Механизмы развития миелотоксических эффектов в процессе противоопухолевой химиотерапии у больных злокачественными новообразованиями

Вероятно, в случае применения схемы CAF, разнообразные ДНК-повреждающие эффекты цитостатических препаратов выражены в большей степени и затрагивают мегакариоцитарный росток кроветворения [Горбунова В.А., 1982; Переводчикова Н.И., 2005]. Кроме того, препараты данной комбинации, наряду с нуклеофильной "атакой", оказывают выраженное токсическое действие на мембрану тромбоцитов, вызывая их повышенную деструкцию в периферической крови [Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986]. В частности, немаловажным механизмом действия доксорубицина является прямой повреждающий эффект в отношении мембран клеток и митохондрий, связанный с липофильностью антрациклинов [Tritton T.R.,1982; Lampidis T.J. et al., 1997; de Jong W.K. et al., 2007; Francis P. et al., 2008].

В большинстве клинических случаев выраженная токсическая миелодепрессия проявляется следующей последовательностью изменений в периферической крови: в первую очередь лейкопения, затем тромбоцитопения и - в последнюю очередь - анемия [Алмазов В.А., 1981; Гершанович М.Л., 1982; Гаврилов О.К. и др., 1987; Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007]. Полученные нами собственные данные продемонстрировали отсутствие признаков анемии и тромбоцитопении у больных РМЖ в процессе лечения по схеме АТ и, напротив, достаточно выраженные проявления (со стороны периферической крови) угнетения эритроидного и мегакариоцитарного ростков кроветворения в случае использования режима CAF. Что же касается самой первой составляющей токсического воздействия цитостатических препаратов - лейкопении, то ее развитие наблюдалось при использовании обоих режимов противоопухолевого лечения.

Проведенные нами исследования показали, что ОКЛ у пациентов, леченных по схеме CAF, закономерно уменьшилось почти в 2 раза уже после первого курса химиотерапии. К началу второго курса цитостатической терапии общее число белых клеток крови несколько возросло, не достигая при этом исходного уровня, а далее происходило прогрессирующее уменьшение ОКЛ после завершения каждого курса химиотерапии, с максимальным падением (в 3 раза) на момент окончания третьего курса специального лечения.

Лечение больных РМЖ с использованием препарата из группы таксанов в сочетании с доксорубицином также приводило к статистически значимому снижению количества лейкоцитов почти в 2 раза после завершения 1 курса химиотерапии. По окончании трехнедельных перерывов отмечалось почти полное восстановление числа лейкоцитов, сменявшееся достоверными падениями в ответ на второй и третий курсы специального лечения, однако, менее выраженными, чем после завершения первого курса. Таким образом, лейкопения в случае применения схемы АТ была выражена в меньшей степени, чем при использовании схемы CAF.

Анализ стернальных пунктатов в процессе химиотерапии показал наличие компенсаторных сдвигов со стороны гранулоцитарного ростка кроветворения, причем более выраженными оказались эти изменения при использовании комбинации доксорубицина с доцетакселом. Так, уже перед началом второго курса химиотерапии CAF содержание незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов достоверно выросло на 22 и 16 % соответственно в сравнении с уровнем до начала лечения. В те же сроки введение доксорубицина/доцетаксела приводило к возрастанию числа ЗНГ более чем на 31 %. Это обстоятельство, возможно, обусловлено отсутствием значительных повреждений цитостатическими препаратами как комбинации CAF, так и АТ способных к митозу предшественников гранулоцитопоэза, что создает основу для активации регенераторных процессов в костном мозге на ранних этапах цитостатической болезни [Гольдберг Е.Д., Козинец Г.И., 1982]. Однако в ходе дальнейшего лечения по протоколу CAF происходило истощение репаративных возможностей гранулоцитарного ростка.

Назначение же больным РМЖ комбинации доксорубицина с доцетакселом приводило к достоверному возрастанию числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов перед третьим курсом специального лечения по сравнению с исходным уровнем, что свидетельствует о нарастающей активации в ходе химиотерапии как процессов пролиферации, так и дифференцировки клеток гранулоцитарного ряда в ответ на воздействие указанных препаратов. Отражением описанной ситуации в костном мозге является выраженный рост числа палочкоядерных нейтрофилов в периферической крови практически во все сроки наблюдения у больных, леченых по схеме АТ.

Угнетение костномозгового лимфопоэза и моноцитарно-макрофагального ростка гемопоэза имело место при назначении обеих схем цитостатического лечения, хотя степень выраженности этого процесса в случае выбора схемы CAF несколько превалировала над режимом АТ.

Увеличение содержания клеток-предшественников грануломоноцитопоэза в кроветворной ткани наблюдалось уже перед началом второго курса химиотерапии как по схеме CAF, так и по схеме АТ на 26,6% и 47% соответственно, далее величина указанного параметра возвращалась к исходному уровню в обеих исследуемых группах больных. Феномен гиперплазии кроветворной ткани костного мозга вследствие активации гипофизадреналовой и симпатоадреналовой систем представляется естественной реакцией организма на цитостатический стресс [Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 1999]. В основе активации гемопоэза при этом лежит усиление миграции Т-лимфоцитов - регуляторов в костный мозг под действием глюкокортикоидов и катехоламинов. Т-клетки повышают функциональную активность резидентных макрофагов и стромальных механоцитов, формирующих ГИМ, во многом ответственное за пролиферацию и созревание кроветворных клеток от родоначальных до зрелых форм. Кроме того, имеют место прямые (рецепторные) и опосредованные (через Т-лимфоциты, макрофаги, стромальные механоциты) эффекты гормонов мозгового и коркового слоев надпочечников на кроветворные клетки, приводящие к синхронизации и повышению их пролиферативных и дифференцировочных потенций.

Изучение пролиферативного и дифференцировочного статуса гранулоцитарных предшественников в двух группах пациентов выявило разнонаправленность развивающихся изменений. Так, при лечении больных РМЖ в рамках протокола АТ, усиление пролиферативной активности гранулоцитарных предшественников перед вторым курсом химиотерапии настолько выражено, что, несмотря на параллельное ускорение их созревания, содержание КОЕ-ГМ в кроветворной ткани значительно возрастает. Выявленные изменения можно трактовать, как реализацию всех возможных механизмов регенерации грануломоноцитопоэза в условиях химиотерапевтического лечения доксорубицином и доцетакселом. Это становится возможным благодаря тому, что при применении данной схемы не происходит существенных повреждений механизмов, ответственных за регуляцию системы крови, в частности элементов, составляющих гемопоэзиндуцирующее микроокружение. При этом еще большее ускорение созревания КОЕ-ГМ к началу третьего курса химиотерапии по схеме АТ (даже в условиях сниженного пролиферативного индекса) обуславливает нарастание содержания незрелых и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге.

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что ускоренная дифференцировка гемопоэтических прекурсоров является важнейшим механизмом репарации кроветворения при цитостатических гемодепрессиях у онкологических больных, а участие этого процесса в восстановлении отдельных ростков костного мозга существенно ускоряет их регенерацию даже без увеличения темпа пролиферации соответствующих предшественников. Это полностью согласуется с постулатами динамической теории регуляции кроветворения, разработанной в нашей лаборатории на основе результатов экспериментальных исследований [Дыгай А.М. и др., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

В то же время рост числа клоногенных клеток гранулоцитарного ростка гемопоэза в костном мозге больных, леченых по схеме CAF, был выражен в меньшей степени вследствие наблюдаемого падения интенсивности их пролиферации на протяжении всего периода изучения на фоне существенного угнетения созревания указанных элементов на поздних этапах исследования.

Обнаруженные различия в скорости деления гранулоцитомакрофагальных прекурсоров оказались обусловлены в первую очередь неодинаковой секреторной активностью клеток ГИМ (в большей степени неадгезирующего компонента) при применении сравниваемых схем цитостатического лечения. Так, уровни КСА в супернатантах как от прилипающей, так и от неприлипающей фракций костного мозга больных РМЖ, леченых по схеме CAF, перед вторым курсом химиотерапии снижались. В то же время концентрация соответствующих факторов в кондиционных средах от неадгезирующих клеток костного мозга больных, леченных в режиме АТ, достоверно возрастала. Отсутствие стимуляции секреторной функции элементов ГИМ перед третьим курсом специального лечения препаратами схемы АТ объясняет, вероятно, резкий спад пролиферативной активности гранулоцитарных предшественников в этот период.

Принимая во внимание тот факт, что митотическая активность кроветворных прекурсоров зависит прежде всего от концентрации гемопоэтических ростовых факторов, объединенных понятием КСА и ЭПА в окружении клетки, можно предположить негативное влияние режима CAF на секреторную активность клеток ГИМ.

Экспериментальные данные, полученные в нашей лаборатории, убедительно демонстрируют выраженное токсическое влияние препаратов из группы фторпиримидиновых антиметаболитов на функциональную активность фибробластов, моноцитов и макрофагов, являющихся не только клетками с высокой секреторной активностью, но и основными компонентами адгезирующей фракции гемопоэзиндуцирующего микроокружения [Гольдберг Е.Д. и др., 1992, 1999; Дыгай А.М. и др., 1995, 2003; Жданов В.В. и др., 1998].

В частности, так называемый альтернативный механизм действия 5-фторурацила (одного из компонентов схемы CAF) заключается в угнетении образования всех фракций рибосомальной, информационной и транспортной РНК, что ведет к глубоким нарушениям белкового синтеза [Rojas E. et al., 1993; Ghoshal K., Jacob S.T., 1997]. Кроме того, изменения метаболизма РНК под влиянием 5-фторурацила инициируют экспрессию гена P53, что ведет к выраженной индукции апоптоза [Piazza G.A. et al., 1997; Pritchard D.M. et al., 1997].

Снижение же секреторной активности неприлипающих компонентов ГИМ в случае использования режима CAF обусловлено, вероятно, известным токсическим влиянием циклофосфана на лимфоидные клетки, считающиеся основными продуцентами гемопоэтических ростовых факторов неадгезирующей составляющей системы локальной регуляции костного мозга [Hemendinger R.A., Bloom S.E., 1996].

Анализируя изменения колониестимулирующей активности сыворотки крови у больных обеих исследуемых групп в процессе химиотерапевтического лечения, мы опять пришли к выводу (как и в случае изучения ЭПА), что гемопоэтические ростовые факторы, выделяемые клетками ГИМ, играют гораздо более существенную роль в восстановлении гемопоэза при цитостатических миелосупрессиях, нежели гуморальные факторы периферической крови.

Объясняя возможные механизмы снижения интенсивности созревания гемопоэтических предшественников в условиях лечения по схеме CAF, необходимо отметить, что важным условием нормального кроветворения в костном мозге является не только достаточная клеточность кроветворного микроокружения, но и непосредственный контакт его с гемопоэтическими клетками [Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989; Науменко О.И., 1992; Gordon M.Y., 1988; Hardy C.L., Minguell J.J., 1993; Kobayashi M. et al., 1994]. Межмембранное связывание служит при этом для сообщения регуляторной информации, передачи необходимых веществ, миграции и последующего хоминга клеток-предшественников в специфических участках кроветворной ткани и представления гемопоэтических ростовых факторов в биологически доступной форме [Науменко О.И., 1992; Hardy C.L., Minguell J.J., 1993].

Проведенные экспериментальные исследования четко продемонстрировали тот факт, что введение 5-фторурацила животным вызывает длительно сохраняющиеся нарушения структурно-функциональной организации костного мозга, связанные с мощным деструктивным эффектом антиметаболита в отношении стромальных элементов ГИМ [Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2000].

Весьма интересны полученные нами данные по динамике содержания кроветворных прекурсоров в периферической крови у больных РМЖ в процессе цитостатической химиотерапии. Так, в случае выбора схемы CAF, число предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза прогрессивно снижалось от курса к курсу, достигая своих минимальных значений к окончанию периода наблюдения. В то же время лечение препаратами схемы АТ не вызывало каких-либо значимых колебаний уровня циркулирующих клеток-предшественников на протяжении всего периода наблюдения.

Известно, что некоторые цитостатические препараты, в частности циклофосфамид, при введении в достаточно высоких дозах способны вызывать выход кроветворных предшественников из гемопоэтической ткани в периферическую кровь [Neben S. et al., 1993; Venturini M. et al., 1996; Liu F. et al., 1997; de Jong M.E. et al., 2006; Ford C.D. et al., 2006; Ingrid G. Winkler, 2006]. Механизм этого явления изучен недостаточно, однако установлено, что в нем принимают участие рецепторы для гемопоэтических ростовых факторов, имеющиеся в большом количестве на кроветворных прекурсорах [Liu F. et al., 1997; Ingrid G. Winkler, 2006]. Определенную роль в мобилизации предшественников играет снижение их сродства к элементам стромы костного мозга [Жданов В.В. и др., 1998].

Установлено, что в условиях длительного курсового воздействия цитостатических препаратов (что имеет место при лечении в режиме CAF) и ионизирующего излучения в системе крови развиваются нарушения, способные отрицательно влиять на процесс мобилизации кроветворных клеток-предшественников в периферическую кровь. Во-первых, на уровне синусов костного мозга происходит изменение проницаемости выстилающего их эндотелия [Berthou C. et al., 1995; Mohle R. et al., 1995; Daldrup-Link H.E. et al., 2000; Tordjman R. et al., 2001] и во-вторых, возникает постепенное истощение продукции гемопоэзстимулирующих цитокинов (вследствие ее постоянного напряжения), таких как Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-3, фактор Стила (SF). При однократном применении цитостатиков в больших дозах указанные гемопоэтины вызывают выход кроветворных предшественников из костного мозга в периферическую кровь за счет воздействия на специфические рецепторы [Neben S. et al., 1993; Knopinska-Posluszny W. et al., 1998; Daldrup-Link H.E. et al., 2000; Ingrid G. Winkler, 2006]. Вероятно, использование режима АТ ведет к меньшей выраженности описанных нарушений мобилизации кроветворных прекурсоров в циркуляцию, что значительно расширяет возможность расселения гемопоэтических предшественников на внекостномозговые территории.

При введении преднизолона больным РМЖ нами было выявлено преходящее повышение числа нейтрофилов в периферической крови, что свидетельствует о наличии типичной реакции на гормональный препарат. Результаты проведенных проб перед вторым и третьим курсами химиотерапии по схеме CAF существенно не отличались от реакции на введение преднизолона у больных РМЖ до начала лечения. Однако при этом величина максимального выброса нейтрофилов как в абсолютных, так и в относительных значениях неуклонно падала, достигая минимального уровня перед третьим курсом цитостатического воздействия.

Совершенно другая картина имела место при сочетанном использовании доксорубицина с доцетакселом. Перед вторым курсом химиотерапии выброс нейтрофилов уже на 2-ой час после введения преднизолона превосходил аналогичные значения, полученные у больных до приема цитостатиков, на 2,05 Г/л. Указанные отличия оставались статистически достоверными и на 5, 6 часы пробы. Максимальный выброс превосходил значения, полученные у больных до начала химиотерапии, на 2,13 Г/л, а у пациентов, леченных по схеме CAF, на 2,3 Г/л. Проведение гормональной пробы перед началом третьего курса химиотерапии продемонстрировало еще большее возрастание выброса нейтрофилов.

Ослабление реакции на преднизолон в случае использования режима CAF может быть обусловлено повреждением эндотелия синусов костного мозга циклофосфамидом, что, в свою очередь, влияет на перераспределение поступающих в периферическую кровь нейтрофилов [Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И., 1984; Булкина З.П., 1991; Переводчикова Н.И., 1993]. Снижение величин максимального выброса нейтрофилов может быть связано также с уменьшением числа нейтрофилов в крови в результате более длительного воздействия цитостатиков, вызывающих угнетение продукции лейкоцитов и деструкцию циркулирующих клеток [Кулагина И.В., 1990].

Кроме того, уже отмечалось, что препараты группы фторпиримидиновых антиметаболитов (5-фторурацил) обладают мощным деструктивным влиянием в отношении стромальных элементов ГИМ, что приводит к нарушению процессов дифференцировки гранулоцитарных предшественников в зрелые сегментоядерные нейтрофилы, либо к снижению функциональной активности последних [Дыгай А.М. и др., 1995; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Значительное улучшение показателей гормональной пробы при лечении больных с использованием схемы АТ, по-видимому, обусловлено отсутствием вышеперечисленных отрицательных моментов, а также, возможно, потенцирующим действием дексаметазона - обязательного компонента премедикации в случае применения препаратов из группы таксанов [Манзюк Л.В., Артамонова Е.В., 2006], в отношении мобилизующего эффекта преднизолона.

Таким образом можно заключить, что в условиях назначения комбинации доксорубицина с доцетакселом больным РМЖ эритроидный, мегакариоцитарный и гранулоцитарный ростки гемопоэза сохраняют достаточно широкие возможности компенсации повреждений, вызванных цитостатическими препаратами. Важнейшее значение в регенерации кроветворной ткани имеет при этом ускорение созревания гемопоэтических предшественников, накапливающихся в костном мозге в результате возрастания их пролиферативной активности на ранних этапах цитостатической болезни. Увеличение интенсивности дифференцировки указанных элементов (даже в условиях подавления пролиферации) приводит к возрастанию клеточности в отделах морфологически дифференцируемых и зрелых элементов костного мозга и периферической крови, а также к увеличению костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов. Высокий уровень пролиферативной активности эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров обусловлен при этом увеличением продукции гемопоэзстимулирующих активностей элементами микроокружения (рис. 2). Полученные результаты представляют значительный интерес в связи с тем, что за последние годы доцетаксел стал основой комбинированной химиотерапии при лечении наиболее распространенных злокачественных опухолей [Sandler A.B. et al., 2000, 2005; Kelly K. et al., 2001; Nabholtz J.M. et al., 2001, 2005; Schiller J.H. et al., 2002; Johnson D.H. et al., 2004; Ishikawa T. Et al., 2006; Heigener D.F. et al., 2007; Jazieh A.R. et al., 2007; Choong N.W. et al., 2008; Ramalingam S.S. et al., 2008]. Признанный наиболее эффективным препаратом при лечении больных раком молочной железы, яичников и немелкоклеточного рака легкого, доцетаксел продемонстрировал преимущество перед стандартными схемами лечения у больных гормонорезистентным раком простаты, раком желудка и плоскоклеточным раком головы и шеи [Johnson D.H. et al., 2004; Sandler A.B. et al., 2005; O'Brien M. et al., 2007; Ramalingam S.S. et al., 2008]. Внедрение новых схем на основе доцетаксела существенно улучшило результаты терапии вышеназванных заболеваний, в лечении которых в течение длительного времени отсутствовал клинически значимый прогресс [Моисеенко Б.М.,1997; Тюляндин С.А., 2001; Манзюк Л.В., Артамонова Е.В., 2006; Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007].

В то же время мы вынуждены констатировать, что на фоне химиотерапии по схеме CAF в системе крови отсутствовали полноценные механизмы гемопоэтической репарации, что проявлялось в торможении созревания и выраженном угнетении пролиферации гемопоэтических предшественников, обусловленном депрессией продукции гуморальных активностей как адгезирующими, так и неадгезирующими элементами ГИМ, что, в конечном итоге, приводило к развитию анемии, тромбоцитопении и лейкопении в периферической крови у данной группы больных (рис. 1). Мы склонны связывать указанные нарушения регуляции кроветворения, в первую очередь, с наличием в схеме препарата из группы антиметаболитов и алкилирующего агента, обладающих токсическим действием в отношении клеток ГИМ.

Учитывая большую вероятность того, что именно присутствие препарата из группы фторпиримидиновых антиметаболитов в режиме химиотерапевтического лечения CAF привело к выраженным нарушениям локальной регуляции гемопоэза и более глубокому угнетению кроветворения, мы решили продолжить исследование эффектов цитостатических комбинаций с включением антиметаболитов в отношении системы крови, но уже при другой локализации опухолевого процесса и в комбинации с платиноидом.

В связи с тем, что до сих пор не определена оптимальная схема цитостатического лечения диссеминированного рака желудка, большой интерес представляет новый режим комбинированной химиотерапии, разработанный в НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. Проведенные клинические исследования показали более выраженный и длительный противоопухолевый эффект с улучшением показателей функциональной шкалы, общего статуса здоровья и снижением выраженности симптомов заболевания в случае применения предложенного способа лечения, включающего, наряду с оперативным вмешательством, назначение цисплатина (внутрибрюшинно, внутривенно) и капецитабина (per os), по сравнению с исключительно паллиативной хирургической операцией [Тюляндин С.А., 2001; Чубенко В.А., Орлова Р.В., 2007; Janunger K.G. et al., 2002; Terashima M. et al., 2003; Enzinger P.C. et al., 2005; Newman E. et al., 2005; Sharma A. Et al., 2006; Lorenzen S. et al., 2007; Seymour M.T. et al., 2007].

Исследование периферической крови больных с установленным диагнозом рака желудка IV стадии в процессе химиотерапевтического лечения показало достоверное уменьшение числа эритроцитов и концентрации гемоглобина во все сроки исследования относительно данных, полученных до начала терапии. Изучение качественного и количественного состава эритроидных клеток в костном мозге продемонстрировало наличие компенсаторных сдвигов со стороны красного ростка гемопоэза. Так, уже перед началом второго курса химиотерапии содержание зрелых эритрокариоцитов выросло на 40,2%, а к началу третьего курса цитостатического лечения превысило значение данного показателя до начала лечения более чем в 2 раза. Количество же незрелых эритроидных клеток существенно не изменялось. Это обстоятельство, вероятно, связано с ускорением процессов пролиферации и созревания незрелых эритрокариоцитов, о чем свидетельствует отсутствие депрессии их числа на фоне возрастания содержания зрелых эритрокариоцитов в костном мозге.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение по схеме цисплатин+капецитабин весьма негативно сказывается на состоянии периферического звена эритрона. Следствием снижения темпа дифференцировки КОЕ-Э явился рост их числа в костном мозге больных раком желудка перед третьим курсом химиотерапии на 46,8% от исходного уровня.

Как известно, цисплатин относится к препаратам, обладающим выраженным кумулятивным нефротоксическим эффектом. Повреждение почек при этом проявляется в виде некроза извитых канальцев, интерстициального нефрита, сосудистых нарушений [Переводчикова Н.И., 2005; Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007; Masunaga H. et al., 1991]. Как следствие, угнетается продукция почечного эритропоэтина, что приводит к усилению секреции эритропоэзстимулирующих веществ костномозговыми макрофагами [Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай А.М. и др., 2007]. Такая изолированная активация системы локальной регуляции эритропоэза вызывает увеличение содержания в костном мозге клоногенных и морфологически дифференцируемых эритроидных клеток, однако оказывается недостаточной для эффективного восстановления содержания эритроцитов в периферической крови. Кроме того, в эксперименте на животных была продемонстрирована способность платиносодержащих препаратов значительно усиливать интенсивность гемолиза эритроцитов [Карпова Г.В., Боровская Т.Г., 2004]. Одновременно с этим необходимо учитывать, что капецитабин и его метаболиты выводятся в основном с мочой (95,5%), а следовательно могут усугублять токсическое действие цисплатина в отношении почек [Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007].

Достаточно токсичной представленная схема лечения больных РЖ оказалась и в отношении мегакариоцитарного ростка кроветворения, что проявлялось в статистически значимом снижении числа тромбоцитов на протяжении практически всего периода оценки, с минимальным уровнем (64,8% от значения до начала лечения) на момент завершения второго курса цитостатического лечения.

У исследуемой нами группы больных РЖ на фоне лечения цисплатином и капецитабином имело место развитие выраженной лейкопении, усугубляющейся от курса к курсу, при этом минимальный уровень ОКЛ (48% от исходного) отмечался перед третьим курсом химиотерапии.

Уменьшение числа лейкоцитов было обусловлено снижением содержания лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, в частности сегментоядерных нейтрофилов, в периферической крови. Уже перед началом второго курса химиотерапии наблюдалась тенденция к снижению содержания как зрелых, так и незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге больных, леченных по исследуемой программе послеоперационной химиотерапии. Наметившаяся тенденция приобрела достоверный характер к началу третьего курса лечения: число незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов уменьшилось на 22,6% и 23,5% соответственно по сравнению со значениями данных показателей до начала комбинированного лечения.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение выбранной комбинацией цитостатических препаратов негативно сказывается не только на состоянии периферического лейкоцитарного звена, но и вызывает выраженное опустошение гранулоцитарного ростка костного мозга. Опираясь на количественный и качественный состав морфологически идентифицируемых элементов гранулоцитарного ряда, мы можем говорить о нарушении не только процессов пролиферации, но и созревания в отделе незрелых нейтрофильных гранулоцитов, что и влечет за собой снижение числа ЗНГ в костном мозге и ОКЛ в периферической крови.

Динамика содержания грануломоноцитарных предшественников в костном мозге больных РЖ характеризовалась выраженной тенденцией к угнетению перед вторым курсом с последующим возрастанием выше исходного уровня начала химиотерапии. Что касается интенсивности созревания кроветворных клеток-предшественников в костном мозге, то она достоверно падала и к началу второго, и к началу третьего курсов цитостатического воздействия. Как и при использовании режима CAF, это обстоятельство может быть связано c включением в схему цитостатического лечения препарата из широко применяемой в клинической онкологии группы фторпиримидиновых антиметаболитов. Развивающиеся при этом нарушения структурно-функциональной организации кроветворной ткани и обусловливают сбой нормального течения процессов дифференцировки гемопоэтических предшественников, что служит дополнительным фактором снижения числа морфологически идентифицируемых клеток гранулоцитарного ростка и препятствием к развитию генетически детерминированных адаптивных изменений со стороны клоногенных элементов. Используемый же в лечении больных РЖ капецитабин является производным фторпиримидинкарбамата и под влиянием фермента тимидинфосфорилазы способен превращаться в 5-фторурацил, при этом концентрация 5-фторурацила в ткани опухоли в 3,2 раза выше, чем в прилежащих здоровых тканях. Метаболиты капецитабина становятся цитотоксичными лишь после превращения в 5-фторурацил и метаболиты 5-фторурацила [Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007]. Эти метаболиты повреждают клетки посредством двух различных механизмов. Во-первых, угнетают клеточное деление, а во-вторых - нарушает процессинг РНК и синтез белка.

Содержание кроветворных прекурсоров грануломоноцитопоэза в периферической крови у больных РЖ в процессе цитостатической химиотерапии достоверно снижалось почти на все сроки наблюдения, причем минимальный уровень КОЕ-ГМ отмечался уже после первого курса лечения и составлял 69% от первоначального значения. Число же циркулирующих предшественников эритропоэза статистически значимо снижалось лишь после завершения второго курса цитостатической терапии на 21,6% от уровня до начала лечения.

Нарушение выхода КОЕ в циркуляцию в условиях применения цисплатина и капецитабина может быть связано с нарушением механизмов мобилизации клоногенных элементов (описанных выше) под действием цитостатиков данной схемы. Таким образом, при использовании данного метода химиотерапевтического лечения ограничивается возможность расселения гемопоэтических предшественников на внекостномозговые территории.

При введении преднизолона больным РЖ было выявлено преходящее повышение числа нейтрофилов в периферической крови, что свидетельствует о наличии типичной реакции костномозговых нейтрофилов на гормональный препарат. Результаты проведенных проб перед вторым курсом лечения, несмотря на имевшую место тенденцию к снижению освобождения нейтрофильных гранулоцитов, статистически значимо не отличались от реакции на введение преднизолона у больных РЖ до начала лечения. Однако при этом величина максимального выброса нейтрофилов как в абсолютных (в 1,8 раза), так и в относительных значениях (в 2 раза) достоверно падала.

Перед третьим курсом цитостатического воздействия, наметившаяся ранее тенденция к снижению реакции на введение преднизолона усугублялась и приобретала достоверный характер, причем разница между приростом числа нейтрофилов в ответ на введение глюкокортикоида у больных на фоне лечения, либо до его начала, становилась статистически значимой на все часы гормональной пробы. Достоверно ниже на данном этапе исследования оказалась и величина максимального выброса нейтрофилов в ответ на фармакологическую стимуляцию по сравнению с аналогичным показателем у нелеченых больных.

Известно, что полноценность ответа на преднизолон зависит от объема костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов [Грибова И.А., Свинкина Н.В., 1968; Кулагина И.В., 1990]. Использование цисплатина и капецитабина в лечении больных РЖ вело к значительному снижению содержания в костном мозге как незрелых, так и зрелых морфологически дифференцируемых элементов гранулоцитарного ростка (более выраженному именно перед третьим курсом химиотерапии), от которых и зависит восполнение костномозгового резерва нейтрофилов. С другой стороны ослабление реакции на преднизолон может быть обусловлено повреждением эндотелия сосудов костного мозга цитостатическими препаратами [Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И., 1984; Булкина З.П., 1991; Переводчикова Н.И., 1993]. Многие цитостатики способны стать причиной васкулярных фиброзов за счет стимуляции пролиферации фибробластов, атонии гладкой мускулатуры сосудистой стенки, функциональной активации эндотелия сосудов и тромбоцитов [Гершанович М.Л., 1982]. Веноокклюзионные осложнения развиваются у больных раком желудка, получавших 5-фторурацил, доксорубицин и митомицин. Непосредственные причины веноокклюзионных осложнений вследствие химиотерапии не ясны, однако повреждение эндотелия и стимуляция пролиферации фибробластов доказаны гистологическими исследованиями [Тюляндин С.А., 2001; Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007].

Кроме того, применение комбинаций, в которые входит цисплатин, часто приводит к развитию цереброваскулярных нарушений, синдрома Рейно, тромботической микроангиопатии [Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 2007].

Полученные результаты позволяют заключить, что механизмы, обеспечивающие мобилизацию костномозговых нейтрофилов в периферическую кровь, нарушаются в процессе лечения больных РЖ цисплатином и капецитабином.

Таким образом, применение химиотерапевтического режима цисплатин+капецитабин у больных раком желудка IV стадии вызывало наиболее выраженное угнетение (по сравнению со всеми представленными выше цитостатическими схемами) центральных и периферических звеньев системы крови. Токсический эффект платиносодержащего препарата усугублялся длительным приемом препарата группы фторпиримидиновых антиметаболитов, что приводило к выраженному угнетению темпа созревания гемопоэтических предшественников с вытекающим отсюда падением общей численности клеток гранулоцитарного ряда и резким снижением костномозгового резерва нейтрофильных гранулоцитов. При этом со стороны периферической крови имело место развитие анемии, тромбоцитопении и лейкопении.

Представленные результаты изучения системы крови на фоне химиотерапии цисплатином и капецитабином подтверждают высказанное ранее заключение о том, что присутствие препарата группы фторпиримидиновых антиметаболитов в терапевтических режимах вызывает глубокое угнетение кроветворения, механизмы развития которого были достаточно подробно рассмотрены нами на примере схемы CAF (рис.1).

В настоящее время в тех ситуациях, когда желательно быстро увеличить количество гранулоцитов в крови, используют преимущественно препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [Carlo-Stella C. et al., 2000; Holmes F.A. et al., 2002; Lokich J. et al., 2005; Lyman G.H. et al., 2005; Ng R., Green M.D., 2005; Sasse E.C. et al., 2005; Stathopoulos G.P. et al., 2005; tePoele E.M. et al., 2005; de Jong M.E. et al., 2006; Ford C.D. et al., 2006; Pro B. et al., 2006; Anderlini P., Champlin R.E., 2007; Mйndez-Ferrer S., Frenette P.S., 2007; Morrison V.A. et al., 2007].

Однако, принимая во внимание различные механизмы угнетения кроветворения под действием цитостатиков из разных фармакологических групп, логично предположить и неодинаковую эффективность гемостимуляторов (в частности, Г-КСФ) при каждом конкретном химиотерапевтическом режиме. С целью подтверждения высказанного предположения, нами были сформированы две группы больных раком молочной железы, которым вводили филграстим в перерывах между курсами цитостатического воздействия, причем первая группа больных получала противоопухолевое лечение по схеме CAF, а вторая - АТ. Контролем в данном случае служили группы пациентов, не получавших препарат цитокина в процессе химиотерапии по вышеназванным схемам.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение по обеим схемам в комбинации с цитокином не сказывается существенным образом на состоянии периферического звена эритрона, однако на фоне режима АТ Г-КСФ вызывает некоторое опустошение эритроидного ростка костного мозга, а на фоне схемы CAF имеет место накопление эритроидных клеток, способных к активной пролиферации, перед вторым курсом специального лечения.

В основе уменьшения клеточности эритроидной ткани (на фоне включения филграстима в схему АТ) лежат, вероятно, реципрокные взаимоотношения между гранулоцитарным и эритроидным ростками гемопоэза. Они заключаются в том, что резкое увеличение потребления ранних гемопоэтических прекурсоров вследствие их массового выхода в гранулоцитарную дифференцировку приводит к временному дефициту клеток, способных развиваться в направлении красного ростка кроветворения [de Haan G. et al., 1992]. Кроме того, существуют данные о непосредственной способности Г-КСФ направлять развитие примитивных гемопоэтических предшественников в сторону миелоидного ростка кроветворения [Richards M. et al., 2003].

Однонаправленной оказалась реакция на включение в схемы противоопухолевого лечения рекомбинантного цитокина в отделе коммитированных клеток-предшественников эритропоэза, составляющих его глубокий резерв. Содержание КОЕ-Э в костном мозге больных обеих исследуемых групп характеризовалось незначительной тенденцией к росту на протяжении всего периода изучения. Причем вышеописанные изменения в случае применения схемы CAF происходили на фоне общей тенденции к активации процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных предшественников под влиянием филграстима, а использование режима АТ в комбинации с колониестимулирующим фактором характеризовалось общей тенденцией к снижению интенсивности этих процессов.

Изменения пролиферативной активности эритроидных предшественников соответствовали уровню продукции ЭПА прилипающими и неприлипающими клетками костного мозга в случае назначения филграстима в перерывах между курсами лечения по схеме CAF. Введение же колониестимулирующего фактора на фоне химиотерапии АТ приводило к угнетению продукции эритропоэтической активности от неадгезирующей фракции ГИМ перед вторым курсом специального лечения, однако перед третьим курсом химиотерапии наблюдался всплеск секреторной активности клеток микроокружения.

Рекомбинантный цитокин оказывал стимулирующее действие на ЭПА сыворотки крови только на фоне лечения по схеме АТ, что может свидетельствовать в пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний филграстима на гемопоэз в данной группе больных.

Таким образом, репродуктивная способность эритрона на фоне химиотерапии по схеме АТ с включением филграстима оказывается несколько ниже по сравнению с применением гемостимулятора в сочетании с режимом CAF, что, однако, не отражается отрицательно на качественном составе периферической крови. Это явление объясняется, вероятно, противофазными изменениями кинетики гемопоэтических предшественников, имеющих общую родоначальную клетку, в условиях выраженной стимуляции гранулоцитомакрофагальных прекурсоров, что было зафиксировано нами при лечении филграстимом на фоне схемы АТ.

С другой стороны, в больших дозах кортикостероиды (дексаметазон является обязательным компонентом премедикации в случае применения препаратов из группы таксанов) оказывают ингибирующее действие на процессы эритропоэза [Scaltrini G.C., Conigliaro S., 1959; Consolo F., Princi P., 1960; Gordon A.S. et al., 1967; Glader B.E. et al., 1968]. Показана способность гормонов коркового слоя надпочечников ингибировать рост эритроидных колоний из клеток-предшественников типа БОЕ-Э и КОЕ-Э [Gordon A.S. et al., 1967]. Говоря о возможных механизмах угнетения пролиферации эритроидных клеток-предшественников под влиянием глюкокортикоидов, следует иметь в виду, что дексаметазон в дозе 10-7 М понижает продукцию бурстпромоторной активности клетками периферической крови здоровых людей и больных апластической анемией [Nissen C. et al., 1983].

Рекомбинантный гемопоэтин не проявил активности в отношении угнетенного цитостатиками мегакариоцитарного ростка кроветворения. В то же время в экспериментальных работах B. Olas et al. (2000) был продемонстрирован выраженный ингибирующий эффект Г-КСФ на перекисное окисление липидов в изолированных тромбоцитах свиньи. Этот цитокин значительно снижал и уровень свободных радикалов в тромбоцитах животных, предварительно получавших цисплатин. На основании представленных данных, авторы сделали вывод о наличии у Г-КСФ протективного эффекта против оксидативного стресса (в отношении тромбоцитов крови), вызванного введением цисплатина [Olas B. et al., 2000].

Со стороны показателей периферической крови гемостимулирующий эффект препарата Г-КСФ в отношении белого ростка гемопоэза наиболее полно реализовывался в случае выбора режима АТ для лечения больных РМЖ. Это проявлялось в более выраженном росте ОКЛ на все сроки исследования, причем не только за счет сегментоядерных нейтрофилов, но и лимфоцитов, моноцитов и палочкоядерных форм нейтрофильных лейкоцитов.

Картина периферической крови пациентов обеих исследуемых групп в целом соответствовала изменениям со стороны миелоидного ростка кроветворения. Введение рекомбинантного гемопоэтина на фоне схемы CAF приводило к достоверному возрастанию числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов перед вторым курсом химиотерапии как по сравнению с исходным уровнем (в 1,3 раза), так и с величиной соответствующего показателя у больных, леченых по схеме CAF без препарата-корректора (в 1,1 раза). Учитывая, что назначение колониестимулирующего фактора вызывало достоверное снижение содержания в костном мозге незрелых нейтрофильных гранулоцитов перед вторым курсом цитостатического воздействия по сравнению с контрольной группой, можно сделать вывод о преобладании процессов дифференцировки миелоидных клеток над процессами их пролиферации под влиянием филграстима на фоне схемы CAF.

В то же время применение филграстима в комбинации с режимом АТ вызывало значительное возрастание не только количества зрелых нейтрофильных гранулоцитов на все сроки исследования (в 1,1-1,2 раза), но и достоверный рост числа активно пролиферирующих морфологически идентифицируемых элементов гранулоцитарного ростка гемопоэза перед вторым курсом химиотерапии АТ (в 1,14 раза) по сравнению с контрольной группой больных. Данный факт позволяет говорить о том, что введение цитокина на фоне схемы АТ приводит к выраженной активации не только процессов дифференцировки, но и пролиферации в отделе морфологически дифференцируемых элементов нейтрофильного ростка кроветворения.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является основным гемопоэтическим фактором роста, который обеспечивает пролиферацию, дифференцировку и терминальное созревание предшественников нейтрофильных гранулоцитов, а также стимулирует разнообразные функции зрелых нейтрофилов и увеличивает продолжительность их жизни. Г-КСФ играет важную роль в регуляции гранулоцитопоэза как в равновесном состоянии, так и в условиях его экстренной активации, например, при миелосупрессивных состояниях [Broxmeyer H.E. et al., 1986; Asano S., 1991; Avalos B.R. et al., 1996; Welte K. et al., 1996; Sunami T. et al., 2001; Basu S. et al., 2002; Boneberg E.M., Hartung T., 2002; Bozlar M. et al., 2005; Oguma K. et al., 2005; Parvez T. et al., 2005; Roberts A.W., 2005; Stroncek D. et al., 2005].

Выявленные нами эффекты препарата Г-КСФ также свидетельствуют о том, что он оказывает стимулирующее действие преимущественно на процессы восстановления гранулоцитопоэза. Обнаруженные изменения содержания в крови клеток других ростков носят, по всей видимости, перераспределительный характер. Так, повышение числа циркулирующих моноцитов и лимфоцитов на фоне схемы АТ обусловлено, вероятно, ускоренным выходом этих клеток из костного мозга, где их количество в соответствующий момент несколько снижается.

Кроме того, помимо стимулирующего влияния в целом на различные показатели функциональной активности нейтрофилов, Г-КСФ повышает выживаемость клеток, т.е. обладает ингибирующим эффектом на спонтанный и индуцированный апоптоз. Это проявляется замедлением фрагментации ДНК и отсроченным замедлением снижения уровня АТФ в клетках. Известно, что морфологическим изменениям, характеризующим апоптоз нейтрофилов, предшествует внутриклеточная ацидификация. Г-КСФ, как оказалось, предотвращает как апоптоз, так и ацидификацию, стимулируя активность вакуолярной Н+-АТФазы, которая выкачивает протон из цитозоля. Предполагается, что антиапоптотический эффект цитокина реализуется через Bcl-2-зависимый механизм [Козлов В.А., Сенников С.В., 2004; Adachi S. et al., 1993; Gottlieb R.A. et al., 1995; Leavey P.J. et al., 1998; Semerad C.L. et al., 1999; Oguma K. et al., 2005; Roberts A.W., 2005].

Как известно, состояние костномозгового кроветворения во многом зависит от функциональной активности пула кроветворных клеток-предшественников, способных давать начало определенному числу зрелых специализированных клеток крови. Нами было установлено, что число КОЕ-ГМ в костном мозге больных РМЖ при лечении по схеме CAF и АТ достоверно возрастало лишь перед вторым курсом специального лечения на 26,6% и 47,1% соответственно. Дальнейшие исследования показали, что лечение больных по схеме CAF в сочетании с препаратом Г-КСФ приводило к достоверному увеличению содержания КОЕ-ГМ в костном мозге больных (на 5,8% перед вторым и 22,8% перед третьим курсами цитостатического воздействия) по сравнению с «чистой» схемой. Введение же филграстима на фоне режима АТ демонстрировало много больший рост в костном мозге больных числа гранулоцитарных клеток-предшественников, а именно до 114% перед вторым и 156,6% - перед третьим курсами химиотерапии по сравнению с аналогичным показателем в группе больных, леченых по схеме АТ без гемостимулятора.

Поскольку количественное состояние пула любых незрелых клеток определяется интенсивностью пролиферации и дифференцировки составляющих его элементов, мы обратили особое внимание на изучение этих процессов в отделе прекурсоров грануломоноцитопоэза.

Вызванное лечением по схеме АТ снижение пролиферативной активности гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в последний срок исследования полностью нивелировалось под влиянием препарата Г-КСФ. Более того, он вызывал повышение содержания в костном мозге больных данной группы КОЕ-ГМ, находящихся в S-фазе митотического цикла, до 288,8% от уровня данного показателя в группе без филграстима. Одновременно с этим, в группе пациентов, которым вводили филграстим на фоне таксан-содержащей схемы химиотерапии, наблюдалось, как и в группе без стимулятора, ускорение созревания КОЕ-ГМ. Однако интенсивность этого процесса значительно возрастала как перед вторым (в 1,34 раза), так и перед третьим курсами цитостатического воздействия (в 1,33 раза) по сравнению с контрольной группой.

В то же время рост числа гранулоцитарных клеток-предшественников при использовании схемы CAF в комбинации с гемопоэтином был обусловлен выраженным усилением пролиферативной активности КОЕ-ГМ (в 1,5-2 раза) на протяжении всего периода исследования, развивающимся на фоне отсутствия статистически значимого возрастания интенсивности дифференцировки вышеназванных прекурсоров перед вторым курсом химиотерапии, либо небольшого ее роста (в 1,2 раза) - перед третьим курсом специального воздействия. Вероятно, достоверное снижение содержания незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге больных данной группы перед вторым курсом химиотерапии CAF объясняется невозможностью активного созревания гранулоцитарных прекурсоров, что приводит к еще большему их накоплению в отделе коммитированных предшественников.

Таким образом, изменения состояния пула коммитированных прекурсоров играют важную роль в ускорении постцитостатической регенерации грануломоноцитопоэза под действием препарата Г-КСФ. Как показано в работах D.Metcalf (1989), M.A.Moore (2002), его гемостимулирующий эффект обусловлен активацией как пролиферации, так и дифференцировки соответствующих предшественников. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что повышение пролиферативной активности КОЕ-ГМ играет важную роль в реализации фармакологического эффекта филграстима в условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной как химиотерапевтическим режимом CAF, так и АТ. Однако ускорение созревания клоногенных элементов под действием Г-КСФ является также важнейшим механизмом реализации его гемостимулирующего действия и препятствует накоплению в костном мозге гранулоцитарных прекурсоров на фоне выраженного снижения численности морфологически идентифицируемых элементов гранулоцитарного ряда [Metcalf D., 1989, 2008; Basu S. et al., 2002; Moore M.A., 2002; Parvez T. et al., 2005]. Последнее явление было зафиксировано нами в случае использования филграстима на фоне схемы CAF и свидетельствовало о невозможности реализации описанного механизма в полной мере.

Традиционное мнение о том, что гемостимулирующее действие Г-КСФ обусловлено непосредственным его эффектом в отношении кроветворных клеток, не исключает возможности изменения под его влиянием функции добавочных клеток, формирующих микросреду в гемопоэтической ткани. Так, F. Bussolino c соавт. (1991) показали, что Г-КСФ проявляет ангиогенную активность (без признаков стимуляции воспаления) путем индукции программы дифференцировки, включающей повышение способности к пролиферации и миграции эндотелиальных клеток [Bussolino F. et al., 1991]. Кроме того, имеются свидетельства активации функций (фагоцитарной, бактерицидной и др.) мононуклеарных фагоцитов под действием Г-КСФ [Kitano K. et аl., 1991; Hebert J.C. et al., 1994; Lenhoff S. et al., 1999; Papadaki H.A. et al., 1999; Sunami T. et al., 2001; Boneberg E.M. et al., 2002; de Revel T. et al., 2002; Hareng L., Hartung T., 2002; Sawa Y. et al., 2003; Hill J.M. et al., 2005; Kuhlmann M.T. et al., 2006; Takano H. et al., 2006].

К настоящему времени накоплено большое количество сведений о влиянии данного цитокина на состояние компонентов лимфоцитарного звена кроветворного микроокружения. Так, экспериментально получены свидетельства иммунорегуляторных свойств Г-КСФ, которые заключаются в повышении под его действием продукции Т-клетками растворимых регуляторных факторов, ингибиции пролиферации лимфоцитов, и индукции парциальной активации лимфоцитов после митогенной стимуляции [Franzke A. et al., 2003; Roberts A.W., 2005; Rutella S. еt аl., 2005; Anderlini P., Champlin R.E., 2007]. Однако E. Reyes и соавт. наблюдали у больных раком молочной железы, получавших препараты Г-КСФ, преходящее угнетение пролиферативного ответа Т-клеток на митоген [Reyes E. et аl., 1999]. Введение мышам препарата Г-КСФ поляризует T-клетки в сторону продукции цитокинов 2-го типа, что связано с угнетением продукции цитокинов 1-го типа. Указанные изменения обусловливают, по мнению L.Pan и соавт., уменьшение выраженности реакции «трансплантат против хозяина» [Pan L. et al., 1995]. У пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, Г-КСФ вызывает существенный подъем общего числа лимфоцитов, общего количества T-клеток, CD8+ T-клеток и естественных киллеров [Волкова М.А., 1998; Kawakami M. et al., 1992; Asano S., 1993; Nielsen S.D. еt аl., 1998; Davidson M. et al., 2002; Cosenza-Nashat M. et al., 2007].

В связи с этим для дальнейшего выяснения механизмов стимулирующего влияния препарата Г-КСФ на процессы регенерации костномозгового кроветворения у онкологических больных в процессе цитостатического лечения нами были исследованы уровни КСА супернатантов костномозговых нуклеаров.

Под действием филграстима наблюдалось значительное увеличение подавленной цитостатиками схемы CAF колониестимулирующей активности клеток адгезирующей и неадгезирующей фракций костного мозга на протяжении всего периода наблюдения. В то же время введение препарата цитокина больным РМЖ, леченым по схеме АТ, вызывало достоверный рост уровня КСА от прилипающих и неприлипающих миелокариоцитов лишь к началу третьего курса специального воздействия, отмечавшийся при этом всплеск секреторной активности элементов кроветворного микроокружения значительно превышал подъем уровней КСА на фоне схемы CAF на этот же срок оценки.