1

Размещено на http://www.allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КОРРЕКЦИЯ АНЕМИЧЕСКОГО СИНДРОМА ПРИ МИЕЛОИНГИБИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

14.00.16 - патологическая физиология

Удут Елена Владимировна

Томск 2008

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ Гольдберг Евгений Данилович

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ Венгеровский Александр Исаакович

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН Кушлинский Николай Евгеньевич

доктор медицинских наук Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация:

ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные данные, касающиеся распространенности заболеваний, сопровождающихся угнетением кроветворения, в частности, эритропоэза, показывают, что анемии являются одним из основных проявлений различных патологических процессов [Алмазов В.А. и др., 1981; Гаврилов О.К. и др., 1987; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 2002; Милованова Л.Ю., Николаев А.Ю., Козлова Т.А. и др., 2004; Ермоленко В.М., Филатова Н.Н., 2004; Евтушенко И.Д. и др., 2006]. В терапии анемического синдрома актуальным является как лечение ведущей нозологии, поскольку анемии, как правило, вторичны и обычно представляют собой проявление основного заболевания, так и своевременная коррекция нарушений, возникших в системе эритрона [Сабуров Х.С., Хамдамова Ф.К., 1990; Моршакова Е.Ф., Дмитриев А.В., Борисова И.П., 1997; Милованова Л.Ю., Николаев А.Ю., Козлова Т.А. и др., 2004; Ермоленко В.М., Филатова Н.Н., 2004; Евтушенко И.Д. и др., 2006]. Многочисленными исследованиями установлено, что изменения в системе крови, возникающие при действии различных болезнетворных факторов, во многом однотипны и заключаются в последовательной активации отдельных звеньев единого каскадного механизма регуляции кроветворения. Поэтому, несмотря на большое разнообразие причин, лежащих в основе развития анемий, адекватные патогенетически оправданные методы их фармакологической коррекции могут быть разработаны лишь на основе детального изучения общих механизмов управления гемопоэзом [Гершанович М.А., 1982; Переводчикова Н.И., 1996; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 1998; Воробьев А.И., 2002].

Существующая теория регуляции кроветворения свидетельствует о наличии в организме единой, сложноорганизованной, взаимосвязанной системы управления гемопоэзом [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Гольдберг В.Е. и др., 1996; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 1999; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Хлусов И.А., 1999; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др., 2001]. Ее основными компонентами являются центральные нейроэндокринные механизмы, элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения, осуществляющие локальный контроль за процессами кроветворения, и цитокины - активные вещества, секретируемые клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток. Учитывая вышесказанное, фармакологическая коррекция нарушений, возникающих в системе крови, вероятно, может осуществляться путем модуляции центральных механизмов регуляции гемопоэза, функций элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и применения заместительной терапии препаратами, аналогичными естественным регуляторам кроветворения.

Существует ряд биологически активных веществ, которые, модулируя функции центральной нервной системы, способны изменять и функционирование аппарата системы крови, приводя к развитию позитивной динамики со стороны показателей периферического звена эритрона [Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольдберг В.Е. и др., 1991; Гольдберг В.Е., Абрамова Е.В., 1991; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Гольдберг В.Е. и др., 1997; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., 1998; Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др., 1999; Дыгай А.М., Гольдберг В.Е., Родионченко А.А. и др., 2000; Goldberg E.D., Dygai A.M., Agafonov V.I. et al., 1994]. Перспективным также является создание препаратов на основе гликозаминогликанов. Данные вещества, являясь составной частью экстрацеллюлярного матрикса, клеточной мембраны, влияют на процессы пролиферации кроветворных клеток, регулируют продукцию цитокинов, то есть могут опосредованно (путем активации гемопоэзиндуцирующего микроокружения) стимулировать процессы репарации подавленного гемопоэза. Создание гемостимуляторов на основе цитокинов продемонстрировано многочисленными работами иностранных и отечественных авторов [Волкова М.А., Ширин А.Д., 1997; Масычева В.И., Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М. и др., 2006; Moore M.A., Welte K., Gabrilove J. et al., 1987; Vose J.M., Armitage J.O., 1995; Moore M.A., 2002; Glaspy J.A., 2003].

Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные, позволяющие дать патогенетическое обоснование применения различных препаратов в терапии нарушений эритрона, возникающих при отдельных нозологиях. Это обусловлено как отсутствием соответствующих данных, касающихся механизмов их действия, так и недостаточной изученностью патогенеза развивающихся анемических синдромов. С указанных позиций удобными моделями для вскрытия закономерностей и механизмов функционирования кроветворной ткани при анемическом синдроме и разработки патогенетически обоснованных методов терапии являются цитостатические миелосупрессии, вызванные различными по механизмам действия антибластомными средствами, так как одним из наиболее тяжелых осложнений токсической миелодепрессии является развитие анемического синдрома различной степени выраженности.

Изучение механизмов действия стимуляторов эритропоэза на моделях миелосупрессий, вызванных повреждающими агентами (цитостатиками), влияющими на отдельные структуры гемопоэзиндуцирующего микроокружения, позволит дать патогенетическое обоснование подходов к дифференцированному применению гемостимуляторов в лечении анемического синдрома и разработать целенаправленные методы терапии отдельными препаратами в клинической практике.

Цель исследования. Вскрыть механизмы регуляции эритропоэза при миелоингибирующих воздействиях. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекции гемостимуляторами анемического синдрома на моделях цитостатических миелосупрессий.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы развития цитостатических миелосупрессий, вызванных введением циклофосфана, 5-фторурацила, адриамицина и карбоплатина.

2. В сравнительном аспекте оценить эффективность действия гемостимуляторов (рекормон, таблетированный эритропоэтин, препарат сверхмалых доз антител к эритропоэтину - поэтам, экстракт шлемника байкальского, байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) на эритропоэз на моделях цитостатических гемодепрессий, вызванных введением циклофосфана и 5-фторурацила.

3. Вскрыть специфические для каждого из гемостимуляторов механизмы участия элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения в восстановлении эритрона при моделировании цитостатических миелосупрессий.

4. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекций нарушений в системе эритрона в условиях повреждения кроветворной ткани противоопухолевыми препаратами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами эритроидного ростка кроветворения при введении рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, N-ацетилнейраминовой кислоты, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина является избирательная чувствительность прекурсоров эритропоэза и клеточных элементов ГИМ к действию цитостатиков и гемостимуляторов.

2. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений эритрона является рекормон и N-ацетилнейраминовая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция эритропоэза наблюдается под влиянием рекормона и препаратов экстракта шлемника байкальского. При моделировании миелосупрессии адриамицином и карбоплатином рекормон более эффективен в сроки развития депрессии эритроидного ростка, поэтам - в период его активной регенерации.

3. В основе регуляторного действия рекормона и таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на костномозговой эритропэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки эритроидных клеток-предшественников, поэтама - увеличение уровня гуморальных регуляторов эритропоэза (в том числе, сывороточного эритропоэтина). Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани N-ацетилнейраминовой кислотой и препаратами шлемника байкальского при назначении циклофосфана вызвано формированием гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа, в случае применения 5-фторурацила - возрастанием концентрации гемопоэтических факторов роста в экстрацеллюлярном матриксе.

4. Стимуляция периферических альфа-адренергических структур стромальных элементов ГИМ восстанавливает подавленную циклофосфаном фидерную активность адгезирующих клеток в отношении эритроидных прекурсоров и значительно усиливает ее в присутствии эритропоэтина (рекормон). анемический миелоингибирующий гемостимулятор эритропоэз

5. Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, N-ацетилнейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид байкалин оказывают умеренное стимулирующее влияние на гранулоцитарный росток кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила. В основе действия препаратов лежит увеличение функциональной активности клеточных элементов ГИМ.

Научная новизна. Впервые выявлена многофакторная природа, лежащая в основе развития длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения цитостатических препаратов с различными механизмами действия (алкилирующий агент, антиметаболит). Основной причиной падения содержания эритрокариоцитов в системе крови у мышей при введении циклофосфана выступает подавление функциональной активности пула коммитированных предшественников кроветворения и, в меньшей степени, нарушение межклеточных взаимодействий и выработки гуморальных регуляторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. При этом развитие анемии на фоне увеличения числа эритроидных гемопоэтических островков свидетельствует в пользу функциональной несостоятельности образованных de novo клеточных комплексов.

Развитие гемодепрессии при назначении 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и, в меньшей степени, с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирующими клетками гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из стимуляторов эритропоэза (рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского, флавоноид байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) механизмов участия клеток кроветворного микроокружения в регуляции эритрона при его восстановлении. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимуляторов. Мишенью для рекормона и таблетированной формы эритропоэтина являются прекурсоры эритропоэза. N-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроидных клеточных комплексов. С модуляцией активности дистантных структур (эритропоэтическая активность сыворотки крови) связано стимулирующее действие на эритропоэз экстракта шлемника байкальского и поэтама.

Впервые показано, что в условиях моделирования гипопластических состояний циклофосфаном гемостимуляторы в большей степени активируют процессы регенерации эритропоэза, чем при назначении 5-фторурацила, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и нарушениями функций системы дальноранговой регуляции эритропоэза, вызванными антиметаболитом.

Патогенетически обоснована эффективность применения N-ацетил-нераминовой кислоты и рекормона при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, рекормона и препаратов шлемника байкальского - в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита, рекормона и поэтама - при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и адриамицина.

Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции анемий, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию создания новых гемостимуляторов для лечения анемий различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешен к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации препарат на основе сверхмалых доз антител к эритропоэтину - поэтам (выпускается НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва), препарат шлемника байкальского в таблетках (НПЦ натуральных продуктов "Даника", Харьков, Украина; ООО "Амрита", Киев, Украина).

По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина и препарата N-ацетилнейраминовой кислоты для получения разрешения на клинические исследования в качестве гемостимуляторов. Получены патенты: (RU) №2001100123 от 03 января 2001 г., (RU) №2003116260 от 02 июня 2003 г.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, Х Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2000, 2001, 2003), на Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2001, 2002), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005, 2007), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006, 2007), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 15 - в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 412 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 119 таблицами (таблицы 96-119 размещены в приложении). Библиографический указатель включает 647 источников, из них 249 отечественных и 398 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1634 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биологического моделирования Института фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Циклофосфан (“Биохимик”, Саранск), 5-фторурацил (Украина, химфармобъединение «Дарница»), адриамицин (Апджон С.п.А., Италия) и карбоплатин (Ebewe, Австрия) вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам пробит-анализа соответственно 250 мг/кг, 228 мг/кг, 6 мг/кг и 100 мг/кг. После введения цитостатика мыши опытных групп получали подкожные инъекции препарата ЭП Recormon («Hoffmann-La Roche Ltd.», Швейцария), суммарная доза - 50 ЕД на мышь; таблетированную форму рекомбинантного человеческого ЭП, разработанную НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os 1 раз в день в течение 5 суток, начиная со дня введения цитостатика, содержание действующего вещества 10 ЕД на мышь (суммарная доза - 50 ЕД на мышь); оригинальный препарат сверхмалых доз антител к ЭП - поэтам, созданный НПФ «Материа Медика Холдинг» (Москва) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os ежедневно по 0,2 мл/мышь в течение 10 суток, начиная со дня введения цитостатика; экстракт шлемника байкальского жидкий, разработанный ГНЦЛС (Харьков, Украина), совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 1 мл/кг, начиная за 48 часов до введения цитостатика. Стандартизацию экстракта шлемника проводили по флавоноиду байкалину, содержание которого в сухом экстракте составляло 37,20 %. Биофлавоноид байкалин, выделенный из корней и корневищ шлемника байкальского (ГНЦЛС, Харьков, Украина) вводили per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 15 мг/кг, начиная за 48 часов до введения цитостатика. N-ацетилнейраминовую кислоту («Sigma», США) использовали внутривенно, трехкратно на 3, 4, 5-е сутки после введения цитостатика в дозе 50 мг/кг (суммарная доза - 150 мг/кг). Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных. Мышей забивали на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15 и 16-е сутки после введения цитостатика методом дислокации шейных позвонков.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми методами [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода “клеточного самоубийства” путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Эритропоэтическую (ЭПА) и колониестимулирующую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 10⁵ миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992]. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови определяли методом ИФА, с помощью набора фирмы «Sangui Bio Tech, Inc.» согласно методическим указателям производителя. Изучение прямого действия препаратов природного происхождения на эффективность клонирования in vitro КОЕ-Э из костного мозга интактных мышей и после применения цитостатика осуществляли в метилцеллюлозной культуре ткани. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента [Урбах В.Ю., 1975]. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ. Влияние цитостатического воздействия либо препаратов (факторов) на изменения признака исследовали с помощью факторного анализа по критерию Фишера. Использовали также линейный пошаговый дискриминантный анализ Фишера [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004]. Оценка влияний препаратов на динамику костномозгового эритропоэза проводилась с помощью разности интегральных показателей [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А., 1997].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования производилась оценка регенераторных возможностей кроветворной ткани экспериментальных животных при введении цитостатических агентов.

Однократное введение циклофосфана (ЦФ) вызывало выраженное угнетение всех ростков гемопоэза, о чем свидетельствовало уменьшение числа незрелых (1-4-е сутки) и зрелых (1-5-е сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов (1-12-е сутки) в костном мозге. Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания зрелых элементов изучаемых ростков в периферической крови. В частности, на протяжении длительного периода имело место развитие нейтрофильной лейкопении (1-5-е сутки) и ретикулоцитопении (1-8-е сутки).

Вместе с тем, на 4-е сутки после инъекции алкилирующего агента отмечалось восстановление содержания незрелых форм нейтрофилов в костномозговой ткани, а уже на 5-е сутки развивалась гиперплазия гранулоцитарного ростка кроветворения. Увеличение числа полиморфноядерных гранулоцитов в периферической крови имело место на 8-12-е сутки опыта. В свою очередь, регенерация эритропоэза значительно задерживалась, о чем свидетельствовала нормализация содержания эритрокариоцитов в костном мозге только на 12-е сутки исследования и увеличение числа ретикулоцитов с 10-х суток.

У мышей, получавших 5-фторурацил (5-ФУ), была обнаружена более глубокая и продолжительная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Так, фторпиримидиновый антиметаболит приводил к статистически достоверному падению количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов на 1-14-е сутки опыта, причем на 3-8-е сутки эксперимента отмечалось наименьшее содержание всех изучаемых форм миелокариоцитов, вплоть до полного исчезновения на препаратах костного мозга эритрокариоцитов. Вслед за периодом депрессии наблюдалось постепенное увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов в костном мозге животных. Однако восстановление процессов в кроветворной ткани до исходных значений регистрировалось только на 16-е сутки.

Отражением состояния костномозгового гемопоэза являлась картина периферической крови. Так, уже на 1-е сутки после введения 5-ФУ наблюдалось значительное снижение числа нейтрофильных лейкоцитов, вплоть до полного их исчезновения на гемограммах на 4-8-е сутки. В указанные сроки на мазках крови были представлены преимущественно лимфоциты. Рост уровня нейтрофильных лейкоцитов регистрировался на 10, 12 и 16-е сутки наблюдения. К окончанию эксперимента (16-е сутки) содержание нейтрофилов превосходило исходные значения на 47,50 %. На 1-12-е сутки после введения антиметаболита обнаруживалось развитие выраженной ретикулоцитопении в периферической крови. Однако к 14-м суткам содержание ретикулоцитов нормализовалось, а на 16-е сутки число ретикулоцитов более чем в 2 раза превосходило исходный уровень.

Изучение колониеобразующей способности костного мозга мышей, перенесших цитостатические воздействия, позволило выявить ряд закономерностей. Так, в условиях введения циклофосфана отмечалось резкое снижение содержания эритроидных прекурсоров в костном мозге на протяжении всего периода наблюдения. Вместе с тем, угнетение гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования было выявлено на 3, 4-е сутки исследования. К 5-м суткам опыта интенсивность роста КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде нормализовалась и в дальнейшем не отличалась от таковой в интактном контроле. При моделировании гемодепрессии 5-ФУ динамика содержания клеток-предшественников в костном мозге (как и при назначении алкилирующего агента) носила волнообразный характер: непродолжительное уменьшение числа эритроидных (1-5-е сутки) и грануломоноцитарных (1-6-е сутки) прекурсоров сменялось возрастанием их числа (14-16-е и 8-10-е сутки соответственно).

Итак, однократное введение цитостатиков в МПД вызывает развитие продолжительной гипоплазии костного мозга, лейкопению и ретикулоцитопению в периферической крови у мышей линии CBA/CaLac. Нарушения в системе крови в случае использования фторпиримидинового антиметаболита более выражены, чем при назначении алкилирующего агента. Примечательно, что активация процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков при моделировании гемодепрессии ЦФ наступает значительно раньше, чем при введении 5-ФУ (табл. 1). Дополнительной характеристикой использованных модельных ситуаций выступает выявленная нами большая чувствительность эритрона к действию цитостатиков по сравнению с клетками белой крови.

Таблица 1

Сроки ингибиции и регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения при введении цитостатиков

Была проведена серия экспериментов, в которой изучалась пролиферативная активность и интенсивность дифференцировки кроветворных прекурсоров и локальные механизмы их контроля при гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана или 5-фторурацила.

Как и предполагалось, уже на 1-е сутки после введения циклофосфана регистрировалось снижение темпов деления и скорости созревания эритроидных прекурсоров, которое сохранялось на протяжении всего периода исследования. Падение числа ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ обнаруживалось на 1-8-е сутки опыта. В то же время, интенсивность дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных предшественников изменялась волнообразно. Так, если индекс созревания грануломоноцитарных клеток на 1-4-е и 10-12-е сутки исследования статистически достоверно снижался, то на 5, 6-е сутки значение показателя, напротив, существенно возрастало.

Анализ результатов исследования митотической активности прекурсоров гемопоэза после назначения 5-фторурацила позволил установить, что в условиях данной модели существенно снижалась доля КОЕ-ГМ в S-фазе митотического цикла во все сроки эксперимента. В противоположность этому, темпы деления эритроидных предшественников возрастали (4, 5, 14-16-е сутки). Со стороны интенсивности дифференцировки эритроидных и грануломоноцитарных клеток отмечались как периоды увеличения (1-3-и и 1-4, 10-е сутки соответственно), так и уменьшения величины показателя (8-10, 14-16-е и 6-8, 10-е сутки соответственно).

Рассматриваемые процессы в отделе коммитированных клеток-предшественников кроветворения сопровождались значительными нарушениями в структурно-функциональной организации костного мозга. Под влиянием алкилирующего агента нарушение формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом имело место на 1-2-е сутки опыта, а фибробластоидных гемопоэтических островков - на 1-4-е сутки. В последующем наблюдалась стимуляция образования ассоциаций клеточных элементов (более интенсивная - макрофагположительных ГО). Анализ цитограмм позволил установить, что динамика содержания эритроидных ГО в целом повторяла таковую клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом. Как и в случае с фибробластными ассоциациями, дефицит смешанных и гранулоцитарных гемопоэтических островков в костном мозге сменялся увеличением их числа. Вместе с тем, у мышей после введения фторпиримидинового антиметаболита обнаруживалось падение содержания всех типов гемопоэтических островков в костномозговой ткани на протяжении большей части эксперимента.

При изучении роли гуморальных регуляторов в локальном контроле процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток установлено, что ЦФ уменьшал концентрацию эритропоэтической активности в супернатантах адгезирующих (5, 6-е сутки) и неадгезирующих (3-12-е сутки) клеток ГИМ и сыворотке крови (6-8, 12-е сутки). В свою очередь, продукция колониестимулирующей активности нуклеарами прилипающей (6-8-е сутки) и неприлипающей (10-е сутки) фракций ГИМ и уровень сывороточных факторов (3, 5-12-е сутки) возрастали. При назначении 5-ФУ характер секреции ЭПА клетками кроветворного микроокружения и сдвиги уровней сывороточных гемопоэтических факторов роста отличались от вышеописанного. В частности, после снижения ЭПА в биологических средах на 1-5-е сутки опыта отмечался ее рост в более поздние сроки. Вместе с тем, выработка КСА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (3, 10-е сутки) миелокариоцитами значительно превосходила исходные значения, но способность сыворотки периферической крови стимулировать грануломоноцитарное колониеобразование, напротив, падала.

Совокупность выявленных феноменов указывает на многофакторную природу длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила, которая складывается из повреждения структурно-функциональной целостности костного мозга, нарушения продукции ЭПА и КСА и угнетения деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров. Постцитостатическая регенерация гемопоэза обусловлена восстановлением функций ГИМ и коммитированных предшественников кроветворения.

Данные корреляционного и факторного анализов показали, что основной причиной снижения содержания эритрокариоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в системе крови у мышей линии CBA/CaLac при введении циклофосфана выступает снижение функциональной активности пула коммитированных предшественников кроветворения, а только потом - нарушение межклеточных взаимодействий (образование очагов гранулоцитарного кроветворения) и низкий уровень гемопоэтинов и цитокинов в биологических жидкостях.

Развитие гемодепрессии вследствие назначения 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и лимфоидных механизмов, во вторую очередь - с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирующими клетками ГИМ (рис. 1).

Дальнейшим шагом в нашем исследовании явилось проведение экспериментов, направленных на сравнительное изучение гемостимулирующей активности препарата рекомбинантного человеческого эритропоэтина (эпоитин-Я) - рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, оригинального препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину поэтама, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина, N-ацетилнейраминовой кислоты в условиях цитостатических гемодепрессий. Основной акцент был сделан на эритроидный росток кроветворения.

Введение рекормона животным приводило к ускорению процессов восстановления эритропоэза, подавленного цитостатиками, по сравнению с мышами контрольной группы, получавшими растворитель. Причем в условиях введения циклофосфана увеличение содержания эритрокариоцитов в костном мозге под действием препарата эритропоэтина регистрировалось на 4-е сутки опыта, нормализовалось к 10-м суткам, а уже на 12-е сутки значение показателя существенно превышало исходный уровень (на 128 %). При назначении 5-фторурацила количество эритроидных элементов возрастало позднее - с 6-х суток исследования, и статистически достоверно превосходило уровень интактных животных только на 16-е сутки. Активация костномозгового эритропоэза сопровождалась накоплением ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови: после введения ЦФ соответственно на 4-12-е и 6-10-е сутки исследования, а в случае использования 5-ФУ - соответственно на 8, 14-е и 4-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала процессы восстановления эритроидного ростка кроветворения при цитостатической болезни. Так, препарат значительно увеличивал число эритроидных клеток в костном мозге в условиях введения циклофосфана на 4, 5, 8-12-е сутки опыта. Прирост ретикулоцитов в периферической крови отмечался на 5, 6-е сутки исследования, а эритроцитов - на 8-е сутки. При моделировании гемодепрессии 5-фторурацилом таблетированная форма эритропоэтина была менее эффективна. Об этом свидетельствовало повышение содержания эритрокариоцитов в костномозговой ткани лишь на 8, 12, 14-е сутки после введения цитостатика. При этом уровень содержания ретикулоцитов в крови превосходил таковой у мышей, получавших только цитостатик, на 8-е сутки (на 46 %).

При назначении мышам алкилирующего агента поэтам стимулировал регенерацию в эритроидном компартменте кроветворения на 5, 8, 10, 12-е сутки исследования. В указанные сроки содержание эритрокариоцитов в костном мозге превосходило таковое у контрольных животных в 2,4-10,7 раза, а количество ретикулоцитов - на 13-32 %. В свою очередь, поэтам у мышей, получавших предварительно 5-фторурацил, способствовал накоплению эритроидных ядросодержащих клеток в кроветворной ткани только на 12-е сутки опыта и не оказывал существенного влияния на динамику содержания ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови.

Влияние экстракта шлемника байкальского и его флавоноида байкалина на процессы восстановления эритроидного ростка, подавленного алкилирующим агентом, в целом оказалось однотипным. Так, уже с 4-х суток опыта количество эритрокариоцитов в костном мозге животных, получавших данные модификаторы биологических реакций, превышало обнаруженное в контрольной группе, достигая уровня интактных животных на 8-е сутки при введении экстракта, и на 4-е сутки - в случае назначения байкалина. Изменения содержания ретикулоцитов в периферической крови соответствовали описанным выше. Причем, под действием экстракта шлемника байкальского накопление клеток происходило более интенсивно, о чем свидетельствовало развитие более выраженного ретикулоцитоза.

При курсовом введении растительного экстракта резкое увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови мышей (с 5-фторурацилом) обнаруживалось раньше - на 12-е сутки эксперимента, а не на 14-е сутки, как в группе животных, получавших только цитостатик. В то же время, под влиянием байкалина сдвиги в кроветворной ткани не носили статистически достоверный характер. Однако на 8-е сутки после назначения антиметаболита регистрировался значительный прирост ретикулоцитов, а на 4-е сутки - эритроцитов.

Результаты экспериментальных исследований позволили прийти к выводу о том, что N-ацетилнейраминовая кислота обладала способностью в значительной степени стимулировать процессы регенерации эритропоэза при цитостатической болезни, вызванной ЦФ. Так, препарат уже на 4-е сутки опыта нормализовал содержание эритрокариоцитов в костном мозге животных, а в последующем - на 5-е сутки, и вплоть до окончания исследования уровень нуклеаров превосходил исходный. В указанные сроки выявлена и нормализация числа ретикулоцитов в периферической крови. В свою очередь, динамика содержания эритроцитов в крови изменялась волнообразно и на 5, 8-е сутки исследования их содержание в опыте оказалось достоверно выше, чем у мышей контрольной группы.

При введении N-ацетилнейраминовой кислоты интенсивность прироста эритроидных клеток в системе крови мышей, подвергнутых воздействию 5-фторурацила, значительно уступала таковой в случае использования алкилирующего агента. Действительно, в рассматриваемой ситуации отмечалось статистически достоверное увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге (4-8, 12, 14-е сутки). Однако нормализация их количества происходила только к 16-м суткам, как и в контрольной группе, а гиперплазия и вовсе не обнаруживалась. Отражением стимуляции N-ацетилнейраминовой кислотой костномозгового эритропоэза являлось более раннее, чем в контроле, восстановление содержания ретикулоцитов и развитие ретикулоцитоза в периферической крови.

Приведенные выше результаты собственных экспериментальных исследований позволяют сделать заключение о том, что рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовая кислота стимулируют подавленный цитостатиками костномозговой эритропоэз.

При этом существует избирательность действия гемостимуляторов в различные сроки после назначения противоопухолевых средств. В частности, при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом наиболее эффективными с точки зрения нивелирования нарушений в эритроне (1-12-е сутки) являются N-ацетилнейраминовая кислота и рекормон (табл. 2). Байкалин, растительный экстракт, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина и поэтам замыкают ряд. Эффективность гемостимуляторов в сроки регенерации эритроидного ростка кроветворения (с 14-х суток), выглядела следующим образом: рекормон > N-ацетилнейраминовая кислота > таблетированный эритропоэтин > байкалин > экстракт шлемника байкальского > поэтам.

В условиях однократного введения фторпиримидинового антиметаболита лекарственные средства по способности увеличивать содержание эритрокариоцитов в костном мозге в период развития депрессии эритрона расположились в ином порядке: рекормон > препараты шлемника > N-ацетилнейраминовая кислота > поэтам > таблетированный эритропоэтин (табл. 2). Значительная активация процессов регенерации отмечалась также под влиянием рекормона и препаратов шлемника байкальского. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, сиаловая кислота и поэтам оказывали менее выраженное стимулирующее действие.

Таблица 2

Эффективность действия гемостимуляторов на эритропоэз в условиях цитостатической болезни

Примечание. Цифры отображают увеличение препаратами числа эритрокариоцитов в костном мозге, где 1 - минимальный эффект, 5 - максимальный.

Косвенным подтверждением справедливости высказанных предположений явились результаты факторного анализа. Так, при обработке данных экспериментов, направленных на изучение влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге при цитостатических миелосупрессиях, методом главных компонент установлено, что в условиях однократного введения циклофосфана высокие значения факторных нагрузок характерны для рекормона (1 фактор; k=0,988) и N-ацетилнейраминовой кислоты (1 фактор; k=0,947) (табл. 3). Указанные факторные нагрузки превосходят выявленные в группах с экстрактом шлемника байкальского, таблетированной формой рекормона и поэтамом. При гипоплазии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, наибольший вклад в структуру первой компоненты вносят рекормон (1 фактор; k=0,948) и экстракт шлемника байкальского (1 фактор; k=0,933).

Таблица 3

Факторные нагрузки для данных, полученных при изучении влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге в условиях цитостатических миелосупрессий, после применения метода главных компонент и вращения: нормальный варимакс

Примечание. Курсивом обозначены коэффициенты корреляции переменных, прошедших редукцию данных

Как уже неоднократно подчеркивалось выше, все изучаемые нами препараты стимулируют процессы регенерации костномозгового эритропоэза у мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях. Вместе с тем, интенсивность восстановления эритрона в каждом конкретном случае различна. По нашему мнению, причиной этого выступает избирательная чувствительность процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и элементов системы локальной регуляции кроветворения к лекарственным средствам. Для подтверждения выдвинутой гипотезы проведена серия экспериментов, которая была посвящена изучению локальных механизмов регуляторного влияния рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, экстракта шлемника байкальского и N-ацетил-нейраминовой кислоты на пул коммитированных предшественников эритропоэза и ГИМ на моделях различных цитостатических миелосупрессий.

В ходе проведенных экспериментов нами выявлено, что рекормон в значительной степени увеличивал функциональную активность прекурсоров эритропоэза уже на 3-и сутки опыта после назначения циклофосфана, что приводило к статистически достоверному возрастанию темпов деления (3-8-е сутки) и созревания (5-е сутки) прекурсоров эритропоэза выше исходного. При этом имело место ускорение образования макрофагпозитивных (3-5, 8-12-е сутки) и эритроидных (4-12-е сутки) гемопоэтических островков, обнаруживалось возрастание уровней ЭПА в супернатантах от прилипающих (3-12-е сутки) и неприлипающих (4-12-е сутки) миелокариоцитов и в сыворотке периферической крови (4-12-е сутки).

В рассматриваемой модельной ситуации таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала пролиферативную активность эритроидных предшественников на 3, 5-е сутки опыта, а интенсивность их дифференцировки - на 3-6-е сутки. В более поздние сроки, напротив, происходило угнетение деления (6, 8-е сутки) и созревания (10-е сутки) клеток. При исследовании структурно-функциональной организации костного мозга было установлено, что препарат усиливал формирование макрофагположительных (3-5, 12-е сутки) и эритроидных (6, 10-е сутки) клеточных комплексов, существенно стимулировал рост секреторной активности адгезирующих (5, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4, 5, 8-е сутки) клеток ГИМ. Таблетированный эритропоэтин увеличивал уровень ЭПА в сыворотке крови.

Увеличение активности процессов в отделе эритроидных клеток-предшественников под влиянием поэтама приводило к нормализации темпов деления и созревания прекурсоров на 5, 6, 8-е сутки после назначения ЦФ. Вместе с тем, на 12-е сутки исследования значение соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э становилось достоверно ниже такового в интактном контроле. Одновременно с увеличением числа предшественников в опытной группе регистрировалась значительная стимуляция формирования в костном мозге новых ассоциаций с макрофагальной клеткой (5, 8, 10, 12-е сутки) и гемопоэтических островков эритроидного типа (5, 6, 8, 10, 12-е сутки). Анализ уровней ЭПА в биологических средах позволил сделать вывод о том, что поэтам оказывал стимулирующее влияние на продукцию активности прилипающими миелокариоцитами, сывороткой крови и, в меньшей степени, клетками неадгезирующей фракции ГИМ.

При изучении локальных механизмов гемостимулирующих эффектов экстракта шлемника байкальского было установлено, что его введение приводит к накоплению коммитированных предшественников эритропоэза в кроветворной ткани животных с циклофосфаном на 4-12-е сутки опыта. Практически в те же сроки наблюдалась активация процессов пролиферации (3-6-е сутки) и дифференцировки (3, 5, 6, 12-е сутки) прекурсоров. Стимулирующее влияние растительного экстракта распространялось и на ГИМ, о чем, в частности, свидетельствовало усиление образования макрофагпозитивных ГО (3-5, 10-12-е сутки) и клеточных комплексов эритроидного типа (4, 6, 10-е сутки). Наряду с этим, препарат вызывал повышение уровня ЭПА как в супернатантах от адгезирующих (3, 4, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4-6, 12-е сутки) миелокариоцитов, так и в сыворотке крови (3, 4, 6, 8, 12-е сутки).

Введение N-ацетилнейраминовой кислоты мышам, получавшим предварительно алкилирующий агент, приводило к повышению темпов деления (4, 5-е сутки) и скорости созревания (6, 12-е сутки) КОЕ-Э, благодаря чему содержание предшественников эритропоэза (4-6, 8-е сутки) в костном мозге увеличивалось. Сиаловая кислота в значительной степени способствовала образованию дополнительных очагов эритроидного кроветворения (5-12-е сутки). Стимулирующее действие препарат оказывал и на секрецию ЭПА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (6-е сутки) клетками костного мозга. Вместе с тем, следует отметить, что на 4, 10, 12-е сутки исследования интенсивность продукции факторов роста КОЕ-Э неприлипающими нуклеарами ГИМ уступала таковой в контрольной группе (без гемостимулятора). Сдвиги со стороны уровня активности в сыворотке крови под влиянием N-ацетилнейраминовой кислоты были незначительны.

В условиях моделирования цитостатической болезни 5-фторурацилом (препаратом более токсичным, чем циклофосфан) изменения со стороны пула коммитированных предшественников эритропоэза и кроветворного микроокружения под влиянием стимуляторов эритрона носили иной характер. Так, под влиянием рекормона статистически достоверное увеличение выхода КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде отмечалось только в период активной регенерации кроветворной ткани (14-е сутки). Вместе с тем, рост темпов деления эритроидных предшественников обнаруживался в сроки ингибиции эритрона (5-8-е сутки), а интенсивность дифференцировки клеток - практически на протяжении всего периода наблюдения (3, 4, 6, 12-16-е сутки). Применение рекомбинантного эритропоэтина приводило и к ускоренному формированию макрофагпозитивных клеточных комплексов (3-5, 8, 12-16-е сутки) и накоплению числа эритроидных ГО (3-14-е сутки). Причем в указанные сроки наблюдалось и значительное возрастание уровня ЭПА в супернатантах от адгезирующих клеток ГИМ и в сыворотке крови. В свою очередь, после подъема секреторной активности неприлипающих нуклеаров на 6-е сутки исследования отмечалось снижение величины данного показателя на 8-10-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина вызывала неоднозначные сдвиги со стороны функциональной активности пула прекурсоров эритропоэза мышей после введения 5-ФУ. В частности, первоначально препарат усугублял ингибицию образования КОЕ-Э (3-8-е сутки) и снижал темпы деления предшественников (4-6-е сутки), но в значительной степени стимулировал скорость дифференцировки клеток (4-6-е сутки). В дальнейшем активность пролиферации прекурсоров, напротив, существенно превосходила наблюдаемую в контрольной группе (10-14-е сутки), а интенсивность их созревания падала (8, 14, 16-е сутки). Препарат способствовал восстановлению функций кроветворного микроокружения, о чем свидетельствовало активное формирование эритроидных гемопоэтических островков и резкое возрастание продукции ЭПА адгезирующими миелокариоцитами на протяжении всего периода исследования. В то же время, имело место повышение активности гуморальных факторов сыворотки крови (3-5, 8, 10, 14, 16-е сутки). Обращал на себя внимание тот факт, что после кратковременной стимуляции продукции факторов роста неприлипающими клетками костного мозга на 4-е сутки после назначения 5-ФУ регистрировалось падение уровня показателя ниже контрольного на 8, 10-е сутки.

Назначение поэтама сопровождалось продолжительным угнетением роста КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде (3, 4, 12, 16-е сутки) и процессов пролиферации (4-6, 14, 16-е сутки) и дифференцировки (5, 14, 16-е сутки) прекурсоров эритропоэза в костном мозге животных в условиях введения антиметаболита. Следствием ингибиции функциональной активности предшественников выступало усугубление депрессии эритрона в указанные сроки. Между тем, на 10-е сутки опыта отмечался рост числа КОЕ-Э, находящихся в S-фазе митотического цикла, а на 12-е сутки - величины соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э. Это приводило к восстановлению содержания эритрокариоцитов в костном мозге на 12-е сутки эксперимента. Неоднозначное действие препарат оказывал и на кроветворное микроокружение. В частности, на ряду с периодами стимуляции организации дополнительных очагов кроветворения (5, 12-е сутки) и секреции цитокинов прилипающими нуклеарами (4, 5, 8-е сутки), в определенные сроки регистрировалась ингибиция процессов: формирования клеточных комплексов эритроидного типа (10-е сутки), продукции ЭПА адгезирующими (12, 14-е сутки) и неадгезирующими (8, 12-16-е сутки) миелокариоцитами. Волнообразно изменялся уровень сывороточных факторов роста. После увеличения ЭПА на 4-е сутки опыта регистрировалось падение величины показателя на 5-е сутки, которое вновь возрастало на 14-16-е сутки.

Экстракт шлемника байкальского нормализовал колониеобразующую способность костного мозга и функциональную активность эритроидных предшественников на 3-и сутки после введения 5-ФУ. Однако в дальнейшем сдвиги со стороны изучаемых процессов были не столь однозначны. В частности, на 12-16-е сутки эксперимента содержание предшественников в силу угнетения их пролиферативной активности значительно уступало таковому в контрольной группе. Этому предшествовало снижение скорости созревания эритроидных клеток на 8, 10-е сутки. Вместе с тем, на 6, 12-16-е сутки опыта величина соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э, напротив, резко возрастала. Неоднозначно действие растительного экстракта и на ГИМ. Препарат нарушал образование эритроидных ГО. В свою очередь, на уровень ЭПА в биологических средах шлемник байкальский оказывал модулирующее влияние: в сроки ингибиции эритроидного ростка имело место увеличение ЭПА в супернатантах от костномозговых нуклеаров и и в сыворотке крови. В поздние сроки препарат увеличивал преимущественно ЭПА неадгезирующих миелокариоцитов костного мозга.