Анализ данных в группе выживших тяжелообожженных с ИФ ?135±10 выявил еще большую активацию, как рецепторной, так и митохондриальной инициации апоптоза (табл.4, рис. 12, 13). На это указывали резкое повышение экспрессии mRNA TNF- (p<0.05) и тенденция к усилению активности генов IL-6, 10 и Bax, наблюдавшаяся, однако, на фоне минимальной экспрессии mRNA каспазы 8 и p53 (p<0.05).

Несомненно, увеличение количества поврежденных клеток при утяжелении травмы приводит к усилению цитокинового ответа на них и сигнальной рецепции к апоптозу фагоцитов, однако наблюдавшееся нами относительное угнетение экспрессии гена каспазы 8, одного из конечных участников процесса апоптоза, свидетельствовало об ослаблении апоптотического сигнала. В такой ситуации превалирует некротическая форма гибели эффекторных клеток, при которой интрацеллюлярные энзимы выходят во внешнюю среду, оказывая протеолитическое воздействие на здоровые клетки, в том числе и иммунные, и усиливая их дефицит. Возможно, поэтому ингибирование каспазной активности приводит к развитию бактериемий, на что указывают литературные данные.

Более точные тенденции выявили предложенные нами индексы. У тяжелообожженных выживших пациентов мы определили: РМ - 3.7, Ц - 1.14, М - 2.4 и А - 2.9, а по результатам проб с экспрессией: РМ - 2.7, Ц - 0.97, М - 1.5 и А - 2.0.

Т.е., действительно, несмотря на более высокую реализацию определяемых генов в клетках крови у больных этой группы, становятся очевидны явления, лежащие в основе утяжеления состояния пострадавших. Усиление клеточного дефицита привело к относительному ослаблению провоспалительной активности макрофагов и рецепторной индукции апоптоза (снижение РМ и Ц), а значительное поражение митохондрий (увеличение М и А) - к дальнейшему прогрессированию клеточной гибели путем митохондриальной индукции апоптоза (рис. 14).

Поэтому, несмотря на повышение экспрессии mRNA как про-, так и противовоспалительных цитокинов, мы вынуждены констатировать ослабление воспаления у тяжелообожженных пациентов по сравнению с больными предыдущей

Этиология первичного поражения митохондрий связана, в свою очередь, с прогрессированием клеточной гипоксии и митохондриальной проницаемости, в результате чего происходит усиление дисбаланса пептидов семейства Bcl в пользу индуктора апоптоза белка Bax.

Однако известно, что адаптивная реакция по «безвредной» утилизации скомпрометированных клеток апоптотическим путем возможна при незначительных повреждениях. В условиях же тяжелой ожоговой травмы на фоне выраженной клеточной гипоксии и отека наблюдается грубое набухание митохондрий и ингибирование окислительного фосфорилирования вплоть до энергетического коллапса, при котором возможна только некротическая форма гибели клетки. Поэтому, повышение экспрессии генов белков семейства Bcl, отражающее митохондриальную инициацию апоптоза, скорее всего, является проявлением начальной стадии поражения митохондрий, которое в дальнейшем может привести к гибели клетки путем некроза.

Таблица 4

Экспрессии генов цитокинов и факторов апоптоза у пациентов с ИФ ? 135±10

Примечание: результаты представлены в виде разности критических циклов ПЦР (M±m).

% выявленных случаев экспрессии от общего количества наблюдений (n).

группы. А по результатам проб с экспрессией выявилась даже тенденция к преобладанию противовоспалительного статуса.

Данных по клиническому исследованию экспрессии mRNA митохондриальных маркеров апоптоза, пептидов семейства Bcl, а также ядерного белка p53 при термической травме и сепсисе мы не обнаружили.

Несомненную ясность в динамику дезадаптивных реакций, выявленных у выживших пациентов с тяжелыми ожогами (относительное ослабление воспаления, тенденция к антивоспалительному фону, митохондриальная индукция апоптоза и усиление клеточной гибели), вносит анализ результатов исследования больных, погибших от аналогичной по тяжести травмы.

Среди пострадавших с неблагоприятным в дальнейшем исходом, в зависимости от его срока, выделены две подгруппы: погибшие через 1.5 - 2 месяца после травмы (поздняя гибель) и - через 3-4 недели (ранняя гибель).

Характерной особенностью пациентов с поздним летальным исходом (табл. 5, рис. 12) является антивоспалительный цитокиновый фон уже при поступлении, т.е. преимущественная экспрессия mRNA IL-10 по сравнению с IL-6 (p<0.02), а также ее возрастание по сравнению со стабильно-тяжелыми пациентами (p<0.001).

Кроме того, необходимо отметить тенденцию к раннему усилению активности каспазы 8 по сравнению с пострадавшими предыдущих групп, как в уровне экспрессии, так и в проценте выявленных случаев. В то время как у пациентов 1-й группы она составляла 28%, в группе выживших тяжелообожженных всего 23.5%, у больных с таблица 5

Экспрессия генов цитокинов и факторов апоптоза при поздней гибели пациентов с ИФ ? 130±15

Примечание: результаты представлены в виде разности критических циклов ПЦР (M±m).

% выявленных случаев экспрессии от общего количества наблюдений (n).

неблагоприятным в дальнейшем прогнозом отмечено усиление экспрессии mRNA cas 8 в 41% случаев.

Возможной причиной данного факта может быть реакция усиления индукции апоптоза на состоявшееся системное инфицирование, которая, наслоившись на ответную реакцию организма на тяжелое повреждение, привела к истощению воспалительного цитокинового фона, оставив протеолитический след. Действительно, у пациентов с неблагоприятным прогнозом по сравнению с выжившими больными с аналогичной по тяжести травмой зарегистрировано достоверное снижение экспрессии TNF- (p<0.01) и тенденция к угнетению активности гена IL-6. Другой возможной причиной усиления каспазной активности могут быть состояния гемодилюции и гипокоагуляции, усиливающие протеолиз.

В дальнейшем угнетение цитокиновой активности продолжалось, и перед гибелью на фоне сохраняющегося ингибирования гена TNF- экспрессия mRNA IL-6, -10 практически не определялась.

Еще более прогностически значимыми в данной подгруппе оказались предложенные индексы. При поступлении выявлено резкое снижение как рецепторно-макрофагального (0.7), так и цитокинового (0.31) индексов, а перед гибелью получены их нулевые значения, продемонстрировавшие полное угнетение фагоцитарно-воспалительных реакций (рис.14).

Причинами раннего ингибирования цитокиновой активности является, по-видимому, супрессия антивоспалительным IL-10 и нарастающий дефицит клеток, особенно стремительный у пострадавших с неблагоприятным прогнозом.

Несомненную важность с позиций патогенеза и возможностей терапии представляет сравнение показателей цитокинового статуса и модуляции процесса апоптоза у пациентов, погибших в разные сроки.

Для раннего летального исхода также характерен антивоспалительный цитокиновый профиль, причем абсолютный, при нулевой экспрессии mRNA IL-6 (табл.6, рис. 12, 13). При этом зафиксирована выраженная активность генов TNF- и Bax (у 6 из 7 погибших), отразившая резкое усиление рецепторной и митохондриальной сигнальной инициации апоптоза. Достоверно усиление экспрессии mRNA Bax по отношению к mRNA Bcl-2 (p<0.05). При сравнении с пациентами с «поздней гибелью» достоверно повышение активности TNF- (p<0.05), IL-10 (p<0.05). Достоверно также усиление экспрессии Bax у погибших в ранние сроки по сравнению с выжившими тяжелообожженными (p<0.05). Наблюдалась тенденция к дальнейшему повышению активности каспазы 8 по сравнению таблица 6.

Экспрессия генов цитокинов и факторов апоптоза у пациентов с ИФ ? 130±15, погибших в первые 3-4 недели

Примечание: результаты представлены в виде разности критических циклов ПЦР (M±m).

% выявленных случаев экспрессии от общего количества наблюдений (n).

с пострадавшими предыдущих групп, которая в комбинации с высокой экспрессией TNF- и Bax свидетельствовала о выраженной инициации апоптотической гибели клеток.

Определяемые индексы отражали полное ингибирование фагоцитарно-воспалительной реакции (РМ - 0.57, Ц - 0) и резкое увеличение митохондриального (М - 12.4) и апоптотического (А - 17.6) индексов (рис. 14).

Таким образом, для пациентов с летальным исходом в ранние сроки на фоне полной иммуносупрессии, включающей ингибирование фагоцитарно-воспалительного звена, характерна стремительная гибель клеток путем митохондриальной инициации, которая является пусковым моментом как апоптотической, так и некротической форм клеточной гибели в зависимости от степени поражения митохондрий.

В то время как у погибших в более поздние сроки наблюдалось постепенное угнетение апоптоза также на фоне иммуносупрессии, следствием чего явилось развитие хронического воспаления, которое в условиях интенсивной детоксикации обусловило более медленный, но необратимый процесс клеточной гибели путем некроза.

Изменение регуляции процесса апоптоза ядерным p53 также нашло свое отражение в динамике экспрессии его mRNA в зависимости от тяжести травмы и исхода. Максимум активности гена p53 зарегистрирован у стабильно-тяжелых пациентов (0.536±0.200) и в подгруппе погибших в ранние сроки (0.490±0.214). При этом, как уже сказано выше, его экспрессия имела противоположную направленность: в первом случае - анти-, а во втором - проапоптотическую. Минимальная активность отмечена у выживших тяжелообожженных (0.048±0.022), изменение которой достоверно по отношению как к стабильно-тяжелым больным (p<0.05), так и к погибшим в ранние сроки (p<0.05).

Таким образом, клиническое восприятие тяжелообожженного пациента как пострадавшего с более выраженным системным воспалением не находит подтверждения и по результатам молекулярно-биохимического исследования, которые демонстрируют разнонаправленную цитокиновую активность и модуляцию процесса апоптоза в зависимости от тяжести травмы и исхода, что необходимо учитывать при проведении комплексной интенсивной терапии.

Известно, что цитокины, являясь продуктами активированных иммунных клеток, сами участвуют в процессе их роста, дифференцировки, активации и гибели.

Результаты исследования основных популяций лимфоцитов у 67 пациентов с тяжелой термической травмой соответствуют известным литературным данным касательно клеточного дефицита и иммуносупрессии.

Вместе с тем, у пострадавших с разной степенью травмы и исходом выявлены отличия. У стабильно - тяжелых больных на фоне общего клеточного дефицита определены относительно наиболее высокие показатели, как воспаления (хелперной активации), так и супрессии, держащиеся на одном уровне в течение всего периода наблюдения с тенденцией относительного преобладания супрессорной активности к 25 суткам (рис.15).

Рис.15. Динамика основных популяций лимфоцитов у стабильно-тяжелых пациентов с ИФ ? 90

Сравнительно с ними, у выживших тяжелообожженных при поступлении и в дальнейшем отмечалось ослабление воспаления, особенно выраженное к 15 суткам (p0.05) (рис.16).

При этом в течение исследуемого периода наблюдалась тенденция к превалированию супрессорной активности. Отмечался волнообразный характер показателей с критическим падением количества клеток всех популяций к 15 суткам. В- клеточный дефицит, исходно более выраженный, чем у стабильно - тяжелых, также к 15 суткам имел тенденцию к усилению.

Напряженность про- и антивоспалительных потенциалов проявлялась первую неделю после травмы и по коэффициенту корреляции Т-активных с Т-хелперами (r= 0.97) и Т-супрессорами (r= 0.81). К 25 суткам корреляция активных лимфоцитов с супрессорной популяцией снижается (r= 0.52), а с хелперной - остается высокой (r= 0.89).

Рис. 16. Динамика основных популяций лимфоцитов у выживших тяжелообожженных с ИФ ? 135±15

У пациентов с фатальным исходом обнаружено еще большее ослабление воспаления, имевшее, однако, тенденцию к росту, но не достигшего уровня, отмеченного у больных предыдущих групп (рис.17).

Рис. 17. Динамика основных популяций лимфоцитов у пациентов с ИФ ? 130±10 при неблагоприятном прогнозе

Парадоксально, но при этом супрессорная активность была максимальна и также имела тенденцию к значительному ослаблению к 21-25 суткам сравнительно с пострадавшими первой (p0.005) и второй групп в эти же сроки.

Кроме того, при поступлении у пострадавших с неблагоприятным прогнозом отмечен сравнимый с пациентами стабильно тяжелой группы дефицит B_ клеток. Однако к 25 сут наблюдалось критическое падение представителей всех популяций, в том числе и B- клеток, обуславливая состояние иммунного паралича.

Реализацией цитокиновой регуляции является тип формируемого адаптивного иммунного ответа: доминирование макрофагальной активации (хелперный первого типа- Th1) или антителообразования (хелперный второго типа -Th2), - имеющий колоссальное значение для положительного исхода болезни. Th1 и Th2 типы имеют различные механизмы утилизации чужеродных антигенов. В первом случае происходит преимущественная стимуляция макрофагов к внутриклеточному киллингу микробов, во втором - экстраклеточному, с помощью антител-зависимого цитолиза, сопровождаемого секрецией эозинофилами и базофилами локальных медиаторов.

При этом, если Th2 развивается преждевременно, до завершения процесса фагоцитоза, АТ не смогут уничтожить микробы, находящиеся внутри фагосомы, и они будут продолжать размножаться. К тому же, АТ- зависимый цитолитический медиаторный эффект обернется против собственных клеток. В этом случае организм будет подвергаться двойной агрессии: экзо- и эндо-.

В дополнение к данным по угнетению фагоцитоза и наличию противовоспалительного цитокинового статуса у пострадавших с неблагоприятным прогнозом результаты анализа основных популяций лимфоцитов по иммуносупрессии и ослаблению хелперной активации в этой группе свидетельствовали о преждевременном формировании у них гуморальной фазы воспалительного ответа уже на 7-10 сутки.

У выживших тяжелообожженных пострадавших с относительной выраженностью указанных процессов имелась тенденция к формированию Th2 ответа в эти же сроки.

Умеренная активность фагоцитоза, провоспалительный цитокиновый статус и Т- хелперная активация, лежащие в основе воспаления, подтвердили формирование Th1 ответа у стабильно тяжелых пациентов. Постепенное нарастание супрессорной активности к 25 суткам на фоне относительной пролиферации B-клеток свидетельствовали о своевременной подготовке к формированию Th2 ответа.

Результаты дополнительного исследования иммунного ответа на тяжелую ожоговую травму у 42 пострадавших с применением проточной цитофлуориметрии подтвердили правомочность нашей гипотезы о превалировании гуморальной фазы воспаления у пациентов с ИФ>100 (табл.7).

По мере истощения основных эффекторных популяций (CD3+, CD4+, CD8+ T - клеток) наблюдалось дополнительное включение воспалительных резервов, обладающих цитолитической активностью (эозинофилы и перфорин содержащие клетки, система комплемента) и превалировали иммуноглобулины аутоиммунной направленности (Е, М).

Таким образом, по мере утяжеления степени ожоговой травмы происходит усиление процессов цитолиза, являющихся, по-видимому, основным механизмом клеточной гибели. Несостоятельность адаптивной реакции воспаления по уничтожению чужеродных микробных и измененных собственных антигенов приводит к другой адаптивной реакции - гуморальному ответу. АТ - зависимый цитолиз, наслаиваясь на состоявшуюся в процессе системного воспалительного ответа гибель клеток, приводит к еще большему ее усилению, оказывая негативное воздействие и на здоровые ткани.

В таком случае возникает необходимость пересмотра этиотанатогенеза с позиций интоксикации на позиции клеточной гибели, которая и обуславливает развитие жизнеопасных осложнений и высокую летальность пострадавших с прогностически неблагоприятной ожоговой травмой.

Таким образом, на основании комплексного сравнительного исследования пациентов, различающихся по степени тяжести и исходу, и, используя принципы адаптивности в оценке ответной реакции организма на тяжелую термическую травму, мы пришли к выводу о стадийности этого ответа при неблагоприятном прогнозе (рис. 18, табл. 8).

Адаптивная ответная реакция, заключающаяся в умеренно выраженном системном воспалительном ответе, приводит в условиях традиционного комплексного интенсивного лечения к достижению срочной адаптации и дальнейшему выздоровлению.

В случае дезадаптивности ответа, наблюдаемого, в основном, при прогностически неблагоприятной ожоговой травме, и заключающегося в ослаблении системного воспаления, происходит хронизация процесса, для которого характерны адреналовая недостаточность, гипометаболизм, угнетение фагоцитоза, противовоспалительный цитокиновый профиль, иммуносупрессия и АТ-зависимый цитолиз. Данные признаки выявляют противоположную системному воспалению стадию - анти-СВО.

Таблица 7

Основные проявления иммунной активности у пациентов с ИФ ? 135±10