Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности и механизмы гемостимулирующего действия препаратов разных фармакологических групп в условиях противоопухолевой полихимиотерапии

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Матяш Марина Григорьевна

Томск - 2008

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте онкологии и ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Гольдберг Виктор Евгеньевич

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Дыгай Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ Венгеровский Александр Исаакович

доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна

доктор медицинских наук Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии РАМН

Защита состоится "___"______________2008 г. в________часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр-т Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан "___"________________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Амосова Е.Н.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Индуцированная цитостатиками нейтропения является наиболее частым дозолимитирующим побочным эффектом противоопухолевой химиотерапии у онкологических больных [Дмитриева Н.В., Петухова И.Н., 2006; Орлова Р.В., Чубенко В.А., 2006; Cappozzo C, 2004; Biganzoli L et al, 2005; Di Maio M et al, 2005; Lyman GH et al, 2005; Luftner D, Possinger K, 2005; tePoele EM et al, 2005]. Несмотря на современное лечение, до сих пор продолжают погибать от 3 до 10% пациентов с фебрильной нейтропенией; особенно следует учитывать, что в их числе - потенциально излечимые больные [Laws HJ et al, 2005].

В настоящее время во всех ситуациях, когда желательно быстро увеличить количество гранулоцитов в крови, преимущественно используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор [Волкова М.А., 1998]. Г-КСФ действует не только на предшественники гранулоцитопоэза, обеспечивая их пролиферацию, дифференцировку, созревание и выход зрелых гранулоцитов в периферическую кровь, но и на зрелые гранулоциты, обусловливая увеличение продолжительности их жизни за счет уменьшения апоптоза, ускорение и увеличение миграции гранулоцитов в очаг воспаления, повышение их способности к хемотаксису по отношению к бактериям и фагоцитозу [Lida S et al, 2005; Kanbayashi Y. et al, 2006]. Вышеназванные эффекты лежат в основе многократно показанной способности экзогенного Г-КСФ уменьшать продолжительность и тяжесть постхимиотерапевтической нейтропении. Оказывая такой эффект, препарат может достоверно уменьшить частоту и тяжесть нейтропенических инфекций, тем самым снижая заболеваемость и затраты для системы здравоохранения [Птушкин В.В., Сидоренко С.В., 2000; Uyl-de Groot CA et al, 1996; Sasse EC et al, 2005]. Кроме того, Г-КСФ используют для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь как у здоровых добровольцев, так и у больных, получающих противоопухолевую химиотерапию [de Jong ME et al, 2006; Ford CD et al, 2006]. Область применения Г-КСФ в настоящее время быстро расширяется, и постоянно появляются новые данные, свидетельствующие об его успешном использовании при различных патологических состояниях [Гольдберг Е.Д. и др., 2005; Liu F et al, 2005; Rutella S et al, 2005; Takano H et al, 2006]. Так, в последние годы доказано нейропротективное действие гранулоцитарных колониестимулирующих факторов, заключающееся в активации эндотелиальной пролиферации, мобилизации костномозговых стволовых клеток, значимом увеличении количества микроглиальных клеток [Schabitz WR et al, 2003; Jung KH et al, 2006; Sehara Y e. a., 2007]. Показано, что Г-КСФ стимулирует нейрогенез, редуцирует ранний и поздний апоптоз и некроз нейронов. Установлено также, что рецепторы Г-КСФ экспрессируются нейронами во многих областях головного мозга [Schneider A et al, 2005; Kirsch F et al, 2008]. Известно, что при использовании Г-КСФ для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников из костномозговой стромы значимо подавляется функция остеобластов, и это связано с сигналами от симпатической нервной системы [Mendez-Ferrer S, Frenette PS, 2007; Montgomery M, Cottler-Fox M, 2007]. Проведенные исследования показывают перспективность применения Г-КСФ для лечения нейродегенеративных состояний [Schneider A et al, 2005], энцефалопатий [Гольдберг Е.Д. и др., 2007].

Вместе с тем, идет активная разработка гемостимуляторов, обладающих свойствами естественных регуляторов кроветворения, низкой токсичностью, возможностью длительного применения без развития толерантности. Создан ряд препаратов растительного и животного происхождения, оказывающих вегетотропное действие и обладающих стимулирующим влиянием на гемопоэз.

В этом отношении большой интерес для исследования представляет новый препарат животного происхождения, получаемый из крови марала по оригинальной технологии - кропанол. Проведенные ранее исследования показали высокую гемостимулирующую активность пантогематогена сухого (препарат разработан в ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН), являющегося действующей субстанцией кропанола [Udut VV et al, 1997; Dygay AM et al, 2000; Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Soldatova GS et al, 2000]. Учитывая вышесказанное, представляется перспективным изучение гемостимулирующих свойств кропанола в клинике онкологических больных и оценка возможности его использования в качестве корректора нарушений в системе крови в условиях цитостатической терапии. Экспериментальными исследованиями, проведенными в ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, было показано наличие у кропанола (пантогематогена) ноотропных свойств [Суслов Н.И., 1995]. Повторные введения водного экстракта пантов, как было установлено, значимо ингибируют развитие гиперчувствительности постсинаптических допаминовых рецепторов [Kim HS et al, 1999]. Кроме того, как показано in vitro, полипептиды, выделенные из пантов, могут индуцировать дифференцировку нейральных стволовых клеток в нейроны, что может служить базисом для регенерации нервной системы [Lu LJ et al, 2005].

Не меньший интерес вызывает препарат, полученный из шлемника байкальского - экстракт шлемника байкальского в таблетках. Показано, что флавоноиды шлемника обладают не только гемостимулирующим, но и противоопухолевым и противометастатическим действием [Разина Т.Г. и др., 1989; Martin J, Dusek J, 2002; Liao HL, Hu MK, 2004; Ong ES et al, 2005]. Описано также нейропротективное действие флавоноида байкалина и его цитопротективное влияние на эндотелиальные клетки [Liu LY et al, 2005]. В эксперименте in vivo установлено, что после внутривенного введения экстракта шлемника байкальского байкалин аккумулируется в таких областях головного мозга, как стриатум, таламус и гиппокамп [Zhang L et al, 2006]. В исследованиях, проведенных в ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, экстракт шлемника байкальского обнаружил выраженные ноотропные свойства [Гольдберг Е.Д. и др., 1994].

Многочисленные данные свидетельствуют о существовании в организме единой сложноорганизованной системы регуляции кроветворения, представляющей собой комплекс взаимосвязанных и сбалансированных механизмов, направленных, в конечном итоге, на обеспечение необходимого числа специализированных клеток системы крови для ее адекватного ответа на чрезвычайные раздражители [Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 2004]. Установлено, что физиология системы кроветворения контролируется на трех уровнях: на клеточном уровне через костномозговую строму, на гуморальном уровне через гемопоэтические цитокины и на уровне центральной нейроэндокринной регуляции - через катехоламины и нейроэндокринные факторы [Дыгай А.М. и др., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Maestroni GJ, 1998; Fliedner TM et al, 2002].

При злокачественном росте деятельность вегетативной нервной системы изменяется, что может вызывать дополнительные нарушения в системе крови [ThyagaRajan S et al, 2000; Лыков А.П. и др., 2003]. Ряд противоопухолевых агентов обладают нейротоксическим влиянием, в том числе, на вегетативную нервную систему [Поддубная И.В. и др., 2000]. Литературные данные подтверждают существование нейро-эндокринного и, в частности, вегетативного контроля процессов повреждения и восстановления гемопоэза при цитостатическом воздействии противоопухолевых препаратов. Однако механизмы модулирующего эффекта ВНС в условиях противоопухолевой полихимиотерапии остаются практически не изученными. Более полное понимание нервной и нейроэндокринной регуляции гемопоэза, особенно в условиях цитостатического воздействия, может открыть новые терапевтические перспективы для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований.

Учитывая вышесказанное, представляется весьма перспективным изучение механизмов гемостимулирующего действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, препарата из крови марала - кропанола и сухого экстракта шлемника байкальского, поскольку, как было установлено, все они в той или иной степени оказывают влияние на деятельность нервной системы.

Цель исследования. Изучить изменения вегетативного обеспечения функций и показателей гемопоэза в динамике проведения противоопухолевой полихимиотерапии, оценить возможность их коррекции экстрактом шлемника байкальского, кропанолом, гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и вскрыть механизмы, лежащие в основе их гемостимулирующего действия.

Задачи исследования:

1. Исследовать нарушения со стороны системы крови, возникающие у больных РМЖ IIIБ-IV стадии под действием полихимиотерапии, проводимой в режиме CAF.

2. Изучить гемостимулирующие эффекты и их механизмы у больных распространенным РМЖ, получающих цитостатическую терапию CAF на фоне применения экстракта шлемника байкальского, кропанола и филграстима.

3. Оценить тонус и реактивность ВНС у больных РМЖ в сравнении со здоровыми лицами.

4. Изучить типы адаптационных реакций, изменения состояния ВНС у больных с распространенным РМЖ в процессе проведения цикловой полихимиотерапии CAF.

5. Изучить зависимость показателей гемопоэза от типов адаптационных реакций у больных распространенным РМЖ в процессе проведения им полихимиотерапии CAF.

6. Изучить влияние экстракта шлемника байкальского, кропанола и филграстима на представительство фаз общего адаптационного синдрома и состояние вегетативной нервной системы у больных РМЖ в динамике химиотерапии CAF.

показатель гемопоэз противоопухолевая полихимиотерапия

7. Определить роль и место ВНС в механизмах стимулирующего действия исследуемых препаратов (экстракта шлемника байкальского, кропанола и филграстима) на кроветворение при проведении противоопухолевой химиотерапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Состояние гемопоэза определяется тонусом и реактивностью вегетативной нервной системы, которые в свою очередь зависят от наличия распространенного опухолевого процесса и от проводимого противоопухолевого лечения. Нормотония и парасимпатикотония с сохранной реактивностью определяют повышенную резистентность системы крови к цитостатической терапии, в то время как превалирование симпатической нервной системы на фоне снижения реактивности ВНС определяют большее повреждающее гемопоэз действие цитостатиков.

2. При проведении режимов полихимиотерапии, обладающих умеренной гематологической токсичностью, применение кропанола и экстракта шлемника байкальского обеспечивает гемостимулирующее действие, сравнимое по эффективности с таковым при применении Г-КСФ.

3. Механизмы гемостимулирующего действия исследуемых препаратов различаются. Так, экстракт шлемника байкальского стимулирует регенерацию трех ростков кроветворения, увеличивая содержание в периферической крови ретикулоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тромбоцитов и нормализуя структурно-метаболический статус циркулирующих эритроцитов; активация миело - и эритропоэза при его применении обусловлена возрастанием содержания клеток - предшественников гемопоэза типа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в периферической крови. Кропанол стимулирует преимущественно грануломоноцитопоэз, активируя гемопоэтические клетки-предшественники с последующим увеличением содержания в костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а в периферической крови - нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов; повышая костномозговой резерв нейтрофильных гранулоцитов и их функциональную активность. Препарат Г-КСФ филграстим увеличивает содержание зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и периферической крови, увеличивая число костномозговых клеток-предшественников грануломоноцитопоэза при постепенном уменьшении числа циркулирующих КОЕ-ГМ.

4. В механизмах гемостимулирующих эффектов кропанола и экстракта шлемника байкальского существенная роль принадлежит их нормализующему действию в отношении состояния вегетативной нервной системы, проявляющемуся в увеличении числа пациентов с "нормотонией" и сохранной реактивностью ВНС.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение показателей гемопоэза у больных распространенным раком молочной железы в динамике проведения цикловой полихимиотерапии при использовании в качестве гемостимуляторов экстракта шлемника байкальского, кропанола или Г-КСФ. Показано, что названные препараты в изученных режимах оказывают практически идентичное гемостимулирующее воздействие на гранулоцитарный росток кроветворения, однако механизмы их гемостимулирующего влияния различны. Экстракт шлемника байкальского стимулирует регенерацию трех ростков кроветворения, увеличивая содержание в периферической крови ретикулоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тромбоцитов и нормализуя структурно-метаболический статус циркулирующих эритроцитов; активация миело - и эритропоэза при его применении обусловлена возрастанием количества клеток - предшественников гемопоэза типа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ. Кропанол стимулирует преимущественно грануломоноцитопоэз, активируя гемопоэтические клетки-предшественники с последующим увеличением содержания в костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а в периферической крови - нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов; повышая костномозговой резерв нейтрофильных гранулоцитов и их функциональную активность. Применение филграстима приводит к повышению содержания зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и периферической крови, увеличивая число костномозговых клеток-предшественников грануломоноцитопоэза при постепенном уменьшении числа циркулирующих КОЕ-ГМ.

Впервые на основании углубленного анализа динамики ряда показателей, характеризующих системы жизнеобеспечения, дана комплексная оценка участия вегетативной нервной системы и общих приспособительных реакций целостного организма в регуляции гемопоэза у больных распространенным раком молочной железы при проведении противоопухолевой химиотерапии. Показано, что вегетативное обеспечение функций у данной категории больных характеризуется повышенным уровнем симпато-адреналовых процессов, нарушениями центральных механизмов взаимодействия дыхательного и сосудистого центров, что свидетельствует об истощении адаптационного резерва. Проведение полихимиотерапии приводит к увеличению числа больных с симпатикотонией и повышению встречаемости энергозатратных фаз общего адаптационного синдрома.

Впервые проведено сравнительное изучение состояния вегетативной нервной системы у больных раком молочной железы в динамике проведения цикловой полихимиотерапии при использовании в качестве гемостимуляторов экстракта шлемника байкальского, кропанола или препарата Г-КСФ. Показано, что под действием кропанола и экстракта шлемника байкальского, применяемых в качестве гемостимуляторов, возрастает встречаемость энергосберегающих адаптационных реакций и формируется вегетативное и метаболическое равновесие. Выявлено, что ослабление симпатических влияний у больных раком молочной железы при дополнении полихимиотерапии одним из названных препаратов приводит к активации подавленного цитостатиками гемопоэза, в основе которого лежит повышение колониеобразующей активности гемопоэтических клеток-предшественников с последующим увеличением содержания в костном мозге и периферической крови ее форменных элементов, в частности, нейтрофильных гранулоцитов.

Впервые показано, что двукратное профилактическое применение препарата Г-КСФ филграстима в межкурсовом периоде приводит к сохранности, однако менее выраженной в сравнении с данными, полученными у больных, получающих только цитостатическую терапию, активации эрготропных процессов при одновременном снижении вагоинсулярных влияний. При этом зарегистрированы нарушения в процессах перемежающейся смены активности симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы.

Практическая значимость. Разработан патогенетически обоснованный подход к фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворения, возникающих в условиях цитостатической терапии, с использованием препаратов, обладающих вегетостабилизирующим действием - препаратом животного происхождения кропанолом и препаратом растительного происхождения экстрактом шлемника байкальского. Результаты клинического исследования показали высокую эффективность включения адаптогенных препаратов в схему специального лечения больных раком молочной железы с целью активации процессов кроветворения. Установлено, что все три препарата - экстракт шлемника байкальского, кропанол и препарат Г-КСФ - в изученных режимах оказывают практически идентичное гемостимулирующее действие на гранулоцитарный росток кроветворения, что позволяет рекомендовать использование адаптогенных препаратов кропанола и экстракта шлемника байкальского при проведении противоопухолевой химиотерапии.

Полученные результаты могут явиться основой для проведения исследований по изучению возможности применения адаптогенных препаратов с целью коррекции нарушений, возникающих в системе крови при воздействии на организм различных по своей природе экстремальных факторов и для лечения ряда заболеваний системы крови.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 2000), международной конференции "25 лет клинической фармакологии" (Москва, 1997), межрегиональной конференции "Актуальные вопросы медицинской радиологии" (Челябинск, 1997), региональной конференции "Актуальные проблемы пропедевтической и клинической фармакологии" (Омск, 1997), Пленуме правления Российского научного общества фармакологов (Москва, 1997), конференции фармакологов Сибири (Томск, 1997), Юбилейной конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН "Проблемы современной онкологии" (Томск, 1999), конференции "Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов" (Томск, 1999), на 1-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на ежегодной научной конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2000), на втором конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2001), на итоговых научных конференциях НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (Томск, 2001, 2002), Российской научно-практической конференции "Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии" (Томск, 2003), Российской научно-практической конференции "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2004), Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты" (Новосибирск, 2004), научной конференции "Фармакологическая регуляция стволовой клетки" (Томск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях" (Барнаул, 2007).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 29 научных работ, из них 15 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 365 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, 53 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, указателя литературы из 550 источников (129 отечественных и 421 иностранных авторов).

Материалы и методы

В настоящую работу включены результаты изучения системы крови и вегетативной нервной системы 152 больных раком молочной железы IIIБ-IV стадий, женщин в возрасте от 38 до 67 лет, находившихся на обследовании и лечении в отделении химиотерапии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 1999 по 2006 год и не получавших ранее специальной терапии. Материалом исследования являлись костный мозг, капиллярная и венозная кровь. Диагноз рака молочной железы в каждом случае устанавливался на основании данных маммографического, рентгенологического, ультразвукового методов обследования и был верифицирован морфологически. Определялась степень распространенности процесса: у 74 больных установлена IIIБ стадия рака молочной железы и у 78 - IV стадия.

Все больные получали противоопухолевую полихимиотерапию по схеме CAF, которая включала в себя введение адриамицина по 30 мг/м² внутривенно в 1-й и 8-й дни; 5-фторурацила по 500 мг/м² внутривенно в 1-й и 8-й дни; циклофосфана по 400 мг/м² внутримышечно через день (суммарная курсовая доза - 2400 мг/м²). Длительность цикла - 14 дней, интервал между курсами - 3 недели. Программа лечения в рамках данного исследования предусматривала проведение 3-х циклов полихимиотерапии. Наряду с указанным лечением в перерывах между курсами: 35 больных в течение 2-х недель принимали кропанол (АКО "Синтез", г. Курган) по 1 капсуле (0.05 г) 3 раза в день; 30 пациенток принимали экстракт шлемника байкальского в таблетках (ЭШБТ) (ГНЦЛС, г. Харьков) по 1 таблетке 3 раза в день начиная за 5-6 дней до специальной терапии и далее ежедневно в течение всей программы; 16-ти пациенткам в 8 и 12-й дни от последнего введения цитостатиков между курсами химиотерапии вводился нейпоген (фирма “Roche”) в дозе 300 мкг подкожно. Женщины, получавшие только противоопухолевую химиотерапию, составили 2 контрольных группы.1-я группа (28 больных) - для экстракта шлемника байкальского в таблетках, 2-я группа (43 пациентки) - для кропанола и Г-КСФ. Такое разделение было выполнено вследствие разных временных промежутков при проведении исследования препаратов.

Материал для исследования (капиллярную и венозную кровь) забирали до и после каждого цикла цитостатического лечения. Проведение преднизолоновых проб и стернальных пункций было запланировано до начала специфического лечения, а также перед II и III курсом химиотерапии. Распределение больных по группам наблюдения представлено в таблице 1.

Кроме того, состояние вегетативной нервной системы оценивали у 35 практически здоровых женщин в возрасте от 42 до 64 лет. Полученные данные использовали в качестве контроля.

Таблица 1. Распределение больных по группам наблюдения в соответствии с использованными методами исследования

Характеристика кропанола. Кропанол разработан в ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН на основе пантогематогена-сухого (регистрационное удостоверение МЗ РФ № Р № 000051/01-2000 от 12.10.2000). Препарат получен путем низкотемпературного обезвоживания и стерилизации крови алтайского марала (Cervus elaphus sibiricus), взятой в период срезки пантов. Представляет собой аморфный порошок буровато-коричневого цвета, со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен.

Пантогематоген содержит большое количество биологически активных веществ, включая сложные органические соединения, энзимы, гормоноподобные вещества в высоких концентрациях, а также минеральные соли, витамины и аминокислоты.

В состав капсулы кропанола (200 мг) входит 50 мг пантогематогена-сухого, 145 мг глюкозы и 5 мг аскорбиновой кислоты.

Характеристика экстракта шлемника байкальского в таблетках. Представляет собой таблетированную форму экстракта шлемника байкальского сухого, получаемого из корневищ и корней шлемника байкальского - Scutellaria baicalensis Georgi, семейства яснотковых - Lamiaceae.

Аморфный порошок от желтого до буровато-желтого цвета, со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен.

Химический состав: корни и корневища содержат флавоноиды - байкалин, байкалеин, вогонин, большое количество дубильных веществ пирокатехиновой группы, смолы, крахмал и другие органические соединения. Содержание суммы флавоноидов в экстракте шлемника сухом в пересчете на байкалин и сухое вещество - не менее 35%.

Характеристика Г-КСФ. Нейпоген, фирма “Roche” (активное вещество - филграстим): негликозилированный рекомбинантный человеческий метионильный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Представляет собой высокоочищенный негликозилированный белок, состоящий из 175 аминокислот. Вырабатывается лабораторным штаммом бактерии Escherichia coli, в которую методами генной инженерии введен ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.

Один флакон с 1,0 мл раствора для инъекций содержит 30 млн ЕД филграстима; один флакон с 1,6 мл раствора для инъекций содержит 48 млн ЕД филграстима. Наполнители: натрий-ацетатный буфер (рН 4,0), маннитол, полисорбат 80, вода для инъекций.

Изучение показателей периферической крови (содержание гемоглобина, эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и лейкоцитарных формул), а также дифференциальный подсчет миелограмм в стернальном пунктате проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В. и др., 1987].

Изучение костномозгового резерва полиморфноядерных лейкоцитов выполнялось по результатам преднизолоновой пробы [Dall D e. a., 1975].

Функциональную активность нейтрофилов определяли в реакции восстановления нитросинего тетразолия (по методу И.В. Нестеровой с соавт., 1999) по их способности генерировать активные формы кислорода (АФК).

Количественное определение сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса в эритроцитах периферической крови производили методом цитофотометрии.

Определение величины сухой массы эритроцитов производили методом интерферометрии [Козинец Г.И. и др., 1980; Гольдберг Е.Д. и др., 1983] с помощью поляризационно-интерференционного микроскопа “Biolar PI” (Польша, фирма PZO).

Типы адаптационной реакции определяли по процентному содержанию лимфоцитов в лейкоцитарной формуле и их соотношению с сегментоядерными нейтрофилами.

Оценку вариаций сердечного ритма (ВСР) производили по статистическим показателям и параметрам спектра сердечного ритма (СР).

Анализируемые показатели:

Мода (Мо) - наиболее часто встречающееся значение длительности RR - интервалов; амплитуда Моды (АМо) - число значений интервалов, равных Мо, в процентах к общему количеству зарегистрированных кардиоинтервалов; вариационный размах (DX) - разница между максимальным и минимальным значениями длительности зарегистрированных RR - интервалов в секундах.

Рассчитывали следующие индексы вегетативной регуляции:

Индекс напряжения регуляторных систем (ИН), отражающий степень централизации управления сердечным ритмом, по формуле:

Индекс вегетативного равновесия (ИВР), указывающий на соотношение между активностью симпатического и парасимпатического отделов ВНС, по формуле:

Вегетативный показатель ритма (ВПР), позволяющий судить о вегетативном балансе с точки зрения оценки активности автономного контура регуляции, по формуле:

Показатель адекватности процессов регуляции (ПАПР), позволяющий путем сопоставления с частотой пульса судить о наличии избыточной или недостаточной централизации управления ритмом сердца, по формуле:

Оценку периодограммы проводили по методу Уэлча, основанному на быстром преобразовании Фурье.

Определение тонуса и реактивности вегетативной нервной системы проводили также с помощью расчета индекса Кердо по формуле:

;

где Д - величина диастолического давления, Р - частота сердечных сокращений в минуту.

При полном вегетативном равновесии индекс Кердо равен нулю, положительное значение свидетельствует о преобладании симпатических влияний, а отрицательное - о повышении тонуса парасимпатического отдела ВНС [Вейн А. М., 1998; Михайлов В. М., 2002].

Полученные в работе результаты обрабатывали методами вариационной статистики.

Результаты исследования и их обсуждение

Для того чтобы подтвердить на выбранной нами клинической модели роль вегетативной нервной системы в регуляции системы крови при проведении цитостатической химиотерапии, было выполнено изучение основных показателей гемопоэза в зависимости от тонуса и реактивности ВНС.

С целью изучения периферического звена гемопоэза определялись такие показатели, как общее число лейкоцитов и количество их отдельных морфологических форм, число эритроцитов и ретикулоцитов, а также уровень гемоглобина. Больные распространенным РМЖ, получавшие химиотерапию CAF, были разделены на 3 группы: "гипер" и "симпатотоники" с дефицитом резервов реактивности ВНС; "нормотоники" с сохранной реактивностью ВНС; "парасимпатотоники" с сохранением резервов реактивности ВНС.

Уже до начала противоопухолевого лекарственного лечения были отмечены различия между 3-мя группами, сформированными по состоянию тонуса и реактивности ВНС, практически по всем вышеназванным показателям периферической крови, и данные изменения в разной степени отмечались на протяжении всего периода наблюдения.

Так, в группе "гипер" - и "симпатотоников" количество лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, ретикулоцитов периферической крови было достоверно меньше, чем в группах больных с нормотонией и парасимпатикотонией. Кроме того, достоверные отличия были зарегистрированы по таким показателям, как сухая масса эритроцитов и их цитохимические характеристики (содержание сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса). С целью исследования костномозгового кроветворения в зависимости от преобладания у больных того или иного отдела ВНС нами было проведено определение содержания кроветворных клеток-предшественников в периферической крови больных РМЖ: в группе "гипер" - и "симпатотоников" отмечено достоверно меньшее содержание циркулирующих гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров, чем в группах "нормотоников" и "парасимпатотоников". Аналогичные различия данного показателя в группах больных были зарегистрированы после каждого из 2-х курсов химиотерапии. Что касается эритроидных предшественников, то здесь различия между группами пациенток были не столь ярко выражены: только на момент окончания запланированных курсов химиотерапии в группе "симпатотоников" содержание КОЕ-Э было достоверно меньше, чем у больных с нормотонией и парасимпатикотонией.

Таким образом, на основании проведенных нами исследований было убедительно показано, что основные показатели периферического звена кроветворения зависят от тонуса и реактивности вегетативной нервной системы.

Далее нами было проведено изучение основных показателей гемопоэза при проведении химиотерапии CAF больным раком молочной железы в условиях применения каждого из трех препаратов - экстракта шлемника байкальского, кропанола и нейпогена.

Первым по времени было выполнено исследование гемостимулирующих и вегетотропных свойств у препарата растительного происхождения - экстракта шлемника байкальского сухого (ЭШБ). Поскольку данный препарат назначался непрерывно в течение всего периода наблюдения, в том числе - и во время проведения курсов цитостатической терапии, в отличие от кропанола и нейпогена, применение которых осуществлялось только в межкурсовой период, некоторые показатели изучались в течение более короткого временного промежутка (до и после каждого из 2-х курсов полихимиотерапии), и была выделена отдельная контрольная группа больных, получавших только химиотерапию CAF.

При изучении содержания эритроцитов и гемоглобина в периферической крови больных РМЖ в динамике цитостатической терапии в комбинации с экстрактом шлемника байкальского не было выявлено достоверных отличий от аналогичных показателей у пациентов контрольной группы, получавших только противоопухолевую химиотерапию, однако нами получены данные, свидетельствующие об изменении качественных характеристик клеток красной крови при проведении химиотерапии на фоне экстракта шлемника байкальского: отмечалось достоверное увеличение сухой массы эритроцитов и их цитохимических показателей - количества сульфгидрильных групп и липопротеинового комплекса, а также нарастание числа ретикулоцитов. В совокупности вышеприведенные данные однозначно можно интерпретировать в пользу того, что под влиянием ЭШБ имеет место стимуляция эритроидного ростка гемопоэза.

Анализ миелограмм показал, что применение ЭШБ приводило к повышению количества незрелых эритроидных клеток (типа эритробластов-базофильных нормобластов) во всех контрольных точках (на ј - 1/3 от своего исходного значения). Говоря о механизмах гемостимулирующего действия ЭШБ, следует иметь ввиду [Абрамова Е.В., 1992, Гольдберг В.Е. и др., 1992], что в основе активирующего влияния жидкого экстракта шлемника байкальского на процессы костномозгового кроветворения у мышей лежит возрастание уровней эритропоэтической и колониестимулирующей активностей периферической крови, увеличение продукции клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения короткодистантных гуморальных регуляторов типа ЭПА и КСА, стимуляция образования гемопоэтических островков, процессов пролиферации и дифференцировки коммитированных клеток-предшественников типа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ.

В нашей клинической работе нами было установлено, что под влиянием ЭШБ содержание периферических (циркулирующих) эритроидных предшественников вплоть до начала 2-го курса специального лечения сохранялось в пределах исходного значения, снижаясь примерно до 70% от фона лишь к окончанию программы лечения, в то время как в контрольной группе при проведении полихимиотерапии имело место нарастающее уменьшение числа КОЕ-Э - до 50% от фона к окончанию срока наблюдения.

Выполненные нами исследования выявили и значительное увеличение содержания тромбоцитов в периферической крови у больных РМЖ в процессе проведения полихимиотерапии при включении в программу лечения препарата шлемника байкальского.

При анализе динамики показателей белой крови было отмечено повышение под действием шлемника байкальского общего количества лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, регистрируемое на протяжении всей программы лечения. В костном мозге больных РМЖ при включении в схему терапии ЭШБ увеличивалось содержание незрелых миелоидных элементов.

Как известно, состояние плацдарма кроветворения напрямую зависит от размеров и функциональной активности пула кроветворных клеток-предшественников. При этом, определяя содержание прекурсоров, циркулирующих в периферической крови, можно оценить состояние костномозгового кроветворения [Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989]. Вероятно, препарат шлемника байкальского стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки не только морфологически дифференцируемых кроветворных клеток (о чем свидетельствует анализ миелограмм), но и кроветворных предшественников грануломоноцитопоэза типа КОЕ-ГМ. Так, включение растительного препарата в схему лечения больных раком молочной железы сопровождалось постепенным возрастанием числа КОЕ-ГМ (примерно на 15% от исходного на момент окончания программы лечения).

Таким образом, нами было установлено, что экстракт шлемника байкальского обладает гемостимулирующими свойствами, о чем свидетельствует возрастание содержания в периферической крови ретикулоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и тромбоцитов. Вызванная применением ЭШБ активация функции эритрона обусловлена стимуляцией процессов костномозгового эритропоэза, возрастанием содержания коммитированных клеток-предшественников типа КОЕ-Э, нормализацией структурно-метаболического статуса зрелых эритроцитов - таких как сухая масса, сульфгидрильные группы, липопротеиновый комплекс. В основе активации миелопоэза под влиянием препарата ЭШБ лежит стимуляция процессов костномозгового гранулоцитопоэза, о чем свидетельствует повышение содержания в костном мозге пациенток незрелых нейтрофильных гранулоцитарных клеток, а также возрастание числа циркулирующих клеток-предшественников грануломоноцитопоэза - КОЕ-ГМ.

Вторым, изученным нами в рамках данного исследования, был препарат животного происхождения, получаемый из крови марала - кропанол (пантогематоген).

В процессе проведения курсов химиотерапии отмечалось более высокое содержание лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов у больных, получавших кропанол, в сравнении с пациентками контрольной группы, причем разница была достоверна. При изучении показателей красного ростка кроветворения, таких как эритроциты и гемоглобин, а также содержания тромбоцитов, нами не было выявлено значимых отличий при применении кропанола.

Вместе с тем, при включении в схему лечения кропанола было выявлено достоверно большее по сравнению с контрольной группой содержание в костном мозге коммитированных клеток-предшественников эритропоэза, составляющих его глубокий резерв. Подобной оказалась и динамика содержания эритроидных прекурсоров в периферической крови. Таким образом, несмотря на малую активность исследуемого препарата в отношении эритроидного ростка в целом, репродуктивная способность эритрона оставалась на достаточно высоком уровне за счет его глубокого резерва.

Что касается лейкоцитарного звена гемопоэза, то картина периферической крови в целом соответствовала изменениям со стороны миелоидного ростка кроветворения. Прием кропанола приводил к достоверному возрастанию в костном мозге числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов перед 2-м и 3-м циклами специфического лечения как по сравнению с исходным уровнем (в 1,4 - 1,5 раза), так и с величиной соответствующего показателя у больных, леченых по схеме CAF (в 1,2 - 1,3 раза). Учитывая, что назначение препарата животного происхождения вызывало достоверное снижение содержания в костном мозге незрелых нейтрофильных гранулоцитов во все сроки исследования по сравнению с контрольной группой, можно сделать вывод о преобладании процессов дифференцировки миелоидных клеток над процессами их пролиферации под влиянием кропанола.

Говоря о механизмах гемостимулирующего действия кропанола, следует иметь в виду, что в основе активирующего влияния пантогематогена сухого на процессы восстановления костномозгового кроветворения у мышей после введения циклофосфана лежит возрастание уровней эритропоэтической и колониестимулирующей активностей сыворотки периферической крови, увеличение продукции клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения короткодистантных гуморальных регуляторов типа КСА, стимуляция образования гемопоэтических островков и процессов пролиферации коммитированных клеток-предшественников типа КОЕ-ГМ [Жданов В.В. и др., 1999; Удут Е.В. и др., 1999; Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Гурьянцева Л.А. и др., 2000; Дыгай А.М. и др., 2000].

В нашей клинической работе было установлено, что число костномозговых КОЕ-ГМ при лечении по схеме CAF достоверно возрастало лишь перед 2-м курсом специальной терапии (на 22 %). В эти же сроки при лечении больных в сочетании с кропанолом содержание КОЕ-ГМ увеличивалось на 88,5 % по сравнению с нелечеными пациентами, при этом их количество превышало аналогичные параметры у больных, не принимавших кропанол, в 1,6 раза. Перед 3-м курсом химиотерапии в группе больных, принимавших кропанол, число клеток-предшественников грануломоноцитопоэза оказалось достоверно выше аналогичных значений в контрольной группе (в 1,7 раза).

Вместе с тем, количество циркулирующих клеток-предшественников грануломоноцитопоэза у больных, получавших кропанол в интервалах между курсами химиотерапии, хотя и было на протяжении всего периода наблюдения значительно выше уровня аналогичного параметра в контрольной группе, но достоверно от него не отличалось. Приведенные факты могут быть обусловлены, с одной стороны, усилением пролиферативной активности коммитированных предшественников в костном мозге, с другой - перераспределительными реакциями в системе крови под действием кропанола, поскольку обнаруженные изменения соответствуют картине мобилизации кроветворных прекурсоров из костного мозга в периферическую кровь. Таким образом, применение кропанола расширяет возможность расселения гемопоэтических предшественников на внекостномозговые территории.

Учитывая тот факт, что наиболее выраженные различия при проведении противоопухолевой химиотерапии CAF и CAF+кропанол наблюдались со стороны белого ростка гемопоэза, нами было проведено более глубокое изучение токсического влияния цитостатического лечения на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов. Для оценки функциональной активности нейтрофилов периферической крови проводилась преднизолоновая проба. При сравнительном анализе ее результатов было установлено, что выраженность реакции на преднизолон костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов значительно возрастает при использовании режима CAF в комбинации с кропанолом по сравнению как с контрольной группой (CAF), так и с соответствующими показателями у больных РМЖ до специального лечения.

Для оценки функциональной активности нейтрофилов периферической крови при назначении кропанола также проводилось исследование уровня окислительно-восстановительных процессов в НСТ-тесте. Результаты данного исследования показали, что назначение больным РМЖ в процессе химиотерапии кропанола приводит к полной отмене угнетающего влияния препаратов схемы CAF на показатели фагоцитарного резерва, и даже некоторому их возрастанию в сравнении с исходным уровнем. Необходимо отметить, что при этом значение фагоцитарного резерва и показатель фагоцитарного резерва в группе больных, леченных по схеме CAF в комбинации с кропанолом, в 2,3 и 2,6 раза соответственно превышали аналогичные параметры в контрольной группе. Приведенные выше факты подтверждают протективное влияние кропанола на показатели функциональной активности нейтрофилов в процессе цитостатической терапии.

Таким образом, в ходе исследования было показано, что кропанол стимулирует регенерацию преимущественно грануломоноцитопоэза за счет активации гемопоэтических клеток-предшественников с последующим увеличением содержания в костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а в периферической крови - нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов.

У больных, получавших в межкурсовой интервал препарат Г-КСФ, в сравнении с пациентками контрольной группы, отмечалось достоверно большее содержание лейкоцитов в течение всего периода наблюдения. Что касается динамики содержания в периферической крови нейтрофильных гранулоцитов, то она была аналогична таковой для общего числа лейкоцитов.

Таким образом, в группе больных, получавших препарат Г-КСФ, было отмечено увеличение содержания в периферической крови общего числа лейкоцитов, которое в основном было обусловлено повышением числа нейтрофильных гранулоцитов.

При изучении таких показателей периферической крови как содержание эритроцитов, уровень гемоглобина и число тромбоцитов нами не было выявлено значимых различий между группами CAF и CAF+нейпоген.

Анализ миелограмм позволил установить, что у больных, получавших препарат Г-КСФ, в отличие от пациенток контрольной группы, в костном мозге преобладали зрелые нейтрофильные гранулоциты и эритроидные клетки.

При сравнительном анализе данных, полученных при проведении преднизолоновой пробы, было отмечено, что выраженность реакции на преднизолон костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов при профилактическом применении нейпогена в межкурсовом периоде значительно возрастает (как перед 2-м, так и перед 3-м курсами химиотерапии), достигая достоверных отличий по сравнению как с контрольной группой, так и с больными до начала специального лечения.

Помимо подсчета миелограмм и проведения преднизолоновых проб, нами было изучено содержание предшественников эритро - и грануломоноцитопоэза в костном мозге больных, получающих лечение по программам CAF, либо CAF+нейпоген. В группе пациенток, которым вводился нейпоген, количество КОЕ-ГМ статистически достоверно превышало данный показатель в группе контроля как перед 2-м, так и перед 3-м курсами противоопухолевого лекарственного лечения. Вместе с тем, содержание эритроидных предшественников в костном мозге больных, получавших лечение с нейпогеном, достоверно не отличалось от данного показателя в контрольной группе в течение всего периода наблюдения. Также ни в одной контрольной точке не было зафиксировано достоверных различий в содержании циркулирующих клеток-предшественников грануломоноцито - и эритропоэза между двумя сравниваемыми группами больных (CAF и CAF+нейпоген).

Таким образом, было установлено, что нейпоген при его профилактическом двукратном применении в межкурсовом интервале вызывает увеличение числа костномозговых клеток-предшественников грануломоноцитопоэза при постепенном уменьшении количества циркулирующих КОЕ-ГМ, повышение содержания в костном мозге и в периферической крови зрелых нейтрофильных гранулоцитов.

Учитывая тот факт, что основным дозолимитирующим фактором проведения противоопухолевой химиотерапии является цитостатическая лейкопения/ нейтропения, было проведено сравнительное изучение лейкопоэзстимулирующего действия всех трех препаратов (кропанол, экстракт шлемника байкальского, нейпоген). Показатели лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов были переведены нами в проценты от своего 100% -ного значения до начала специального лечения (рис.1 и 2)

Рис.1. Динамика содержания лейкоцитов в периферической крови больных распространенным РМЖ в процессе проведения противоопухолевой химиотерапии по схеме CAF+ЭШБ, CAF+кропанол, CAF+нейпоген, %.

Рис.2. Динамика содержания нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови больных распространенным РМЖ в процессе проведения противоопухолевой химиотерапии по схеме CAF+ЭШБ, CAF+кропанол, CAF+нейпоген, %.

При анализе полученных нами данных можно сделать следующие выводы:

К окончанию 1-го курса химиотерапии наблюдается большее содержание лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови у пациенток в группе CAF+ЭШБ, что связано с режимом применения ЭШБ, прием которого больные начинали до первого дня специального лечения;

К началу 2-го курса химиотерапии наблюдалось равное по величине повышение содержание лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови у пациенток всех трех групп (CAF+ЭШБ, CAF+кропанол, CAF+нейпоген) - в среднем около 10% от исходного уровня (до начала 1-го курса химиотерапии);

На момент начала 3-го курса химиотерапии наибольший прирост лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов отмечается у больных РМЖ, получавших между курсами полихимиотерапии CAF кропанол;

Наибольшее число нейтрофильных гранулоцитов в контрольных точках после 2-го и после 3-го курсов химиотерапии зафиксировано у больных, получавших экстракт шлемника байкальского, прием которого осуществлялся пациентками непрерывно в течение всего периода исследования.

Анализ состояния вегетативной нервной системы позволил нам сделать следующее заключение: в сравнении с данными, полученными в группе здоровых лиц, в когорте больных раком молочной железы IIIБ-IV стадии определяется явное преобладание "симпатотоников". При распространенном раке молочной железы встречаемость симпатикотонии превышает 67%, уже в оценке исходного вегетативного тонуса выражено отличаясь от контроля. Кроме того, различия между больными РМЖ и здоровыми выявлены со стороны вегетативной реактивности.

Изучение вариабельности ритма сердца, выполненного при анализе целого ряда расчетных величин, показало, что в контроле, представленном практически здоровыми лицами, и у больных РМЖ имеют место выраженные различия в состоянии вегетативной регуляции. Если у здоровых лиц сердечный ритм регулируется в условиях равновесного состояния симпатических и парасимпатических влияний с приоритетом действия периферического контура, то у больных, по полученным данным, регистрируется выраженное нарушение вегетативного равновесия в сторону преобладания симпатических влияний. При этом налицо явное повышение роли центрального звена (контура) регуляции.

У пациенток с распространенным РМЖ, судя по реакции активности автономного контура вегетативной регуляции, оцениваемой уровнем вегетативного показателя ритма (ВПР) сердца, исходно в сравнении со здоровыми лицами регистрировалось преобладание симпатических влияний.

По результатам изучения восстановительного периода вегетативной регуляции функций, оцениваемого по данным сердечного ритма в клиностатическом положении, установлено, что в контроле полное восстановление произошло в 45% случаев, а в 37% имела место симпатотоническая реакция. На долю реакции утомления пришлось лишь 18% пациентов. Такое распределение встречающихся характеристик восстановительного периода вполне соответствует физиологическому представительству состояния тонуса и реактивности ВНС в здоровой популяции [Михайлов В. М., 2002]. У больных раком молочной железы, напротив, несмотря на исходное преобладание симпатикотонии, восстановительный период характеризовался явным приоритетом встречаемости лиц с реакцией утомления (61%) в основном за счет убыли нормальных и симпатикотонических удлиненных реакций (рис.3).