Микробиологические аспекты и факторы противомикробной защиты в генезе невынашивания беременности в I триместре

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.00.01 - Акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Микробиологические аспекты и факторы противомикробной защиты в генезе невынашивания беременности в I триместре

Савченко Татьяна Николаевна

Москва 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор О.В. Макаров

доктор биологических наук профессор В.А. Алёшкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Г.Н. Минкина

(ГОУ ВПО «Московский медико-стоматологический университет Росздрава»)

доктор медицинских наук профессор А.П. Кирющенков

(ГОУ ВПО «Московская медицинская

акдемия им. И. М. Сеченова Росздрава»)

доктор медицинских наук А.А. Агаджанова

(ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии

им. академика В. И. Кулакова»Росмедтехнологии)

Ведущая организация:

ГУ Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии Министерства здравоохранения Московской области.

Защита состоится «____» _________________-2008 г.в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.12 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва,

ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор А.З. Хашукоева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы обусловлена высокой частотой невынашивания беременности, составляющей, по данным ВОЗ, 15-20% всех желанных беременностей, причем на эмбриональный период приходится до 75% всех репродуктивных потерь, связанных с невынашиванием (Серов В.Н. и соавт., 2002; Сидельникова В.М., 2005).

В последние годы в физиологическом течении беременности большое внимание стали уделять нормальному микробиоценозу различных биотопов организма, обеспечивающему формирование колонизационной резистентности слизистых (Кира Е. Ф., 2001; Радзинский В.Е. и соавт., 2007; Тютюнник В.А., 2006). Однако нарушения микробиоценоза биотопов могут происходить под влиянием различных экзогенных и эндогенных факторов (стресс, применение лекарственных препаратов, гормональные нарушения, хронические экстрагенитальные заболевания, иммуносупрессия и др.), что обусловливает развитие дисбиозов, характеризующихся нарушением соотношения микроорганизмов, с повышением содержания условно-патогенной микрофлоры в определенном биотопе и с изменением микроэкологического гомеостаза в целом. Тем не менее в литературе нет единого мнения о частоте и характере различных форм дисбиотических изменений влагалища при невынашивании беременности (Воронова С.И., 2000; Краснопольская К.В., 2005; Стрижаков А.Н. и соавт., 2003), что, возможно, обусловлено отсутствием патогенетического подхода к изучению микрофлоры. До настоящего времени микробиоценоз влагалища оценивают только по характеру микрофлоры просветной области и без учета влияния на нее локальных факторов противоинфекционной защиты. Принципиально новым в изучении микробиоценоза является оценка микроэкологии как просветной, так и пристеночной области влагалища с учетом секреторных иммуноглобулинов (Воропаева Е.А. и соавт., 2005). Нарушения микробиоценоза, приводящие к увеличению уровня условно-патогенных микроорганизмов, запускают каскад иммунологических реакций на локальном и системном уровнях. Установленными факторами, стимулирующими синтез цитокинов в моноцитах, макрофагах, являются микроорганизмы и их продукты. В свою очередь, увеличение провоспалительных цитокинов может приводить к нарушению формирования гестационной иммуносупрессии, обусловленной усилением продукции T-хелперов 1 типа и сопровождающейся патологией процессов имплантации, роста и развития эмбриона (Ковальчук Л.В. и соавт., 2006; Хонина Н.А., 2006). Однако практически нет работ, посвященных параллельному анализу спектра цитокинов в сыворотке крови и слизи цервикального канала, взаимосвязи их с дисбиотическими нарушениями влагалища и использованию полученных результатов как критериев риска невынашивания беременности.

Микробиоценоз влагалища нельзя рассматривать как изолированный биотоп. Гормоны гестации влияют на кислотность среды и тем самым нарушают микробное равновесие биоценозов всех слизистых оболочек беременной. Выраженный дисбиоз кишечника и полости рта, как правило, не учитываемый акушерами-гинекологами, может быть причиной не только патологического течения беременности и родов, но и определять формирование кишечного биоценоза новорожденных (Гвасалия А.Г. и соавт., 2003; Гатауллина Р.Х., 2003).

Нормальный микробиоценоз и факторы локального иммунитета на уровне влагалища и шейки матки являются первой линией противоинфекционной защиты, которые или предупреждают, или ограничивают размножение микроорганизмов и препятствуют их проникновению в верхние отделы половых путей. С этой точки зрения большое значение имеет изучение маркеров воспаления на системном уровне, повышение показателей которых свидетельствует о прорыве первой линии противоинфекционной защиты и генерализации воспалительного процесса, что может иметь значение в изучении патогенеза невынашивания беременности. Особый интерес представляет группа белков крови, называемых реактантами острой фазы (С-реактивный белок, 1-ингибитор протеиназ, орозомукоид, гаптоглобин и др.), основными активаторами которых являются провоспалительные цитокины. В настоящее время повысился интерес к изучению системы комплемента, в частности, C4 компонента, относящегося к белкам острой фазы и активно участвующего в противоинфекционной защите. Однако в зарубежной литературе имеются лишь единичные сведения по изучению различных белков острой фазы и системы комплемента как при нормально протекающей беременности, так и при беременности, осложненной невынашиванием (Azizia M.M. et al., 2006; Lokki M.L. et al., 2001; Paternoster D.M., 2006).

Недостаточное понимание взаимосвязи механизмов и факторов противоинфекционной защиты при физиологической и осложненной беременности, в свою очередь, обусловливает отсутствие патогенетических подходов к профилактике и лечению нарушений репродукции. Изучение генеза невынашивания с позиции комплексного исследования микробиоценоза слизистых генитального и пищеварительного трактов, как единой экосистемы, с оценкой секреторных иммуноглобулинов, цитокинов и белков острой фазы воспаления как факторов, обеспечивающих физиологическую роль микрофлоры в местной и общей реактивности организма, откроет новые пути к профилактике и патогенетическому лечению данной патологии.

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования явилось комплексное изучение состояния и взаимосвязи микробиоценоза слизистых генитального и пищеварительного трактов и факторов противоинфекционной защиты на локальном и системном уровнях при нормально протекающей и осложненной невынашиванием беременности в I триместре гестации для прогнозирования, профилактики и улучшения качества лечения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

изучить состояние микробиоценоза с определением пристеночной и просветной микрофлоры и показателей локального гуморального иммунитета слизистых влагалища, полости рта и кишечника у здоровых беременных и женщин с невынашиванием беременности;

выявить наличие взаимосвязи частоты встречаемости со степенью нарушений микробиоценоза слизистых генитальной и пищеварительной систем;

определить уровни цитокинов как основных иммунных факторов регуляции противоинфекционной защиты и выявить зависимость исхода беременности от их концентрации в сыворотке крови и слизи цервикального канала;

определить уровни белков острой фазы как системных маркеров воспаления у женщин с физиологически протекающей и осложненной невынашиванием беременностью;

проанализировать взаимосвязь уровней цитокинов как основных индукторов синтеза белков острой фазы в слизи цервикального канала с уровнями белков острой фазы в сыворотке крови у беременных с невынашиванием;

выявить частоту встречаемости врожденных дефицитов изотипов С4 компонента комплемента у беременных с невынашиванием;

на основании комплексного изучения клинико-иммуномикробиологических маркеров создать алгоритм обследования для выделения групп риска и обоснования тактики ведения беременных с невынашиванием в I триместре гестации.

Научная новизна. Проведенное нами комплексное исследование с определением просветной и пристеночной микрофлоры слизистых влагалища, полости рта и кишечника выявило наличие более выраженных изменений микробиоценоза во всех биотопах у пациенток с невынашиванием по сравнению со здоровыми беременными, проявляющихся в увеличении ассоциаций и интенсивности колонизации условно-патогенных микроорганизмов.

Получены новые данные по изучению состояния локального гуморального иммунитета, которые свидетельствуют о наличии гестационной иммуносупрессии, проявляющейся в снижении основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM), секреторного IgA (sIgA) и его свободного компонента (sc) в слизистой влагалища, слюне и копрофильтратах у здоровых беременных по сравнению с небеременными женщинам. Однако динамика изменений иммуноглобулинов в различных биотопах была неоднозначной и зависела от клинического течения гестации. Показано, что у беременных с невынашиванием во влагалищном секрете имело место достоверное увеличение IgA, sIgA, sc и достоверное снижение sIgA, sc в слюне и sc в копрофильтратах по сравнению со здоровыми беременными.

Инновационным методом оценки микробиоценоза слизистых является комплексное исследование микрофлоры влагалища, полости рта и кишечника по данным бактериоскопического, бактериологического исследований, включающих количественные и качественные показатели как индигенной, так и условно-патогенной микрофлоры с учетом состояния локальных иммуноглобулинов, являющихся одним из основных факторов противоинфекционной защиты слизистых. Проведенное исследование показало высокую частоту и степень выраженности дисбиотических нарушений в группе беременных с невынашиванием во всех биотопах и наличие тесной связи между ними. У каждой третьей беременной были выявлены равнозначные микроэкологические изменения биотопов влагалища, полости рта и кишечника, свидетельствующие о системных микроэкологических изменениях в организме беременной.

Установлено, что дисбиотические нарушения влагалища и активация условно-патогенной микрофлоры на фоне дисбаланса иммуноглобулинов включают механизмы врожденного иммунитета на уровне цервикального канала. У женщин с прервавшейся беременностью отмечено достоверное увеличение провоспалительных цитокинов ИФг, ИЛ-8 и увеличение индекса ИФг/ИЛ-4 в слизи цервикального канала, свидетельствующие о нарушении формирования гестационной иммуносупрессии, что может быть причиной прерывания беременности. Проведенный нами корреляционный анализ продемонстрировал прямую корреляционную зависимость между ИФг, ИЛ-8 и воспалительным процессом влагалища.

Подтверждена взаимосвязь локальных и системных факторов противоинфекционной защиты в организме беременной. Впервые проведенное исследование белков острой фазы воспаления позволило выявить достоверное увеличение С-реактивного белка, б1-ингибитора протеиназ, орозомукоида у женщин с невынашиванием беременности. Отмечено наличие выраженной корреляционной зависимости между С-реактивным белком и провоспалительным цитокином ИЛ-8 и обратной - между С-реактивным белком и противовоспалительным цитокином ИЛ-4.

Впервые проведенное исследование частоты встречаемости дефицитов изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента показало высокую частоту встречаемости дефицита С4В как одного из факторов противоинфекционной защиты у женщин с прервавшейся беременностью, возможно, свидетельствующее о врожденной предрасположенности их к данной патологии при наличии дисбиотических нарушений слизистых.

Практическая значимость работы. Комплексное исследование микробиоценоза различных биотопов с определением количественных и качественных показателей просветной и пристеночной микрофлоры и изучение локальных гуморальных факторов противоинфекционной защиты позволяет дать более объективную оценку микробиоценоза слизистых. Выраженность дисбиоза в различных биотопах организма свидетельствует о риске невынашивания беременности. Наличие тесной связи между микробиоценозом влагалища, полости рта и кишечника служит обоснованием необходимости проведения комплексного исследования и своевременной коррекции выявленных нарушений не только влагалища, но и полости рта и кишечника, что может свести к минимуму вероятность подобных осложнений.

На основании комплексного изучения маркеров противомикробной защиты разработан алгоритм обследования для выделения групп риска и обоснования тактики ведения беременных с невынашиванием в I триместре.

Основные положения, выносимые на защиту

Микробиоценоз просветной и пристеночной областей влагалища, полости рта и кишечника у пациенток с невынашиванием беременности, по сравнению со здоровыми беременными, характеризуется увеличением степени обсемененности факультативными микроорганизмами с формированием их ассоциаций.

Снижение локального IgG во влагалищном секрете, IgА, sIgА, sc в слюне и копрофильтратах коррелирует с повышением степени обсеменённости слизистых различных биотопов организма, что доказывает значение иммунных факторов в местной противоинфекционной защите.

Комплексное микроскопическое, бактериологическое и иммунологическое исследование выявило достоверно более выраженные дисбиотические нарушения во влагалище, полости рта и кишечнике у пациенток с прервавшейся беременностью по сравнению со здоровыми беременными. Выявленная микробиологическая связь между генитальным и пищеварительным трактами свидетельствует о системном характере дисбиотических нарушений в организме беременной.

У женщин с прервавшейся беременностью, по сравнению со здоровыми беременными, отмечены достоверное увеличение провоспалительного цитокина ИЛ-8, ИФг и преобладание ИФг над противовоспалительным цитокином ИЛ-4 в слизи цервикального канала, свидетельствующие об активации иммунорегуляторных факторов воспаления на локальном уровне.

Невынашивание беременности характеризуется усилением системной воспалительной реакции, проявляющейся в достоверном увеличении концентрации С-реактивного белка, орозомукоида и 1-ингибитора протеиназ по сравнению со здоровыми беременными. Наличие положительной корреляционной связи между белками острой фазы воспаления и провоспалительными цитокинами является подтверждением взаимосвязи локальных и системных факторов противомикробной защиты организма.

У женщин с прервавшейся беременностью отмечено нарушение врождённых факторов противомикробной защиты, проявляющееся в высокой частоте встречаемости дефицита С4В компонента комплемента, что позволяет прогнозировать развитие инфекционного процесса у пациенток группы риска.

На основании изучения микробиоценоза слизистых и факторов противоинфекционной защиты в сочетании с клиническим течением гестационного процесса создан алгоритм обследования беременных, дающий возможность проследить патогенез невынашивания, определить маркеры прерывания беременности и выделить группы риска по невынашиванию беременности.

Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании сотрудников кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета, врачей ГКБ №55, МСЧ №33, родильного дома №10, ГБ №8 гор. Москвы и сотрудников ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского 20 мая 2008 года.

Материалы и основные положения диссертации представлены и доложены на междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной к интегральной медицине» (Судак, Крым, Украина, 2006), на 1-м Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2006), на 14-м Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), на 2-м Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2008), на научно-практической конференции «Новые технологии лечения и профилактики в педиатрии и акушерско-гинекологической практике» (Тольятти, 2008), на 15-м Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты внедрены в практику работы женской консультации и отделений роддома №10, ГБ №8, гинекологического объединения ГКБ №55, МСЧ №33 гор. Москвы, консультативно-диагностического центра ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета.

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 43 научные работы; монография «Инфекции в акушерстве и гинекологии»; методические рекомендации для врачей «Современные подходы к диагностике различных форм урогенитального хламидиоза», утвержденные МЗ РФ 02.02.2004; получены приоритетные справки на два изобретения: «Способ диагностики воспалительных заболеваний» (регистрационный №2007104991 от 09.02.2007) и «Способ диагностики угрозы прерывания беременности» (регистрационный №2007146816 от 19.12.2007).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 339 источников, из них 201 отечественных и 138 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 29 рисунками.

Содержание работы

Данное исследование проведено на базах кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (зав. кафедрой - д.м.н. проф. Макаров О.В.): в гинекологических отделениях ГКБ №55 (главный врач - д.м.н. проф. Румянцев О.Н.), в женской консультации и отделениях родильного дома №10 (главный врач - Озимковская Е.П.) совместно с ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (директор - д.б.н. проф. Алешкин В.А.), кафедрой клинической иммунологии РГМУ (зав.кафедрой - д.м.н. проф. Ковальчук Л.В.) и лабораторией иммуногенетики МГНЦ РАМН (руководитель - д.б.н. Пухальский А.Л.).

Материалы и методы исследования

Диссертационная работа основана на результатах клинико-лабораторного обследования 448 беременных, из них 373 пациентки с невынашиванием беременности включены в основную группу и 75 беременных с физиологическим течением гестационного процесса - в контрольную группу.

Для выяснения этиологии невынашивания беременности всем пациенткам основной группы, помимо общеклинических методов исследования, проводили исследование гормонального статуса и диагностику урогенитальной бактериальной и вирусной инфекции.

Для выяснения особенности и взаимосвязи микробиоценоза генитального и пищеварительного трактов проводили одновременное бактериологическое исследование просветного и пристеночного микроценоза и изучение показателей локального гуморального иммунитета влагалища, полости рта и кишечника с определением концентрации иммуноглобулинов классов М, А, G, секреторного IgА (далее sIgА) и свободного секреторного компонента (sc). Родовую и видовую идентификацию осуществляли на основании изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов согласно руководству «Медицинская микробиология» (1998). Определение содержания иммуноглобулинов в слюне, вагинальном отделяемом и копрофильтратах проводили методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле по Манчини. Исследования концентрации цитокинов ИФ-г, ФНО- б, ИЛ-8, ИЛ-4 в сыворотке крови и слизи цервикального канала проводили методом иммуноферментного анализа наборами фирм «Цитокин» и «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Определение уровней белков острой фазы: С-реактивного белка (СРБ), орозомукоида (ОР), гаптоглобина (ГГ), б1-ингибитора протеиназ (б1-ИП) проводили методом РИД по Манчини. Определение функциональной активности С4А и С4В компонента С4 комплемента осуществляли методом иммуноферментного анализа.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью стандартного пакета программ SPSS версии 11.0. Для непрерывных переменных представлена описательная статистика с расчетом средних значений, медианы и стандартной ошибки среднего. Для определения достоверности различий между показателями в изучаемых выборках использовали непараметрические критерии Манна - Уитни и Вилкоксона. Непараметрическими корреляционными методами изучена связь между иммунологическими показателями. Анализ категориальных данных проводили с использованием критерия ч2 и точного критерия Фишера. При р<0,05 различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными. Взаимосвязь показателей считалась значимой при коэффициенте корреляции r?0,2.

Результаты исследования и их обсуждение

Данные анамнеза свидетельствуют, что характерными для пациенток с невынашиванием беременности являлись следующие особенности: высокая частота инфекционных заболеваний, наличие сопутствующей экстрагенитальной патологии, особенно со стороны желудочно-кишечного тракта, хронические экстрагенитальные очаги инфекции (хронический тонзиллит, бронхит и др.), хронические воспалительные заболевания гениталий, нарушения менструальной и репродуктивной функций, осложненное течение предыдущих беременностей. Все перечисленное является подтверждением роли преморбидного фона, на котором наступает беременность, и свидетельствует о необходимости проведения предгравидарной подготовки с санацией возможных очагов инфекции.

Средние сроки беременности при поступлении в стационар составляли 9,4±0,8 недели у пациенток основной группы и не отличались от сроков беременности в контрольной группе (9,4±0,6 недели). Беременные обеих групп были сопоставимы по возрастному составу, возраст которых варьировал от 16 до 39 лет (средний возраст 27,5±5,6 года).

В зависимости от течения беременности пациентки основной группы были разделены на 2 группы: I-ю группу составляли 263 женщины, поступившие в стационар с клинической картиной начавшегося выкидыша, которые после проведенной терапии выписаны с сохраненной беременностью. II-ю группу составили 110 беременных, поступивших в стационар с прервавшейся беременностью, которым было произведено инструментальное удаление элементов измененного плодного яйца.

Анализ проведенного исследования показал, что в 22,0% случаев у беременных основной группы имела место гиперандрогения яичникового или смешанного генеза (в 21,7% случаев в I-й группе и в 22,7% случаев во II-й группе), для коррекции которой назначали терапию дексаметазоном в количестве не более 0,5 мг в сутки. Согласно нашим данным, среди представителей урогенитальной инфекции у беременных с невынашиванием наиболее часто выявляли гарднереллы (в 40% случаев - в I-й группе и в 50% случаев - во II-й группе), уреаплазмы и грибы рода Candida в клинически значимых титрах - ?104 (в 62,4% случаев и в 78,9% случаев - в I-й группе и 82,1% случаев и 89,3% случаев - во II-й группе, соответственно), что свидетельствует о высокой частоте дисбактериоза в группе беременных с невынашиванием, причем частота встречаемости данных возбудителей была достоверно выше в группе беременных с прервавшейся беременностью, что подтверждает их роль в генезе невынашивания. У беременных с физиологическим течением беременности были выявлены в небольшом количестве гарднереллы и грибы рода Candida (в 13,4% случаев и 10,% случаев, соответственно). Необходимо подчеркнуть, что у пациенток с невынашиванием беременности отмечена высокая частота ассоциаций различных микроорганизмов (бактериально-вирусной, вирусно-вирусной и бактериально-бактериальной), которые выявлялись в 63,8% случаев у беременных с начавшимся выкидышем и в 89,9% случаев у беременных с прервавшейся беременностью.

Однако не у всех беременных с наличием возбудителей урогенитальной инфекции происходит самопроизвольное прерывание беременности. Это подтверждает роль и других механизмов, изменение которых запускает последовательную цепочку реакций, приводящих к прерыванию беременности. В связи с этим особое значение имеет интегральная оценка состояния микробиоценоза слизистых в совокупности с иммунными механизмами, обеспечивающими противоинфекционную защиту организма.

С целью выявления состояния микробиоценоза и наличия связи между различными биотопами в организме женщины с невынашиванием беременности нами впервые проведено одновременное бактериологическое исследование просветного и пристеночного микроценоза и изучение показателей локального гуморального иммунитета влагалища, полости рта и кишечника у 121 беременной, из них у 101 беременной с невынашиванием (I-я группа - 75 беременных с начавшимся выкидышем, но пролонгированной беременностью и II-я группа - 26 пациенток с прервавшейся беременностью) и у 20 здоровых беременных.

Согласно нашим исследованиям, микрофлора влагалища просветной и пристеночной областей не была идентична по своему составу. Так, например, золотистый стафилококк в просветной области высевался достоверно чаще, но в более низкой концентрации (р<0,05), чем в пристеночной области, и составлял 12,0% и 4,0% случаев при интенсивности колонизации 5,2±0,4 lg КОЕ/г и 6,4±0,6 lg КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что для характеристики микрофлоры влагалища необходимо проведение исследования как просветной, так и пристеночной области. Причём необходимо заметить, что в развитии воспалительных заболеваний более важное значение имеют пристеночные микроорганизмы, которые адгезированы к стенке слизистой и определяют инициацию инфекционного процесса.

Проведенный сравнительный анализ микробиоценоза влагалища, с учетом просветной и пристеночной микрофлоры у беременных с различным клиническим течением гестации установил более выраженные дисбиотические нарушения у пациенток с невынашиванием по сравнению со здоровыми беременными (рис. 1).

Дисбаланс микрофлоры у беременных основной группы проявлялся в снижении представителей индигенной микрофлоры и увеличении степени обсемененности факультативными микроорганизмами. Так, у пациенток

Рис. 1. Микрофлора пристеночной области влагалища у женщин обследованных групп.

Примечание: достоверность различий показателей (p<0,05) : * - между -й и I-й группами, ** - между -й группой и группой контроля, *** - между I-й группой и контрольной группой.

основной группы в 55,4% случаев отмечено снижение частоты колонизации лактобацилл в пристеночной области (менее 6 lg КОЕ/г). Кроме того, у беременных с начавшимся выкидышем (I-я группа) в просветной и пристеночной областях установлено достоверное (р<0,05) снижение частоты встречаемости и степени колонизации бифидобактерий по сравнению с беременными контрольной группы, частота встречаемости бифидобактерий у пациенток I-й группы была в 2 раза ниже, чем в группе контроля, и отсутствовала у беременных с прервавшейся беременностью. Интенсивность колонизации в просветной и пристеночной областях достигала в контрольной группе 5,0±0,5 lg КОЕ/г и 4,6±0,5 lg КОЕ/г, соответственно, а у беременных с начавшимся выкидышем - только 3,7±1,1 lg КОЕ/г и 3,5±1,1 lg КОЕ/г, соответственно (р<0,05). Микробиоценоз влагалища у беременных I-й группы характеризовался значительным многообразием различных факультативных микроорганизмов, причем в 72% случаев отмечено формирование 3-5 компонентных ассоциаций, в то время как 3-компонентные ассоциации в группе контроля имели место только в 15% случаев. Среди представителей условно-патогенной микрофлоры (УПМ) у беременных с начавшимся выкидышем наиболее часто высевались грибы рода Candida, анаэробные стрептококки (пептострептококки) и энтерококки с частотой выявления 20,0-21,3% в просветной области и 20-24% в пристеночной области влагалища при интенсивности колонизации более 4,0 lg КОЕ/г, что превышает нормативные показатели для данных микроорганизмов. У пациенток с прервавшейся беременностью УПМ биотопа влагалища была представлена пептострептококками, коагулазонегативными стафилококками, золотистым стафилококком, кишечной палочкой и грибами рода Candida, частота обнаружения которых (за исключением грибов) была достоверно выше (р<0,05), чем у здоровых беременных или женщин с сохраненной беременностью. Все перечисленные микроорганизмы у пациенток с прервавшейся беременностью высевались в высоких титрах, с интенсивностью колонизации более 5,0 lg КОЕ/г. У беременных из группы контроля спектр условно-патогенных бактерий был значительно уже, однако следует отметить, что в этой группе частота выявления грибов рода Candida, пептострептококков и энтерококков также находилась на высоком уровне (от 15% до 20%) как в просветной, так и в пристеночной области влагалища при интенсивности колонизации 3,5±0,4 - 4,7±1,0 lg КОЕ/г в просветной области и 4,7±1,0 - 5,0±0,5 lg КОЕ/г в пристеночной области. Среди других микроорганизмов наиболее часто у них высевались кишечная палочка (10% случаев как в просветной, так и в пристеночной области) и эпидермальный стафилококк (15% - в просветной и 10% - в пристеночной области) в низкой концентрации 3,40,4 - 4,40,2 и по 2,0 1,0 lg КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, микробиоценоз влагалища характеризовался большой вариабельностью количественных и качественных показателей микроорганизмов во всех обследованных группах беременных. В результате наших исследований идентифицированы штаммы таких УПМ, как грибы рода Candida, кишечная палочка, стафилококки, пептострептококки, которые потенциально могут быть причиной развития воспалительных процессов беременных. Однако средний уровень колонизации УПМ в просветной и особенно в пристеночной областях был достоверно (р<0,05) выше у беременных с невынашиванием, чем у женщин с нормально протекающей беременностью, и составлял в просветной области 4,8±0,7 lg КОЕ/г и 3,3±0,5 lg КОЕ/г, а в пристеночной области - 5,3±0,5 lg КОЕ/г и 4,0±0,5 lg КОЕ/г, соответственно.

Нами впервые проведены исследования микробиоценоза полости рта у здоровых беременных и пациенток с невынашиванием беременности , согласно которым микрофлора пристеночной (ротоглотки) и просветной (слюны) областей так же, как и микрофлора влагалища, была неидентичной по своему составу. Изучение показателей микробиоценоза свидетельствует о том, что преобладающей микрофлорой ротоглотки и слюны у беременных различных групп являлись представители индигенной флоры: -гемолитические стрептококки, непатогенные нейссерии ( рис. 2). В то же время нами отмечены существенные отличия степени обсемененности полости рта у беременных с различным клиническим течением гестационного процесса.

У беременных с начавшимся выкидышем выявлен более широкий спектр УПМ в просветной и пристеночной областях по сравнению с группой контроля. Одновременно у 45,3% обследованных наблюдалось формирование 3-5 компонентных ассоциаций УПМ, среди которых наиболее часто высевались грибы рода Candida, пептострептококки и золотистый стафилококк.

Рис. 2. Микрофлора пристеночной области ротоглотки у женщин обследованных групп.

Примечание: достоверность различий показателей (p<0,05): * - между -й и -й группой,** - между -й и контрольной группами, *** - между II-й группой и группой контроля.

Частота их выделения выявлена в 8,0%; 13,3% и 30,7% случаев в количестве 4,7±0,9 lg КОЕ/г; 4,5±0,5 lg КОЕ/г и 4,8±0,4 lg КОЕ/г, соответственно, а в слюне - 12,0%; 21,3%; 16,0% случаев в количестве 4,7±0,3 lg КОЕ/г; 4,2±0,5 lg КОЕ/г; 4,3±0,3 lg КОЕ/г, соответственно. Кроме того, у пациенток с начавшимся выкидышем, в отличие от здоровых беременных, в пристеночной области выявляли такие микроорганизмы, как в-гемолитический стрептококк (1,3% случаев в количестве 4,0±0,4 lg КОЕ/г) и кишечную палочку с равной частотой выявления (1,3% случаев) и интенсивностью колонизации (4,7±0,2 lg КОЕ/г) в пристеночной области и слюне, которые не являются нормальными представителями микрофлоры полости рта, а также определяли повышенное содержание пептострептококков (р<0,05). Кроме того, у пациенток данной группы высевались и такие микроорганизмы, которые отсутствовали в группе контроля: эпидермальный стафилококк, пропионибактерии, актиномицеты и клебсиеллы. У пациенток с прервавшейся беременностью, в отличие от пациенток с начавшимся выкидышем, но сохраненной беременностью, отмечена достоверно (р<0,05) более высокая частота встречаемости в клинически значимой концентрации таких микроорганизмов, как золотистый стафилококк, в-гемолитический стрептококк, кишечная палочка и грибы рода Candida. В то же время анализ обсемененности полости рта показал, что общий популяционный уровень УПМ в пристеночной области у беременных с невынашиванием был достоверно (р<0,05) ниже, чем в вагинальном биотопе. Средняя интенсивность колонизации в ротоглотке у беременных I-й группы составляла 4,3±0,4 lg КОЕ/г, во II-й группе - 4,5±0,5 lg КОЕ/г, а средняя интенсивность колонизации в пристеночной области влагалища у беременных I-й и II-й групп составляла 6,7±0,9 lg КОЕ/г и 5,5±0,5 lg КОЕ/г, соответственно.

Для оценки состояния микробиоценоза кишечника проведено бактериологическое исследование фекалий в обследуемых группах беременных (рис. 3), в результате которого установлено, что микрофлора кишечника в группе пациенток с невынашиванием беременности характеризовалась снижением количества индигенной флоры: кишечной палочки с нормальными ферментативными свойствами, лактобацилл и бифидобактерий, обеспечивающих резистентную способность слизистой оболочки кишечника. Кишечная палочка с нормальными ферментативными свойствами выявлена только у 76% беременных с начавшимся выкидышем, что достоверно ниже (р<0,05), чем в группе контроля (90% беременных), кроме того, у каждой третьей пациентки с невынашиванием беременности содержание кишечной палочки с нормальными ферментативными свойствами было менее 6 lg КОЕ/г, в то время как в группе контроля у 85% женщин содержание ее было более 8 lg КОЕ/г. Отмечено также достоверное (р<0,05) снижение бифидобактерий и лактобацилл, частота обнаружения которых в I-й группе составляла 76,0% и 74,7%, во II-й группе - 73,1% и 69,2%, а в группе контроля - 90% и 90%, соответственно. На фоне снижения резидентной флоры кишечника в основной группе пациенток, по сравнению с контрольной группой, отмечалось увеличение УПМ. У 77,3% беременных с невынашиванием микробиоценоз кишечника был представлен 4-6- компонентными ассоциациями УПМ и только в 30% случаев - в группе контроля.

Рис. 3. Микрофлора кишечника у женщин обследованных групп.

Примечание: достоверность различий показателей (p<0,05): * - между I-й, II-й и группой контроля, ** между I-й и II-й группами.

Средняя частота встречаемости представителей УПМ в основной группе была достоверно выше (р<0,05), чем в контрольной группе, и составляла 13,7% случаев (в I-й группе 12,3% и во II-й группе 15,0%), а в контроле - 8,2% случаев при нормальной интенсивности колонизации, составляющей в среднем 4,3±0,3 lg КОЕ/г у здоровых беременных, и при повышенной концентрации, составляющей в среднем 5,7±0,5 lg КОЕ/г у беременных с невынашиванием. Выявлено также и расширение спектра микрофлоры у беременных с невынашиванием, проявляющееся в увеличении частоты встречаемости и степени колонизации таких микроорганизмов, как гемолизирующая кишечная палочка, энтерококки, клостридии (р<0,05). Кроме того, у беременных с осложненным течением гестации выявляли и такие редкие микроорганизмы, как актиномицеты и клебсиеллы, которые отсутствовали в кишечнике здоровых беременных.

Нами проведено изучение состояния локального гуморального иммунитета (IgG, IgM, IgA, sIgA, sc) во влагалищном секрете, слюне и копрофильтратах у здоровых беременных (контрольная группа) и женщин с невынашиванием беременности (I-я и II-я группы). Проведенный анализ показал, что у здоровых беременных отмечалось достоверное (р<0,05) снижение всех классов иммуноглобулинов в изученных биотопах по сравнению со здоровыми небеременными женщинами, что свидетельствует о наличии иммуносупрессии при беременности. При сравнении различных классов иммуноглобулинов у здоровых беременных во влагалищном секрете были выявлены более высокие уровни IgG, чем IgА, показатели которых составляли 1,75±0,36 мкг/мл и 0,11±0,07мкг/мл, соответственно, уровни sIgA и sc не определяли, в то время как доминирующими иммуноглобулинами в слюне и копрофильтратах были sIgA и sc (в слюне - IgG - 2,49±0,38 мкг/мл, sIgA - 8,95±1,59 мкг/мл, sc - 16,04±2,37 мкг/мл; в копрофильтратах имел место только sIgA в количестве 1,78 ±0,42 мкг/мл и sc - 4,2±0,94 мкг/мл). Наши данные согласуются с данными Э.М. Гильмиярова и соавт. (2002), которые в секретах генитального тракта обнаружили более высокие уровни IgG, чем IgA, в отличие от других секретов, таких как слюна, молоко, кишечный сок, в которых sIgA являлся доминирующем компонентом. Анализ иммунного статуса у беременных с невынашиванием выявил выраженное отличие в показателях гуморального иммунного ответа во влагалище, кишечнике и полости рта по сравнению со здоровыми беременными. Во влагалищном секрете у беременных с невынашиванием имело место достоверное (р<0,05) увеличение всех классов иммуноглобулинов, причем наиболее выраженные изменения касались IgA и его секреторных форм (sIgA, sc). Учитывая, что основная роль в противоинфекционной защите слизистых принадлежит секреторному иммуноглобулину, достоверное увеличение его содержания у беременных с невынашиванием, по сравнению со здоровыми беременными, свидетельствует о напряжении локального иммунитета, что может быть объяснено активацией воспалительного процесса влагалища. В то же время достоверное снижение sIgA и его свободного компонента (sc) в слюне и копрофильтратах у беременных с невынашиванием, по сравнению со здоровыми беременными, позволяет предположить истощение локального иммунитета, что, возможно, связано с наличием длительно текущего хронического воспалительного процесса в полости рта и кишечнике. Подтверждением этого может являться наличие у каждой четвертой женщины с невынашиванием заболеваний желудочно-кишечного тракта и хронического тонзиллита.

В связи с наличием различных изменений микробиоценоза слизистых в обследованных группах проведена оценка степени микробиологических нарушений биотопов влагалища, полости рта и кишечника по данным микроскопического, бактериологического и иммунологического исследований у беременных согласно классификациям, разработанным сотрудниками МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Алешкин В.А и соавт., 2005).

Анализ полученных результатов показал наличие взаимосвязи состояния микробиоценоза различных биотопов и особенностей клинического течения I триместра беременности. В группе беременных с начавшимся самопроизвольным выкидышем (I-я группа) нормальный биоценоз влагалища наблюдался лишь в 18,7% случаев. У остальных беременных этой группы имели место дисбиотические нарушения различной степени выраженности, причем у 1/3 беременных наблюдали дисбиоз III степени. Во II-й группе (пациентки с прервавшейся беременностью) в 100% случаев выявлялись дисбиотические нарушения во влагалище, причем у 1/2 беременных - дисбиоз III степени. Наши результаты свидетельствуют о наличии связи между наличием дисбиозом влагалища и осложненным течением гестационного процесса, что может служить прогностическим критерием риска невынашивания беременности.

Изучение состояния микроценоза в полости рта у обследованных беременных показало, что нормоценоз в группе беременных с начавшимся выкидышем встречался лишь в 12,0% случаев, у 40,0% - в контрольной группе, а в группе беременных с прервавшейся беременностью нормоценоз не встречался вообще. В остальных случаях имели место дисбиотические нарушения различной степени выраженности. Аналогичные изменения выявлены и при изучении состояния кишечника, которые коррелировали с показателями микробиоценоза влагалища всех обследованных групп. Так, у беременных I-й группы нормоценоз выявлен лишь в 16,0% случаев, II-й группы - у 4,3% и 45% у беременных группы контроля. Причем дисбактериоз кишечника III степени в I-й и II-й группах выявлялся достоверно чаще (р<0,05), чем в группе контроля, и составлял 25,3%, 34,1% и 5,0%, соответственно. Клинические проявления дисбактериоза кишечника у обследованных женщин были выражены умеренно. Дисбактериоз I степени клинически себя не проявлял. У женщин с дисбактериозом II и III степени преобладающими симптомами были метеоризм, запоры и снижение аппетита.

Для выявления наличия микробиологической взаимосвязи биотопов проведен индивидуальный анализ состояния микробиоценоза влагалища, полости рта и кишечника у каждой беременной, который показал, что у каждой третьей пациентки имели место равноценные микробиологические изменения данных биотопов, свидетельствующие о системном характере дисбиотических нарушений.

Для выявления роли локальных факторов противоинфекционной защиты в развитии дисбиотических нарушений проведен корреляционный анализ микробиологических и иммунологических показателей биотопа влагалища, который выявил наличие обратной корреляции уровней IgG и содержания УПМ в секрете влагалища при дисбиотических нарушениях I-III степени (г=-0,37; г=-0,31; г=-0,29, соответственно; р<0,05). Для биотопа полости рта выявлена обратная корреляционная связь уровня IgA и содержания УПМ в этой области при дисбиотических нарушениях I-III степени (г=-0,27; г=-0,24; г=-0,28, соответственно; р<0,05), аналогичная связь имела место и для sIgA при дисбиозе I степени (г=-0,21; р<0,05), а более выраженная обратная корреляция уровней sIgA и УПМ была при дисбиозах полости рта II-III степени (г=-0,34; г=-0,32, соответственно; р<0,05). В биотопе кишечника беременных отмечена незначительная, но достоверная обратная корреляция IgA и содержания УПМ при дисбиозе I степени (г=-0,24; р<0,05), sIgA - при дисбиозе I-II степени (г=-0,21; г=-0,24, соответственно; р<0,05). Более выраженная обратная корреляция концентраций IgA и уровней УПМ при дисбиозах II-III степени (г=-0,32; г=-0,38, соответственно; р<0,05), sIgA и sc - при дисбиозе III степени (г=-0,32; г=-0,36, соответственно; р<0,05).

Для определения роли цитокинов в генезе невынашивания беременности проведено исследование уровней провоспалительных (ИФг, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов в сыворотке крови и слизи цервикального канала у 225 беременных. Из них 185 пациенток составили основную группу (135 беременных с начавшимся выкидышем - I-я группа и 50 беременных с прервавшейся беременностью - II-я группа) и 40 женщин - контрольную группу (беременные с нормально протекающим гестационным процессом) (табл. 1). В результате проведенных исследований установлено, что средние значения ИФг в сыворотке крови были достоверно (р0,05) выше в группе женщин с прервавшейся беременностью (II-я группа), чем в контрольной группе, и составляли 156,0±46,5пг/мл и 18,8±7,9 пг/мл, соответственно. Анализ индивидуальных данных показал увеличение ИФг, превышающее 120 пг/мл у 60% беременных II-й группы, только у 13% - I-й группы и не показал увеличения у беременных контрольной группы.

Аналогичные результаты были получены и при измерении ИФг в слизи цервикального канала, которые показали, что средние значения данного показателя у женщин с прервавшейся беременностью были достоверно выше, чем у беременных с начавшимся выкидышем, и составляли 114,2+53,4 пг/мл

Таблица 1

Средние значения цитокинов в сыворотке крови и слизи цервикального канала

Примечание: достоверность различий показателей (p<0,05): * - по отношению к контрольной группе; ** - по отношению к I-й и контрольной группам

и 3,8+1,9 пг/мл, соответственно (р0,05), причем более чем у половины (55%) пациенток II группы концентрация его была выше 40 пг/мл, в то время как при нормальном течении гестационного процесса данный показатель в цервикальной слизи не определялся вообще. Необходимо отметить, что нарастание ИФ в сыворотке крови выше 120 пг/мл происходило у всех женщин II группы, чьи уровни изучаемого показателя в цервикальной слизи превышали 40 пг/мл. Установлена прямая корреляционная зависимость между ростом ИФ в слизи цервикального канала и показателями его в сыворотке крови (r=0,5; р<0,05). Согласно данным Л.В. Ковальчука и соавт. (2006), определение в сыворотке крови высоких уровней цитокинов всегда свидетельствует о нарушении функционирования цитокиновой сети, что наблюдается при выраженных патологических процессах.

При исследовании уровня ИЛ-8 не установлено повышение его в сыворотке крови у женщин с патологическим течением гестационного процесса, что согласуется с данными P.B.Kaplan (2003). В то же время в наших исследованиях ИЛ-8 в цервикальной слизи явился особенно чувствительным тестом и определялся у всех обследованных пациенток. Средние значения ИЛ-8 в слизи цервикального канала у пациенток I-й группы достоверно преобладали над средними значениями данного показателя у женщин контрольной группы и составляли 2497,0+77,0 пг/мл и 2106,0+170,0 пг/мл, соответственно (р0,05). В группе женщин с несохраненной беременностью отмечены наиболее высокие средние значения изучаемого показателя - 3127±103 пг/мл, достоверно превышающие таковые в I-й и контрольной группах (р0,001). У большинства пациенток с прервавшейся беременностью (70%) уровень ИЛ-8 в цервикальной слизи был выше 3000 пг/мл (р0,001). Полученное сочетание высоких уровней ИЛ-8 в слизи цервикального канала и практически его полное отсутствие в сыворотке крови у пациенток с невынашиванием беременности свидетельствует о локальности происходящих воспалительных процессов и важной роли местных факторов противоинфекционной защиты на уровне нижнего отдела генитального тракта.

По нашим данным, средние значения ИЛ-4 в сыворотке крови не имели статистически достоверных различий у пациенток различных групп. В то же время средние значения ИЛ-4 в цервикальной слизи у пациенток с прервавшейся беременностью (II-я группа) были достоверно выше, чем у беременных I-й (р<0,05) и контрольной групп (р<0,001), и составляли 261,7+51,6 пг/мл, 130,0±38,5 пг/мл и 50,5±20,6 пг/мл, соответственно. Возможно, увеличение ИЛ-4 в слизи цервикального канала следует рассматривать как компенсаторный механизм в ответ на увеличение ИФг у беременных с осложненным течением гестации, направленный на увеличение T-хелперов 2 типа, обеспечивающих пролонгирование беременности.

Необходимо заметить, что течение гестационного процесса зависит не столько от абсолютных показателей цитокинов, сколько от связи между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Проведенный анализ отношения ИФг к ИЛ-4 в сыворотке крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности и беременных с физиологическим течением гестационного процесса установил, что отношение ИФг/ИЛ-4 в сыворотке крови у женщин с несохраненной беременностью было достоверно (р<0,01) выше, чем у здоровых беременных или пациенток с пролонгированной беременностью. Преобладание продукции ИФг над ИЛ-4 у пациенток с прервавшейся беременностью отличалось от значений беременных контрольной группы в 13,1 раза и от значений у пациенток I-й группы в 7 раз (средние данные соотношения интерлейкинов во II-й группе составили 7,6+0,63, у женщин I группы - 1,08+0,32 и 0,58+0,13 - в контроле). Аналогичная тенденция прослежена нами и при исследовании соотношения ИФг/ИЛ-4 в слизи цервикального канала у пациенток обследованных групп. Средние данные, полученные у женщин II группы, составляли 0,44+0,09 и были в 14,7 раза выше, чем у пациенток I-й группы, чьи средние данные составляли 0,03+0,01 (р<0,05). У пациенток контрольной группы изучаемый показатель был равен нулю. Таким образом, у женщин с невынашиванием беременности установлено статистически значимое преобладание продукции ИФг над ИЛ-4. Показатель ИФг/ИЛ-4 является чувствительным тестом для определения нарушений процессов имплантации, так как свидетельствует о дисбалансе в продукции цитокинов и способности лимфоцитов к непропорционально высокому выбросу ИФг, формированию локальной иммуносупрессии.

Особого внимания заслуживают данные, полученные при проведении анализа связи между уровнями различных цитокинов в слизи цервикального канала и показателями микробиоценоза влагалища. Нами отмечена прямая корреляционная связь между уровнями провоспалительных цитокинов ИФг, ИЛ-8 и воспалительным процессом влагалища (r=0,98; р<0,01 и r=0,61; р<0,05, соответственно).

С учетом выявленной положительной корреляционной связи между наличием воспалительных изменений влагалища и концентрацией ИФ, а также в связи с достоверным увеличением ИФ в слизи цервикального канала и сыворотки крови у беременных с прервавшейся беременностью можно полагать, что диспропорция индукции ИФ, обладающего цитотоксическим действием, при наличии выраженных дисбиотических нарушений участвует в развитии патологии гестации.

Проведенный нами корреляционный анализ выявил участие микрофлоры влагалища в регуляции продукции цитокинов в цервикальном канале и свидетельствует о тесной взаимосвязи факторов противоинфекционной защиты на уровне нижнего отдела гениталий.

По данным D. Buxton et al. (2002), системными маркерами воспаления являются белки острой фазы (БОФ). Однако в большинстве исследований (Makhoul I.R. et al., 2007, Pitiphat W. et al., 2005) приводятся только данные о значимости CРБ в развитии патологических состояний и не уделяется должного внимания другим БОФ, обладающих различными биологическими свойствами, которые могут неоднозначно влиять на течение гестации. Нами впервые проведено исследование концентрации СРБ, ОР, ГГ, б1-ИП в сыворотке крови у 132 пациенток, из них 87 беременных составили основную группу: 53 - с начавшимся выкидышем, но сохраненной беременностью - I-я группа, 34 - с прервавшейся беременностью - II-я группа (IIа - прервавшаяся по типу самопроизвольного выкидыша, IIб - с неразвивающейся беременностью) и 15 здоровых беременных, которые включены в контрольную группу, а также 30 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста.