Криптоспоридиоз у больных ВИЧ-инфекцией: клинико-экспериментальное и паразитологическое исследование

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КРИПТОСПОРИДИОЗ У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ: КЛИНИКО-ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Карташев Владимир Васильевич

Ростов-на-Дону 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор

АМБАЛОВ Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

СИМОВАНЯН Эмма Никитична

доктор медицинских наук,

профессор

ЛУЧШЕВ Владислав Иванович

доктор медицинских наук

старший научный сотрудник

ЯГОВКИН Эдуард Александрович

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «____»_______ 2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022 г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « ____ » __________________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук Т.Н. Кузина

1. Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Более ста лет назад Эрнест Эдвард Тизер (1875 - 1965) впервые обнаружил и описал нового паразита из класса споровиков (E. Tyzzer, 1907).

С момента этого открытия прошло около 70 лет прежде чем криптоспоридиоз был выявлен у человека. В 1976 году почти одновременно были опубликованы описания двух случаев болезни, один из них в форме энтероколита у ребенка с сохранным иммунитетом (F. Nime et al., 1976), другой - в виде обильной водной диареи у взрослого больного с иммунодепрессией (J.Meisel et al., 1976).

В целом 7 случаев криптоспоридиоза были опубликованы и суммированы в литературе к 1980 году, из них у 5 больных заболевание возникло на фоне иммунодепрессии (R. Bird, M. Smith, 1980). В связи с этим авторы отметили в своей публикации: «В тех случаях, когда иммунная система функционирует нормально, и нет никаких других фоновых поражений кишечника, криптоспоридиоз не представляет никаких проблем для здоровья и ориентировочно может рассматриваться как оппортунистический возбудитель». Эти слова были написаны в то самое время, когда стали регистрироваться первые случаи СПИД.

Уже через три года появилась первая статья, в которой были представлены 10 случаев криптоспоридиоза с затяжной водной диареей у больных СПИД гомосексуалистов (P. Ma, R. Soave, 1983). А еще через год число описанных в литературе случаев криптоспоридиоза у больных СПИД достигло пятидесяти (P. Ma, 1984). К концу 1984 года из числа всех описанных в литературе случаев криптоспоридиоза больные со СПИД составляли 83%, а 55% из них погибли (T. Navin, D. Juranek, 1984).

Связь криптоспоридиоза со СПИД была настолько очевидной, что криптоспоридиоз стал одним из общепризнанных индикаторов СПИД задолго до открытия и описания самого вируса иммунодефицита человека. С начала эпидемии ВИЧ-инфекции и до сегодняшнего дня основная часть исследований, посвященных проблеме криптоспоридиоза, так или иначе были связаны с проблемой СПИД. Исследователей меньше интересовала проблема криптоспоридиоза у больных, находящихся на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Отчасти это было обусловлено тем, что предположение о криптоспоридиозе и целенаправленное обследование больных на криптоспоридиоз выполнялось только у больных ВИЧ-инфекцией при появлении диареи.

Больные ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД подвержены особо тяжелым затяжным и хроническим формам криптоспоридиоза с обильной водной диареей, обезвоживанием и неблагоприятным прогнозом для жизни (S. Pitlik et al., 1983; C. Petersen, 1992; B. Ramratnam, T. Flanigan, 1997; D. Clark, 1999; S. Caccio, 2005). Однако, почти одновременно с описанием злокачественных форм криптоспоридиоза у больных СПИД появлялись единичные публикации о более благоприятных клинических вариантах болезни со спонтанным выздоровлением и сообщения о ее бессимптомных формах (F. Zar et al., 1985; F. Zar, 1990; E. Janoff et al., 1990; D. Saltzberg et al., 1991; C. Blanshard et al., 1992; R. Goodgame et al., 1993; I. McGowan et al., 1993; M. Pettoello-Mantovani et al., 1995; S. Chhin et al., 2006). Благоприятно протекающие формы любых болезней редко привлекают внимание врача.

Варианты клинического течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией напрямую зависят от степени выраженности иммунодепрессии (T. Flanigan et al., 1992; E. Pozzio et al., 1997). Единичные публикации последних лет свидетельствуют также и о том, что клинические проявления криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией могут быть обусловлены биологическими свойствами отдельных видов и генотипов возбудителя (M. Messner et al., 2001; C. Chappell et al., 2006; V. Cama et al., 2007).

Важность проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией неоднократно подчеркивалась и отечественными учеными (В.И. Покровский, В.В. Покровский, 1988; Н.А. Чайка, Т.В. Бейер, 1990; В.И. Покровский, Б.А. Годованный, 1995; В.В. Шкарин, С.Н. Соринсон, 1999; В.В. Покровский и др., 2000, 2003; Е.С. Белозеров, Е.И. Змушко, 2003; Ю.В. Лобзин и др., 2003; В.М.Волжанин, 2008). Однако специальные исследования по проблеме криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в России не выполнялись.

Образовавшийся разрыв между информацией о криптоспоридиозе у больных ВИЧ-инфекцией за рубежом и отсутствием данных о состоянии этой проблемы у больных ВИЧ-инфекцией в России, а также неоспоримое значение проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией определяют актуальность данного исследования.

Цель работы. На основе изучения эпидемиологии криптоспоридиоза в Ростове-на-Дону, особенностей его клинического течения и лабораторной диагностики у больных ВИЧ-инфекцией, а также методов оценки биологических свойств паразита разработать программу диагностики и прогноза криптоспоридиоза у больных с разными стадиями ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1) исследовать чувствительность разных лабораторных методов диагностики криптоспоридиоза и определить частоту криптоспоридиоза у больных с ВИЧ-инфекцией, дать клиническую характеристику криптоспоридиоза в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также изучить влияние разных клинических форм криптоспоридиоза на динамику клинического течения и прогноз ВИЧ-инфекции;

2) выполнить молекулярно-генетические исследования паразита и определить доминирующий вид криптоспоридий у больных ВИЧ-инфекцией в Ростове-на-Дону;

3) исследовать биологические особенности паразита, в частности, жизнеспособность ооцист, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией с разными клиническими проявлениями криптоспоридиоза, провести оценку вирулентности криптоспоридий при экспериментальной инфекции у лабораторных мышей SCID, а также потенциал роста на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина;

4) провести исследование ооцист паразита в питьевой воде городской системы водоснабжения Ростова-на-Дону, а также изучить содержание ооцист криптоспоридий в речной воде бассейна Нижнего Дона для оценки ее роли в эпидемиологии криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией;

5) оценить потенциальную роль отдельных сельскохозяйственных животных и птиц как резервуара криптоспоридий и зоонозного источника инфекции для больных ВИЧ-инфекцией;

6) на основе полученных данных разработать программу оптимизации клинико-лабораторной диагностики и прогноза течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна

Установлены преимущества иммунологических методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза (прямая иммунофлюоресценция и иммуномагнитная сепарация) при обследовании больных ВИЧ-инфекцией над традиционными методами лабораторной диагностики (прямая микроскопия, окраска мазка испражнений по Циль-Нильсену). Эти преимущества характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью методов первой группы, которые позволили выявить высокую частоту бессимптомных формы болезни форм криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

Впервые установлена зависимость клинических проявлений и исходов криптоспоридиоза от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также отрицательное влияние хронического криптоспоридиоза на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции уже на ее начальных стадиях.

Впервые в России выполнено генотипирование криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией и определен доминирующий вид паразита у больных ВИЧ инфекцией в Ростовской области - С. parvum.

Впервые в истории изучения криптоспоридиоза изучены биологические свойства криптоспоридий, обнаруживаемых в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией. В частности, исследована жизнеспособность выделяемых с испражнениями больных ВИЧ-инфекцией ооцист по показателю активности эксцистирования и их вирулентность для мышей SCID, а также потенциал роста паразита на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина.

Впервые выполнена эпидемиологическая оценка качества питьевой воды в г. Ростове-на-Дону и речной воды бассейна Нижнего Дона по содержанию в ней ооцист криптоспоридий, а также определен потенциал зоонозного резервуара инфекции среди сельскохозяйственных животных, которым является крупный рогатый скот.

Практическая значимость

Разработана программа клинико-лабораторной диагностики и оценки прогноза криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от ее стадии.

Расширены показания к лабораторному обследованию больных ВИЧ-инфекцией на криптоспоридиоз. Рекомендованы методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, что повышает вероятность его распознавания у больных ВИЧ-инфекцией.

Изучены биологические особенности криптоспоридий, обнаруженных в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией, выполнена оценка их жизнеспособности, потенциал роста при культивировании в искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина, разработана модель оценки вирулентности паразита на экспериментальной модели инфекции у мышей SCID.

Показано, что клинические проявления и исход криптоспоридиоза варьируют в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, вероятность выздоровления существует только у больных на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Установлено отрицательное влияние криптоспоридиоза на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции даже на ранних клинических стадиях при отсутствии выраженного иммунодефицита. При выявлении криптоспоридиоза у больного ВИЧ-инфекцией следует его в число первоочередного кандидата для проведения высоко активной антиретровирусной терапии.

Установлен доминирующий вид паразита, являющийся возбудителем криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией, естественный резервуар инфекции в природе, показано, что вода не является основным путем передачи инфекции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. При использовании высоко чувствительных методов лабораторной диагностики выявлена высокая частота криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону, который характеризуется на ее ранних стадиях значительным удельным весом легких и бессимптомных форм.

2. ВИЧ-инфекция и криптоспоридиоз оказывают взаимное отягчающее влияние друг недруга. Отрицательное влияние ВИЧ-инфекции проявляется на поздних стадиях болезни и характеризуется увеличением удельного веса клинически проявляющихся и хронических форм криптоспоридиоза. Отрицательное влияние криптоспоридиоза выражается в ускорении темпов прогрессирования ВИЧ-инфекции у больных с хронической формой болезни, сопровождающейся диареей.

3. Доминирующим видом возбудителя криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону является C. parvum, что является свидетельством преимущественно зоонозного резервуара и источника инфекции.

4. Экспериментальная инфекция у мышей SCID является наиболее чувствительной моделью оценки вирулентности криптоспоридий, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией (с учетом видовой принадлежности обнаруженного паразита, представленного C. parvum), показатель эксцистирования ооцист и рост криптоспоридий на искусственной питательной среде не обладают такой чувствительностью.

5. Питьевая вода не является ведущим фактором передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

6. Основным естественным резервуаром инфекции в природе является крупный рогатый скот.

Внедрение в практику

Материалы диссертации внедрены:

1) в работу Областного центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями в Ростовской области;

2) в работу Северокавказского Центра СПИД;

3) в учебный процесс на кафедре инфекционных болезней РостГМУ

Росздрава.

Подготовлены и опубликованы методические указания для инфекционистов и врачей амбулаторно-поликлинического звена «Стандарты диагностики и лечения инфекционных болезней» (Ростов-на-Дону, 2008 г.). Предложена программа оптимизации диагностики и прогноза течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией.

Апробация работы

Основные результаты исследования представлены на научных конференциях: «Developing Research for a Common Future. The 2nd German-Russian Cooperative Symposium, 4-8 June, 2002» (Rostov-on-Don, Russia, 2002); «IWA Symposium on Health-Related Water Microbiology, 14-19 September, 2003» (Cape Town, South Africa, 2003); «Improving Research for a Common Future. The 3rd German-Russian Cooperative Symposium, 29-31 May, 2004» (Cologne, Germany, 2004); « The 3rd Congresss of German-Greek Academy for Biomedicine, 29-31 May, 2004» (Kavala, Greece, 2004); « The Fourth International Giardia Conference and the First Combined Giardia/Crypto Meeting in Amsterdam, 20-24 September, 2004» (Amsterdam, Netherlands, 2004); «The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases, 16-21 September, 2006» (Obihiro, Hokkaido, Japan, 2006). The 4-th German-Russian Cooperative Symposium, 6-10 June, 2006» (Rostov-on-Don, Russia, 2006). I Съезд инфекционистов ЮФУ (Краснодар, 2008). The 5-th German-Russian Cooperative Symposium, 14-17 June, 2008» (Cologne, Germany, 2008). Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы», IV Международная конференция по иммунотерапии (Москва, 2008).

Публикации

Основные результаты диссертации представлены в 16 работах, в том числе в 7 изданиях, включенных в перечень рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 668 источников, из которых 34 опубликованы на русском языке и 634 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 36 рисунками.

2. Содержание работы

1. Общая характеристика обследованных больных и методы исследования

В период с 2002 года по 2006 год было выявлено 182 больных ВИЧ-инфекцией с криптоспоридиозом. Диагноз криптоспоридиоза устанавливали путем обнаружения ооцист в испражнениях методом прямой иммунофлюоресценции. Среди 182 больных криптоспоридиозом распределение больных по полу выглядело следующим образом: мужчин было 130 человек (71,4%), женщин - 52 (28,6%). Возраст обследованных больных колебался от 15 лет до 54 лет. Средний возраст больных составил 32,9 ± 0,6 лет. Характеристика распределения больных по возрасту представлена в таблице 1.

Таблица 1. Распределение больных криптоспоридиозом по возрасту

Показатель	Возраст (в годах)
	< 15	16-20	21-25	26-30	31-35	36-40	41-45	46-50	51-55
Число больных	Абс.	6	6	15	33	59	32	24	5	2
	%	3,3	3,3	8,2	18,1	32,4	17,6	13,2	2,7	1,1

Заражение ВИЧ-инфекцией у большинства пациентов предположительно произошло в результате внутривенного употребления наркотиков в период с 1998 года по 2002 год. Подобный путь передачи ВИЧ-инфекции можно было рассматривать в качестве ведущего у 167 (91,8%) больных. Половой путь передачи в результате гетеросексуальных контактов предположительно имел место у 9 (4,9%) больных. Среди ВИЧ-инфицированных с таким путем заражения преобладали женщины - 7 (77,8%). У остальных 6 (3,3%) человек (женщин - 5, мужчин - 1) путь заражения мог быть смешанным, т.е. наряду с частой сменой половых партнеров и незащищенным сексом имела место практика эпизодического употребления внутривенно вводимых наркотиков.

Самым частым сопутствующим ВИЧ-инфекции заболеванием у всех обследованных больных с криптоспоридиозом был хронический гепатит С, который был выявлен у 158 (86,8%) из 182 больных. Хронический гепатит В был выявлен у 22 (12,1%) обследованных больных ВИЧ инфекцией.

Кроме серологических маркеров гепатита С у больных ВИЧ-инфекцией с криптоспоридиозом обнаруживались антитела класса IgG к вирусу простого герпеса (156 больных - 85,7%), цитомегаловирусу (152 больных - 83,5%), токсоплазмам (69 больных - 37,9%).

. Распределение больных с криптоспоридиозом по стадиям ВИЧ-инфекции выглядело следующим образом (таблица 2). У 9 (4,9%) человек на момент выявления криптоспоридиоза была диагностирована 3 стадия ВИЧ инфекции. Самым массовым контингентом больных с криптоспоридиозом были больные 4А стадии ВИЧ инфекции, их под наблюдением было 126 (69,2%). Больных криптоспоридиозом с 4Б стадией ВИЧ-инфекции было выявлено 33 (18,1%). Диагноз ВИЧ-инфекции 4В стадии был установлен у 14 (7,7%) больных криптоспоридиозом. Все больные со стадией ВИЧ-инфекции 4В в течение короткого отрезка времени, чаще в пределах от 6 до 11 месяцев, в результате прогрессирования иммунодефицита и развития тяжелых вторичных заболеваний переходили в терминальную стадию ВИЧ-инфекции и погибали.

Программа обследования больных включала:

1) клиническое обследование (жалобы, данные анамнеза, физикальный осмотр, консультации врачей различный медицинских специальностей - хирурга, гинеколога, невропатолога, ЛОР, психиатра);

2) общепринятые лабораторные исследования (клинические анализы крови и мочи, спинномозговой жидкости, рутинные биохимические тесты, оценка иммунного статуса, серологические маркеры вирусных гепатитов и оппортунистических инфекций);

3) инструментальные исследования (ЭКГ, ЭЭГ, рентгенограмма и ультразвуковое исследование различных органов по показаниям, радиоизотопные исследования печени и почек, компьютерная и магнитно-резонансная томография по показаниям);

4) бактериоскопия и бактериологическое исследование крови, мочи, спинномозговой жидкости, испражнений, мокроты (в том числе, на микобактерии туберкулеза), экссудатов.

С целью лабораторной диагностики криптоспоридиоза были использованы:

1) прямая микроскопия взвеси испражнений с использованием эталонного препарата очищенных ооцист из испражнений теленка, инфицированного в естественных условиях;

2) микроскопия мазка взвеси испражнений, окрашенного по методу Киньюн (Kinyoun), котрый является модификацией окраски на кислотоустойчивые микроорганизмы по методу Циль-Нильсена, оличающийся тем, что препарат не нагревают на этапе окраски фуксином (P. Ma, R. Soave, 1983).

3) метод прямой иммунофлюоресценции выполнялся с помощью коммерческого набора Crypto Cel (Cellabs Pty Ltd, Австралия), все этапы исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя;

4) для обнаружения ооцист методом иммуномагнтной сепарации ооцист криптоспоридий был использован набор Dynabeads M-280 anti-Cryptosporidium kit (Dynal, Норвегия).

Выделение ДНК из испражнений больных ВИЧ-инфекцией осуществляли после пяти циклов замораживания в жидком азоте и оттаивания при температуре 65є С для разрушения стенок ооцист. После этого для экстракции ДНК криптоспоридий из испражнений был использован коммерческий набор QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen GmbH, Германия). Все этапы исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя, прилагаемой к данному набору.

Для исследования видовой принадлежности криптоспоридий была использована полимеразная цепная реакция с вложенными праймерами (nested-ПЦР (описанной в публикации L. Xiao и соавт. (1999). Для выполнения первого этапа ПЦР и амплификации фрагмента ДНК SSU rRNA гена криптоспоридий размером 1325 пн были использованы прямой праймер 5'-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3' и обратный праймер 5'-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3'. Второй этап ПЦР имел своей целью амплификацию фрагмента ДНК SSU rRNA гена криптоспоридий размером от 826 bp до 864 bp. Для выполнения второго этапа ПЦР был использован продукт амплификации ДНК, полученный в результате выполнения первого этапа ПЦР. На втором этапе ПЦР были использованы прямой праймер 5'-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3' и обратный праймер 5'-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3'. Для выполнения ПЦР использовали термоциклер MyCycler Bio-Rad (Cat. No. 1709703, Bio-Rad Laboratories, Inc., CA 94547 USA).

Для изучения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) продукт, полученный в результате выполнения второго этапа ПЦР, подвергали воздействию рестрикционных эндонуклеаз SspI и VspI (Promega, США). Препарат ДНК, подвергнутый воздействию эндонуклеаз SspI и VspI, подвергали электрофоретическому разделению в 2% агарозном геле. Визуализацию результатов осуществляли путем окраски ДНК при помощи бромистого этидия. Гель окрашивался в течение 60 мин. в растворе красителя с концентрацией последнего 1 мг/л. Результат визуализировали с помощью ультрафиолетового трансиллюминатора LAS-4000 (Life Science, FUJIFILM, Japan) в соответствии со специальной встроенной программой и инструкцией изготовителя.

Для обнаружения ооцист криптоспоридий в питьевой воде Ростовской городской системы водоснабжения был использован метод фильтрации воды через полипропиленовый волокнистый фильтр с размером пор 1 мкм (Super Micro-Wynd CUNO, США), рекомендованному LeChevallier и соавт. (1991) в модификации Karanis и соавт. (1998). Образцы питьевой воды отбирали два раза в месяц с интервалом в две недели. Всего были исследованы 12 образцов воды по 600 л каждый.

Помимо исследования питьевой воды было выполнено исследование воды реки Дон. Место забора проб было выбрано с учетом ранее выполненного изучения проб питьевой воды. На протяжении первого этапа исследования местом забора был правый берег Дона на расстоянии 1 км вверх по течению от места городского водозабора. Воду для исследования в объеме по 10 литров забирали два раза в неделю в период с 24 апреля 2005 г. по 19 мая 2005 г. Всего для данного исследования было получено 9 образцов воды. В период 26-27 мая 2005 года были дополнительно исследованы 16 проб воды реки Дон и ее притоков на протяжении от Цимлянского водохранилища до г. Азов (протяженность участка акватории около 250 км). Объем каждой из проб также составлял 10 л. Ооцисты криптоспоридий выделяли из исследуемого образца речной воды методом флокуляции (P. Karanis, A. Kimura, 2002; C. Kourenti et al., 2003).

Концентрацию и очистку ооцист из испражнений больных ВИЧ-инфекцией осуществляли путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и в градиенте плотности хлорида цезия (M. Arrowood, 2002).

Оценку жизнеспособности ооцист, выделенных из испражнений больных ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом, проводили по показателю их эксцистирования ( M. Arrowood, 2002). Исследование вирулентности ооцист, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией, выполняли путем экспериментального заражения лабораторных мышей SCID (K. Hikosaka et al., 2005).

Культивирование криптоспоридий, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией в искусственной питательной среде, которая не содержит клеток хозяина, осуществляли по методике N. Hijjawi с соавт. (2004).

Для оценки частоты криптоспоридиоза среди сельскохозяйственных животных и птиц были исследованы испражнения 116 телят, 56 поросят, 64 цыплят и 48 утят. Были также исследованы испражнения 29 хищников Ростовского зоопарка и 15 дико живущих лис. Обнаружение ооцист в испражнениях выполняли методом прямой иммунофлюоресценции.

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

2.1 Сравнительная чувствительность лабораторных методов диагностики криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией

С помощью прямой микроскопии влажного мазка испражнений у 6 (12,5 + 4,8%) больных из 48 были обнаружены ооцисты криптоспоридий, морфологически сходные с контрольным препаратом.

При микроскопии мазков, окрашенных по методу Киньюн, ооцисты были выявлены у 11 (22,9 + 6,1%) больных, причем у всех шести больных, у которых их удалось обнаружить ранее при диагностике методом прямой микроскопии. Среди 11 больных с положительными результатами диарея имела место у 8, но остальные трое больных сообщали об эпизодах диареи в течение последнего года. Статистически достоверной разницы между частотой обнаружения ооцист при прямой микроскопии и при окраске по Циль-Нильсену не было выявлено.

С помощью метода прямой иммунофлюоресценции ооцисты криптоспоридий были найдены в испражнениях 26 больных ВИЧ инфекцией (54,2 + 7,2%), включая всех 11 больных криптоспоридиозом, выявленных ранее с помощью микроскопии мазков после окраски по Циль-Нильсену. Из них у 9 больных на момент обследования была диарея, а из оставшихся 17 больных эпизоды диареи в отдаленном анамнезе отмечали 6 человек. Таким образом, связать положительный результат прямой иммунофлюоресценции с диареей при криптоспоридиоза можно было у 15 больных из 27 (56%). Метод прямой иммунофлюоресценции позволял обнаруживать ооцисты достоверно чаще, как по сравнению с прямой микроскопией влажного мазка испражнений (p < 0,05), так и по сравнению с микроскопией мазка после окраски по Циль-Нильсену (p < 0,01). У тех больных, у которых ооцисты не были обнаружены при окраске по Циль-Нильсену, метод прямой иммунофлюоресценции позволял обнаружить даже единичные ооцисты в препарате.

Метод иммуномагнитной сепарации позволил обнаружить ооцисты у 37 (77,1 + 6,1%) больных ВИЧ из 48 обследованных. При этом следует отметить, что из 11 вновь выявленных больных, у которых ооцисты не были найдены при использовании метода прямой иммунофлюоресценции, в пробах испражнений 10 больных было обнаружено всего по одной ооцисте, а у оставшегося одного больного - лишь три ооцисты во всем препарате. Метод иммуномагнитной сепарации давал более значимые статистически отличия в частоте выявления ооцист по сравнению с прямой микроскопией влажного мазка испражнений (p < 0,01), микроскопией мазка после окраски по Циль-Нильсену (p < 0,001) и методом прямой иммунофлюоресценции (p < 0,001). Диарея на момент обследования имела место у 9 больных с положительным результатом исследования испражнений методом иммуномагнитной сепарации, т.е. у оставшихся 2 из 11 больных с диареей не было установлено ее связи с криптоспоридиозом. Из 16 больных с диареей в анамнезе ооцисты были обнаружены у 7 человек, т.е. у 9 человек также не было оснований признавать причинную роль криптоспоридиоза при ранее имевшей место диарее. С другой стороны, ооцисты были обнаружены у 21 больного ВИЧ, у которых на протяжении последнего года до обследования, а также на момент обследования диарея отсутствовала.

Специфические методы обнаружения ооцист - метод прямой иммунофлюоресценции и метод иммуномагнитной сепарации, позволяли выявлять криптоспоридиоз у существенно большего числа больных. Недостатком метода иммуномагнитной сепарации является многоэтапность исследования и затраты времени на его выполнение. Поэтому при дальнейшей лабораторной диагностике криптоспоридиоза у всех обследованных нами больных ВИЧ инфекцией был использован метод прямой иммунофлюоресценции.

Клиническое значение обнаружения единичных ооцист в испражнениях больных ВИЧ без диареи подлежит специальному обсуждению. Полученные нами результаты использования высокочувствительных методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза являются свидетельством высокой частоты бессимптомных или транзиторных форм криптоспоридиоза в популяции больных ВИЧ инфекцией в Ростове-на-Дону.

Клиническая характеристика криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией на момент установления диагноза

При обследовании 515 больных ВИЧ-инфекцией лабораторный диагноз криптоспоридиоза с помощью исследования испражнений методом прямой иммунофлюоресценции был установлен 182 из них, что в целом составило 35,3 ± 2,1%.

Среди 39 обследованных больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции диагноз криптоспоридиоза был установлен у 9 больных, что составило 23,1 ± 6,7%. Из 332 больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции криптоспоридиоз был распознан у 126 (38,0 ± 2,7%) человек. Разница между частотой криптоспоридиоза у больных 3 и 4А клинических групп ВИЧ-инфекции была статистически значимой (p < 0,05). Больных с 4Б клинической группой ВИЧ-инфекции было обследовано 103, а диагноз криптоспоридиоза был выявлен у 33 (32,0 ± 4,6%), т.е. несколько чаще, чем у больных 3 группы, и реже, чем у больных 4А группы. Однако, эти отличия были статистически недостоверными (в обоих случаях p > 0,05). Криптоспоридиоз был обнаружен у 14 (34,1 ± 7,4%) из 41 больного с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции, но и в этом случае полученный показатель не имел статистически значимых отличий от таковых в группах больных 3 стадией, 4А стадией и 4Б стадией ВИЧ-инфекции (во всех трех случаях p > 0,05). Таким образом, только у больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции частота криптоспоридиоза была достоверно ниже по сравнению с больными с 4А клинической стадией.

Среди 9 больных криптоспоридиозом с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея при первичном обследовании на момент госпитализации была выявлена у 3 (33,3 ± 16,6%) человек. Длительность диареи у одного больного составила 5 дней, у другого больного - 6 дней, у третьего больного диарея продолжалась 8 дней. Содержание CD4+ лимфоцитов в группе больных криптоспоридиозом, относящихся к 3 клинической группе ВИЧ-инфекции составило в среднем 0,348 ± 0,035 Ч 10⁹/л (у больных с диареей - 0,304 ± 0,029 Ч 10⁹/л, у больных без диареи - 0,370 ± 0,049 Ч 10⁹/л, p > 0,05).

Из 126 больных криптоспоридиозом и ВИЧ-инфекцией 4А клинической стадии диарея при обследовании была выявлена у 59 (46,8 ± 4,5%) человек. Статистически значимых различий в частоте диареи у больных с 3 и 4А стадиями ВИЧ-инфекции, установлено не было. Максимальная частота стула 2-3 раза в день наблюдалась у 31 (52,4%) больного с диареей. У 21 (35,6%) больных с диареей было отмечено учащение стула до 4-5 раз в день. У оставшихся 7 (11,9%) больных диарея сопровождалась учащением стула до 6-8 раз в день. Диарея продолжалась менее двух недель у 32 (54,2%) больных, от двух до трех недель - у 23 (39,0%) больных и более трех недель - у оставшихся 4 (6,8%) больных. Ни у одного больного диарея не сохранялась более одного месяца. Содержание CD4+ лимфоцитов у 126 больных криптоспоридиозом, относящихся к 4А клинической группе ВИЧ-инфекции, составило в среднем 0,293 ± 0,013 Ч 10⁹/л (у больных с диареей - 0,261 ± 0,015 Ч 10⁹/л, без диареи - 0,319 ± 0,019 Ч 10⁹/л, p < 0,05).

Из числа 33 больных с 4Б клинической стадией диарея была выявлена у 24 (72,7 ± 7,9%) человек. Удельный вес больных криптоспоридиозом с диареей в этой группе был заметно выше, чем у больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (33,3 ± 16,6%, p < 0,05), с одной стороны, и у больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции (46,8 ± 4,5%, p < 0,01), с другой. Частота стула 2-3 раза в день наблюдалась у 15 (62,5%) больных, 4-5 раз в день - у 7 (29,2%) больных, 6-8 раз в день - у оставшихся 2 (8,3%) больных. Диарея менее двух недель отмечена у 6 (25,0%) больных, от двух до трех недель - у 9 (37,5%), и более месяца - у 9 (37,5%) больных. Так же как и у больных 4А клинической стадии, ни у одного больного с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея не сопровождалась обезвоживанием.

Концентрация CD4+ лимфоцитов у больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции составила в среднем 0,166 ± 0,012 Ч 10⁹/л (у больных с диареей - 0,151 ± 0,011 Ч 10⁹/л, без диареи - 0,206 ± 0,028 Ч 10⁹/л, p < 0,05).

Больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции под наблюдением было 14 человек, из них диарея наблюдалась у 11 (78,6 ± 11,4%), т.е. чаще, по сравнению с больными на 3 стадии ВИЧ-инфекции (33,3 ± 16,6%, p < 0,05), а также по сравнению с больными на 4А стадии ВИЧ-инфекции (46,8 ± 4,5%, p < 0,01). Статистически значимая разница между частотой диареи у больных криптоспоридиозом с 4Б (72,7 ± 7,9%) и 4В (78,6 ± 11,4%) стадиями ВИЧ-инфекции отсутствовала.

Из 11 больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции диарея у всех имела затяжной характер и продолжалась более одного месяца. В частности, у 3 (27,3%) больных она наблюдалась на протяжении 4-5 недель, у 5 (45,5%) - 6-7 недель, у оставшихся 3 (27,3%) - более двух месяцев.

Частота стула у 8 больных не превышала 5 раз в день. У 3 (27,3%) больных стул был чаще, испражнения имели водянистую консистенцию, но только у одного больного наблюдалось выраженное обезвоживание, частота стула у него достигала 10-12 раз в день. Только у этого больного можно было связывать выраженную потерю массы тела с дегидратацией.

Концентрация CD4+ лимфоцитов у больных криптоспоридиозом с 4В стадией ВИЧ-инфекции составила в среднем 0,081 ± 0,012 Ч 10⁹/л (у больных с диареей - 0,067 ± 0,017 Ч 10⁹/л, без диареи - 0,135 ± 0,033 Ч 10⁹/л, p > 0,05).

Результаты наблюдения за больными криптоспоридиозом в отдаленном периоде

За всеми больными ВИЧ-инфекцией, у которых при первичном обследовании был выявлен криптоспоридиоз, осуществлялось наблюдение в динамике с повторным исследованием испражнений и оценкой клинических проявлений. В результате прогрессирования ВИЧ-инфекции и присоединения других вторичных заболеваний из 182 больных криптоспоридиозом умер 31 (17,0 ± 2,8%) человек. Сроки наблюдения за всеми больными ВИЧ-инфекцией со смертельным исходом не превышали 1 года.

Из числа умерших только у 6 (19,4%) больных по результатам клинического наблюдения и патологоанатомического исследования был установлен диагноз СПИД. У всех умерших от СПИД криптоспоридиоз протекал с диареей, но только у одного больного испражнения были обильными, водянистыми и сопровождались обезвоживанием. Наряду с криптоспоридиозом у него была правосторонняя пневмония, токсоплазмоз головного мозга, распространенный кандидоз, хронический гепатит, эрозивный эзофагит с пищеводным кровотечением, кахексия (потеря массы более 30%). Еще у 5 больных со СПИД наблюдалась рецидивирующая диарея с ремиссиями. Причиной смерти у этих 5 больных также был не криптоспоридиоз, а другие множественные и тяжелые вторичные заболевания (у 4 больных - диссеминированный туберкулез, у 1 больного - энцефалит).

У остальных 25 больных криптоспоридиозом смерть наступала на стадии 4Б (6 больных) и на стадии 4В (19 больных). Среди всех причин смерти у этих больных на первом месте по частоте был туберкулез легких с распадом и гематогенной диссеминацией (14 больных). Из оставшихся 11 больных основной причиной смерти у 6 больных был сепсис, у 3 - пневмония, у 1 - менингит и еще у 1 больного нефрит.

Из оставшихся 151 больных криптоспоридиозом из наблюдения по разным причинам (смена места жительства, повторная неявка для диспансерного обследования по вызову и пр.) выбыли 16 (10,6 ± 2,5%) человек, у которых не удалось проследить дальнейшее течение и исход криптоспоридиоза. В результате динамика и исход болезни в отдаленном периоде были прослежены у оставшихся 135 больных.

Из 7 больных криптоспоридиозом с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции, у которых удалось проследить дальнейшее течение болезни, выздоровели 6 (85,7 ± 13,2%) человек. Оставшийся больной продолжал выделять ооцисты криптоспоридий с испражнениями при наличии рецидивирующей 2-3 раза в год диареи. В течение двух лет наблюдения у этого больного наблюдалось прогрессирование ВИЧ-инфекции в 4А стадию.

Из 126 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции динамика болезни прослежена у 112. Из этого числа больных паразитологическое выздоровление наблюдалось у 29 (25,9 ± 4,1%) больных. Доля больных, выздоровевших от криптоспоридиоза на 4А клинической стадии ВИЧ-инфекции, была намного меньше, чем среди выздоровевших больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (p < 0,001). Из 53 больных криптоспоридиозом с диареей на момент первичного обследования паразитологическое выздоровление при наблюдении в динамике наступило у 9 (17,0 ± 5,2%) человек, а из 59 больных без диареи на момент первичного обследования - у 20 (33,9 ± 6,2%). Разница статистически значима (p < 0,05).

Возможным вариантом объяснений указанной разницы в заметно более высокой частоте паразитологического выздоровления при криптоспоридиозе у больных с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции могло быть то, что на момент выявлении криптоспоридиоза больные без диареи находились в стадии реконвалесценции. Другим возможным объяснением является то, что более сохранный иммунный статус у больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции без диареи обеспечил возможность формирования противопаразитарного иммунитета и освобождение организма больного от паразита.

Ответ на первый вопрос можно по результатам оценки жизнеспособности и других биологических свойств ооцист, выделяемых с испражнениями. Известно, что при реконвалесценции наблюдается выделение с испражнениями преимущественно нежизнеспособных ооцист (Z. Bukhari, H. Smith, 1997). Результаты оценки жизнеспособности ооцист, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией, приведены ниже.

Ответ на второй вопрос получить сложнее. Прямых доказательств о взаимосвязи отдельных показателей противопаразитарного иммунитета с паразитологическим выздоровлением от криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией до последнего времени не получено. В качестве косвенных доказательств может быть использован такой параметр, как темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции у больных криптоспоридиозом с диареей по сравнению с больными без диареи.

После исключения из дальнейшего рассмотрения тех больных, у которых наблюдалось паразитологическое выздоровление, под наблюдением в динамике продолжали оставаться 83 больных с 4А стадией ВИЧ-инфекции, в том числе 44 больных с диареей. У них криптоспоридиоз протекал в хронической форме.

Из этой группы 44 больных с диареей 31 (70,5 ± 6,9%) больных сообщали о рецидивирующей диарее с малой частотой (от 2 до 3 раз в год) и продолжительностью на протяжении всего периода последующего наблюдения. В этой группе пациентов только у 18 (40,9 ± 7,4%) человек не было установлено признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции, т.е. все эти больные по-прежнему оставались на 4А клинической стадии.

Из 39 больных без диареи на момент первичной диагностики криптоспоридиоза от 18 (46,2 ± 8,0%) больных при дальнейшем наблюдении также были получены сведения об эпизодах непродолжительной диареи с частотой 2-3 раза в год. Удельный вес больных с диареей в отдаленном периоде (при ее отсутствии на момент первичного обследования) в этой группе больных был заметно меньше, а разница с 44 больными представленной выше группы по пропорции больных с диареей оказалась статистически значимой (p < 0,05). Признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции из 39 больных без диареи на момент первичной диагностики криптоспоридиоза не наблюдалось у 26 (66,7 ± 7,5%). Этот показатель также заметно превышал аналогичный параметр в представленной выше группе из 44 больных, а обнаруженная разница была статистически достоверной (p < 0,05).

Еще один из возможных вариантов анализа выглядит так. Из 83 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции рецидивирующая диарея в отдаленном периоде наблюдения (вне зависимости от ее наличия на момент первичного обследования) имела место у 49 (59,0 ± 5,4%) больных. У остальных 34 (41,0 ± 5,4%) больных криптоспоридиоз также протекал в хронической форме, но бессимптомно. По истечении периода наблюдения у 44 (53,0 ± 5,5%) больных из 83 не наблюдалось прогрессирования ВИЧ-инфекции и перехода больных из 4А в 4Б или 4В клинические стадии. В группе из 34 больных с бессимптомным криптоспоридиозом отсутствие прогрессирования ВИЧ-инфекции наблюдалось у 24 (70,6% ± 7,8%). В то же время, в группе из 49 больных с хроническим криптоспоридиозом такое же течение ВИЧ-инфекции без прогрессирования имело место только у 20 (40,8 ± 7,0%) человек. Разница этих двух показателей была статистически значимой (p < 0,01).

Из 33 больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции паразитологическое выздоровление наблюдалось всего у 3 (9,1 ± 5,0%) человек. Доля больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции, которые выздоровели от криптоспоридиоза, была намного меньше, чем в группе больных с 3 клинической стадией ВИЧ-инфекции (85,7 ± 13,2%, p < 0,001) и с 4А клинической стадией ВИЧ-инфекции (25,9 ± 4,1%, p < 0,01).

Из 24 больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции и диареей паразитологического выздоровления не наблюдалось ни в одном случае. Все 3 выздоровевших больных с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции были из числа тех 9 больных, у которых диарея на момент первичного установления диагноза криптоспоридиоза отсутствовала (это составило 33,3 ± 15,7%).

Интересно, что практически с такой же частотой (33,9 ± 6,2%) наблюдалось выздоровление и среди больных криптоспоридиозом с 4А клинической группой ВИЧ-инфекции без диареи.

Из остававшихся под дальнейшим наблюдением 30 больных криптоспоридиозом с 4Б клинической стадией ВИЧ-инфекции умерли 17 больных. Из числа 24 больных с диареей при первичном обследовании умерил 15 (62,5 ±9,9%) человек, а из оставшихся 6 больных без диареи - 2 (33,3 ± 19,2%). Однако, при данном числе наблюдений статистически значимой разницы этих показателей не установлено.

Среди оставшихся 13 больных с 4Б стадией, которые были доступны дальнейшему наблюдению, у 9 человек наблюдалась диарея при первичном обследовании. В дальнейшем рецидивирующая диарея с периодами ремиссий сохранялась у всех 9 больных. Из 4 пациентов, у которых диарея при первичном обследовании отсутствовала, у всех были выявлены кратковременные эпизоды повторной диареи в отдаленном периоде. Признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции за время наблюдения не было у 4 (30,8 ± 12,8%) больных, у остальных 9 (69,2 ± 12,8%) больных ВИЧ инфекция прогрессировала в 4В стадию.

Ни у одного из 14 больных криптоспоридиозом с 4В клинической стадией ВИЧ-инфекции паразитологического выздоровления не было зафиксировано вплоть до момента их смерти, которая наступала в результате усугубления иммунодефицита и прогрессирующего течения резистентных к терапии вторичных болезней. Диарея отсутствовала у 3 (21,4 ± 11,4%) больных, что свойственно бессимптомному течению криптоспоридиоза.

Молекулярно-генетическая характеристика криптоспоридий, обнаруженных у больных ВИЧ-инфекцией

Молекулярно-генетическая характеристика криптоспоридий стала предметом изучения только в конце 90-х годов 20 века и позволила четко определять источники инфекции, как при массовых заболеваниях, так и при спорадических случаях болезни. Изучение генотипов паразита на клиническом материале выявило отличия клинических проявлений при заражении тем или иным видом криптоспоридий.

Молекулярно генетические исследования были выполнены у 14 больных криптоспоридиозом с 4А клинической стадией ВИЧ инфекции. Из числа отобранных 14 больных, у 7 человек криптоспоридиоз сопровождался диареей, у других 7 человек имела место бессимптомная форма болезни. При отборе больных мы руководствовались критерием концентрации ооцист в испражнениях. У всех обследованных больных она была максимальной среди других представителей соответствующей группы. Это было предпринято для повышения вероятности положительных результатов экстракции ДНК для последующего исследования с помощью полимеразной цепной реакции с вложенными праймерами (ПЦР) и основанного на ней анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК.

Амплификация ДНК была успешной с каждым из всех 14 исследованных образцов испражнений. При электрофоретическом разделении вторичного продукта ПЦР, подвергнутого воздействию рестрикционной эндонуклеазы Ssp I, были получены три отчетливые полосы. Одна из полос соответствовала фрагменту величиной 448-450 пар нуклеотидв (пн), другая - фрагменту величиной 250-255 пн, третья - фрагменту величиной 108-110 пн (рис. 1).

Рис. 1. Результат ПЦР-ПДРФ анализа после воздействия рестрикционной эндонуклеазы SspI (метки указаны жирными стрелками и соответствуют фрагменту ДНК величиной 500 пар нуклеотидов (пн))

В результате воздействия рестрикционной эндонуклеазы Vsp I и последующего элетрофоретического разделения были получены две полосы. Одна полоса соответствовала фрагменту величиной 625-630 пн, другая фрагменту 100-106 пн (рис. 2). По результатам ПДРФ-анализа все обнаруженные в испражнениях больных ВИЧ криптоспоридии были идентифицированы как C. parvum (ранее употреблявшиеся синонимы - C. parvum генотип 2 или C. parvum бычий генотип). Ни в одном из изученных образцов испражнений не было обнаружено ни C. hominis, равно как и ни одного другого из числа описанных у больных ВИЧ зоонозных генотипов паразита.



Рис. 2. Результат ПЦР-ПДРФ анализа после воздействия рестрикционных эндонуклеаз VspI (метки указаны жирными стрелками и соответствуют фрагменту ДНК величиной 500 пар нуклеотидов (пн))

Оценка жизнеспособности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ инфекцией, по показателю их эксцистирования

Применительно к задачам данного исследования оценка жизнеспособности ооцист была выполнена у больных ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом, который сопровождался клиническими проявлениями (диареей), а также у больных с бессимптомным течением. Исследование выполняло несколько задач. С одной стороны оно представляло собой попытку ответить на вопрос, является ли бессимптомное течение криптоспоридиоза признаком начинающегося выздоровления, с другой - давало возможность оценить в сравнении эпидемиологическую опасность больного криптоспоридиозом с диарей и без диареи. Известно, что в периоде ремиссии или реконвалесценции при отсутствии клинических проявлений больной продолжает выделять ооцисты криптоспоридий с испражнениями, но среди ооцист начинают преобладать нежизнеспособные формы (Z. Bukhari, H. Smith, 1997; Caccio, E. Pozio, 2006).

Исследование было выполнено у 25 больных с криптоспоридиозом с 4А стадией ВИЧ инфекции. Из их числа у 13 человек криптоспоридиоз протекал бессимптомно, а у 12 больных сопровождался диареей. Оценка активности эксцистирования выявила следующее. У 13 больных ВИЧ инфекцией без диареи средний показатель эксцистирования составил 82,7%+11,4%, а у12 больных ВИЧ инфекцией с диареей - 85,3%+12,1%. Статистически значимая разница этих показателей отсутствовала (p > 0,05).

Таким образом, у больных ВИЧ инфекцией содержащиеся в испражнениях ооцисты характеризовались одинаково высокой степенью жизнеспособности независимо от наличия или отсутствия клинических проявлений в виде диареи. Использованный нами метод оценки жизнеспособности ооцист позволяет считать, что больные ВИЧ инфекцией с криптоспоридиозом без диареи представляют такую же эпидемиологическую опасность, как и больные с диареей. Высокий процент эксцистирования ооцист криптоспоридий у больных с субклинической формой криптоспоридиоза не дает оснований полагать, что отсутствие диареи было признаком ремиссии или начавшегося выздоровления.

Оценка вирулентности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией, при экспериментальном заражении мышей SCID

Мыши линии SCID, у которых нет ни Т- ни В-лимфоцитов, представляют собой одну из наиболее адекватных экспериментальных моделей для оценки биологических свойств криптоспоридий, прежде всего их инфекционности (K. Hikosaka et al., 2005). До последнего времени интерес к оценке жизнеспособности ооцист был сконцентрирован на характеристике свойств паразита, обнаруживаемого в воде или подвергшегося воздействию дезинфицирующих средств. Удалось обнаружить только одну работу, в которой авторы выполнили исследование заразительности ооцист, выделенных от больных ВИЧ инфекцией, путем инокуляции лабораторным животным (C. Raccurt et al., 2006). Инфекцию удалось воспроизвести у всех 24 животных, зараженных ооцистами из испражнений 24 больных ВИЧ инфекцией (12 больных криптоспоридиозом с диареей и 12 больных - без диареи). Клиника криптоспоридиоза отсутствовала у всех зараженных мышей. На протяжении всего эксперимента и в отдаленные сроки наблюдения все мыши остались живы.

Заражающая доза ооцист, использованная нами для каждого отдельного опыта, была постоянной и составляла 10³ ооцист. Несмотря на это биологическая модель позволила обнаружить разницу в вирулентности криптоспоридий, полученных от разных больных ВИЧ инфекцией. Наши исследования показали, что из 24 исследованных образцов испражнений больных ВИЧ только в 3 (12,5%), если ориентироваться на сроки первого появления ооцист в кале мышей, или в 5 (20,8%) образцах, если ориентироваться на время достижения пика экскреции ооцист, содержались высоковирулентные криптоспоридии. Это число высоковирулентных криптоспоридий может быть увеличено до 8 (33,3%), если ориентироваться на самую высокую концентрацию ооцист паразита, которая была зафиксирована в испражнениях этих 8 мышей по итогам двух месяцев наблюдения. Таким образом, результаты экспериментальной инфекции у мышей SCID дают основание предполагать, что у подавляющей части больных ВИЧ криптоспоридиоз был вызван штаммами паразита с невысокой вирулентностью.

Связь изученных параметров экспериментальной инфекции у мышей с наличием или отсутствием диареи при криптоспоридиозе у больных ВИЧ инфекцией отсутствовала. Это свидетельствовало о том, что наличие или отсутствие диареи в большей мере определялось состоянием организма больного, чем вирулентностью и патогенностью каждого отдельного изолята паразита.

Результаты оценки биологических свойств криптоспоридий по росту в культуре (в питательной среде, не содержащей клеток хозяина)

Исследование культур криптоспоридий в течение первых двух часов инкубации позволило наблюдать процесс освобождения спорозоитов из ооцист. При этом в культуре можно было видеть одновременно целые ооцисты, частично освободившиеся от спорозоитов ооцисты, свободные спорозоиты, пустые оболочки ооцист.

В специальной серии исследований, посвященной изучению процесса трансформации спорозоитов в другие морфологические формы паразита в культуре, были получены следующие результаты.

...