

Защита состоится «31» марта 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета 215.002.03 при Военно-медицинской академии им С.М. Кирова по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Военно-медицинской академии им С.М. Кирова по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева 6.

Автореферат разослан «___» ______ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Дергунов А.В.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Широко известно, что частота сердечных сокращений (ЧСС) является важным фактором риска у больных с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью [Gilman M. et al, 1993; Шальнова С.А. и соавт., 2005]. В связи с тем, что кардиальная проводящая система генерирует и синхронизирует сокращения сердца, ел дисфункция может приводить к аритмиям и нарушениям проводимости различных степеней тяжести, вплоть до внезапной смерти. Ионный канал (If) активирующийся при гиперполяризации, регулируя ритм сердца, является определяющим для спонтанной диастолической деполяризации синоатриального узла (СА). Четыре изоформы данного канала hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel (HCN) 1-4 различаются не только своим распределением в тканях сердца и нервной системы, но и кинетикой, амплитудой и другими электрофизиологическими свойствами [Moosmang S. et al., 2001], и являются переносчиком ионов не только K+ и Na+ но и Ca2+ [Yu X. et al., 2004]. В связи с тем, что кальций является важным внутриклеточным мессенджером, важной задачей представляется изучение электрофизиологических свойств тока ионов кальция через канал If. В последние годы интенсивно разрабатываются варианты трансплантации биологических пейсмекеров (БП), созданы селективные блокаторы канала If, что требует глубокого понимания особенностей механизмов его работы [Barbutti A. et al., 2007; Kehat I. et al., 2001]. Идентификация изоформы HCN, наиболее близкой по своим свойствам к нативному каналу If, является необходимой предпосылкой для создания искусственного биологического пейсмекера путем трансфекции клеток-кандидатов, которые будут использованы в терапевтических целях.

Несмотря на то, что изменение внеклеточного раствора в случае нативных кардиомиоцитов (КМЦ), в частности, повышение концентрации калия, меняет кинетику тока и проницаемость ионов через канал If [Azene E. et al., 1999; Leitch S., 1995], подобные исследования в трансфицированных клетках, экспрессирующих некоторые изоформы HCN, проведены не были.

в-субъединицы всех калиевых каналов обладают рядом важных свойств, модулирующих изменение проводимости, селективности и других параметров. Однако, по данным различных авторов, неоднозначным является воздействие в-субъединицы канала HCN MiRP1, кодируемый геном KCNE2 на его электрофизиологические свойства: от снижения кинетики активации канала до увеличения плотности тока [Altomare C. et al., 2003; Qu J. et al., 2004]. Точное знание модулирующих свойств в-субъединицы канала HCN позволит создать биологические пейсмекеры с заданными характеристиками, которые могут быть использованы для лечения больных с различными поражениями синоаурикулярного узла.

Другой способ получения биологических пейсмекеров заключается в использовании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые дифференцируются в различные ткани организма и, в том числе, в кардиомиоциты (КМЦ), и представляют собой удобную модель для исследования механизмов дифференцировки пейсмекерных клеток [Gassanov N. et al., 2004]. В настоящее время факторы дифференцировки КМЦ исследованы не достаточно.

Селекция КМЦ в направлении пейсмекерных клеток (ПК), в том числе с использованием факторов дифференцировки, таких как сосудистый цитокин эндотелин-1, нейрорегулин-1 и ретиноевая кислота, является перспективным направлением развития клеточных терапевтических стратегий для регенерации и/или репарации кардиальной проводящей системы и создания биологических пейсмекеров.

Цель исследования. Изучение механизмов функционирования и регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из эмбриональных стволовых клеток.

Задачи исследования.

1. На основании микроэлектродных экспериментов представить характеристику кардиоспецифических субъединиц каналов HCN1 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel), HCN2 и HCN4. Определить HCN изоформу, наиболее близкую по электрофизиологическим параметрам нативному If току, в качестве кандидата для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла.

2. Определить патогенез нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровне калия.

3. В микроэлектродных и молекулярно-биологических исследованиях изучить влияние в-субъединицы калиевых каналов MiRP1 (MinK-related peptide) на кардиоспецифические изоформы канала HCN1, 2 и 4 в моделях трансгенной экспрессии изоформ в овариальных клетках китайских хомячков.

4. Установить патогенетические механизмы предсердного аритмогенеза путем исследования проведение ионов кальция через канал изоформы HCN2 при его трансгенной трансфекции в овариальных клетках китайских хомячков и в человеческих предсердных и неонатальных крысиных кардиомиоцитах.

5. На модели эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide), изучить возможности выделения по морфологическим критериям EGFP-ANP-позитивной сублинии клеток с фенотипом пейсмекерных клеток.

6. Определить влияние факторов дифференцировки - эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты - на клетки EGFP-ANP-позитивной сублинии эмбриональных стволовых клеток.

Научная новизна. В ходе решения поставленных задач получены следующие новые научные результаты:

1. Установлены электрофизиологические характеристики кардиоспецифичных изоформ HCN при их экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков.

2. Получены прямые доказательства проводимости ионов Ca2+ через канал HCN2, что может быть важным в лечении аритмий.

3. Показана модуляция электрокардиофизиологических свойств кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 в-субъединицей MiRP1.

4. Для создания биологического пейсмекера выделены трансгенные линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие зеленый флюоресцирующий белок под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора, в том числе сублинии клеток со свойствами пейсмекерных клеток.

5. Оценен эффект факторов дифференцировки эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты на линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок: эндотелин-1 увеличивает концентрацию пейсмекероподобных клеток, нейрорегулин-1 не влияет на данный показатель, а ретиноевая кислота в концентрациях 10-7 - 10-9 обладает эмбриотоксическим действием, менее 10-9 - увеличивает концентрацию клеток, схожих с кардиомиоцитами предсердий.

Научно-практическая значимость работы:

1) В микроэлектронных экспериментах установлены электрофизиологические свойства кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4. Наиболее близкой по электрофизиологическим свойствам к нативному каналу If оказалась изоформа HCN2, что позволяет её считать кандидатом для создания биологических пейсмекеров.

2) Показано, что в растворе с высоким содержанием калия изоформы HCN1 и, в первую очередь, HCN4 замедляют активацию тока ионов через канал, что проявляется снижением ЧСС. Данная модель исследования и полученные результаты могут быть использованы при изучении влияния гиперкалиемии плазмы крови на состояние сердечно-сосудистой системы.

3) В микроэлектродных экспериментах показано модулирующее влияние в-субъединицы калиевых каналов MinK-related peptide(MiRP)1 на электрофизиологические свойства и экспрессию HCN канала. При создании биологического пейсмекера коэкспрессия в-субъединицы MiRP1 способна модулировать свойства канала в зависимости от выбранной изоформы HCN.

4) Проведение кальциевого тока через канал If/HCN, как важного клеточного мессенджера, может иметь значение для понимания механизмов развития некоторых сердечно-сосудистых заболеваний и состояний, а также в исследованиях аритмогенных свойств канала If.

5) Среди эмбриональных стволовых клеток, трансфицированных геном EGFP, кодирующим зеленый флюоресцирующий белок, под контролем кардиоспецифичного промотора, возможно по морфологическим критериям выделение сублинии клеток, обладающих пейсмекероподобным фенотипом.

6) В связи с тем, что эндотелин-1 способствует дифференцировке кардиальных эмбриональных стволовых клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа, данный фактор роста может быть использован для увеличения количества пейсмекероподобных клеток в данной клеточной популяции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Кардиоспецифичные изоформы HCN1, HCN2 и HCN4 при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков обладают различной кинетикой активации. Наибольшим сходством с нативным If обладает изоформа HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера.

2. В растворе с высоким содержанием калия в несколько раз возрастает амплитуда токов у всех изоформ; изоформы HCN1 и HCN4 замедляют активацию тока ионов через канал, что может быть причиной отрицательного хронотропного действия при гиперкалиемии.

3. в-субъединица калиевых каналов MiRP1 модифицирует функции канала HCN: увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех изоформ HCN, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4 и дифференцированно действует на вероятность нахождения канала в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и, в то же время, увеличивает амплитуду открытия канала для всех изоформ.

4. Установлено проведение тока ионов Ca2+ через изоформу HCN2 и нативные крысиный и человеческий If канал.

5. В эмбриональных стволовых клетках возможно выделение клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced fluorecsent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide). В ANP-EGFP-позитивной линии клеток клетки веретенообразной формы обладали электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток.

6. Эндотелин-1 направляет дифференцировку ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает их количество в популяции. Нейрорегулин-1 не обладает таким действием. Ретиноевая кислота в низкой концентрации способствует дифференцировке ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону фенотипа предсердных клеток, а в более высоких - обладает тератогенным действием.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Всероссийском конгрессе молодых кардиологов (Москва, 2004), конгрессе Немецкого общества кардиологов (Манхайм, 2005), конгрессе Европейского общества кардиологов (Вена, 2007), Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2007, 2008), Конгрессе по кардиоваскулярной терапии и профилактике (Москва, 2008), проблемной комиссии по кардиологии Башкирского государственного медицинского университета, межкафедрального совещания в Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 6 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК, и 3 - в иностранных журналах.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы используются в учебном процесс на кафедрах нормальной физиологии, пропедевтики внутренних болезней Башкирского государственного медицинского университета, кафедре патологической физиологии и центра передовых медико-биологических технологий Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 244 страницах компьютерного текста, содержит 105 рисунков, 30 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 270 наименований, включающего 5 отечественных и 265 зарубежных источников.

Выражаю искреннюю и сердечную благодарность руководителю лаборатории клинической и молекулярной кардиофизиологии Кельнской университетской клиники (Германия) проф. У.Хоппе и ел сотрудникам за предоставленную возможность выполнения экспериментальной части исследовательской работы.

Материалы и методы

плейсмекероподобный клетка эмбриональный стволовой

Работа выполнена с использованием человеческих предсердных кардиомиоцитов, полученных интраоперационно, крысиных неонатальных вентрикулоцитов, овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ) и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), полученных из крысиных бластоцист.

Дизайн исследования представлен на рисунке 1, а методы исследования и количество экспериментов - в таблице 1.

Электрофизиологические методы. Для определения If/HCN токов в кардиомиоцитах и эмбриональных стволовых клетках использованы 2 варианта метода микроэлектродных экспериментов (МЭ): «вся клетка» (whole cell), «один канал» (single channel). Первый вариант позволяет записывать электрофизиологические характеристики всех каналов мембраны клетки, а второй - только единичных каналов. В варианте «один канал» представлены также 2 типа: «прикрепленный к клетке», в котором активность канала записывается непосредственно на мембране и «вне клетки», когда с помощью пипетки отрывают кусочек мембраны клетки.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1 Дизайн исследования. КМЦ - кардиомиоциты, МЭ - микроэлектродные эксперименты, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, ОККХ - овариальные клетки китайских хомячков, ПНУП - предсердный натрийуретический пептид, УЗФБ - усиленный зеленый флюоресцирующий белок, ПД - потенциал действия, ЭТ-1 - эндотелин-1, НР- нейрорегулин-1, РК-ретиноевая кислота

В исследованиях типа «вся клетка» использован усилитель Axopatch 200B (Axon instruments, Foster City, США) c шагом 10 кГц и фильтром 2 кГц. Записи токов были проведены при комнатной температуре (21-23єС). Внешний раствор содержал KCl (5 или 100 ммоль), NaCl (135 или 40 ммоль), CaCl2 (2 ммоль), глюкозу (10 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль); pH был оттитрован до 7,4 с помощью NaOH. При записи If тока в стволовых клетках к внешнему раствору для блокирования IK1, ICaL и Ito токов были добавлены, соответственно, BaCI2 (2 ммоль), CdCI2 (200 нмоль) и 4-аминопиридин (4 ммоль). Растворы в микропипетках с электродом (сопротивление 2-4 оМ) во всех опытах содержали K-глютамат (130 ммоль), KCI (15 ммоль), NaCI (5 ммоль), MgCI2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль) и Mg-AТФ (5 ммоль);pH был отрегулирован до 7,3 с KOH.

Таблица 1

Методы исследования и количественные параметры экспериментов

Методы/культуры клеток и задачи

ОККХ (свойства HCN изоформ)

ОККХ (в-субъединица)

ОККХ (проведение кальция)

КМЦ ушек предсердий

Крысиные неонатальные КМЦ

ANP-EGFP -позитивные ЭСК

ЭСК (влияние ЭТ-1, НР-1 и РК)

МЭ «вся клетка»

HCN1(9), HCN2(11), HCN4 (10); HCN1†(18), HCN2† (11), HCN4† (12); всего 61 клетка

HCN1(17), HCN2(11), HCN4(9); HCN1*(10), HCN2*(14), HCN4*(6);

всего 57 клеток

-

-

-

(128)

С РК на 6-8 день (10/10)‡, на 14-16 день (14/10)‡

МЭ «один канал», тип «прикрепленный к клетке»

HCN1(4), HCN2(7), HCN4(8), всего 19 клеток

HCN1(4), HCN2(7), HCN4(8); HCN1*(5), HCN2*(5), HCN4*(4); всего 33 клетки

HCN2 (4); HCN2 при Ca2+ 2ммоль (6); всего 10 клеток

3 сердца, 4 клетки

36 сердец, 4 клетки

-

-

МЭ «один канал», тип «вне клетки»

-

-

HCN2 при Na+10 ммоль (4-6); HCN2 при K+ 1 ммоль (4),
2 ммоль (5),4 ммоль (6),

7 ммоль (6); всего 14 клеток

-

-

-

-

Иммуноцитохимия, антитела к

-

-

-

-

-

б-актину, антитропонину I

коннексинам

-40, -43, -45

Планиметрический анализ

-

-

-

-

-

130 клеток

163 клеток

Анализ белка методом

Вестерн блот

-

HCN1, HCN2, HCN4; HCN1/HCN2/HCN4 +KCNE2

-

-

-

коннексины 40, 43, 45

коннексины 40, 45

Прим: ОККХ - овариальные клетки китайских хомячков; ANP-EGFP - atrial natiuretic peptide-enhanced green fluorescent protein (предсердный натрийуретический пептид - усиленная версия зеленого флюоресцирующего белка); ЭТ-1 - эндотелин-1, НР-1 - нейрорегулин-1, РК - ретиноевая кислота, ЭСК - эмбриональные стволовые клетки, КМЦ - кардиомиоциты † - HCN изоформы в высококалиевом растворе; * - HCN изоформы с коэкспрессией в-субъединицы; ‡ - в скобках количество клеток в контроле/при экспозиции с РК.

Величина If /HCN тока в экспериментах «вся клетка» была измерена при подаче тестового потенциала в диапазоне от - 30 до - 150 мВ (в некоторых экспериментах - до - 180 мВ) с увеличивающимся шагом 10 мВ между потенциалами в течении 2,45 - 3 с как разница между «мгновенным» током в начале гиперполяризации (рис. 2А) и плато в конце гиперполяризиции. Быстрая активация тока была получена при пульсовой деполяризации +20 мВ. Вычислялись следующие параметры: амплитуда тока, равная разнице между мгновенным» током в начале гипердеполяризации и максимумом тока, измеряемая в пА; плотность тока, равная соотношению амплитуды тока и емкости клетки в пА/пФ; кинетика активации (ф) в мс в точке, соответствующей 66,6% от максимума амплитуды. В некоторых экспериментах записывался также потенциал действия.

Рис. 2А. Запись HCN тока при гиперполяризации импульсом - 130 мВ в течение 3 секунд от потенциала покоя - 30 мВ с последующей деактивацией импульсом +20 мВ. Двухсторонней стрелкой показана точка вычисления силы тока канала, а односторонней - вычисляемая точка активации (в мс). 2Б. Запись потенциала действия (ПД) и его параметры. Овершут - позитивное отклонение пика ПД, ПП - потенциал покоя клетки, ДПД90 - длительность 90% потенциала действия

Полученные данные по каждому их этих параметров в последующем были использованы для построения следующих графиков: соотношение напряжение/сила тока, нормализованное по силе тока; соотношение напряжение/сила тока, кинетика активации (ф/напряжение). По нормализованным данным по формуле Больцмана I = Imax/(1+exp(-(Vtest-V1/2)/s), где I - плотность тока, Imax - максимальная плотность тока, Vtest - использованное тестовое напряжение, V1/2 - точка полуактивации и s - фактор уклона кривой, вычислялись следующие параметры: точка полуактивации (V1/2), соответствующая напряжению, при котором кривая активации находилась между верхним и нижним «плато»; точка наклона (s-фактор) - угол наклона кривой, определяемый в точке полуактивации. Потенциал действия (ПД) инициировали короткими деполяризующими импульсами (2 мс, 500-800 пА). В ПД определялись следующие параметры (рис.2Б): потенциал покоя (ПП), овершут, длительность 90% потенциала действия (ДПД90). При МЭ типа «один канал» экстраклеточный раствор содержал KCl (130 ммоль), NaCl (10 ммоль), ЭДТА (5 ммоль), HEPES-KOH (10 ммоль), pH оттитрован до 7,4 с помощью KOH. Боросиликатные пипетки с сопротивлением 7-10 мВ были заполнены раствором с KCl (70 ммоль), NaCl (70 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES-KOH (5 ммоль), pH 7,4 с KOH. Для записей токов типа “вырезанная мембрана” внешний раствор был идентичен внутрипипеточному. Усилитель Axopatch 200B, дигитайзер Digidata 1200 interface (Axon Instruments) были использованы для генерации импульсов, записи данных (10 кГц) и фильтрации (2 кГц). Записи токов были проведены при комнатной температуре (21-23є С). Продолжительность деполяризации равна 3 секундам с ПП - 30 мВ. При регистрации кальциевого тока через канал HCN в варианте «вне клетки» как пипеточный, так и внешний раствор содержали (ммоль): KCl (160 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль), ЭДТА (1 ммоль); pH 7,4 с KOH. Для кальциевых записей «вне клетки» как внутрипипеточный, так и внеклеточный растворы содержали соответственно: Ca2+-глютамат (2 или 20 ммоль) и TEA-бромид (136 или 100 ммоль),; pH был оттитрован до 7,4 с TEA-OH. Для записей типа «прикрепленный к клетке» был использован следующий состав внутрипипеточного раствора: К-глютамат (1, 4, 7, 10 ммоль) или натрия глютамат (10 или 100 ммоль) и/или Ca-глютамат (2 и 20 ммоль) и HEPES (10 ммоль). Общая осмолярность 140 ммоль достигалась добавлением ТЕА-бромида (pH оттитрован до 7,4 с TEA-OH). Внеклеточный раствор состоял из: K-глютамат (140 ммоль), Mg-глютамат (1 ммоль), Ca-глютамат (0,1 ммоль), HEPES (10 ммоль).

Для регистрации тока Ca2+ через If канал с целью блокирования кальциевого L- и T-типов, натрий-кальциевого обменного, плазма-мембранного АТФ-кальциевого и емкостного кальциевого каналов к внеклеточному раствору были добавлены блокаторы кальциевых каналов: соответственно нифедипин (10 мкмоль), эфонидипин (10 мкмоль), KB-R79435 (10 мкмоль), 6-карбоксиэозин (10 мкмоль) и SKF-96365 (10 мкмоль). В некоторых экспериментах в экстрацеллюлярный раствор добавлялся 8-бром-аденозин 3'5'-циклический монофосфат и If блокатор ивабрадин в концентрации 10 ммоль.В МЭ типа «один канал» ток линейной утечки и емкостный ток вычитались с помощью средних токов неактивных импульсов. Открытие и закрытие каналов определялись с помощью половинно-амплитудного критерия. Вероятность открытия (Pоткр), определяемая как возможность для канала быть открытым в период активных дорожек, и доступность - как фракция импульсов, содержащих, по меньшей мере, одно открытие, вычислялись при наличии одного или более каналов. Количество каналов в месте контакта с мембраной было определено путем деления амплитуды максимального тока на амплитуду одного канала. Амплитуда одного канала была определена при измерении всех амплитуд единичного канала на вершине распределения Гауса. Среднее время нахождения в закрытом состоянии (СВЗС) и средняя первая латенция (СПЛ - время от тестового импульса до первого открытия) были вычислены при наличии только 1 канала в патче.

Молекулярно-биологические методы. Электропорацию плазмид в ЭСК проводили с помощью электропоратора BioRad (Gen Pulser, США).

Для трансфекции овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ) плазмидами pAdCGI-HCN1, pAdCGI-HCN2, pAdCGI-HCN4, содержащими соответственно гены HCN1, HCN2 и HCN4, а также репортерный ген EGFP (enhanced green fluorescent protein), кодирующий зеленый флюоресцирующий белок, использовался набор «Lipofectamin plus» («Lipofectamin», США). Для изучения влияния в-субъединицы MIRP1 на свойства канала HCN ОККХ котрансфицировали плазмидами AdcGI-HCN (1, 2 или 4) и AdcRI-KCNE2, причем последняя кодировала красный флюоресцирующий белок (RFP).

Для качественного и количественного анализа мембранных белков трансфицированных ОККХ, использовали метод Вестерн блоттинга. Для определения изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 применяли соответственно специфические моноклональные анти-HCN1, анти-HCN2 и анти-HCN4 антитела (Alomone Labs, Израэль). После стандартного Вестерн блоттинга (BioRad Tankblot system, нитроцеллюлозная мембрана) иммуноцитохимическое окрашивание белков антителами визуализировали методом усиленной химической люминесценции (Amersham Pharmacia Biotech, США).

Культивирование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). При культивировании ЭСК линии D3 использовались средовые культуры: модифицированная среда Далбекко (МСД), содержащая глюкозу (4500 мг/л), фетальную телячью сыворотку (ФТС) в концентрациях 10%, 15%, 20%; L-глютамин (2 ммоль); пенициллин (50 Ед/мл) или стрептомицин (50 нг/мл); неэссенциальные аминокислоты (0,1ммоль, GibcoBRL-Life Technologies, Гайтерсбург, США). Для создания эмбрионального тельца (ЭТ) из ЭСК последние выдерживались в так называемых висящих каплях объемом 20 мкл с концентрацией 400 клеток в капле в течение 2 суток. Полученные ЭТ инкубировали в жидкой среде в течение 5 суток, затем переносили на чашки Петри, где они прикреплялись ко дну и начинали дифференцироваться в различные клеточные ростки. Из выросших ЭТ с помощью методики изоляции клеток из сердечной ткани [Isenberg I. et al., 1982] изолировали отдельные кардиомиоциты на разных стадиях дифференцировки: на ранней стадии развития, когда появляются первые спонтанно сокращающиеся клетки (от 7+3 до 7+5 суток), на промежуточной (от 7+6 до 7+8 суток) и поздней (от 7+9 до 7+12 суток) стадиях. Изолированные кардиомиоциты переносили на новые чашки Петри, где в течении первых 12 часов они прикреплялись к поверхности и возобновляли ритмичные сокращения. Участки спонтанно сокращающихся и флюоресцирующих клеток были рассечены с помощью скальпеля в период от 7+4 до 7+28 суток. Морфология и процентное содержание клеток различной формы определяли при осмотре 130 последовательно изолированных флюоресцирующих клеток.

Иммуноцитохимия изолированных ANP-EGFP-позитивных клеток. После формирования ЭТ единичные, энзиматически разъединенные ANP-EGFP-позитивные клетки платировали на предметные стекла. С целью подтверждения кардиальной природы изолированных клеток клеточную стенку разрушали путем спиртового лизирования и на стекло наносили первичные антитела против структурных белков кардиомиоцитов: мышиные моноклональные антитела, распознающие б-актин, козлиные поликлональные антитропониновые антитела (Sigma, ФРГ), козлиные анти-коннексин-40 антитела, мышиные анти-коннексин-43 моноклональные антитела (SantaCruz, США), кроличьи анти-коннексин-45 антитела (Chemicon International, США), анти-minK или анти-MiRP-1 поликлональные антитела. В качестве вторичных антител были использованы козлиные антимышиные IgM, козлиный антикроличий IgG, R-фикоэритрин коньюгированный анти-мышиный IgG и R-фикоэритрин-коньюгированный антимышиный IgG. Визуализация клеток проводилась с помощью конфокального микроскопа (Leica Mycrosystems, Германия).

Изоляция нативных клеток. Для исследования тока кальция через If канал были использованы нативные кардиомиоциты, изолированные интраоперационно из ушек предсердий 4 пациентов по методике UC.Hoppe (1999). Для определения кальциевого тока в If в вентрикулоцитах их изолировали из сердец новорожденных крыс (в возрасте 1 - 3 суток) по стандартной методике [Qu J. et al., 2001].

Статистическая обработка полученного материала была выполнена с помощью одностороннего критерия Стьюдента, линейной и сигмоидальной регрессии с помощью формулы Больцмана. Различия с уровнем вероятности p<0,05 считались достоверными.

Результаты исследований и их обсуждение

Электрофизиологическая характеристика кардиоспецифических HCN1, HCN2, HCN4 изоформ

При микроэлектродных экспериментах (МЭ) типа «вся клетка» при тестовых гиперполяризующих импульсах от - 30 до - 180 мВ при физиологических (K+=5 ммоль) концентрациях ионов внешнего (экстраклеточного) раствора и в растворе с высоким содержанием калия (К+=100 ммоль) было проведено изучение кардиоспецифных изоформ канала HCN, экспрессированных в овариальных клетках китайских хомячков.

Наибольшей кинетикой активации обладал ток изоформы HCN1, за ним следовал HCN2 и наименьшей - HCN4 (фHCN1= -
54,6±7,6, фHCN2= - 152,96±12, фHCN4= - 456,3±23,2). При этом в парах HCN1-HCN2, HCN2-HCN4 и HCN1-HCN4 достоверная разница параметра ф определялась при всех тестируемых потенциалах (p<0,01).

В то же время, разница в плотности тока, вычисляемой как отношение силы тока к емкости клетки, при сравнении всех трех изоформ оказалась несколько менее существенной, чем при сравнении кинетики активации. Так, разница в плотности тока в паре HCN1-HCN2 оказалась достоверной только в самом начале гиперполяризационного протокола - от - 40 до - 90 мВ (p<0,05). В паре HCN2-HCN4, наоборот, плотность тока достоверно различалась при более негативных потенциалах - от - 100 до - 150 мВ (p<0,05 и p<0,01), что, на наш взгляд, связано с более быстрым достижением плато (насыщением) у изоформы HCN4 в сравнении с другими изоформами. При сравнении потенциалов в паре HCN1-HCN4 значения различались при всех тестовых потенциалах, при которых ток вообще регистрировался (p<0,001). При этом активация тока изоформы HCN4 начиналась значительно позже, чем двух других изоформах (- 50 - - 60мВ против - 40 мВ, табл. 2). При нормализации кривых токов по максимальному значению регрессионный сигмоидальный анализ по уравнению Больцмана кривых активации токов изоформ подтвердил полученные данные: изоформа HCN1 обладала минимальным среди этих трех кардиоспецифичных каналов показателем половинной активации (V1/2= - 90,03±4,4 мВ). Изоформа HCN2, несмотря на то, что имела показатель половинной активации чуть меньший, чем у изоформы HCN4 (- 106,92±2,2 мВ против - 108,82±1,8 мВ; p>0,05), обладала наименьшим фактором уклона (s-факторHCN1 10,18±0,6 против s-фактораHCN2 10,18±0,59, p>0,05 и против s-фактораHCN413,55±0,67, p<0,05), то есть самой вертикальной кривой активации.

Таблица 2

Параметры нормализованных кривых активации

Параметры

HCN1

HCN2

HCN4

N

9

11

10

s-фактор

13,88±2,44

10,18±0,6†

13,55±0,7

V1/2, мВ

- 90,03± 4,4**‡‡‡

- 106,92±2,2

- 108,82±0,7

Активация тока

-30 - - 40мВ

-30- - 40мВ

-50 - - 60 мВ

Прим: * - достоверность различий между параметрами изоформ HCN1 и HCN2, † - между HCN2 и HCN4 и ‡ - между HCN1 и HCN4(*,†,‡ - p<0,05; **, ‡‡ - p<0,01, ***‡‡‡ - <p<0,001).

При сравнении плотности тока между изоформами в растворе с высоким содержанием калия можно отметить схожую кинетику активации для изоформ HCN1 и HCN2 (p>0,05 при всех потенциалах) и резкие отличия изоформы HCN4 от HCN1 и HCN2 почти при всех регистрируемых потенциалах, что значительно отличается от экспериментов с физиологическим экстрацеллюлярным раствором.

При сравнении электрофизиологических параметров в физиологическом и растворе с высоким содержанием калия определялась следующая динамика: во всех трех изоформах примерно в 2-3 раза возросла плотность тока, причем достоверность различий, увеличивающаяся с ростом напряжения тестового сигнала, оказалась больше в изоформе HCN2 и особенно в HCN4 (табл.3). При нормализации плотности тока по максимальному значению после увеличения концентрации К+ изменения в электрофизиологических свойствах изоформ несколько различались между собой. Следует отметить отсутствие достоверных изменений в угле наклона кривой активации (s-фактор) во всех изоформах c тенденцией к уплощению кривой (p>0,05).

Таблица 3

Параметры HCN изоформ в низко- и высококалиевом растворах

Параметры

HCN1

HCN2

HCN4

K+ 5

K+ 100

K+ 5

K+ 100

K+ 5

K+ 100

n

9

18

11

11

10

12

s-фактор

13,88±2

17,68±2

10,18±0,6

14,26±2

13,55±0,7

13,8±0,8

V1/2, мВ

- 90,03 ± 4*

- 108,8±5

- 106,92±

- 104,63±4

- 108,8±1‡‡‡

- 152,96±3

Активация

- 30 - -40мВ

- 40- -50мВ

- 30- -40мВ

- 30- -40мВ

- 50- - 60 мВ

- 70- - 80мВ

В изоформе HCN1 произошел достоверный сдвиг кривой активации влево, к более негативным значениям (V1/2(K+5)= - 90,03±4,4, V1/2(K+100)= - 108,8±4,75, p<0,05) и напряжение первой активации тока смещалось несколько влево (с - 30 - - 40 мВ к - 40 мВ - - 50 мВ). Повышение концентрации уровня K+ не сказалось на характере кривой активации изоформы HCN2 (V1/2(K+5)= - 106,92±2,2, V1/2(K+100)= - 104,63±4,4; p<0,05). Уклон кривой активации и первая активация тока также не изменились в сравнении с физиологическим раствором (p>0,05). В изоформе HCN4 изменения кривой активации оказались наибольшими: произошел значительный (на - 34 мВ) сдвиг влево (V1/2(K+5)= - 108,82±0,7, V1/2(K+100)= - 152,96±3,1; p<0,001) - рис.3. Соответственно, первая активации тока стала начинаться с - 70- - 80мВ в отличие от - 50 до - 60мВ в контроле.

При данных изменениях электролитного внеклеточного раствора, в отличие от плотности тока, кинетика активации в изоформах HCN1 и HCN2 в сравнении с контрольным (физиологическим) не изменилась.

Для изучения свойств отдельных изоформ HCN каналов на мембране клеток вне зависимости от его экспрессии на мембране использованы исследования типа «один канал» в варианте «прикрепленный к клетке» (cell attached). Время записи сигнала после импульса было выбрано таким образом, чтобы соответствовать времени регистрации в экспериментах типа «вся клетка» для последующего сравнения полученных результатов.

Рис. 3 Нормализованное по плотности тока соотношение плотности тока/напряжения для изоформы HCN4 в физиологическом растворе и с высоким содержанием калия

В отличии от плотности тока при исследовании «вся клетка», в данном варианте в парах HCN1-HCN2, HCN2-HCN4, HCN1-HCN4 было найдено небольшое количество достоверных изменений (табл.4). Средняя первая латенция была минимальна у HCN1, имела тенденцию к увеличению в HCN2 и HCN4, что соответствует кинетике активации в данных изоформах при исследовании с помощью метода «вся клетка». Среднее время нахождения канала в открытом положении было значительно меньше у изоформ HCN1 и HCN2 в сравнении с изоформой HCN4 (p<0,05), однако время нахождения каналов в закрытом состоянии достоверно не изменилось для всех сравниваемых изоформ.

Таким образом, нами была проведена электрофизиологическая характеристика токов кардиоспецифичных HCN каналов. Изоформа HCN1 показала самую быструю кинетику активации, далее следовала HCN2 и самой «медленной» изоформой оказалась HCN4. Кроме того, изоформа HCN1 превосходила HCN2 и особенно HCN4 по плотности тока. Ток HCN4 активировался гораздо позже других изоформ (- 50- - 60мВ) и значительно раньше достигал порога насыщения (при -130мВ). По литературным данным [Hoppe UC., 1999], нативный If ток обладал средней кинетикой активации (ф= - 220 мс), активировался при - 60 мВ, показатель полуактивации составил - 89,3±0,7 мВ, фактор наклона -12,7 ±0,7 мВ и был более сходен с током HCN2. Одним из вариантов создания биологического пейсмекера может быть трансгенная трансфекция мезенхимальных клеток геном, экспрессирующим необходимый ионный канал с последующей имплантацией компетентных клеток в область синоатриального узла [Barbutti A. et al., 2007]. Сравнение полученных нами электрофизиологических параметров HCN изоформ (табл.2) с вышеуказанными параметрами нативного тока If показало наибольшее сходство If тока с HCN2, что позволяет считать её оптимальным кандидатом для создания биологического пейсмекера.

Таблица 4

Параметры токов HCN1, HCN2 и HCN4 в микроэлектродных исследованиях типа «один канал» при - 90 мВ

Параметры

HCN1

HCN2

HCN4

N

4

7

8

Доступность (%)

99,250,7

94,332,5

98,131,8

Pоткр (%)

18,196,7

22,450,48

21,895,2

СВОС (мс)

1,270,19*

0,710,1‡‡

2,390,48

СВЗС (мс)

17,9311,68

24,122,9

15,575,8

СПЛ (мс)

179,894,8

328,4116,6

402,77127,3

Амплитуда (пА)

- 1,92 0,3

- 1,820,2

- 2,040,13

Прим.: доступность - фракция импульсов, содержащих, по крайней мере, одно открытие канала. Вероятность открытия (Pоткр.) - возможность для канала быть открытым в период активной фазы канала (вычислялась при наличии одного или более каналов). СВОС - среднее время для канала в отрытом состоянии, СВЗС - в закрытом, СПЛ (средняя первая латенция) - время до первого открытия в дорожке, n - количество экспериментов. Для сравнения групп был использован двусторонний тест Стьюдента, * - достоверность различий между параметрами изоформ HCN1 и HCN2, † - между HCN2 и HCN4 (* - p<0,05; ‡‡ - p<0,01).

Полученные нами электрофизиологические характеристики изоформ в целом соответствуют литературным данным [Chen J. et al., 2001; Ludwig A. et al. 2001, Ulens C. et al., 2001]. В то же время, в нашей работе можно отметить определенный сдвиг параметров V1/2HCN2(- 106,92±2,21 мВ) и V1/2HCN4 (- 108,82 ±0,67 мВ) в сторону отрицательных значений.

В клинической практике нередко встречаются случаи почечной недостаточности с повышением концентрации калия в крови, а также передозировки калий-содержащих препаратов, которые могут приводить к значительной брадикардии, вплоть до остановки сердца в диастоле [Vuckovic K. et al., 2004; Walter R.B. et al., 2002], однако неясными оставались механизмы отрицательного хронотропного эффекта данного нарушения электролитного состава на ЧСС. В наших исследованиях было показано, что в высококалиевом растворе значительно возрастает плотность тока в изоформе HCN1 и, особенно, HCN4. Кроме того, определялся значительный сдвиг кривой активации кривой влево, т.е. к более негативным значениям. Учитывая факт высокой плотности изоформы HCN4 в клетках синоаурикулярного узла [Biel M. et al., 2001], сдвиг кривой активации к более негативным потенциалам способен значительно увеличить порог активации, а также время достижения потенциала действия.

Модуляция HCN-тока в-субъединицей MiRP1

Овариальные клетки китайских хомячков, трансфицированные изоформами HCN1,2 и 4 (зеленое свечение), в качестве контроля, и коэкспрессированные с в-субъединицей MiRP1 (зеленое+красное) в опытной группе, выявлялись под микроскопом с помощью флюоресцентной лампы с последующими МЭ типа «вся клетка» и «один канал».

В МЭ типа «вся клетка» при гипердеполяризующих импульсах от - 20 до -180 мВ ни при одном напряжении плотность тока в контроле и при коэкспрессии KCNE2 не показала достоверной разницы. При нормализации данных по плотности тока и регрессионном анализе по формуле Больцмана кривые активации в обеих группах были практически идентичны, так же как и параметры нормализованной кривой не отличались между собой (V1/2HCN1= - 108,6±3, V1/2HCN1+KCNE2= - 113,6±1, p>0,05; s-факторHCN1= 15,9±2,4, s-факторHCN1+KCNE2 = 18,8±1,6; p>0,05 - табл. 5).

Таблица 5

Параметры кривой активации изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 и при коэкспрессии гена KCNE2

Показатели

HCN1

HCN2

HCN4

Контроль

+KCNE2

Контроль

+KCNE2

Контроль

+KCNE2

N

17

10

11

14

9

6

V1/2 (мВ)

- 108,6±3

-113,6±1

-103,1±2

-107,1±1

-151,9±2

-145,5±3

s-фактор

15,9±2,4

18,8±1,6

19,72±1,4

20,46±1,6

12,26±1,2

12,48±1,6

Первая актив., мВ

- 30- -40

-30- -40

-30- -40

-30- -40

-50- -60

-50- -60

При сравнении кинетики активации в обеих группах клеток в опытной группе ток нарастал быстрее контрольной. На рисунке 4 показано, что достоверность разницы достигалась в диапазоне физиологической активации от - 70 до - 90 мВ (фHCN1= - 342,8±52, фHCN1+KCNE2= - 237±37,3 при - 90 мВ, p<0,05).

Рис. 4 Кинетика активации тока HCN1 (полые круги) в сравнении c HCN1+KCNE2 (черные круги). Достоверные различия получены в диапазоне от - 70 до - 90 мВ (* - p<0,05)

При исследовании клеток в варианте «один канал» (табл.6) полученные результаты оказались несколько противоречивыми: с одной стороны, достоверно снизилась доступность (74,47±12% против 99,25±0,7% в контроле, p<0,01) и увеличилась средняя первая латенция (с 179,8±94,8 до 652,6±14,7мс, p<0,01), то есть в целом уменьшилась активность канала, но, с другой стороны, увеличилась амплитуда открытий (с - 1,9±0,3 до - 2,62±0,2 пА, p<0,05).

Таблица 6

Электрофизиологические параметры HCN1, HCN2 и HCN4 изоформ при МЭ типа «один канал», котрансфицированные c KCNE2

Параметры

HCN1

HCN1+ KCNE2

HCN2

HCN2+KCNE2

HCN4

HCN4+KCNE2

N

4

5

7

5

8

4

Дост. (%)

99,25±0,7

75,5±12*

94,33±2,5

56,81±16*

98,13± 1,8

98,2±0,9

Pоткр (%)

18,19±6,7

15,6±5

22,5±0,5

52,1±7*

21,9±5,2

15,2±4,7

СВОС (мс)

1,27±0,2

3,1± 0,5*

0,71±0,1

3,4±0,8 *

2,39±0,5

1,1±0,2*

СВЗС (мс)

17,93±11

25,2±14

24,12±2,9

12,2±1*

15,57±5,8

25,76±10,6

СПЛ (мс)

179,8±4,8

652,6±15*

328,4±117

264,3±146

402,8±127

343± 81

Ампл. (пА)

- 1,92± 0,3

- 2,6±0,2*

-1,82±0,2

- 2,6±0,1*

-2,04±0,1

- 2,9±0,2*

Наконец, при Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных генами HCN1 и HCN1+KCNE2, не было найдено достоверных различий по плотности белков HCN1 (p>0,05).

Плотность тока при коэкспресии с KCNE2 превосходила плотность тока в контроле, но достоверные различия были получены в диапазоне от - 120 до - 150 мВ (72,8±15,8 против 142,9±24,4 мВ при - 140 мВ, p<0,01).

При нормализации данных по плотности тока и построении сигмоидальной регрессии по уравнению Больцмана показано, что в-субъединица не влияла на показатели кривой активации изоформы HCN2 (V1/2(HCN2)= - 103,1±2 против - V1/2(HCN2+KCNE2)=107,1±1, s-факторHCN2=19,72±1,4 против s-фактор HCN2+KCNE2=20,46, p>0,05) - табл. 5. Изменения кинетики активации данной изоформы оказались схожими с HCN1: в целом скорость активации увеличилась, но достоверность была достигнута только в диапазоне физиологической активации (от - 70 до - 90мВ, p<0,05).

Анализ записей токов методом «один канал» в клетках, трансфицированных генами HCN2 и HCN2+KCNE2, показал, что изменения, индуцированные в-субъединицей, частично совпали с тенденциями, характерными для изоформы HCN1: выросла амплитуда открытий канала с - 1,82±0,2 до - 2,59±0,1 мВ (p<0,05), СВОС - с 0,71±0,1 до 3,4±0,8мВ, p<0,01, доступность снизилась с 94,33±2,5 до 56,81±1,6% (p<0,001), однако в отличии от HCN1, СВЗС уменьшилось с 24,12±2,9 до 12,2±1 мс (p<0,01) и возросла Pоткр. с 22,45±0,5 до 52,07±7,3; p<0,01 (табл.6).

При Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных HCN2 и HCN2+KCNE2, плотность белка во второй группе возросла на 63% (p<0,01).

При экспрессии HCN4 и HCN4 с KCNE2 в ОККХ плотность тока в опытной группе была выше в контроле, при этом достоверность различий была получена в диапазоне от - 110 до - 170 мВ (29,7±4,2 против 72,7±12мВ при - 140 мВ; p<0,001).

При нормализации данных по плотности тока и получении сигмоидальной регрессии по уравнению Больцмана показано, что в изоформе HCN4, аналогично HCN1 и HCN2, никакого влияния на кривую активации в-субъединица не оказала (V1/2(HCN4)= - 151,9±2 против V1/2(HCN4+KCNE2)=145,5±3, k(HCN4)=12,26±1,3 против (HCN2+KCNE2)=12,48±1,6; p>0,05) - табл. 5. По аналогии с HCN1 и HCN2, скорость активации значительно уменьшилась при всех тестовых потенциалах (при - 140 мВ фHCN4=1315±268,8 против фHCN4+KCNE2= =499±81,3, p<0,05).

Анализ записей токов методом «один канал» в ОККХ, трансфицированных генами HCN4 и HCN4+KCNE2, показал, что изменения, индуцированные в-субъединицей, не были схожими с теми, что были найдены при анализе HCN1 и HCN2 изоформ. В частности, доступность практически не изменилась (соответственно 98,13±1,8% против 98,2±0,9%; p>0,05), снизилось СВОС (2,39±0,5 мс против 1,11±0,2; p<0,05), однако так же, как и в остальных изоформах, увеличилась амплитуда (- 2,04±0,1 против - 2,96±0,2; p<0,05) - таблица 6.

Наконец, при Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных генами HCN4 и HCN4+KCNE2, плотность белка HCN4 во второй группе возросла на 56% (p<0,01).

Qu J. и соавт. (2004) впервые показали, что белок MIRP-1, кодируемый KCNE2 и соответствующий ему, может быть также в-субъединицей канала HCN. В различных клеточных системах были получены несколько противоречивые данные о воздействии белка MIRP-1 на свойства изоформ HCN [Altomare C. et al., 2003; Decher N., 2003]. Собственные результаты соответствуют данным Qu J. et al. (2000) в отношении изоформы HCN2 и несколько расходятся с данными Decher N.et al. (2003) и Altomare C. et al. (2003) в отношении HCN4 и HCN1. Полученные данные позволяют манипулировать электрофизиологическими свойствами HCN канала при создании соответствующего биологического пейсмекера.

Прямые доказательства проведения кальция через HCN и нативный If канал

В конфигурации «один канал», в варианте «вне клетки» нам удалось зарегистрировать активность канала HCN при его экспрессии в ОККХ. Ток имел время- и вольтажзависимость по аналогии с МЭ типа «вся клетка» для токов If/HCN. Симпатическая стимуляция клеток с помощью цАМФ (1 ммоль) значительно увеличила вероятность открытия HCN2 канала с 24,711,1% до 51,014,1% (p<0,05) без изменения амплитуды одиночных каналов. Кроме того, продемонстрировано значительное снижение вероятности открытия HCN2 канала при добавлении в его раствор ингибитора If тока ивабрадина в концентрации 50 мкмоль (25,87,1% против 6,083,5%; p<0,05).

Для получения прямых доказательств проведения тока Ca2+ через HCN канал была проведена регистрация открытий канала в режиме «вне клетки» в моноионном растворе с Ca2+, как единственным ионным носителем в его физиологической концентрации (2 ммоль). При гипердеполяризации ток ионов кальция через изоформу HCN2 обладал небольшой амплитудой - 0,870,1 пА и низкой вероятностью открытия 3,020,5% (при - 110 мВ). Амплитуда канала прогрессивно увеличивалась при более негативных потенциалах. Проводимость канала, вычисленная с помощью уравнения линейной регрессии, составила 8,91,2 пС для 2 ммоль Ca2+. Увеличение концентрации Са2+ до 20 ммоль привело к снижению проводимости до 5,78±1,1 пС.

Для дальнейшего подтверждения проводимости Ca2+ через HCN использовались эффекты прямой стимуляции цАМФ или его подавление ингибитором If канала ивабрадином. Кальциевый ток через HNC2 канал значительно активировался цАМФ, увеличивая вероятность открытия (3,020,5% в контроле против 8,662,3% в присутствии цАМФ 10 мкмоль при - 110 мВ; p=0,027), сокращая среднюю первую латенцию и среднее время открытия, в то время как амплитуда тока осталась неизменной (рис. 5). Более того, вероятность открытия HCN2 канала при проведении ионов кальция уменьшилась при добавлении ивабрадина в концентрации 10 ммоль (3,671,1% без ивабрадина против 1,160,9% с ивабрадином при - 110 мВ, p=0,033). Следовательно, проведенные исследования позволили установить проведение Ca2+ через канал HCN2.

Для подтверждения наличия тока в нативных клетках были проведены дополнительные одноканальные исследования кальциевого If тока в моноэлектролитном растворе на моделях человеческих предсердных КМЦ и КМЦ желудочков неонатальных крыс при инактивации всех других вольтажзависимых кальциевых каналов. Одноканальные записи при физиологических мембранных потенциалах показали амплитуду открытий 0,790,01 пА и вероятность открытия 3,531,59% (при - 90 мВ).

Влияние проводящих катионов Na+ и K+ на HCN-канал и проводящие свойства IHCN-Ca2+ было до сих пор неизвестно. Поэтому нами проведен анализ проницаемости Ca2+ в присутствии Na+ или K+ в МЭ типа «прикрепленный к клетке». Увеличение концентрации Ca2+ от 2 до 20 ммоль снизило проводимость канала (gCa2mM 7,90,9 пС, gCa20mM 4,590,7 пС; p=0,04) и обратный потенциал в позитивном направлении (Vrev-Ca2mM 15,34,23мВ, Vrev-Ca20mM 50,46,2 мВ, p=0,008). В сравнении с только HCN2-Ca2+ проведением, проводимость HCN2-Na+-Ca2+ была меньше (6,430,4 пС, Na+ 100 ммоль, Ca2+ 2 ммоль; p>0,05), в то время как HCN2-K+-Ca2+-проводимость увеличилась (10,90,48пС, K+ 4 ммоль, Ca2+ 2 ммоль; p<0,05).

Рис. 5 Одноканальная активность HCN2-Ca2+ тока (2 ммоль) значительно увеличилась при добавлении цАМФ (в центре, 10ммоль) и снизилась - ивабрадина (справа, 10 ммоль)

Проводимость HCN2-K+ значительно выросла в отсутствии экстрацеллюлярного Ca2+ с ростом концентрации калия (1 ммоль K+ 10,01,2 пС, 4 ммоль K+ 12,81,0 пС, 7 ммоль K+ 15,20,5 пС, 10 ммоль K+ 21,00,6 пС; p>0,05), в то время как смешанная K+- Ca2+-проводимость не изменялась при различной экстрацеллюлярной концентрации K+ (1 ммоль K+ 9,230,9п С, 4 ммоль K+ 10,90,48 пС, 7 ммоль K+ 10,80,45пС, 10 ммоль K+ 11,50,29 пС; p>0,05).

...

Подобные документы

  • Понятие и функции стволовых клеток, их типы в зависимости от способов получения, потенциал. Характеристики эмбриональных стволовых клеток. Дифференцировки стволовых клеток костного мозга. Органы и ткани, которые ученые смогли вырастить с их помощью.

    презентация [817,5 K], добавлен 04.11.2013

  • Биографии лауреатов Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 г. Разработка метода генного таргетирования. Основные характеристики эмбриональных стволовых клеток. Использование нокаутированных мышей для изучения наследственных заболеваний человека.

    курсовая работа [985,0 K], добавлен 02.08.2020

  • Ознакомление с понятием и историей использования стволовых клеток. Рассмотрение особенностей эмбриональных стволовых клеток, геном которых находится в "нулевой точке", а также соматических - клеток взрослого организма. Основы процесса регенерации.

    реферат [22,6 K], добавлен 21.05.2015

  • Основное свойство стволовых клеток - дифференциация в другие типы клеток. Виды стволовых клеток. Рекрутирование (мобилизация) стволовых клеток, их пролиферация. Болезни стволовых клеток, их иммунология и генетика. Генная терапия и стволовые клетки.

    курсовая работа [94,3 K], добавлен 20.12.2010

  • Дифференциация стволовых клеток. Использование стволовых клеток в медицине: проблемы и перспективы. Пуповинная кровь как источник стволовых клеток. Лекарства будут испытывать на стволовых клетках. Эмбриональные и соматические стволовые клетки.

    реферат [851,0 K], добавлен 24.07.2010

  • Понятие, классификация и применение стволовых клеток. Эмбриональные, фетальные и постнатальные клетки. Клиническое применение стволовых клеток для лечения инфаркта. Опыт применения биологического материала в неврологии и нейрохирургии, эндокринологии.

    реферат [26,1 K], добавлен 29.05.2013

  • Изучение источников и особенностей применения стволовых клеток. Исследование технологии выращивания искусственных органов на основе стволовых клеток. Преимущества биологического принтера. Характеристика механических и электрических искусственных органов.

    презентация [2,1 M], добавлен 20.04.2016

  • Роль тучных клеток в регуляции гомеостаза организма. Локализация тучных клеток, их медиаторы. Секреция медиаторов и их функции. Основные типы тучных клеток. Рецепторы и лиганды, эффекты медиаторов. Участие тучных клеток в патологических процессах.

    презентация [2,2 M], добавлен 16.01.2014

  • Общее понятие об эмбриональных стволовых клетках. Выделение и культура in vitro. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Сущность понятия "калибровка". Важные факторы транскрипции. Особенности стимулирования стволовых клеток в дифференцированные.

    контрольная работа [1,3 M], добавлен 02.12.2013

  • Основные способы получения стволовых клеток в клеточной медицине. История их открытия и изучения в ХХ веке. Уникальность их строения, Выращивание органов для трансплантации. Виды тканеспецифичных стволовых клеток. Сферы применения клеточных технологий.

    презентация [822,9 K], добавлен 30.03.2014

  • Понятие и значение в жизнедеятельности организма стволовых клеток, их классификация и разновидности, структура. Способы получения стволовых клеток и направления их использования, значение в терапии многих заболеваний. Проблемы генной и клеточной терапии.

    презентация [842,0 K], добавлен 22.10.2014

  • История изучения стволовых клеток, их типы и свойства. Стволовые клетки эмбрионов и взрослых организмов. Применение стволовых клеток в клинической практике: от регенерации поврежденных органов до лечения заболеваний, не поддающихся лекарственной терапии.

    презентация [1,3 M], добавлен 09.12.2013

  • Содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток и изменение числа хромосом. Атипизм обмена нуклеиновых кислот и углеводов. Изменение изоферментного спектра. Накопление в крови эмбриональных белков и ферментов. Изменение функционирования регуляторных систем.

    презентация [1,1 M], добавлен 15.09.2015

  • Регенеративная клеточная медицина. Роль эмбриональных и соматических стволовых клеток в восстановлении поврежденных участков органов и тканей. Лечение заболеваний крови. Безграничные возможности терапевтического использования "строительного материала".

    реферат [31,2 K], добавлен 20.10.2009

  • Роль клеток миелоидного и лимфоидного рядов в функционировании иммунной системы. Комплементарная система как составляющая врожденного иммунитета. Положительная и отрицательная селекция развивающихся Т-клеток в тимусе и вне его. Этапы развития В-клеток.

    реферат [30,1 K], добавлен 10.10.2009

  • Общие представления о цитокинах: описание, физические и химические свойства, назначение. Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях, изучение их синтеза на уровне отдельных клеток. Изучение экспрессии генов и анализ полиморфизма.

    курсовая работа [45,5 K], добавлен 23.02.2012

  • Закладка и первичная дифференцировка парафолликулярных клеток щитовидной железы человека, их значимость в регуляции процессов жизнедеятельности. Цитология и физиология С-клеток щитовидной железы. Медуллярный рак как один из видов злокачественной опухоли.

    реферат [21,5 K], добавлен 21.03.2011

  • Характеристика эмбриональных стволовых клеток (ЭСК): свойства генома, основные источники и способы выделения. Характеристика традиционных методов лечения цирроза печени. Сравнительный анализ традиционного лечения и лечения цирроза печени с помощью ЭСК.

    курсовая работа [1,5 M], добавлен 23.07.2011

  • Специфика этических проблем медицинской генетики. Вопрос конфиденциальности генетической информации. Этика и политика клонирования человека. Нравственный и юридический статус эмбриона. Различие во взглядах на использовании эмбриональных стволовых клеток.

    эссе [26,1 K], добавлен 17.06.2015

  • История открытия метода гибридизации соматических клеток, его использование в регенераторной медицине; инструменты клеточной инженерии. Иммунотерапия онкологических заболеваний с помощью стволовых и дендритных клеток. Направления развития наномедицины.

    реферат [45,9 K], добавлен 14.12.2012

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.