Коррекция анемического синдрома при миелоингибирующих воздействиях

В условиях назначения N-ацетилнейраминовой кислоты стимуляции роста КОЕ-Э (6, 8-е сутки) в метилцеллюлозной среде предшествовало увеличение интенсивности дифференцировки прекурсоров эритропоэза (4, 6-е сутки) в костном мозге мышей на фоне введения антиметаболита. Однако позднее темпы деления (14-е сутки) и скорость созревания (14, 16-е сутки) эритроидных предшественников падали до уровня интактного контроля. Со стороны динамики содержания клеточных комплексов в костномозговой ткани отмечалась обратная закономерность. Первоначальное (6-10-е сутки) угнетение формирования эритроидных ГО сменялось на усиление формирования дополнительных очагов кроветворения в более поздние сроки (12, 14-е сутки). Сиаловая кислота неоднозначно изменяла и уровень ЭПА в биологических средах. Так, если секреторная активность адгезирующих клеток ГИМ возрастала, то уровень гемопоэтических факторов роста в супернатантах неприлипающих миелокариоцитов (8-е сутки) и в сыворотке крови (6, 10-14-е сутки) значительно уступал контрольным значениям.

Таким образом, стимуляция рекормоном, таблетированной формой рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтамом, экстрактом шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовой кислотой подавленного цитостатиками эритроидного ростка кроветворения обусловлена восстановлением (и/или активацией) процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и функций ГИМ. При этом прослеживается различный уровень изменений величин показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимуляторов.

Используя некоторые многомерные методы статистической обработки результатов экспериментов, мы попытались ответить на вопрос, в чем заключается причина различной эффективности исследуемых в работе лекарственных средств в отношении эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях.

Прежде всего, наше внимание было обращено на препараты, созданные на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рекормон, таблетированная форма эритропоэтина), являющегося, с одной стороны, гормоном, поскольку выделяется в кровь и транспортируется к клеткам-мишеням, а с другой стороны, его с полным правом можно отнести к группе веществ, объединяемых понятием «цитокины».

При проведении анализа собственных экспериментальных данных с помощью метода главных компонент установлено, что основной причиной ускорения рекормоном восстановления эритрона при цитостатической гемодепрессии выступала активация процессов в отделе эритроидных предшественников, о чем свидетельствовала большая доля изменчивости дисперсии компонент, в структуру которой входит пролиферация и дифференцировка прекурсоров (рис. 2). Увеличение функциональной активности ГИМ отодвигалось на второй план. Причем если в условиях введения циклофосфана рекормон оказывал влияние на формирование эритроидных ГО и уровень ЭПА в биологических средах, то в случае использования 5-фторурацила - только на продукцию активностей миелокариоцитами.

Рис. 2. Влияние рекормона на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Структура корреляционных взаимоотношений между показателями эритрона при использовании рекормона в условиях цитостатических воздействий однотипна. На фоне существующих коррелятов прослеживалась организация дополнительных причинно-следственных связей между кроветворным микроокружением (содержание ГО, уровень ЭПА в биологических средах) и процессами пролиферации и дифференцировки прекурсоров эритропоэза.

При курсовом введении таблетированной формы эритропоэтина (как и в случае использования рекормона) высокие темпы деления и созревания эритроидных предшественников выступали в качестве основной причины, определяющей ускоренное восстановление содержания эритрокариоцитов в костном мозге мышей при цитостатических воздействиях (рис. 3). Вместе с тем, при назначении циклофосфана прослеживались сдвиги общей дисперсии таких характеристик ГИМ, как клеточные комплексы эритроидного типа и продукция ЭПА клетками костного мозга. В случае назначения 5-фторурацила снижалась величина дисперсии уровня гемопоэтических факторов роста в супернатантах миелокариоцитов и сыворотке крови (рис. 3).

Рис. 3. Влияние таблетированной формы эритропоэтина на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Под влиянием таблетированной формы эритропоэтина структура корреляционных взаимоотношений параметров эритропоэза при цитостатических воздействиях оставалась практически без изменений (рис. 3). Исключение составили корреляции, возникающие между формированием дополнительных очагов кроветворения и продукцией активностей клетками костного мозга при введении ЦФ, и взаимосвязь прекурсоров и секреторной активности прилипающих (r=0,742; p=0,014) и неприлипающих (r=0,827; p=0,003) миелокариоцитов в случае назначения 5-ФУ.

Выявленная избирательность действия препаратов на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина была ожидаемой. Вместе с тем, при стимуляции деления и созревания эритроидных клеток и одновременной задержке восстановления структурно-функциональной целостности костного мозга существует опасность повреждения «глубокого» резерва эритропоэза в условиях применения 5-ФУ - истощение пула клеток-предшественников и развитие различных рецидивов, на что и указывает увеличение числа коррелятов в опыте.

При рассмотрении факторных нагрузок переменных эритропоэза в условиях последовательного введения поэтама и циклофосфана было обнаружено, что лекарственное средство вызывало наибольшие изменения дисперсии со стороны переменных, характеризующих восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга и увеличение уровня ЭПА в биологических средах (рис. 4). В условиях гемодепрессии, вызванной введением 5-фторурацила, наибольшие сдвиги под влиянием препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину были свойственны продукции ЭПА адгезирующими нуклеарами и сывороткой крови (рис. 4). В то же время следует отметить, что в обеих патологических ситуациях величина дисперсии компонент, представленных содержанием коммитированных клеток-предшественников и их функциональной активностью, оставалась практически неизменной.

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 4. Влияние поэтама на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

По данным корреляционного анализа, в условиях введения циклофосфана поэтам разрушал корреляты между показателями эритропоэза, наблюдаемые в контрольной группе (рис. 4). Количество связей практически не отличалось от такового в интактном контроле. Однако в случае применения 5-фторурацила была обнаружена высокая степень координации между увеличением темпов деления предшественников и секреторной активности прилипающих клеток (r=0,644; p=0,045), а также ростом скорости созревания и продукцией ЭПА неприлипающими миелокариоцитами (r=0,786; p=0,007). Объяснение полученным феноменам, с нашей точки зрения, находится в более токсичном действии на организм антиметаболита, чем алкилирующего агента. Именно различная чувствительность кроветворной ткани к цитостатикам и определила различные темпы восстановления функций отдельных элементов ГИМ (более высокие при назначении ЦФ, чем 5-ФУ), что, в свою очередь, нашло свое отражение в картине корреляционных взаимоотношений показателей эритрона. В силу этого синхронизация ряда процессов в системе локальной регуляции под влиянием поэтама свидетельствовала о незавершенности регенерации подавленного 5-ФУ эритропоэза.

Как и при назначении поэтама, стимуляция экстрактом шлемника байкальского процессов регенерации, в первую очередь, была связана с увеличением уровня ЭПА в биологических средах (рис. 5). Причем при моделировании гемодепрессии циклофосфаном формирование клеточных комплексов эритроидного типа и ГО с центрально расположенным макрофагом и функциональная активность эритроидных прекурсоров во многом способствовали восстановлению клеточности костного мозга. Однако величина их изменчивости уступала сдвигам дисперсии компоненты, в состав которой входит продукция ЭПА неадгезирующими нуклеарами.

В условиях введения 5-фторурацила регуляторное влияние растительного экстракта на эритрон через изменение активности процессов пролиферации и дифференцировки коммитированных предшественников также отодвигалась на второй план. Как видно из представленных величин дисперсии, стимулирующее действие препарат оказывал на кроветворное микроокружение (в том числе, и на ЭПА сыворотки крови), что свидетельствовало в пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний экстракта шлемника байкальского на эритропоэз. На это указывали вновь возникшие корреляты между показателями гуморальной составляющей системы локальной регуляции в обеих моделях цитостатической болезни (рис. 5). Отражением синхронной стимуляции роста КОЕ-Э и формирования эритроидных ГО выступала прямая корреляция между показателями (r=0,861; p=0,006).

Рис. 5. Влияние экстракта шлемника байкальского на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Интересные результаты получены при факторном анализе данных эксперимента по влиянию N-ацетилнейраминовой кислоты на систему локальной регуляции эритропоэза в условиях цитостатических гемодепрессий. В частности, при назначении циклофосфана и сиаловой кислоты наибольшие изменения дисперсии выявлены со стороны компонент, в состав которых входят переменные, характеризующие функциональную активность адгезирующих клеток кроветворного микроокружения - содержание клеточных комплексов эритроидного типа, интенсивность продукции ЭПА клетками адгезирующей фракции ГИМ (рис. 6). Изменчивость предшественников и уровней гуморальных факторов в кондиционных средах неприлипающих нуклеаров и сыворотке крови отодвигалась на второй план. Появление отрицательной корреляции между двумя противоположными процессами - усилением формирования ГО с центрально расположенным макрофагом и ингибицией митотической активности КОЕ-Э, выступало дополнительным доказательством зависимости увеличения числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови, в первую очередь, от восстановления N-ацетилнейраминовой кислотой структурно-функциональной целостности костного мозга мышей, перенесших введение ЦФ (рис. 6).

В условиях коррекции сиаловой кислотой нарушений в системе крови, вызванных 5-фторурацилом, также прослеживался преимущественный вклад секреторной активности прилипающих клеток ГИМ в стимуляцию процессов регенерации эритрона. При этом высока изменчивость дисперсии компонент, в состав которых входят пролиферативная активность и интенсивность дифференцировки эритроидных предшественников (рис. 6). Корреляционная картина усложнялась появлением дополнительных связей между делящимися предшественниками и уровнем ЭПА в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов (рис. 6).

Рис. 6. Влияние N-ацетилнейраминовой кислоты на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Итак, есть все основания для заключения о том, что избирательная чувствительность коммитированных предшественников и элементов ГИМ к гемостимуляторам диктуют различные темпы и характер восстановления клеточности эритроидного ростка при цитостатических воздействиях (табл. 4). Так, мишенью для рекормона, таблетированной формы эритропоэтина и, в меньшей степени, сиаловой кислоты являлись прекурсоры. В свою очередь, N-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроидных клеточных комплексов. С модуляцией активности гуморальных регуляторов кроветворения связано стимулирующее действие экстракта шлемника байкальского и поэтама (табл. 4).

Таблица 4

Избирательная чувствительность механизмов регуляции эритропоэза к гемостимуляторам при цитостатических воздействиях (по результатам многомерного анализа собственных экспериментальных исследований и данным литературы)

Выявленное нами преимущество фармакологических эффектов лекарственных средств в условиях введения циклофосфана над таковыми при назначении 5-фторурацила главным образом связано с более токсичным действием антиметаболита на систему крови.

Сопоставляя результаты собственных исследований об особенностях механизмов повреждающего влияния циклофосфана и 5-фторурацила на эритрон и данные об индивидуальной чувствительности элементов локальной регуляции к действию гемостимуляторов, можно допустить, что на модели миелосупрессии, вызванной алкилирующим агентом, препараты, обладающие способностью активировать процессы в отделе эритроидных предшественников, будут наиболее эффективны. В свою очередь, антиметаболит требует применения лекарственных средств с преимущественным стимулирующим влиянием на кроветворное микроокружение. Действительно, приведенные в табл. 5 интегральные показатели костномозгового эритропоэза подтверждают нашу гипотезу.

Как видно, механизмы действия противоопухолевых препаратов на кроветворную ткань во многом регламентируют применение гемостимуляторов. Но с нашей точки зрения наиболее перспективным является комплексная фармакологическая коррекция нарушений эритропоэза, вызванных цитостатиками при проведении противоопухолевой химиотерапии. Правомочность такого подхода подтвердилась результатами собственных экспериментов и данными литературы.

Прежде всего хотелось остановиться на возможности активирующего действия гемостимуляторов на кроветворные клетки или на различные элементы системы локальной регуляции эритропоэза. Неизбежность истощения коммитированных прекурсоров, ГИМ и, как следствие, развития осложнений цитостатической болезни при введении рекормона, таблетированной формы эритропоэтина (5-фторурацил, в меньшей степени, циклофосфан) и N-ацетилнейрамино-

вой кислоты (5-фторурацил) заставляет отказаться от монотерапии. Более перспективным для лечения цитостатических анемий, с нашей точки зрения, является комплексное воздействие на кроветворную ткань: одновременное восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга и активности предшественников.

Таблица 5

Влияние гемостимуляторов на величину интегральных показателей эритропоэза мышей линии CBA/Calac при цитостатических воздействиях (% от цитостатического контроля)

Результаты опытов показали, что в метилцеллюлозной среде N-ацетилнейраминовая кислота (50 мкг/мл) значительно увеличивала способность прилипающих клеток связывать обработанные рекормоном (0,5 Ед/мл) эритроидные предшественники. Интенсивность роста КОЕ-Э в опыте превосходила таковую в контрольных группах (без препаратов) на 50 %. Преинкубация адгезирующих миелокариоцитов с циклофосфаном (20 мкг/мл) приводила к существенному угнетению фидерной активности макрофагов в отношении интактных эритроидных прекурсоров. Обработка N-ацетилнейраминовой кислотой или экстрактом шлемника байкальского (50 мкг/мл) подвергнутых цитостатическому воздействию прилипающих клеток ГИМ, а коммитированных предшественников эритропоэза - рекормоном препятствовала ингибиции эритроидного колониеобразования. Причем наиболее выраженный эффект отмечался в случае добавления в культуру костного мозга сиаловой кислоты.

В целом, результаты представленных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что возможны разнообразные подходы фармакологической коррекции нарушений эритропоэза, вызванных цитостатиками при проведении противоопухолевой химиотерапии. Мы постарались проиллюстрировать это настоящей схемой (рис. 7). Следует выделить еще два направления лечебных воздействий, позволяющих минимизировать патогенное влияние цитостатиков. Первое из них - терапевтические мероприятия, направленные на повышение “неврозоустойчивости” (резистентности к психоэмоциональному стрессу) больных. Согласно современным представлениям, состояние ВНС во многом является определяющим в развитии соматической патологии. Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что при назначении цикловой полихимиотерапии при раке легкого имеет место проградиентное, сообразно проведенным курсам лечения, снижение числа пациентов с сохранной реактивностью и формирующееся преобладание лиц с “симпатико-” и “гиперсимпатикотонией” [Рыжаков В.М., 1998]. Безусловно, данное обстоятельство усугубляет состояние системы крови при злокачественном новообразовании в условиях химиотерапевтической “агрессии”. Однако превентивное назначение и включение в схему противоопухолевой химиотерапии скутекса (сухой экстракт шлемника байкальского в таблетках) приводит к физиологически оправданной модуляции тонуса и реактивности ВНС не только повышая число пациентов с исходной “нормотонией” и сохранной реактивностью, но и поддерживая на должном уровне представительство лиц с данными характеристиками. Это является решающим фактором в стимуляции процессов регенерации костномозгового эритро- и грануломоноцитопоэза, закономерным следствием чего является возрастание числа ретикулоцитов и лейкоцитов в периферической крови.

Второй подход связан с нивелированием уже наступивших в результате цитостатических воздействий нарушений дистантных механизмов регуляции системы крови. К настоящему времени предложены методы лечения цитостатических миелосупрессий с помощью фармакологических модуляторов активности симпатического отдела ВНС [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А., 1997]. Эффективность применения симпатолитика, нейролептика и антисеротонинового препарата резко возрастала в случае дополнительного применения рекомбинантных форм цитокинов (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин) [Минакова М.Ю., Скурихин Е.Г., Першина О.В., 2007]. Продемонстрировано, что комбинация лекарственных средств регламентируется типом цитостатического воздействия. В частности, более быстрое восстановление подавленного циклофосфаном гранулоцитопоэза имело место при назначении резерпина и Г-КСФ. Фармакологическое вмешательство в процессы регенерации эритропоэза при назначении 5-фторурацила должно включать препараты, с одной стороны, угнетающие активность серотонинергических структур мозга - ципрогептадин, с другой стороны, стимулирующие эритроидные предшественники - рекормон.

В наших экспериментах установлено, что стимуляция in vitro серотонинергических или в-адренергических структур на предварительно обработанных циклофосфаном макрофагах и (или) на интактных коммитированных кроветворных предшественниках восстанавливала до уровня интактного контроля способность прилипающих элементов к связыванию эритроидных прекурсоров.

Вполне вероятно, что “точечное” воздействие моноаминами на эритроидные клетки и клетки кроветворного микроокружения способно позитивно влиять на состояние системы крови при цитостатической болезни. Однако технически исполнить подобный маневр в условиях целостного организма весьма затруднительно. Возникает опасность фармакологического вмешательства в функции не только периферического звена регуляции кроветворения, но и дополнительной активации механизмов, контролирующих стрессорную реакцию, стимуляция которой чревата усилением повреждающего воздействия цитостатических препаратов [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А. и др., 1993].

В заключение этого раздела исследования мы попытались ответить на вопрос о правомерности предложенных нами подходов фармакологической коррекции нарушений в эритроне при патологии, вызванной введением цитостатиков с отличным от циклофосфана и 5-фторурацила механизмом действия. Для моделирования гипопластического состояния кроветворной ткани использовался противоопухолевый препарат карбоплатин, обладающий помимо цитостатического эффекта выраженным нефротоксическим действием, и адриамицин, прямой повреждающий эффект которого в отношении мембран клеток и митохондрий связан с липофильностью антрациклинов [Тетерина В.И., Пичугина Т.В., Колмогорова Л.А. и др., 1980; Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986; Переводчикова Н.И., 1993; Lohrmann H.P., Schreml W., 1982; Del Bino G., Darzynkiewicz Z., 1991; Masunaga H., Takahira R., Sawai T., 1991].

Проведенные эксперименты позволили установить, что введение в МПД карбоплатина или адриамицина вызывало существенное падение содержания эритрокариоцитов (3-5, 7, 9-12-е и 3, 4-е сутки соответственно) и эритроидных предшественников (7-е и 4, 5, 6, 15-е сутки соответственно) в костном мозге. Однако цитостатики не только ингибировали рост КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде. Так, на 3, 4, 6, 8, 9, 12, 15-е сутки после назначения карбоплатина отмечалась стимуляция эритроидного колониеобразования. В случае адриамицина увеличение показателя регистрировалось на 3, 7, 9, 10-е сутки. Одновременно со сдвигами в костном мозге имело место развитие ретикулоцитопении и эритроцитопении, уменьшение количества гематокрита и гемоглобина в периферической крови. Наиболее выраженные нарушения в крови наблюдались в условиях введения карбоплатина.

Несколько неожиданным было длительное усиление выхода КОЕ-Э в культуре костного мозга мышей с карбоплатином. Детальный анализ функциональной активности прекурсоров эритропоэза позволил выявить, что этому феномену сопутствовало увеличение содержания эритроидных прекурсоров в S-фазе митотического цикла на 3-6, 9-е сутки исследования. На 7, 12, 15-е сутки опыта величина показателя, напротив, падала. В то же время, скорость созревания коммитированных предшественников в зрелые эритроидные клетки снижалась на протяжении всех сроков исследования.

Результаты серии экспериментов по изучению состояния ГИМ в условиях введения цитостатиков показали, что карбоплатин способствовал увеличению продукции ЭПА прилипающими нуклеарами костного мозга (4, 15-е сутки) и не изменял секреторную активность неадгезирующих миелокариоцитов. В то же время, при назначении адриамицина уровень факторов роста в кондиционных средах клеток кроветворного микроокружения не превышал таковой в интактном контроле.

Использование иммуноферментного анализа позволило выявить статистически достоверное снижение концентрации ЭП в сыворотке крови животных с карбоплатином до 0,21+0,02 mU/мл при 1,24+0,05 mU/мл в интактном контроле на 3-и сутки опыта. Начиная с 4-х суток после введения цитостатика, отмечалось поступательное увеличение уровня гемопоэтина, достигшее своих максимальных значений на 12-е сутки (35,82+0,23 mU/мл). Динамика содержания эритропоэтина в крови в условиях введения адриамицина в целом соответствовала описанной выше.

Представленные результаты исследований указывают на зависимость развивающейся депрессии эритропоэза при назначении карбоплатина и адриамицина от угнетения и/или дискоординации процессов пролиферации и дифференцировки коммитированных предшественников эритропоэза, а также нарушения секреторной активности клеток прилипающей фракции ГИМ и уменьшения концентрации эндогенного сывороточного эритропоэтина. В силу этого, предположительно, рекормон и поэтам будут наиболее предпочтительными в ряду исследованных гемостимуляторов при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и адриамицина.

В ходе экспериментов было показано, что введение исследуемых стимуляторов эритропоэза существенно изменяло характер восстановления эритрона, подавленного карбоплатином. Так, в обеих опытных группах число ретикулоцитов в периферической крови значительно превосходило таковое в цитостатическом контроле. Причем величина данного показателя была повышена на протяжении практически всего эксперимента. Примечательно, что в случае применения рекормона максимальное увеличение поступления ретикулоцитов в кровь выявлено на 5-е сутки опыта (до 1004 % от исходного уровня), при использовании поэтама - на 12-е сутки (до 392 %). Препараты способствовали и возрастанию количества эритроцитов, гематокрита и гемоглобина (в большей степени - рекормон). В противоположность этому, на 9, 10 и 12-е сутки эксперимента при введении эритропоэтина и на 9-е сутки при назначении поэтама отмечалось статистически достоверное падение уровня эритроцитов, гематокрита и гемоглобина.

Описанная в группах с гемостимуляторами картина периферической крови явилась отражением увеличения количества эритрокариоцитов в костном мозге: при курсовом введении рекормона - на 3-5, 7, 12-е сутки опыта, а поэтама - на 4, 5, 12-е сутки. Сопоставление значений показателя в опытных группах позволило обнаружить, что если в начальные сроки наблюдения более эффективным оказывался рекормон (3-5-е сутки), то препарат сверхмалых доз антител к ЭП - в более поздний период (6, 8, 15-е сутки). Любопытно отметить, что на 15-е сутки после введения карбоплатина рекормон, в противоположность поэтаму, снижал число эритрокариоцитов до 59,2 % от контроля.

Культуральные исследования фармакологического действия препаратов на эритропоэз доказали зависимость описанных реакций системы крови от увеличения содержания эритроидных предшественников в кроветворной ткани: на 3, 7, 8-е сутки опыта - при использовании рекормона и на 4, 8, 15-е сутки - при введении поэтама. Однако кроме увеличения роста КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде рекомбинантный эритропоэтин снижал величину показателя ниже контрольных значений на 6, 9, 12, 15-е сутки (наиболее выражено на 15-е сутки - до 53,3 %).

Исследование функциональной активности коммитированных предшественников эритропоэза выявило разнонаправленные изменения темпов деления и скорости созревания КОЕ-Э в обеих опытных группах. Так, если при введении рекормона первоначальное увеличение (3, 4-е сутки) пула активно пролиферирующих прекурсоров сменялось на последующее снижение величины показателя (5, 6, 9, 12, 15-е сутки), то лечение поэтамом приводило к повышению числа КОЕ-Э, находящихся в S-фазе митотического цикла, практически во все сроки наблюдения. Следует отметить, что на 3, 4-е сутки опыта пролиферативная активность эритроидных клеток в группе с поэтамом была существенно ниже, чем в случае назначения рекомбинантного эритропоэтина. Интенсивность дифференцировки эритроидных предшественников повышалась под действием обоих исследуемых препаратов преимущественно в ранние сроки исследования. С 7-х суток исследования регистрировалось падение величины соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э.

Как было продемонстрировано на моделях цитостатической болезни, вызванной введением циклофосфана или 5-фторурацила, регуляторное влияние рекормона и поэтама во многом осуществляется посредством гуморальных эритропоэтических факторов. У животных, получавших карбоплатин, гемостимуляторы отменяли угнетение цитостатиком продукции почками эритропоэтина на 3-е сутки эксперимента. Статистически достоверное увеличение концентрации сывороточного ЭП регистрировалось и в более поздние сроки исследования: при назначении рекормона на 3-7, 9, 10, 12-е сутки, а в случае использования поэтама - на 3, 5-7, 9, 10-е сутки. При этом закономерным было значительно более выраженное увеличение данного параметра в группе мышей, получавших препарат рекомбинантного эритропоэтина (до 10772 % на 5-е сутки от контрольных значений), в связи с детекцией в сыворотке вводимой извне субстанции [Синюхин В.Н. и др., 1997]. В противоположность этому, на 15-е сутки эксперимента в обеих опытных группах наблюдалось статистически достоверное падение уровня ЭП в сыворотке крови по сравнению с цитостатическим контролем (более существенное у животных с рекормоном). Данное обстоятельство, вероятно, явилось следствием усиления нефротоксического действия карбоплатина в результате дополнительного «напряжения» под влиянием препаратов интерстициальных почечных клеток, закономерно приводящего к усугублению их повреждения и ускорению декомпенсации эритропоэтин-продуцирующего аппарата.

Гемостимуляторы ускоряли процессы восстановления подавленного адриамицином эритропоэза. Так, если рекормон увеличивал содержание эритрокариоцитов в костном мозге на 4-6, 8-10, 12-е сутки опыта, то при введении поэтама накопление нуклеаров имело место на 6, 9, 12-е сутки. Как и при назначении карбоплатина, в рассматриваемой модели цитостатической патологии рекомбинантный эритропоэтин вызывал более выраженное повышение величины показателя в начальные сроки исследования (3-6, 8, 10-е сутки), а препарат сверхмалых доз антител к эритропоэтину - в более поздние сроки (12, 15-е сутки). Причем к 15-м суткам исследования число эритрокариоцитов в кроветворной ткани в опыте с поэтамом на 34 % превосходило таковое в группе с рекормоном.

Курсовое введение стимуляторов эритропоэза вызывало статистически достоверное возрастание колоний эритроидного типа в метилцеллюлозной среде: рекомбинантный эритропоэтин - на 4-10, 15-е сутки опыта, поэтам - на 4, 10, 12, 15-е сутки. При этом сравнительный анализ влияния препаратов на динамику роста КОЕ-Э на протяжении всего периода исследования позволил выявить более интенсивное увеличение числа эритроидных предшественников в костном мозге рекормоном на 3-8-е сутки исследования, а поэтамом - на 9, 10, 12-е сутки.

Закономерным следствием ускорения регенерации костномозгового кроветворения рекормоном и поэтамом являлось возрастание числа ретикулоцитов (3-15-е и 7-9-е сутки соответственно) и эритроцитов (3, 5, 7-9-е и 5, 10, 12, 15-е сутки соответственно) в периферической крови. Изменение динамики содержания клеточных элементов в крови в опытных группах сопровождалось значительным увеличением количества гематокрита и гемоглобина (более выражено рекормоном).

В заключительной серии экспериментов нами изучалось влияние лекарственных средств на уровень эритропоэтина в сыворотке крови у мышей с адриамицином. Так, уровень ЭП в крови опытных животных с рекормоном существенно превышал таковой в контрольной группе на протяжении большей части периода наблюдений. Наибольшие значения показателя регистрировались на 3-и сутки (458 mU/мл) и 4-е сутки (311 mU/мл) после цистостатического воздействия. Примечательно, что на 15-е сутки опыта регистрировалось снижение количества ЭП в опыте.

Использование поэтама также приводило к повышению содержания эндогенного эритропоэтина в сыворотке крови мышей с адриамицином, начиная с самых ранних сроков исследования. Наиболее выраженный подъем показателя был выявлен на 10-12-е сутки, как и в группе животных, которым вводили растворитель. При этом содержание эндогенного ЭП в крови опытных животных вдвое превосходило таковое в цитостатическом контроле. Этот факт свидетельствует о потенцирующем влиянии поэтама на продукцию почечного эритропоэтина в условиях гипопластической анемии, вызванной введением адриамицина.

На основании проанализированных данных можно сделать следующие выводы. Во-первых, применение рекормона и поэтама действительно правомочно для коррекции нарушений в эритроне при моделировании цитостатической гемодепрессии карбоплатином и адриамицином. Во-вторых, нами был подтвержден ранее выдвинутый тезис о возможности негативных последствий монотерапии анемий, развивающихся вследствие применения цитостатиков. Например, препарат рекомбинантного эритропоэтина в условиях цитостатического воздействия (5-фторурацил, карбоплатин, адриамицин) приводит к повреждению «глубокого» резерва эритропоэза, заключающемуся в истощении пула клеток-предшественников. Причем при назначении карбоплатина состояние усугубляется нефротоксическим действием цитостатика. В-третьих, есть некоторое преимущество применения поэтама над рекормоном в терапии гипопластических анемий, вызванных цитостатиками, состоящее в том, что использование сверхмалых доз антител к ЭП не вызывает истощения пула эритроидных прекурсоров. В-четвертых, если эритропоэзстимулирующее действие рекормона проявляется в ранние сроки после назначения цитостатиков и кратковременно, то при назначении поэтама активация эритрона развивается позднее и более продолжительно.

Сопоставляя имеющиеся факты об особенностях механизмов действия рекормона и поэтама, мы пришли к заключению, что перспективным является совместное применение гемостимуляторов в терапии постцитостатической анемии. Описанный подход, с одной стороны, позволит снизить негативные явления экзогенного эритропоэтина в силу сокращения продолжительности введения препаратов на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина. С другой стороны, немаловажным для организма в условиях цитостатического воздействия является близкое к физиологическому восстановление поэтамом функций нейроэндокринной системы и поступление в кровь эндогенного ЭП.

Однако изученные стимуляторы эритропоэза способны изменять характер и темпы регенерации и гранулоцитарного ростка кроветворения в условиях цитостатических воздействий. Так, на модели миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, установлено, что рекормон восстанавливал число незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов (4-е сутки) в костном мозге и нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови (5-е сутки). Эффект препарата был связан со стимуляцией процессов пролиферации (3-и сутки) и дифференцировки (4, 12-е сутки) грануломоноцитарных клеток-предшественников и образования макрофагнегативных (4-6, 12-е сутки) и гранулоцитарных (3-5-е сутки) ГО, продукции КСА прилипающими (4, 6-е сутки) и неприлипающими (8-е сутки) миелокариоцитами. Увеличение содержание незрелых (3, 6-8, 12-14-е сутки) и зрелых (12-14-е сутки) нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани и сегментоядерных нейтрофилов в крови (14-е сутки) имело место и при назначении 5-фторурацила. Вместе с тем, в этой модельной ситуации сдвиги со стороны пула прекурсоров грануломоноцитопоэза не столь однозначны, как при использовании алкилирующего агента. С одной стороны, инъекционный препарат рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировал рост КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде (3-6-е сутки), с другой стороны - снижал интенсивность колониеобразования (8, 10, 14, 16-е сутки). Пролиферативная активность гранулоцитарно-макрофагальных предшественников падала, а интенсивность их созревания, напротив, возрастала (4-16-е сутки). При этом рекормон ускорял формирование макрофагнегативных клеточных комплексов (4-8, 12-е сутки) и гранулоцитарных ГО (4-5, 12, 16-е сутки) в костном мозге, восстанавливал уровень КСА в супернатантах от адгезирующих (6-е сутки) и неадгезирующих (8, 14-е сутки) клеток ГИМ, и в сыворотке крови (3, 5, 8-12, 16-е сутки).

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина также увеличивала скорость регенерации гранулоцитопоэза при назначении ЦФ, на что указывало повышенное содержание палочкоядерных гранулоцитов в периферической крови по сравнению с цитостатическим контролем на 12-е сутки опыта. Стимуляции грануломоноцитопоэза предшествовало восстановление структурно-функциональной организации костного мозга (3-8-е сутки), рост концентрации гемопоэтических факторов роста в кондиционных средах прилипающих (4-е сутки) и неприлипающих (8-е сутки) миелокариоцитов и в сыворотке крови (8-е сутки). Вместе с тем, под воздействием препарата активация пролиферации (3-и сутки) прекурсоров сменялась на ее угнетение (10-12-е сутки). Со стороны индекса созревания выявлена обратная закономерность: уменьшение показателя имело место на 5-8-е сутки опыта, а увеличение - 10-е сутки. В основе ускоренного восстановления клеточности гранулоцитарного ростка таблетированным эритропоэтином при назначении 5-ФУ лежало повышение темпов деления (3-5, 8-12-е сутки) и скорости созревания предшественников грануломоноцитопоэза (3, 8-10-е сутки). Одновременно возрастала продукция КСА адгезирующими (4, 6-е сутки) и неадгезирующими (8, 12-е сут) миелокариоцитами. В противоположность этому, препарат еще более нарушал образование клеточных комплексов гранулоцитарного типа (3, 6, 10-е сутки).

Показано, что введение поэтама на фоне цитостатической миелосупрессии, вызванной применением ЦФ, приводило к кратковременному увеличению числа незрелых форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге (4-е сутки). При этом в опытной группе рост пролиферативной активности (с 4-х суток) и интенсивности дифференцировки (с 6-х суток) гранулоцитарно-макрофагальных

прекурсоров опережал таковой в цитостатическом контроле. Лекарственное средство способствовало формированию клеточных ассоциаций с центрально расположенным фибробластом (4, 6, 12-е сутки) и смешанных ГО (3-5, 8-10-е сутки) в костном мозге, оказывало стимулирующее влияние на продукцию КСА неприлипающими миелокариоцитами (4-5, 8-е сутки). Несколько иной характер стимуляции гранулоцитопоэза поэтамом отмечался в условиях использования 5-ФУ. Так, резкое увеличение содержания нейтрофильных клеток в костном мозге и периферической крови отмечалось к концу эксперимента (12-14-е сутки). Этому предшествовало возрастание содержания грануломоноцитарных прекурсоров (4-6-е сутки) в гемопоэтической ткани в силу значительной стимуляции темпов их деления (3, 8, 10-е сутки). Возникающая в указанные сроки задержка созревания гранулоцитарных клеток нивелировалась организацией дополнительных очагов гранулоцитарного и смешанного кроветворения. Важнейшим эффектом препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину являлось увеличение уровня сывороточного КСА (4-6, 8, 12-е сутки) и продукции факторов роста прилипающими (3, 6, 14-е сутки) и неприлипающими (14-е сутки) клетками кроветворного микроокружения.

Применение экстракта шлемника байкальского на фоне цитостатических миелодепрессий способствовало стимуляции процессов гранулоцитопоэза. Однако увеличение клеточности гранулоцитарного ростка в условиях введения ЦФ имело место на 3, 5, 10-е сутки эксперимента, при назначении 5-ФУ - на 3-8, 12, 14-е сутки. Изучение механизмов действия растительного экстракта на гранулоцитопоэз выявило ряд межмодельных различий. При назначении ЦФ введению препарата сопутствовало накопление гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в кроветворной ткани (с 6-х суток) и увеличение их функциональной активности (с 4-х суток). Одновременно наблюдалось усиление образование фибробластных (6-е сутки) и гранулоцитарных (3, 8-10-е сутки) ГО, а также повышение уровня КСА в супернатантах от неадгезирующих миелокариоцитов (4-5-е сутки) и сыворотке периферической крови (5-е сутки). При моделировании гемодепрессии 5-ФУ растительный экстракт оказывал модулирующее действие на пул прекурсоров грануломоноцитопоэза: в сроки ингибиции пролиферации и дифференцировки регистрировалось увеличение темпов деления и созревания, в случае стимуляции процессов - снижение их активности. В этих условиях отмечалось угнетение формирования гемопоэтических островков и снижение концентрации сывороточной КСА. В свою очередь, продукция активностей прилипающими (4-е сутки) и неприлипающими (6-16-е сутки) клетками кроветворного микроокружения возрастала.

Стимуляция N-ацетилнейраминовой кислотой костномозгового гранулоцитопоэза (4-12-е сутки) и развитие нейтрофильного лейкоцитоза в крови (с 6-х суток) в условиях цитостатической болезни, вызванной инъекцией алкилирующего агента, являлось следствием повышения функциональной активности прекурсоров грануломоноцитопоэза и прилипающих клеток ГИМ (образование ГО смешанного типа, секреция КСА). Уровень колониестимулирующей активности в сыворотке крови в опыте оказался статистически достоверно ниже по сравнению с цитостатическим контролем (5-8-е сутки). Эффект препарата на 4-8-е сутки после введения 5-фторурацила был связан с увеличением пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки грануломоноцитарных прекурсоров и концентрации КСА в кондиционных средах клеток неадгезирующей фракции кроветворного микроокружения и в сыворотке крови. На 12-14-е сутки опыта активация процессов регенерации находилась в прямой зависимости от межклеточных контактов и всплеска секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов.

В целом, результаты представленных исследований свидетельствуют о том, что рекормон, таблетированный эритропоэтин, поэтам, экстракт шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовая кислота стимулируют подавленный циклофосфаном и 5-фторурацилом гранулоцитарный росток кроветворения. При этом гемостимуляторы действуют на белую кровь в основном опосредованно - через изменения активности ГИМ. Следует отметить, что эффективность лекарственных средств в отношении эритропоэза несопоставимо выше, чем в отношении гранулоцитопоэза.

В совокупности вышеприведенные данные легли в основу предложенных нами схем регуляторного влияния стимуляторов эритропоэза на кроветворную ткань при цитостатических воздействиях (рис. 8, 9).

Как было отмечено выше, рекормон и таблетированная форма эритропоэтина являются аналогом эндогенного эритропоэтина. Действие ЭП осуществляется благодаря специфическим рецепторам, локализованным на плазматической мембране эритропоэтинчувствительных клеток: БОЕ-Э, КОЕ-Э, проэритробластах и базофильных эритробластах [Павлов А.Д., 1997; Эпштейн О.И., Штарк М.Б., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д. и др., 2005]. В условиях введения алкилирующего агента применение в больших дозах препаратов на основе рекомбинантного человеческого ЭП приводит к закономерно быстрому преходящему накоплению числа КОЕ-Э в гемопоэтической ткани, вызванному повышением интенсивности пролиферации и созревания эритроидных прекурсоров. Одновременно повышается также содержание эритробластов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови. Однако указанные лекарственные средства способны стимулировать не только процессы в отделе коммитированных предшественников, но и увеличивают функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Об этом свидетельствуют как экспериментальные исследования с использованием лекарственных средств in vivo (формирование эритроидных ГО, продукция ЭПА), так и увеличение рекормоном in vitro фидерной активности обработанных цикло-фосфаном макрофагов в отношении интактных эритроидных прекурсоров. Причем, по нашим данным, при стимуляции периферических серотонинергических и в-адренергических структур эритропоэтин вызывает существенное ускорение формирования ассоциаций эритроидного типа.

Антитела к эритропоэтину в сверхмалых дозах стимулируют подавленный алкилирующим агентом костномозговой гемопоэз, увеличивая одновременно содержание ретикулоцитов и нейтрофилов в периферической крови (рис. 8). В основе активации регенерации эритроидного ростка кроветворения поэтамом лежит ускорение пролиферации и дифференцировки эритроидных клеток-предшественников вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения.

Гемостимулирующий эффект экстракта шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовой кислоты в условиях введения циклофосфана связан с опережающим восстановлением структурно-функциональной целостности костного мозга (рис. 8). Однако в основе усиленного роста гемопоэтических островков в кроветворной ткани при введении модификаторов биологических реакций и сиаловой кислоты в условиях применения алкилирующего агента лежат различные механизмы. С мембраностабилизирующим эффектом препаратов шлемника байкальского связаны оптимизация функций ЦНС (в том числе, системы дальноранговой регуляции кроветворения) и снижение повреждающего действия цитостатика на кроветворную ткань [Saija A., Scalese M., Lanza M. et al., 1995; Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M., 1998].

В свою очередь, N-ацетилнейраминовая кислота, в основном на уровне костномозговой ткани, способствует восстановлению межклеточных взаимодействий, обеспечению высокой концентрации гемопоэтических ростовых факторов (ЭПА) в экстрацеллюлярном матриксе ГИМ, а также активации митозов коммитированных предшественников эритропоэза (рис. 8).

Выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической болезни, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов кроветворного микроокружения (рис. 9).

ВЫВОДЫ

1. Особенности механизмов развития анемического синдрома в условиях цистостатических гемодепрессий обусловлены неодинаковой чувствительностью коммитированных клеток-предшественников эритропоэза и элементов кроветворного микроокружения к действию миелосупрессирующих препаратов. В основе развития депрессии эритроидного ростка кроветворения при введении циклофосфана лежит угнетение функциональной активности прекурсоров эритропоэза и межклеточных взаимодействий; 5-фторурацил вызывает нарушение формирования гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа и снижение продукции эритропоэтической активности адгезирующими миелокариоцитами. Карбоплатин и адриамицин снижают секреторную активность клеточных элементов ГИМ в сочетании с уменьшением концентрации эритропоэтина в сыворотке крови и ингибицией деления и созревания эритроидных предшественников.

2. Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, N-ацетилнейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид байкалин стимулируют подавленный цитостатиками эритроидный росток кроветворения. При моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом наиболее эффективными средствами являются N-ацетилнейраминовая кислота и рекормон, в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита - рекормон и препараты шлемника байкальского.

3. В основе ускорения рекормоном процессов регенерации эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях лежит активация деления и созревания коммитированных предшественников эритропоэза, при этом наблюдается увеличение функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения (формирование эритроидных гемопоэтических островков, рост уровня гемопоэтических ростовых факторов) при введении циклофосфана и возрастание продукции ЭПА миелокариоцитами при применении 5-фторурацила.

4. При курсовом введении таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина высокие темпы деления и созревания эритроидных прекурсоров и секреторная активность клеток кроветворного микроокружения выступают основными механизмами, определяющими ускоренное восстановление содержания эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови после назначения алкилирующего агента или фторпиримидинового антиметаболита.

5. Стимулирующий эффект поэтама при гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, во многом обусловлен восстановлением структурно-функциональной целостности костного мозга и увеличением уровня ЭПА в кондиционных средах костного мозга и сыворотке крови. В то же время, поэтам при введении 5-фторурацила активирует эритропоэз преимущественно за счет увеличения уровня эритропоэтической активности во фракции адгезирующих нуклеаров и сыворотки крови.

6. Стимуляция экстрактом шлемника байкальского процессов регенерации эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях связана с увеличением функциональной активности клеточных элементов ГИМ: при применении алкилирующего агента формируются гемопоэтические островки, преимущественно, эритроидного типа; в случае использования антиметаболита возрастает уровень гемопоэтических ростовых факторов в супернатантах миелокариоцитов.

7. При моделировании гемодепрессии циклофосфаном основной мишенью для N-ацетилнейраминовой кислоты выступают адгезирующие клетки кроветворного микроокружения (увеличивается содержание клеточных комплексов эритроидного типа и уровень эритропоэтической активности). В условиях введения 5-фторурацила наблюдается стимуляция пролиферативной активности эритроидных колониеобразующих единиц за счет возрастания уровня ЭПА в экстрацеллюлярном матриксе костномозговой ткани.

8. При миелосупрессии, вызванной карбоплатином или адриамицином, эритропоэзстимулирующее действие рекормона проявляется в сроки ингибиции эритроидного ростка, под влиянием поэтама активация эритрона развивается позднее (в период регенерации) и является более продолжительной.

9. Преинкубация адгезирующих миелокариоцитов с N-ацетилнейрамино-

вой кислотой, экстрактом шлемника байкальского или рекормоном существенно увеличивает фидерную активность макрофагов, подвергнутых прямому воздействию циклофосфана, в отношении интактных и обработанных эритропоэтином in vitro коммитированных предшественников эритропоэза. При этом более выраженный эффект отмечается в случае добавления в культуру костного мозга N-ацетилнейраминовой кислоты и рекормона.

10. Активация в-адренорецепторов (изадрин) или серотонинергических структур (серотонин) in vitro на адгезирующих клетках костного мозга восстанавливает нарушенную циклофосфаном способность стромальных элементов к связыванию интактных эритроидных прекурсоров. В этих условиях интенсивность эритроидного колониеобразования в случае предварительной обработки неадгезирующей фракции миелокариоцитов рекормоном значительно превосходит исходный уровень.