II Международный симпозиум «Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи», Саратов, май 1998.

VII Всероссийская научно-практическая конференция по проблеме термических поражений, Челябинск, сентябрь 1999г.

Международный конгресс "Комбустиология на рубеже веков", Москва-Голицино, октябрь 2000г.

XIX съезд хирургов Украины, Харьков, ноябрь 2000г.

Congress of the European Burns Association, September, Lion, 2001.

Международная конференция «Актуальные проблемы термической травмы», Санкт-Петербург, июнь 2002г.

Всероссийская научная конференция «Проблемы термической травмы у детей и подростков», Екатеринбург, октябрь 2003г.

I Съезд комбустиологов России, Москва, октябрь 2004г.

Национальные дни лабораторной медицины, Москва, апрель 2005г.

Ученый Совет Института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, март 2006г.

11 Конгресс с Международным участием «Парентеральное и энтеральное питание», Москва, ноябрь 2007г.

II Съезд комбустиологов России, Москва, июнь 2008г.

Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого совета ФГУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского Росмедтехнологий» 13 марта 2008г.

Внедрение. Структурное моделирование процесса адаптации, основанное на разработанных объективных критериях вариантов универсального ответа организма в зависимости от тяжести ожоговой травмы, способствующее своевременной диагностике и профилактике развития жизнеопасных осложнений и определяющее принципы интенсивной терапии тяжелообожженных, внедрено в лечебно-диагностическую практику ожоговых центров: ФГУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского Росмедтехнологий» и Городской клинической больницы № 36 г. Москвы.

Структура и объем диссертации

ожоговый травма интенсивный терапия

Диссертация изложена на 268 страницах и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения и выводов. Текст диссертации иллюстрирован 22 таблицами и 27 рисунками. Список литературы содержит 408 источников, в том числе 135 отечественных и 273 иностранных.

Характеристика больных и методы исследований

Для оценки ответной реакции организма, включающей эндокринно-метаболические и иммунные звенья, проведено комплексное исследование 442 пациентов с ожоговой болезнью, находившихся на лечении в ожоговом центре Института хирургии им. А.В. Вишневского в 1990-2006 гг.

Все пострадавшие после получения термической травмы находились в состоянии шока. Оказание квалифицированной медицинской помощи по выведению пациентов из ожогового шока осуществлялось в лечебном учреждении по месту жительства или получения повреждения. В дальнейшем больные транспортировались в ожоговый центр, где им оказывалась специализированная медицинская помощь.

Включенные в исследование тяжелообожженные были распределены на три группы в соответствии со степенью тяжести травмы, используя индекс Франка (ИФ). Значение ИФ рассчитывалось по следующей формуле: S поверхностных (% п.т.) + 3 S глубоких ожогов (% п.т.). Кроме того, учитывали наличие термоингаляционного поражения.

Первую группу составили 139 стабильно-тяжелых больных с общей площадью (S) поражения <50% п.т. и ИФ?90. При поступлении состояние их было тяжелым, обусловленным острой ожоговой токсемией. В дальнейшем состояние их оценивалось как стабильно-тяжелое, без признаков выраженной полиорганной недостаточности и сепсиса. Пациентам была продолжена интенсивная терапия в условиях ожогового отделения.

Вторую и третью группы составили тяжелообожженные пострадавшие, оценка степени поражения которых свидетельствовала о неблагоприятном прогнозе - ИФ >100, а течение ожоговой болезни осложнилось развитием клинически выраженной ПОН и сепсиса. Всем пострадавшим этих групп проводилось длительное комплексное интенсивное лечение, включающее реанимационную поддержку.

При этом вторую группу составили выжившие больные с общей S поражения ?50% п.т. и ИФ?135±10 (n=183), а третью - аналогичные по тяжести травмы пострадавшие с ИФ?130±15 (n=120), но имевшие в дальнейшем неблагоприятный исход: в течение 3-4 -х недель после ожога (n=28) или в более поздний период, через 1.5-2 месяца после травмы (n=92). Комплексное исследование пациентов проводилось с момента поступления (7-10 сут), и далее, с периодичностью в неделю.

Оценка глюкокортикоидной функции коры надпочечников осуществлялась путем определения суточной экскреции 17 ОКС методом микроколоночной хроматографии (Bradlow HL, 1968), c использованием реактивов фирмы «Biosystems». Тотальное нарушение процесса канальцевой реабсорбции при тяжелой термической травме обуславливает диагностическую ценность определения метаболитов в моче (Дедов И.И., 2000). Особое значение имеет гипераминоацидурия (повышение экскреции аминокислот), свидетельствующая о преобладании потерь белка. Определение азотистого баланса проводили по содержанию и экскреции азота аминокислот нингидриновой реакцией, предложенной Moore S и Stein W (1948). Измерение спонтанной хемилюминесценции крови проводили по методу Lindena J (1987) на люминометре (Япония). Результаты выражали в приборных единицах (мВ) в пересчете на 10 мкл крови. Определение однонитевых разрывов ДНК осуществляли измерением флюоресцентного свечения комплексов щелочных гидролизатов ДНК с бромистым этидием (Thyerry D et al, 1985) в модификации Москалевой Е.Ю. (1998). Экспрессию mRNA цитокинов и факторов апоптоза определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР), которую проводили с использованием специфических праймеров к ДНК цитокинов (TNF-, IL-6, 10) и факторов апоптоза (каспаза 8, Bcl 2, Bax и P53), а также ревертазы, -актина, Tag-полимеразы (реактивы фирмы «Синтол») на отечественном анализаторе нуклеиновых кислот АНК - 32. Мониторинг накопления амплифицированного продукта осуществляли с помощью флюоресцентного сигнала. Иммунный статус исследовали методами турбодиметрии, хемилюминесценции, иммунодиффузии. Количество клеток и фенотип лимфоцитов, относящихся к различным популяциям, а также молекулярные маркеры активации, зрелости и функциональной специализации клеток анализировали методом иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител и проточного лазерного цитофлюориметра FACSCalibur фирмы Becton Dickinson в отделе активации иммунитета ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ.

Статистическую обработку и расчет коэффициентов корреляции проводили с использованием пакета программ Статистика-6. Результаты представляли как Mm, где M - среднее арифметическое, а m - стандартное отклонение. Достоверность различий между группами оценивали с использованием критерия Уилкоксона для связанных величин и U- теста или Стьюдента для несвязанных величин. Достоверным считали различие при p0.05. Для определения корреляционных связей использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона (r). При оценке показателей мы использовали коэффициент отклонения среднего значения показателя в анализируемой группе от среднего значения нормы - Km.

Результаты и обсуждение

Несмотря на сложившееся мнение о постоянно повышенном уровне стрессовых гормонов у пострадавших с тяжелыми ожогами, нами получены результаты, свидетельствующие о различиях в выбросе кортизола у пациентов наблюдаемых групп на всем протяжении острого посттравматического периода (рис.1).

У выживших тяжелообожженных по сравнению с пострадавшими с фатальным исходом уже при поступлении имелось более чем 6-кратное достоверное (p<0.01) увеличение содержания кортикостероидов: Km первых = 1.9, а вторых = 0.27.

В дальнейшем среди пациентов с неблагоприятным исходом продолжало нарастать число больных, у которых экскреция биологически активных метаболитов кортизола не определялась вовсе.

Однако у стабильно-тяжелых больных c аналогичной по тяжести травмой, но не имевших жизнеопасных осложнений в виде выраженной ПОН и сепсиса, определялась более интенсивная стресс-реакция: 3-кратная от средней нормы и 10-кратная по сравнению с пациентами с фатальным прогнозом. Причем, постепенный ее спад до нормы к 25-30 сут (p< 0.05) совпадал с относительным достижением стадии срочной адаптации к травме, проявляющейся клинической стабилизацией состояния больного, восстановлением основных клинико-биохимических параметров и подготовкой ран к пластике.

Рис. 1. Общая динамика 17ОКС у пациентов с термической травмой (n=58)

Поэтому именно этот уровень интенсивности стресс-реакции должен служить ориентиром для благоприятного прогноза и оптимальным для создания толерантности к постоянным стрессорным нагрузкам, включая агрессивные методы лечения и диагностики. В таком случае менее выраженную стресс-реакцию у выживших тяжелообожженных 2-й группы необходимо отнести к относительно недостаточной, т.е. дезадаптивной, требующей динамического контроля содержания 17 ОКС и общей заместительной терапии, включая глюкокортикоидную при наличии сохраняющейся тенденции метаболического истощения. Ранний спад стрессовых гормонов (срыв адаптации), являющийся прогностически неблагоприятным, необходимо своевременно корригировать назначением кортикостероидов.

Сравнительное исследование летальности пациентов на фоне болюсного введения супердоз кортикостероидов (группа «Г») и пострадавших без применения гормонов (группа «П») продемонстрировало ускорение неблагоприятного исхода на 10% в группе «Г» по сравнению с пострадавшими группы «П» (рис. 2). По-видимому, применение такого рода терапии возможно как экстра-мера в критических ситуациях для поддержания гемодинамики.

Рис. 2. Сравнительная летальность пациентов с «болюсной» терапией кортикостероидами (Г) и без нее (П)

Известно, что летальный исход наступает иногда стремительно, в ранние сроки после травмы, через 3-4 недели. Течение болезни развивается в таком случае по гипердинамическому типу с кортикостероидной гиперактивацией. В четырех наблюдениях определялось стойкое увеличение экскреции 17 ОКС (6-10 кратное) практически весь наблюдаемый период. Однако гибель пациентов наступала на фоне ПОН, включая адреналовую недостаточность.

Аналогичная картина финального исхода наблюдалась у больных с «болюсной» гормональной терапией супердозами глюкокортикоидов (до 90 мг в пересчете на преднизолон), вызвавшими состояние адреналовой гиперактивации с последующей ее недостаточностью. Непосредственно в день гибели у этих пострадавших не определялись ни 17ОКС, ни сывороточное железо, ни продукты пероксидации.

Различия в интенсивности стрессовой реакции, выявленные у пострадавших с разной степенью травмы и исходом, должны вызывать аналогичные изменения и в метаболическом ответе, т.е., адаптивное умеренное усиление, дезадаптивные сверхусиление или ингибирование. Что мы и наблюдали при оценке некоторых важных обменных процессов, при этом дезадаптивность реакций выступала как свидетельство недостаточности соответствующего органа или системы.

Послеожоговый гиперкатаболизм, инициируемый стрессовыми гормонами и цитокинами, приводит к развитию истощения, иммунодефицита и сепсиса. В то же время, это адаптивная реакция, направленная на получение дополнительных источников для синтеза глюкозы из гликогенных аминокислот (АК), образующихся путем распада белка, в первую очередь, скелетных мышц.

Исследование баланса азота АК - общепризнанный метод оценки белкового катаболизма. Умеренная степень гиперкатаболизма определялась у стабильно - тяжелых пациентов, проявившаяся незначительным повышением содержания азота АК в крови (гипераминоацидемия) и достаточно выраженной его экскрецией (Km=3), отражающей преобладание потерь белка над его усвоением при тяжелой ожоговой травме (табл. 1).

Выжившие тяжелообожженные демонстрировали дальнейшее адаптивное повышение гипераминоацидемии (Km = 1.57 при p=0.054) на фоне дезадаптивного резкого усиления гипераминоацидурии (Km=7 при p <0.05), обусловленной нарушением энергозависимой канальцевой реабсорбции АК, т.е., почечной дисфункцией.

Таблица 1

Уровень азота аминокислот у пациентов с термическими поражениями

Примечания: Различия по азоту АК крови достоверны между II и III группами при p<0.0001; различия по азоту АК сут. мочи достоверны: между I и II группами при p <0.05; между I и III - при p <0.001;

У пострадавших с неблагоприятным прогнозом наблюдался срыв процесса адаптации, проявившейся еще большим усилением как экскреции азота АК (Km= 8.5 при p<0.001), так и снижением его содержания в крови (Km=0.67 при p<0.0001), что свидетельствовало о прогрессировании нефропатии у данной группы больных по сравнению с выжившими тяжелообожженными.

Таким образом, сочетание гипоаминоацидемии (0.5 средней нормы) и гипераминоацидурии (8.5 средней нормы), характерное для пациентов с летальным в дальнейшем исходом, оказалось прогностически неблагоприятным.

Коррекция нарушений белкового обмена и восполнение энергодефицита давно являются частью комплексной терапии больных с обширными ожогами. На протяжении ряда лет наиболее распространенными средствами нутритивной поддержки были растворы аминокислот и глюкозы.

Проведенное динамическое обследование выживших тяжелообожженных пациентов и пациентов с неблагоприятным прогнозом на фоне подобной терапии продемонстрировало существенные различия в уровне азота АК у этих больных (рис. 3, 4).

Рис. 3. Динамика азота АК крови на фоне заместительной терапии растворами АК у пациентов с ИФ>100

Как известно, в норме гипераминоацидемия является мощным стимулом синтеза белка. Парентеральное введение растворов АК поддерживало умеренно повышенный уровень азота крови у выживших тяжелообожженных на протяжении всего периода наблюдения. В то время как у больных, в дальнейшем погибших, после резкого подъема его содержания к 15 суткам (p<0.05) отмечалось столь же значительное снижение на 25 сутки после травмы (p<0.05), обусловленное усилением его выделения (рис. 4).

Исходно практически одинаково выраженная гипераминоацидурия у пострадавших обеих групп в процессе лечения снижалась у выживших тяжелообожженных пациентов: изменение значений к 25 суткам достоверны по сравнению с 5-7 (p<0.01) и 15 сутками (p<0.0001), что свидетельствовало об эффективности заместительной терапии у больных с относительно благоприятным прогнозом.

.

Рис. 4. Динамика экскреции азота АК на фоне заместительной терапии растворами АК у пациентов с ИФ>100

Напротив, у пациентов с неблагоприятным в дальнейшем исходом на фоне парентерального введения растворов АК в процессе всего периода наблюдения сохранялся высокий уровень их потерь, обусловленный неспособностью к усвоению экзогенных АК и усилением их экскреции.

Т.е., в условиях энергетического дефицита, снижения активности метаболических энзимов, нарушенного трансмембранного транспорта АК (всасывания в кишечнике, захвата печенью, реабсорбции почками), характерных для тяжелой термической травмы, наблюдалось отсутствие эффективности от заместительной терапии растворами АК у пострадавших с неблагоприятным прогнозом.

Таким образом, мониторинг азотистого баланса в процессе белково-заместительной терапии позволяет своевременно осуществлять коррекцию объемов вводимых нутритивных смесей и демонстрирует необходимость в использовании средств с гепа- и нефропротекторным действием для обеспечения адекватного лечения у всех тяжелообожженных пациентов.

Адаптивность обменной стрессовой перестройки заключается в необходимости усиления продукции макроэргов для энергообеспечения воспалительной реакции. Известно, что синтез АТФ осуществляется в митохондриях, и избыток образующихся в ситуации гиперфункции свободных радикалов оказывает негативное воздействие на окружающие клетки, вызывая состояние оксидативного стресса.

Вторым основным источником свободных радикалов являются активированные нейтрофилы. Система нейтрофильного продуцирования оксидантов предназначена для локализации очага воспаления, однако чрезвычайно реакционные радикалы проникают в окружающие неповрежденные ткани и реагируют с фосфолипидами мембран, сульфгидрильными группами белков и т.д.

В числе последствий активации свободно-радикальных механизмов - перекисное окисление липидов (ПОЛ) биологических мембран, направленное на адаптивное в условиях гиперметаболизма повышение клеточной проницаемости. Однако в связи с безудержной самоподдерживаемой инициацией ПОЛ происходит не только модификация клеточной стенки, но и ее разрыхление и повреждение, приводящие к повышению микроваскулярной проницаемости и системному поражению органов и тканей.

Результаты наших исследований наглядно демонстрируют степень выраженности этих процессов у пострадавших анализируемых групп (рис. 5, табл. 2).

Наиболее реакционный промежуточный продукт ПОЛ, малоновый диальдегид (МДА), имел тенденцию к значительному повышению своего уровня у стабильно тяжелых больных, выявляя гиперактивность указанных выше процессов и необходимость в усилении антиоксидантной защиты у пациентов данной группы (табл. 2).

Однако у пациентов с термоингаляционной травмой зарегистрированы максимальные, дезадаптивные значения содержания МДА, обусловленные, по-видимому, резким усилением клеточной проницаемости в паранекротических зонах, приводящей к интерстициальному отеку легочной ткани и дыхательной недостаточности.

В дальнейшем, этот показатель, как и у стабильно тяжелых больных, постепенно снижался, отражая эффективность проводимой комплексной терапии (p0.05; p0.001).

Рис.5. Динамика содержания ТБК-продуктов при термической травме (n=28)

Таблица 2

Уровень МДА (N-0.2 мкмоль/л) у пациентов с ожоговой травмой (n=34)

Примечания: результаты представлены в виде (M±m); n -число наблюдений; () - достоверная разница изменения показателей в данные сроки; Km - кратность от средней нормы

Таким образом, дезадаптивно повышенный уровень МДА может быть дополнительным маркером острого паренхиматозного поражения легких. По-видимому, именно этим фактом объясняется тенденция к более высокому содержанию альдегида на 10-е сутки после травмы у больных с фатальным в дальнейшем исходом, по сравнению с выжившими тяжелообожженными, у которых осложнения со стороны дыхательной системы развивались позднее, к 15-м суткам, так же, как и рост уровня МДА (табл.2).

Между тем, оценка содержания общего количества метаболитов ПОЛ - продуктов, дающих реакцию с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), отражая активность процессов ПОЛ, выявляет способность организма к окислению промежуточных альдегидов (рис.5).

Умеренная активация пероксидации по содержанию ТБК-продуктов (Km = 2.0 - 2.7) как свидетельство адаптивного усиления свободно-радикального синтеза макроэргов и повышения клеточной проницаемости в условиях гиперметаболизма определена на 10-е сутки после травмы у тяжелообожженных пациентов 1-й и 2-й групп. И дезадаптивное ослабление процессов ПОЛ (Km = 0.9), свидетельствующее о недостаточности системы биологического окисления, выявлено у пациентов с неблагоприятным в дальнейшем исходом.

Известно, что для тяжелой ожоговой травмы характерно стремительно развивающееся метаболическое истощение. Поэтому уже к 15-м суткам у выживших тяжелообожженных мы наблюдали относительное ослабление процессов ПОЛ по сравнению со стабильно-тяжелыми больными, а у пострадавших с неблагоприятным прогнозом - дальнейшее угнетение их активности вплоть до ингибирования к 25-м суткам, когда ТБК-продукты у этой группы пациентов не определялись вовсе.

Причин данного факта может быть несколько. Во-первых, увеличение длительности запроса на энергетические субстраты приводит к их потреблению и невозможности адекватного синтеза и, как следствие, ослаблению продукции свободных радикалов. Во-вторых, уменьшение функциональной активности нейтрофилов как дальнейшая причина ослабления ПОЛ. И наконец, продемонстрированное нами угнетение стрессовой реакции, являющейся основным индуктором этих процессов.

В итоге развивается недостаточность системы биологического окисления (дефицит оксидазно-оксигеназных ферментов, осуществляющих перенос электронов, разрушение липидного микроокружения митохондриально-микросомального комплекса) и возникает необходимость в заместительной терапии переносчиков электронов и протонов (цитохромов), применении методов по электрохимическому и физическому окислению крови, клеточной терапии.

Таким образом, различия в интенсивности стрессовой реакции у пациентов с разной по тяжести травмой и исходом находят свое отражение в уровне метаболических реакций, направленных на энергетическое обеспечение воспаления.

Для более наглядного представления процесса адаптации нами предложено графическое его отображение в виде адаптограмм, которые строятся с помощью кратности исследуемых показателей, позволяющей поместить максимальное их количество, независимо от шкалы и единиц измерения (рис. 6). А располагая значения параметров в динамике и в соответствии со стресс-запускающей или стресс-лимитирующей направленностью, можно оценить уровень стрессовой реакции и ее адаптивность. Выявление нарушений адаптивных реакций позволяет провести опережающую диагностику клинических проявлений недостаточности органа или системы, а своевременная коррекция дезадаптивных реакций - профилактику этих осложнений.

а) гиперстресс б) гипостресс

Рис. 6. Адаптограммы больных: Ш.(а) и С. (б)

На основании результатов комплексного исследования эндокринно-метаболического статуса пострадавших, различающихся по степени тяжести ожоговой травмы и исходу, мы определили три основных типа адаптограмм: нормо -, гипо - и гиперстресс (рис.7).

Адаптивным является нормостресс с умеренным (2-3-кратным) повышением интенсивности ответа, дезадаптивными - гипо- (относительное угнетение) и гиперстресс (6-10 кратное усиление) интенсивности стрессовой реакции, характерные для пострадавших с неблагоприятным прогнозом. Оба этих типа без соответствующей корригирующей терапии неизбежно приводят к срыву процесса адаптации и гибели пациента.

Рис.7. Основные типы адаптограмм при термической травме

Структурное моделирование ответной реакции организма на ожоговую травму, предложенное нами в виде адаптограмм, позволяет вычислить вектор направленности исследуемого процесса, определяемый как результат взаимодействия двух противоположных систем, например, гипер- и гипокоагуляции (рис. 8).

Ретроспективная оценка данной адаптограммы демонстрирует опасную тенденцию снижения прокоагулянтного потенциала (эпизоды критического падения содержания фибриногена - «Ф», тромбоцитов - «тром», резкого удлинения АЧТВ, ТВ), которая может вызвать компенсаторную реакцию его усиления, что на фоне истощения антикоагулянтных факторов, например АIII, чревато развитием тромбоза или диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови - ДВС - синдрома. Через два месяца после ожога в стадии реабилитации пациентка погибла от тромбоэмболии легочной артерии.

Рис. 8. Адаптограмма коагулограммы больной Г

Определение типа адаптограммы способствует более корректному ведению больных в остром периоде формирования срочной адаптации, главным критерием которой является постепенный спад стрессовой реакции на фоне относительного восстановления гомеостаза, а критерием срыва выступает преждевременное угнетение реакции стресс-адаптации на фоне выраженного метаболического истощения и сохраняющегося повреждения.

Вершиной ответной реакции организма на повреждение является воспаление, благодаря которому происходит элиминация чужеродных антигенов, сначала посредством неспецифической реакции фагоцитоза (срочная адаптация), затем - специфической - антиген-антитело (долгосрочная адаптация).

Послеожоговая макрофагальная провоспалительная активация лежит в основе последующей иммунной дисфункции, присущей ПОН и сепсису, считают многие авторы. Другие сообщают, что острые гнойные инфекции сопровождаются как усилением фагоцитоза, так и его ингибированием, особенно, при генерализации процесса.

Выявленные различия в интенсивности эндокринно-метаболического ответа продолжают наблюдаться и при анализе первой стадии воспаления, фагоцитоза, активность которого оценивали по уровню спонтанной хемилюминесценции как показателю способности фагоцитов к продукции бактерицидных радикалов, индексу фагоцитоза как критерию включения клеточных резервов и поглотительной функции нейтрофилов, и содержанию циркулирующих иммунных комплексов как функции первичного неспецифического представления антигена.

Продукция нейтрофилами бактерицидных радикалов при поступлении оказалась повышенной у выживших больных: в группе стабильно-тяжелых в среднем в 4.3, а тяжелообожженных - в 2.3 раза (рис.9). При этом среднее значение уровня СХЛ в 1-й группе составило 869.83±240.44, а во 2-й - 462.70±48.64, что свидетельствовало об активном функционировании циркулирующих нейтрофилов у пострадавших 1-й группы и об относительном ослаблении этого процесса у выживших тяжелообожженных.

В дальнейшем у стабильно-тяжелых пациентов гиперпродукция свободных радикалов на фоне проводимого интенсивного лечения постепенно снижалась, оставаясь, однако, умеренно-повышенной вплоть до 35 сут (Km = 2.2), отражая адаптивность воспалительной реакции.

Выжившие тяжелообожженные пациенты с относительным ослаблением свободно-радикальных процессов в первую неделю, в дальнейшем, на протяжении всего срока наблюдения, имели тенденцию к их компенсаторному усилению, стабильно превышая в 3 раза среднюю норму и демонстрируя тем самым запаздывание адаптивной реакции по активации фагоцитоза.

У пациентов с неблагоприятным в дальнейшем исходом по сравнению с выжившими тяжелообожженными наблюдалось резкое ослабление уровня СХЛ (Km = 0.9 при p0.05), свидетельствовавшее о выраженном угнетении активности циркулирующих нейтрофилов по образованию бактерицидных свободных радикалов, которое может приводить к развитию сепсиса (Саркисов Д.С., 1987).

Рис. 9. Динамика уровня СХЛ при термической травме (n=103)

В дальнейшем, к 3 - 4 недели, пострадавшие с неблагоприятным прогнозом так же, как и выжившие тяжелообожженные, имели достоверное повышение уровня СХЛ (p0.05), обусловленное, по-видимому, стадией септикотоксемии. Однако эти пациенты так и не достигли степени бактерицидной активности, наблюдаемой у выживших больных.

Таким образом, при обширных и глубоких ожогах уже в первую неделю после травмы наблюдались признаки ослабления фагоцитарных реакций вплоть до их ингибирования при неблагоприятном прогнозе, что определяетт необходимость опережающего включения в комплексную терапию пациентов 2-й и, тем более, 3-й групп, дополнительных мер по стимуляции бактерицидной активности нейтрофилов и окислительных процессов в печени.

Снижение способности к продукции свободных радикалов по мере утяжеления травмы наблюдалось на фоне увеличения количества резервных нейтрофилов и усиления их поглотительной функции (рис. 10).

Индекс фагоцитоза в 1-й группе составил 3.14±0.75 (Km = 0.62), во 2-й - 5.16±0.51 (Km = 1.03). И максимальную поглотительную активность мы наблюдали у пострадавших с неблагоприятным в дальнейшем прогнозом - 6.55±1.49 (Km = 1.7).

В дальнейшем поглотительная способность нейтрофилов у пациентов с фатальным исходом 3-й группы резко падала, демонстрируя, по-видимому, истощение и резервных клеток. Аналогичная дезадаптивность, но в меньшей степени, наблюдалась у выживших тяжелообожженных 2-й группы, в то время, как стабильно-тяжелые пострадавшие 1-й группы имели возрастающую в этом отношении активность нейтрофилов при сохраненной способности к продукции бактерицидных радикалов.

Таким образом, более ранняя фаза процесса фагоцитоза, поглощение, по мере утяжеления степени травмы адаптивно усиливается, однако, стадия киллинга, отражающая завершенность этого процесса и требующая, по-видимому, дальнейших энергетических затрат, демонстрирует прогрессивное ослабление фагоцитарной функции, особенно выраженное у пациентов с неблагоприятным в дальнейшем исходом. С учетом у них наиболее низкого уровня спонтанной хемилюминесценции, при неблагоприятном прогнозе происходит перенасыщение нейтрофилов микробами с неспособностью к их перевариванию.

Адаптивная реакция по образованию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) предусматривает быстрое их выведение. В первую очередь, речь идет о макрофагах селезенки, где, главным образом, и происходит деградация ЦИК. При нарастании количества ЦИК организм не может их вывести, и защитная реакция превращается в патологическую.

Результаты исследования уровня циркулирующих иммунных комплексов продемонстрировали усиление их образования при ожоговой травме (рис. 11).

Рис. 10. Динамика индекса фагоцитоза при термической травме (n=103)

Причем, значения ЦИК отражали, по-видимому, активность предыдущего фагоцитарно-воспалительного процесса. Так, в первую неделю максимум содержания отмечался у стабильно-тяжелых больных 1-й группы с ИФ90 (9.31±1.70), далее - выжившие тяжелообожженные 2-й группы с ИФ135 10 (7.27±1.17) и, наконец, минимум определялся у пациентов с фатальным прогнозом с ИФ130 15 (4.58±1.65). Различия между пострадавшими с тяжелыми ожогами 2-й и 3-й групп в эти сроки были достоверны (p0.05).

В дальнейшем, стабильно-тяжелые пациенты в течение наблюдаемого периода практически элиминировали ЦИК, в то время, как у больных 2-й группы этот процесс задерживался, а у пострадавших с фатальным исходом, наоборот, развивался по восходящей, обуславливая дезадаптивность и этой реакции в виде негативных последствий накопления комплексов.

Рис. 11. Динамика ЦИК при термической травме (n=103)

Таким образом, степень активности раннего иммунного ответа у пострадавших с прогностически неблагоприятной ожоговой травмой, соответствующей ИФ?100, находится в обратной зависимости от ее тяжести, подтверждая результаты исследования эндокринно-метаболического статуса пациентов.

У стабильно-тяжелых больных с ИФ90 на фоне умеренно выраженной стрессовой реакции во всех ее проявлениях определялась аналогичная фагоцитарная активность. Для выживших пострадавших с ИФ135 10 характерно относительное ослабление как стрессовой, так и воспалительно-фагоцитарной активности. И, наконец, мы наблюдали угнетение процесса фагоцитоза у тяжелообожженных с фатальным в дальнейшем исходом как следствие ингибирования эндокринно-метаболического ответа.

В настоящее время известно, что глюкокортикоиды действуют на генетическом уровне, оказывая влияние на транскрипцию: они активируют гены для хемокинов, цитокинов, семейства комплемента и т.д. Поэтому выявленные различия ответной реакции организма при тяжелой ожоговой травме должны отразиться и на молекулярно-генетическом уровне.

По современным данным, оксидативный клеточный стресс проявляется повреждениями ДНК. В норме незначительные повреждения запускают репарацию молекулы ДНК. При невозможности восстановления инициируется процесс программируемой клеточной гибели - апоптоз.

Результаты исследования однонитевых разрывов ДНК нейтрофилов и лимфоцитов у 35 тяжелообожженных выявили массовые генетические повреждения клеток крови, превышающее норму в 9-10 раз, что практически исключает возможность восстановления, приводя к клеточной гибели. Причем, по нашим данным, при тяжелой ожоговой травме преобладали разрывы ДНК нейтрофилов (81.3±14.1) по сравнению с разрывами лимфоцитов (43.2±21.0), что естественно в условиях гиперактивного фагоцитоза.

Однако у тяжелообожженных с неблагоприятным прогнозом на стадии клинически выраженной ПОН отмечалось резкое снижение процента повреждений ДНК вплоть до их отсутствия, подтверждая результаты предыдущих исследований по угнетению процессов оксидации у данной категории больных. В таком случае, по-видимому, превалирует некротическая форма гибели клетки, опережающая появление разрывов ДНК.

С открытием молекулярной цитокиновой регуляции воспаления интерес к нему возобновился. И обусловлен он, прежде всего, новыми перспективами противовоспалительного воздействия на клеточно-молекулярном уровне.

Исходя из литературных данных о важной роли гиперактивности определенных цитокинов у пациентов с ПОН и сепсисом при тяжелой ожоговой травме, мы остановили свой выбор на исследовании экспрессии генов провоспалительных TNF- и IL-6, объединенных единой рецепторно-сигнальной связью с каспазой 8, и универсального противовоспалительного IL-10, супрессирующего воспаление в целом, включая рост и дифференцировку клеток, но активирующего гуморальную фазу иммунного ответа. Мы также сочли необходимым исследовать экспрессию генов митохондриальных регуляторов апоптоза, белков семейства Bcl: проапоптотического Bax и противоапоптотического Bcl2. По мнению многих исследователей, от соотношения именно этих регуляторов зависит в конечном итоге реостат клеточной жизни или смерти.

Результаты исследований цитокинового профиля и модуляции апоптоза методом полимеразной цепной реакции реального времени (РТ-ПЦР) подтверждают литературные данные об активации цитокинов и процесса апоптоза при термической травме.

Рис. 12. Сравнительная экспрессия mRNA TNF-, cas-8, IL-6 и IL-10 у пациентов с термической травмой (n=60)

Однако по мере утяжеления степени ожогового повреждения выявлено достоверное повышение экспрессии не только mRNA провоспалительных TNF- и IL-6, но и mRNA антивоспалительного IL-10, которое можно рассматривать как компенсаторную реакцию на усиление воспаления (рис. 12). Но у пострадавших с неблагоприятным в дальнейшем исходом, как в ранние (пог.II), так и в более поздние сроки (пог.I), наблюдался максимум противовоспалительной активности, причем, на фоне минимальной провоспалительной, что предполагает иную причину адаптивной реакции, по-видимому, супрессию клеточной гибели, индуцированной воспалением.

При анализе экспрессии mRNA митохондриальных регуляторов апоптоза обнаружена высокая их заинтересованность уже у стабильно тяжелых пациентов, продемонстрировавшая тяжесть ожоговой травмы как таковой и уровень борьбы за клетку (рис.13). При этом, максимальная активность проапоптотического Bax зарегистрирована у пострадавших, имевших летальный исход в ранние сроки (пог. II), причем, наблюдалась она на фоне минимальной экспрессии mRNA антиапоптотического Bcl-2.

Рис. 13. Сравнительная экспрессия mRNA bcl2, bax и p53 у пациентов с термической травмой (n=60)

Т.е., при раннем фатальном исходе выявлена, преимущественно, митохондриальная индукция апоптоза, в основе которой лежит, по-видимому, интрацеллюлярный энергетический коллапс как следствие стремительно развивающейся клеточной гипоксии.

Данные, полученные в ходе исследования разных по тяжести групп пациентов, представлены в таблицах 3 - 6.

У пострадавших с ИФ?90 наблюдался провоспалительный цитокиновый фон (преобладание экспрессии генов IL-6, TNF- над IL-10), индуцирующий рецепторно-каспазный путь апоптоза (9- кратное повышение активности каспазы 8) (табл. 3). Повышение экспрессии генов митохондриальных факторов апоптоза Bcl-2 и Bax, обнаруженное у стабильно-тяжелых пациентов, зарегистрировано при высокой активности ядерного белка p53. Причем, отмечалась достаточно выраженная прямая корреляция p53 с Bcl-2 (r=0.58) и слабая - с Bax (r=0.28), свидетельствовавшая о превалировании антиапоптотического регулирования.

Чтобы представить количественным образом про- или антивоспалительный и про- или антиапоптотический балансы, мы ввели соответствующие индексы: рецепторно-

Таблица 3

Экспрессия генов цитокинов и факторов апоптоза у пациентов с ИФ ?90

Примечание: результаты представлены в виде разности критических циклов ПЦР (M±m).

% выявленных случаев экспрессии от общего количества наблюдений (n).

макрофагальный (РМ): TNF+IL-6/IL-10, цитокин-воспалительный (Ц): IL-6/IL-10, митохондриальный (М): Bax/Bcl-2 и апоптотический (A): Bax+p53/Bcl-2 (рис.14).

У стабильно-тяжелых пациентов с ИФ?90, используя данные таблицы 3, индексы составили: PМ = 9.47, Ц = 6.57, М = 0.9. Учитывая изменение модальности p53 в зависимости от превалирования активности генов Bcl-2 или Bax, апоптотический индекс (А) в данном случае не может быть определен однозначно, так как экспрессия mRNA обоих пептидов повышена в равной степени. Однако наличие более высокой прямой корреляции p53 и Bcl-2 по сравнению с Bax дает основание к предположению о сохраняющемся потенциале коррекции повреждения митохондрий, а значит, и репарации клеток.

Рис.14. Сравнительные значения цитокиновых индексов при термической травме

Что касается цитокинового фона, высокие рецепторно-макрофагальный и цитокин-воспалительный индексы у стабильно тяжелых пациентов отражают, прежде всего, степень активности фагоцитоза, которая у пострадавших этой группы очень высока. Определив индексы только по результатам проб с экспрессией, мы подтверждаем выявленную направленность исследуемых процессов: РМ = 11.2, Ц = 8.2, М = 1.3.

Таким образом, адаптивный подход в оценке любого лабораторного показателя предполагает определение кратности его отклонения от средней нормы и сравнения с «адаптивной» нормой, исходя из тяжести и срока травмы. Исследование процесса с этих же позиций должно состоять из количественной оценки его противоположных составляющих, вычислении результирующего индекса и аналогичного соотнесения его значения с необходимой на данном этапе ответной реакции организма «адаптивной» нормой. Благодаря именно такому подходу, мы делаем вывод о наличии выраженного провоспалительного цитокинового статуса и индукции апоптоза по рецепторному пути у стабильно-тяжелых пострадавших, которые являются адаптивными реакциями в острый период ожоговой болезни.