Роль оксида азота в механизме долговременной потенциации

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В МЕХАНИЗМЕ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ



Содержание

Список сокращений

Введение

1. Гиппокамп как ключевая структура в формировании памяти

1.1 Морфология и физиология гиппокампа

1.2 Долговременная синаптическая пластичность

1.2.1 Молекулярный механизм индукции долговременной потенциации

1.2.2 Молекулярный механизм поддержания ДВП

1.2.3 Транспорт АМРА-рецепторов во время ДВП

1.2.4 Участие оксида азота в механизме долговременной потенциации

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

2.2 Методика исследования

2.2.1 Экспериментальная установка

2.2.2 Регистрация клеток

3. Результаты и обсуждение

3.1 Результаты

3.1.1 Подбор внутриклеточного раствора

3.1.2 Основной эксперимент

3.2 Обсуждение результатов

Выводы

Заключение

Список литературы



Список сокращений

AMPAR - рецептор б-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты;

Arp2/3 - семисубъединичный белковый комплекс, играющий ключевую роль в регуляции актинового цитоскелета;

CaMKII - кальций/кальмодулин-зависимая киназа II

CREB - транскрипционный фактор, связывающийся с последовательностью CRE;

ERK - сигнальный путь MAPK;

GluN1 - субъединица NMDA-рецептора; GluN2B - субъединица NMDA-рецептора; GluR1/2 - субъединицы АМРА-рецептора; NMDA - N-метил-D-аспартат;

NOS - синтаза оксида азота;

NSF - N-этилмалеимид чувствительный белок;

PICK1 - белок, взаимодействующией с С киназой;

Scar/WAVE - супрессор циклического AMP рецептора;

TBS - протокол стимуляции тетанизацией синаптических входов ;

WASp - Белок синдрома Вискотта -- Олдрича; ВПСТ - вызванные постсинаптические токи; ГАМК - г-Аминомасляная кислота;

ДВП - долговременная потенциация;

ПК G - протеинкиназа G;

ПКА - протеинкиназа А;

рГЦ - растворимая гуанилатцикалаз;

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат;

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат.



Введение

Память -- одно из свойств нервной системы, заключающееся в способности какое-то время сохранять информацию о событиях внешнего мира и реакциях организма на эти события, а также многократно воспроизводить и изменять эту информацию (Каменская М. А, Каменский А. А., 2014). Память - это фундаментальный механизм, на котором основано практически все поведение животных, особенно организмов с наиболее развитой нервной системой. Именно поэтому память требует детального изучения, особенно на молекулярном и физиологическом уровнях.

В основе процессов научения и памяти целостного организма, проявляющихся на поведенческом уровне лежит свойство пластичности нейрона. Пластичность -- фундаментальное свойство клетки, которое проявляется в относительно устойчивых модификациях реакций нейрона и во внутриклеточных его преобразованиях, обеспечивающих изменение эффективности и направленности межнейронных связей. Одним из феноменов пластичности является долговременная потенциация (ДВП). Долговременная потенциация - это усиление синаптической передачи между двумя нейронами, сохраняющееся на протяжении длительного времени после воздействия на синаптический проводящий путь. ДВП впервые была открыта Терье Лёмо на гиппокампе кроликов в 1966 году в Осло, Норвегия (Terje Lшmo, 2003). Явлением ДВП сразу заинтересовались многие нейробиологии, поскольку оно было прекрасно воспроизводимо, специфично и поддавалось не только физиологическому, но и морфологическому, биохимическому и фармакологическому исследованию. С тех пор было разработано несколько успешных моделей ДВП, однако полностью механизм до сих пор не известен. Было обнаружено, что различные зоны мозга и типы синапсов образуют разные формы ДВП. Например, ДВП на коллатералях Шаффера гиппокампа NMDA-зависимая, а на мшистых волокнах этой же структуры - NMDA-независимая (Harris E., Cotman C., 1986). ДВП также является субъектом клинических исследований, например, в сфере исследований Болезни Альцгеймера и аддикций.

В СА1 поля гиппокампа долговременная потенциация требует активации различных протеинкиназ и протеинфосфатаз, что предполагает вовлеченность фосфопротеинов (Lee HK, 2006). Один из таких фосфопротеинов - это рецептор б-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изоксазолпропионовой кислоты (AMPAR). Показано, что АМРАR играют большую роль в молекулярном механизме ДВП, именно их встраивание в мембрану нейрона ответственно за длительность процесса. Существует 2 способа регуляции АМРА-рецепторов, относящихся к синаптической пластичности: первый основан на их встраивании в синаптическую мембрану, второй - на изменении фосфорилирования их субъединиц. Эти два механизма зависимы друг от друга, потому что транспорт АМРА-каналов происходит в том числе и за счет фосфорилирования (Lee HK, 2006; Lee HK, Huganir RL, 2008). В транспорте АМРАR участвует большое количество различных молекул, в том числе, оксид азота (NO). Эта молекула особенно интересна, так как ее роль пока что остается большой тайной для исследователей, а данные экспериментов, направленные на ее изучение, противоречат друг другу. гиппокамп потенциация оксид азот

Считается, что самый лучший способ изучения ДВП - с помощью электрофизиологических методик. Эти методики позволяют исследовать потенциацию как in vivo, так и in vitro. С помощью исследований in vivo можно наблюдать связь между поведением экспериментального животного и электрической активностью его головного мозга. Если же стоит задача исследовать механизм долговременной потенциации более детально - на уровне отдельных клеток или даже белков, то применяют методики in vitro. Особенно эффективна регистрация единичного нейрона методом пэтч-клэмп, так как с помощью данного метода есть возможность изучать отдельные каналы и проходящие через них токи.

В данной работе мы попытались немного приоткрыть завесу двуликости, которая покрывает оксид азота. Однако вместо этого результаты нашего исследования только добавили еще больше противоречий, касающихся его функций, потому что наши результаты не согласуются с некоторыми имеющимися данными о роли NO в транспорте АМРА- рецепторов. В нашем исследовании мы использовали метод пэтч-клэмп в режиме “целая клетка” на гиппокампе мозга крыс.

Актуальность, цель, задачи и гипотеза исследования

Актуальность исследования. Долговременная потенциация тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды и считается клеточным аналогом памяти. Исследования памяти и обучения - одни из самых важных на данный момент в нейробиологии. Хотя молекулярный механизм ДВП довольно детально описан, все же еще остается множество вопросов, связанных с участием той или иной молекулы в этом механизме. Одной из таких молекул является оксид азота.

Кроме того, в нашей работе мы рассматриваем механизм перестройки субъединиц АМРА - рецепторов во время ДВП и участие в нем оксида азота. Показано, что помимо механизмов памяти GluR1 и GluR2 субъединицы участвуют в различных патологиях: эпилепсия, ишемия и т.д. (Malkin SL et al., 2016; Han XJ et al, 2016).

Гипотеза. Блокада АМРА-рецепторов, не содержащих GluR2- субъединицу на фоне блокады синтеза NO вызовет падение амплитуды ДВП.

Задачи исследования.

1. С помощью метода пэтч-клэмп в режиме «целая клетка» индуцировать ДВП на пирамидном нейроне поля СА1 гиппокампа;

2. Заблокировать АМРА-рецепторы, не содержащие GluR2- субъединицу на 5-7 минуте после индукции ДВП;

3. Индуцировать ДВП после блокады синтеза NO в нейроне и заблокировать АМРА-рецепторы, не содержащие GluR2-субъединицу спустя 5-7 минут.

Цель исследования. Проверить действие блокады синтеза NO на долговременную потенциацию при заблокированных АМРА-рецепторах, не содержащих GluR2-субъединицу.



1. Гиппокамп как ключевая структура в формировании памяти

Обучение может быть охарактеризовано как механизм, с помощью которого усваивается новая информация о мире, а память - как механизм, с помощью которого эти знания сохраняются. Удобно разделять память на эксплицитную (осознанные воспоминания о людях, местах, вещах и тд) и имплицитную (к примеру, неосознанное воспроизведение моторных навыков). Эксплицитная память зависит от совместной работы височных долей мозга и таких диэнцефалических структур как гиппокамп, субикулум и энторинальная кора. Имплицитная память включает в себя простые ассоциативные и неассоциативные формы обучения и зависит от совместной работы мозжечка и базальных ганглий (Squire LR, 1992).

Хотя в механизмах обучения и памяти принимают участие несколько областей мозга, считается, что гиппокамп играет главную роль в их формировании, в частности, в формировании декларативной памяти (эпизодические и семантические воспоминания). Наблюдения Сковилла и Милнера (Scoville RM and Milner B, 1957) показали, что билатеральное удаление гиппокампа у пациента Н.М. в целях лечения эпилепсии вызвало антероградную амнезию, тем самым явно обозначив важную роль гиппокампа и височных долей мозга в памяти. С тех пор многие исследования на людях (Squire LR, Cohen NJ, and Zouzounis JA, 1984) и животных (Morris RG, Schenk F, Tweedie F, and Jarrard LE, 1990; Orr WB and Berger TW, 1985) закрепили существенный вывод этого исследования. Более того, в других исследованиях с помощью неинвазивных методов, таких как магнитная резонансная томография и позитронно-эмиссионная томография, было показано участие гиппокампа в задачах на обучение (Squire LR, 1992; Squire LR, Amaral DG, and Press GA, 1990).



1.1 Морфология и физиология гиппокампа

Гиппокамп располагается в медиальной части височной доли. Особое место в системе связей гиппокампа занимает участок новой коры в районе гиппокампа (так называемая энторинальная кора). Этот участок коры получает многочисленные афференты практически от всех областей неокортекса и других отделов головного мозга (миндалины, передних ядер таламуса и др.) и является основным источником афферентов к гиппокампу. Гиппокамп получает также входы от зрительной, обонятельной и слуховой систем. Самой крупной проводящей системой гиппокампа является свод, который связывает гиппокамп с гипоталамусом. Кроме этого, гиппокампы обоих полушарий связаны между собой комиссурой (plasterium). (Шульговский В. В., 2002)

По гистологическим критериям гиппокамп делится на ряд полей. Рамон- и-Кахаль делил гиппокамп на два отдела: regio superior (прилежит к subiculum) и regio inferior (прилежит к fimbria hippocampi). Эта классификация применяется преимущественно в нейрохимических исследованиях. Розе и И. Н. Филимонов делят гиппокамп на пять полей (hi--h5, начиная от subiculum). Наиболее часто употребляется деление гиппокампа, на четыре поля (CA1-- СА4), введенное Лоренте де Но (R. Lorente de No). Поле CA1(h1) в клин, исследованиях иногда называют сектором Зоммера, а остальные поля -- резистентным сектором. Правильность деления гиппокампа на поля по гистологическим критериям подтверждается различием афферентных и эфферентных связей, биохимических и физиологических характеристик и различной чувствительностью к ряду фармакологических веществ и патологических факторов. Так, в поле CA1 в первую очередь обнаруживаются патологические изменения при аноксии, а также при болезни Альцгеймера. Другие поля вместе с зубчатой фасцией дегенерируют при амавротической идиотии, хотя сектор Зоммера остается почти интактным.

Основным клеточным элементом гиппокампа являются крупные пирамидальные нейроны, тела которых образуют единый плотный слой.

Отростки этих клеток строго ориентированы перпендикулярно к продольной оси гиппокампа. Вследствие этого в гиппокампе четко выделяются следующие слои, соответствующие различным уровням ветвления их дендритной системы (а не расположению разных типов клеток, как в неокортексе):

· alveus, содержащий в основном миелинизированные аксоны пирамид (пирамидальных нейроцитов);

· stratum oriens, где находятся ветвящиеся базальные дендриты;

· stratum pyramidale, содержащий тела пирамидальных нейроцитов;

· stratum radiatum, где проходят неветвящиеся стволы апикальных дендритов;

· stratum moleculare lacunosum -- область претерминальных и терминальных ветвлений апикальных дендритов.

В regio inferior выделяется дополнительный слой -- stratum lucidum, где на проксимальных сегментах апикальных дендритов заканчиваются аксоны зубчатой фасции. Остальные афферентные волокна, входящие в гиппокампе, также заканчиваются на определенных уровнях дендритов пирамидных клеток, в результате чего синапсы одного происхождения концентрируются в узких зонах.

Прилежащая к гиппокампу зубчатая фасция у животных состоит из плотного слоя зернистых клеток. Их аксоны (мшистые волокна) заканчиваются гигантскими синапсами на пирамидальных клетках полей СА3--СА4, не выходя за пределы своей стороны. Таким образом, зубчатая фасция, к которой подходят афференты (в основном от энторинальной коры), является внутренней релейной структурой гиппокамповой формации. В зубчатой фасции выделяют 3 слоя: stratum moleculare, содержащий дендриты зерновидных нейроцитов; stratum granulosum, содержащий их тела, и stratum polymorphe, где находятся полиморфные клетки и проходят аксоны зерновидных клеток. (Виноградова О. С., 1975)

Аксоны пирамидальных нейронов гиппокампа выходят из него, образуя бахромку (fimbria hippocampi) и дорсальный свод (fornix dorsalis). В составе бахромки проходят комиссуральные волокна гиппокампа, образующие вентральную комиссуру гиппокампа (psalterium ventrale, commissura fornicis, commissura hippocampi, давидова лира). Эфферентные нисходящие волокна гиппокампа образуют компактный пучок -- посткомиссуральный свод (fornix postcommissuralis) и более диффузный прекомиссуральный свод (fornix precommissuralis). Составляющие их волокна частично переключаются в ядрах перегородки (septum, у человека -- septum pellucidum). Посткомиссуральный свод в основном заканчивается в медиальных ядрах сосцевидных, или мамиллярных, тел (corpora mamillaria). Последующие звенья этой системы [мамиллоталамический тракт -- передние ядра зрительного бугра (таламуса) -- поясной пучок -- поясная и энторинальная кора] образуют основной лимбический круг, или так наз. круг Пейпса. Остальные нисходящие волокна гиппокампа, частично переключаясь в латеральной преоптической области и латеральном гипоталамусе, идут к неспецифическим (ретикулярным) структурам среднего мозга. Афферентные связи к гиппокампу восходят от этих же отделов мозга гл. обр. в составе медиального переднемозгового пучка. Перед вступлением в гиппокамп большинство этих волокон переключается на медиальном ядре перегородки (nucleus medialis septi). Вторым источником афферентных связей является энторинальная область коры. (Виноградова О. С., 1975)

Повреждение гиппокампа приводит к характерным нарушениям памяти и способности к обучению. В 1887 г. русский психиатр С. С. Корсаков описал грубые расстройства памяти у больных алкоголизмом (синдром Корсакова). Посмертно у них были обнаружены дегенеративные повреждения гиппокампа. Нарушение памяти проявлялось в том, что больной помнил события отдаленного прошлого, в том числе детства, но не помнил о том, что произошло с ним несколько дней или даже минут тому назад. Например, он не мог запомнить своего лечащего врача: если врач выходил из палаты на 5 мин, больной его не узнавал при повторном посещении (Шульговский В. В., 2002).

Рис. 1 Анатомия гиппокампальной формации

A. На 3D реконструкции мозга крысы полученной Bock et al. (2006) при магнитно - резонансном in vivo исследовании показано расположение CA2-CA3 областей гиппокампа. Заднюю (каудальную) кромку CA3 области охватывает зубчатая фасция (рис. Б).

Б. Схема отделов гиппокампальной формации в целом (по Amaral, Witter, 1995). Области собственно гиппокампа (CA1-CA3); зубчатая фасция (DG); субикулум (S); энторинальная кора (EC); угловой пучок (ab - angular bundle); пресубикулум (PrS); парасубикулум (PaS); слой полиморфных клеток ЗФ или хилус (Po); слой гранулярных клеток ЗФ (g); молекулярный слой ЗФ (ml); слои нейронов энторинальной коры (I, II, III, IV, IV/V). Слои собственно гиппокампа: stratum alveus (sa); str. oriens (so) ; str. pyramidale (p); str. Lucidum (sl); str. radiatum (sr); str. lacunosum-moleculare В. Схема гиппокампа и ЗФ с расположением клеток и связей выполненная Рамон - и - Кахалом (Ramon y Cajal, 1911).



1.2 Долговременная синаптическая пластичность

Синаптическая пластичность заключается в изменении эффективности синаптической передачи в результате интенсивной ритмической стимуляции афферентнцых путей нейрона. В результате такая стимуляция может либо увеличивать (синаптическая сенситизация, фасилитация, потенциация), либо уменьшать (синаптическая депрессия) результирующие постсинаптические потенциалы (ПСП) в постсинаптическом нейроне.

По временному критерию изменение эффективности может быть кратковременным и долговременным. К кратковременным эффектам относят фасилитацию, усиление и кратковременную депрессию. Относительно мощный залп стимулов (тетанизация) вызывает более продолжительный эффект - посттетаническую потенциацию (десятки минут). Тетанизация (или другие подходящие для этого протоколы стимуляции) может вызывать и более длительное усиление ПСП в нейронах, называемое долговременной потенциацией (ДВП), или ослабление ПСП, называемое долговременной депрессией (ДВД), продолжающееся часы и даже дни.

По механизму такие изменения могут быть локализованы в пресинаптическом и постсинаптическом нейронах. Многообразие пресинаптических механизмов заключается, в конечном счете, в увеличении выброса медиатора из пресинаптического волокна. Постсинаптические механизмы приводят к увеличению чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору - сенситизации рецепторов - и увеличению числа рецепторов (Александров Ю.И., Анохин К.В, 2008).

Феномен ДВП заключается в продолжительном усилении постсинаптического ответа после тетанической активации (высокочастотная серия импульсов, 100 Гц, 50-100 стимулов) в ответ на стимуляцию входа, который до тетанизации вызывал слабый ответ. ДВП вызывается тремя способами: гомосинаптическая ДВП возникает в активированном синапсе как результат его собственной активации; гетеросинаптическая ДВП возникает в синапсе в результате активации другого синапса; разновидность гетеросинаптической ассоциативная ДВП возникает в синапсе в результате его одновременной активации с другим синапсом. Феномен ДВП впервые был обнаружен в пирамидных клетках гиппокампа и интенсивно исследуется как клеточный аналог памяти и обучения (Александров Ю.И., Анохин К.В, 2008).

Гетеросинаптическая ДВП в переживающих срезах гиппокампа представляет собой результат ассоциации возбуждения двух афферентных путей. В экспериментах пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа стимулируют через два пути (рис. 2). Первый путь - это «слабая» стимуляция коммисуральных входов, которая вызывает слабый ПСП. Второй путь - «сильная» стимуляция коллатералей Шаффера (входы от нейронов поля СА3), которая вызывает существенно больший ПСП (Александров Ю.И., Анохин К.В, 2008). Данный метод используется при регистрации ПСП с помощью экстраклеточной регистрации локальных потенциалов. Из-за сложной организации постсинаптических процессов, которые влияют на деполяризацию, многие исследователи предпочитают вызывать ДВП более простым способом с помощью метода пэтч-клэмп, используя так называемый «двойной протокол» (низкочастотная синаптическая стимуляция (100-2000 пульсов,1-2 Гц) на фоне деполяризации постсинаптического нейрона в режиме фиксации потенциала длительностью 1-3 минуты) (Huan-Xin Chen, Nikolai Otmakhov, John Lisman, 1999).



Рис 2 Схема эксперимента по регистрации гетеросинаптической ДВП

В нейрофизиологических внутриклеточных исследованиях синаптическое усиление измеряется как увеличение амплитуды вызванных постсинаптических потенциалов (ВПСП) или вызванных постсинаптических токов (ВПСТ) после стимуляции этого синаптического пути. Практически все внутриклеточные исследования ДВП были выполнены на срезах мозга (T.H. Brown et al., 1988). В экстраклеточных исследованиях измеряется амплитуда или наклон некоторых компонентов полевых потенциалов.

Считается, что при экстраклеточной регистрации in vivo ДВП может держаться неделями или даже месяцами (R. J. Racine and M. Dejonge, 1983). Максимальная продолжительность ДВП при регистрации in vitro обычно составляет от 15 до 60 минут в срезах мозга.

Существует несколько видов ДВП. Некоторые исследователи делят ДВП на декрементную и недекрементную (D. Johnston, W. F. Hopkins, R. Gray, 1988). Сравнительные исследования предположили, что, возможно, необходимо отделить ассоциативную ДВП от других форм (D. Johnston, W. F. Hopkins, R. Gray, 1988; T.H. Brown et al., 1988). Другой путь классификации ДВП базируется на типе рецепторов, задействованных в ее индукции. В нашей работе мы рассматривали NMDA-зависимую долговременную потенциацию.

1.2.1 Молекулярный механизм индукции долговременной потенциации

Полной картины происходящих во время индукции ДПВ явлений пока еще нет. Однако все исследователи согласны с тем, что увеличение концентрации кальция в постсинаптической клетке является важным фактором. В пирамидных клетках поля СА1 индукция происходит с участием кальция, входящего через глутаматные NMDA рецепторы. NMDA рецепторы образуют каналы для катионов с необычной характеристикой -- эти каналы заблокированы при нормальном потенциале покоя клетки. Канал блокирован ионами магния из экстраклеточного раствора, которые освобождают канал только при деполяризации участка мембраны с этими глутаматными рецепторами (Nowak L et al, 1984). Большая часть глутамат-чувствительных клеток экспрессирует NMDA и не-NMDA (АМРА) рецепторы в постсинаптической мембране (Takumi Y, 1999), которые активируются при выделении глутамата из пресинаптических терминалей.

NMDA рецепторы обладают относительно высокой кальциевой проводимостью, однако вход кальция зависит от величины деполяризации, которая должна быть достаточна для снятия магниевого блока в каналах. Именно этим можно объяснить то, что в эксперименте по активации ассоциативной ДВП стимуляция только одного (слабого) входа II не вызывала достаточной синаптической деполяризации для снятия магниевого блока и входа кальция. Однако когда эта стимуляция сопровождалась деполяризацией, вызванной активацией входа I, NMDA рецепторы оказались разблокированы, что привело к входу кальция и ДВП. Участие NMDA рецепторов подтверждено экспериментами, в которых антагонисты NMDA блокируют индукцию ДВП, но не мешают ДВП при применении после индукции (Collingridge GL, Kehl SJ and Mc-Clennan H, 1983).

Идея о том, что ДВП индуцируется увеличением концентрации кальция в постсинаптической мембране, поддержана двумя типами доказательств. Во- первых, было экспериментально показано увеличение концентрации внутриклеточного кальция во время стимуляции, при этом блокада увеличения градиента этого катиона внутриклеточно введенными буферами устраняет ДВП. Во-вторых, увеличение концентрации кальция в постсинаптической клетке благодаря извлечению его из других внутриклеточных источников приводит к длительному увеличению амплитуды. Таким образом, источник кальция не является существенным, поэтому в некоторых синапсах ДВП индуцируется входом кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы, тогда как в других -- высвобождением кальция из внутриклеточных депо (Yeckel MF, Kapur A and Johnston D, 1999; Malenka RC et al, 1988).

Увеличенная концентрация внутриклеточного кальция может активировать целый ряд внутриклеточных биохимических путей. Наиболее важны для индукции ДВП активация кальций/кальмодулин-зависимой киназы II (СаМКII) и цАМФ-зависимая протеинкиназы СаМКII обнаружена в больших количествах в постсинаптических уплотнениях шипиков дендритов, и внутриклеточная инъекция блокаторов СаМКII блокирует индукцию ДВП. Кроме того, индукция ДВП нарушена у мышей с генетическими нарушениями синтеза одной из субъединиц СаМKII. Блокада цАМФ-зависимой протеин- киназы также существенно уменьшает ДВП (Malenka RC et al, 1989; Malinow R, Schulman H and Tsien RW, 1989).

1.2.2 Молекулярный механизм поддержания ДВП

Открытие ДВП поставило вопрос о том, является ли наблюдаемое увеличение амплитуды синаптического потенциала результатом увеличенного выброса передатчика из пресинаптической терминали или изменения чувствительности постсинаптической мембраны. Привлекательным казалось предположение о том, что ДВП, так же как фасилитация, усиление и ПТП, отражает увеличение квантового состава синаптического ответа, что и было показано в первых экспериментах. В ряде экспериментов статистический анализ распределений амплитуд синаптических потенциалов показал увеличение среднего квантового содержания (Malinow R and Tsien RW, 1990; Bekkers JM and Stevens CF, 1990). Однако в других экспериментах были показаны противоположные результаты: увеличение ВПСП происходило благодаря изменению размера одного кванта, а не количества квантов в ответе (Reid CA and Clements JD, 1999).

Увеличение квантового содержания потенциированного ответа с одной стороны и увеличение размера кванта рассматриваются в настоящее время как указывающие на различные механизмы проявления ДВП: пресинаптический (выделяется больше квантов) и постсинаптический (больший ответ на каждый квант). Новые данные говорят в пользу того, что увеличение и квантового содержания, и числа квантов опосредованы изменениями в постсинаптической мембране.

Изменения в постсинаптической мембране включают в себя сложный метаболический каскад, который в результате приводит к увеличению АМРА- рецепторов. С использованием флюоресцентных красителей было показано встраивание новых меченых рецепторов в мембраны дендритных шипиков (Eric R. Kandel, 2001). Методами имунногистохимии показано, что синапсы, образованные коллатералями Шаффера и коммисуральными волокнами на нейронах СА1, содержат NMDA-рецепторы и только часть их содержит АМРА-рецепторы. ДВП приводит к встраиванию в мембрану вновь синтезированных АМРА-рецепторов (Medina JH, Izquierdo I.,1995).

ДВП можно разделить, как минимум, на две временные фазы: ранняя ДВП (1-3 часа после индукции) и продолжительная ДВП. Первые относительно кратковременные изменения синаптической пластичности происходят за счет активации Са2+-зависимых киназ и протеаз, которые обеспечивают фосфорилирование мембранных канальных белков и белков цитоскелета, ответственных за рециклизацию АМРА-рецепторов из цитоплазматического пула (Medina JH, Izquierdo I.,1995).

Показано, что СаМКII прямо активируется кальциевым входом в клетку через NMDA-каналы и далее предположительно фосфорилирует АМРА- рецепторы, регулируя их встраивание в мембрану постсинаптического нейрона. Другое свойство СаМКII, которое недавно было обнаружено (Okamoto et al., 2009; Hell, 2014) - это ее способность связываться с актином и регулировать актиновый цитоскелет.

Роль цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА) более сложная и зависит от паттернов и интенсивности электрической стимуляции, используемой для индукции ДВП (Nguyen and Woo, 2003). ПКА фосфорилирует большое количество субстратов не только в цитоплазме, но и в ядре. Это делает функцию ПКА в механизме долговременной потенциации и формировании памяти более сложной. ПКА может прямо фосфорилирует АМРА-рецепторы и модулирует их функции (Banke et al., 2000; Carvalho et al., 2000; Shen еt al., 2013). Это свойство может регулировать глутамаэргическую трансмиссию на ранних стадиях ДВП. Более того, СаМКII и ПКА могут обе фосфорилировать GluR1 субъединицу АМРАRs и, следовательно, транспорт АМРА-каналов. Также, ПКА опосредует активацию транскрипционного фактора CREB и содействует ядерной транслокации ERK (Nguyen and Woo, 2003). Показано, что этот путь лежит между экстраклеточной сигнализацией и синтезом новых белков, особенно АМРА-рецепторов, и таким образом участвует в поздней стадии ДВП. Другой путь, заслуживающий внимания - это способность ПКа фосфорилировать различные сайты GluN2B и GluN1 субъединиц NMDA-рецепторов, тем самым регулируя их кальциевую проницаемость (Lau et al., 2009). Наконец, необходимо заметить, что ПКА участвует в регуляции актиновых филаментов. Новые актиновые филаменты формируются из-за связывания комплекса Arp2/3 с рядом белков из семейства WASp/Scar/WAVE (Rogers et al., 2003).

Рис 3 Каскад ПКА

ПКА активируется различными сигналами, включая кальций, аденозиновые А2 рецепторы. Они могут фосфорилировать АМРА-рецепторы и регулировать их функции (1), фосфорилировать сигнальные каскады, приводящией к транскрипции и трансляции

(2). Могут фосфорилировать NMDA-рецепторы (3). Могут участвовать в регуляции актиновых филаментов (4).

1.2.3 Транспорт АМРА-рецепторов во время ДВП

AMPA рецепторы - это ионотропные рецепторы глутамата, которые могут состоять из субъединиц четырёх типов - GluR1/2/3/4. Первые 3 субъединицы распространены в гиппокампе, коре, базальных ганглиях, а 4-я - в этих структурах встречается редко, но зато она найдена в таламусе, мозжечке и спинном мозге (Nakagawa T., 2001). Что касается процентного содержания этих субъединиц, то на мембране синапса непотенциированных пирамидальных клеток гиппокампа мышей находится ~80% GluR1R2 и ~16% GluR2R3 гетеромеров (Lu et al, 2009).

Рис 4 Процентное содержание субъединиц АМРА-рецепторов на мембране синапса непотенциированных пирамидальных клеток гиппокампа мышей

GluR2 субъединица выполняет критическую роль в детерминации функций АМРА-рецепторов. Она определяет главных биофизических свойств нативного канала: кинетику рецептора, проводимость и кальциевую проницаемость (рис 5). Эта субъединица блокирует вход кальция в клетку, соответственно, АМРА-рецепторы в зависимости от наличия ее в своей структуре бывают кальций-проницаемыми и наоборот. Также это одна из наиболее крепко регулируемых субъединиц АМРА-рецепторов с несколькими регуляторными процессами на уровне генной экспрессии, редактировании РНК (John T.R, Isaac, Michael C. Ashby, Chris J. McBain, 2007).



John T.R., Isaac, Michael C. Ashby, Chris J. McBain, 2007

Рис 5 При наличии GluR2 субъединицы АМРА-рецептор не проницаем для кальция и имеет линейную вольтамперную характеристику

Субъединицы АМРА-рецепторов состоят из четырёх доменов (структурно-функциональных участков): внеклеточного N-концевого домена (англ. amino-terminal domain, ATD); внеклеточного домена, связывающего лиганды (англ. ligand-binding domain, LBD); трансмембранного домена (англ. transmembrane domain, TMD) и внутриклеточного С-концевого домена (англ. carboxyl-terminal domain, CTD). Тетрамеризация субъединиц происходит благодаря взаимодействию между лиганд-связывающими, трансмембранными и N-концевыми доменами соответствующих субъединиц (Kim KS; Yan D, Tomita S, 2010). Сборка рецепторов происходит в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, где особые механизмы обеспечивают правильное сворачивание субъединиц и их взаимное расположение. Показано, что внутри эндоплазматического ретикулума происходят изменения конформации рецепторов, связанные с их функциональной активностью: связыванием лиганда (глутамата), активацией, десенситизацией и другие; эти конформационные изменения способны влиять на процесс транспортировки рецепторов на наружную клеточную мембрану. Кроме того, значительную роль в олигомеризации рецепторов и их транспорте играют N-концевые домены их субъединиц (Ayalon G; Segev E, Elgavish S, and Stern-Bach Y, 2005). После окончательного формирования АМРА-рецепторы высвобождаются в цитоплазму.

Ранее считалось, что во время долговременной потенциации рецепторы, состоящие из субъединиц 1 и 2 заменяются на рецепторы, состоящие из 2 и 3 субъединиц. Эта схема основана на предположении, что все AMPA каналы содержат GluR2 субъединицу. Однако, примерно с 2004 года начали появляться работы, свидетельствующие о том, что внутриклеточный резервный пул нейронов содержит рецепторы без этой субъединицы, которые могут встраиваться в синапс под определенными условиями. И, действительно, дальнейшие исследования только подтвердили это предположение; была разработана новая схема транспорта AMPA рецепторов, согласно которой каналы, содержащие GluR2 встраиваются в постсинапс только спустя 15 минут ДВП. До этого на мембране экспрессируются кальций- проницаемые не содержащие GluR2 каналы (рис 3). К примеру, если добавить специфический блокатор этих каналов в первые 10-15 минут ДВП, то потенциация упадет практически до базовой линии. А если добавить его после этого времени, то никаких изменений не произойдет, что говорит о том, что после 20 й минуты LTP в мембране либо не остается GluR2-несодержащих рецепторов, либо они каким-то образом перестают участвовать в поддержании потенциации (Plant et al, 2006).



Plant et a

Рис 6 А. Если добавить блокатор Gl несодержащихм АМРА-рецепторов спустя 10 минут после индукции ДВП, то амплитуда потенциации упадет практически до базовой линии. Б. А если добавить его спустя 20 минут, то потенциация останется на прежнем уровне

1.2.4 Участие оксида азота в долговременной потенциации

Считается, что одной из ключевых фигур в молекулярном механизме долговременной потенциации является оксид азота. Более того, необходимость оксида азота в ассоциативном обучении и реконсолидации памяти прямо была показана в поведенческих экспериментах (Balaban PM, Roshchin M, Timoshenko AK, Gainutdinov KL, Bogodvid TK, Muranova LN, Zuzina AB, Korshunova TA., 2014; Korshunova TA, Balaban PM., 2014).Оксид азота - это бесцветный газ, растворимый в воде, в водной среде легко окисляется кислородом воздуха. Оксид азота - один из самых простых представителей веществ с нечетным количеством электронов, и его радикальный свойства обуславливают способность реагировать с различными соединениями и свободными радикалами. Оксид азота является внутри- и межклеточным вторичным мессенджером - аутокринным и паракринным соединением. Способность NO взаимодействовать с разнообразными веществами - тиолами, белками, сахарами, ионами металлов, гемами протеинов и т.д., локализованными в самых различных тканях и органеллах, предполагает наличие окида азота и (или) его комплексов в межклеточных жидкостях. Учитывая, что концентрация NO, необходимая для активации фермента растворимой гуанилатциклазы и повышения клеточного уровня циклического гуанозинмонофосфата весьма незначительна, можно полагать, что оксид азота и его комплексы непрерывно циркулируют в кровотоке, т.е. выполняют гуморальную функцию (Граник В.Г., Григорьев Н.Б., 2004).

Оксид азота образуется также в различных нейрональных клетках центральной и периферической нервной системы. Образование NO в организмах человека и животных основано на ферментативной трансформации гуанидинового фрагмента полузаменимой аминокислоты - L- аргинина под воздействием ферментов семейства цитохром - Р-450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (NOS) (Feelish M., 1991;Реутов Е.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С., 1998). К настоящему времени идентифицированы 3 определенные формы NOS (Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П., 2000; Ed. R.J. Gryglewsky, P., 2001). Это - конститутивная нейрональная изоформа (nNOS или NOS 1), обнаруженная в нервной ткани центральной и периферической нервной системы. Активность nNOS регулируется Ca2+ и кальмодулином (белковый мономер, который является межклеточным посредником переноса ионов кальция). Еще один конститутивный изофермент - eNOS или NOS III обнаружен в сосудистых эндотелиальных клетках.

И третий, Ca2+-независимый энзим (iNOS или NOS II) - индуцибельная форма, образующаяся в ответ на раздражение и экспрессия которой индуцируется, например, воспалением или бактериальной инфекцией.

Активация NOS в мозге протекает следующим образом (Альберт А., 1989): пресинаптическийй нейрон активируется нервным импульсом, в синаптическую щель высвобождается глутамат, который рецепторно связывается. В результате открывается кальциевый канал, Са2+ входит в клетку, образуя комплекс с белком - кальмодулином, который активирует nNOS, катализирующую образование оксида азота.

Растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) - это наиболее чувствительный рецептор NO (Roy, B., Halvey, E. J., and Garthwaite,J. 2008). В последние годы было собрано много информации о важности этой молекулы в процессах передачи эндогенного NO, в основном в пресинаптическом сайте (Garthwaite, J., 2010; Bartus, K., Pigott, B., and Garthwaite, J., 2013). Рецептор рГЦ имеет в своем составе гем-группу, который работает по принципу гем-группы гемоглобина, однако, когда она ассоциирована с белками рецепторами, она обладает существенным предпочтением NO, что позволяет ей находить оксид азота среди тысяч молекул О2 (Martin, E., Berka, V., Bogatenkova, E., Murad, F., and Tsai, A. L., 2006).

Механизм активации рГЦ NO сложный и включает в себя конформационые изменения посредством связывания с гем-сайтом, что влечет за собой увеличение конвертирования гуанозинтрифосфата (ГТФ) в циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) (Roy, B., Halvey, E. J., and Garthwaite, J. 2008). Вместе с образованием цГМФ в дальнейшем молекулярном пути образуется бифуркация; один путь - это путь, на котором цГМФ влияет на цГМФ-активируемые протеин киназы (цГМФ-зависимая киназы (цГК) и протеин киназа G (ПКG)) Второй путь - связывание цГМФ с агонистами или регуляторными сайтами циклических нуклеотид-зависимых ионных каналов.

Исследования последних двух десятилетий совершенно четко показали, что оксид азота действует на пресинапсе и механизм как он это делает (Feil, R., and Kleppisch, T., 2008). Большинство детальных доказательств участия NO в высвобождении нейромедиаторов было сделано из исследований глутаматэргической и ГАМКэргической систем (Li, D. P., Chen, S. R., and Pan, L., 2002; Kawaguchi, Y., Aosaki, T., and Kubota, Y., 1997). На пресинаптическом сайте оксид азота может действовать 4 разными способами:

1. Воздействуя на активную зону образованием нитрозотиолов. Например, продукция нитрозотиолов в синтаксине имеет фасилитирующий эффект на высвобождении нейротрансмиттеров, потому что это предотвращает связывание белка munc18 с ближайшей конформацией синтаксина 1а. Это позволяет синтаксину 1а изменять свою конформацию и далее выполнять свою важную функцию в экзоцитозе везикул Meffert, M. K., Calakos, N. C., Scheller, R. H., and Schulman, H., 1996);

2. Участие в везикулярном транспорте посредством активации цГМФ-зависимых протеинкиназ;

3. Влияние на скорость высвобождения везикул из пула готовых к высвобождению везикул. Например, активация N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторов ведет к активация NO и кальцинерина, которые взаимодействуют между собой в целях увеличения количества доступных везикул (Ratnayaka, A., Marra, V., Bush, D., Burden, J. J., Branco, T., and Staras, K., 2012);

4. Влияние на рост и формирование новых персинаптических терминалей (Wang, H. G., Lu, F. M., Jin, I., Udo, H., Kandel, E. R., De Vente, J., et al., 2005).

Что касается синаптической пластичности, то еще в самых ранних исследованиях путем добавления антагонистов NO была обнаружена необходимость этой молекулы в формировании ДВП (Bohme, G. A., Bon, C., Stutzmann, J. M., Doble, A., and Blanchard, J. C., 1991; O'Dell, T. J., Hawkins, R. D., Kandel, E. R., and Arancio, O., 1991). Причем электрофизиологические данные свидетельствуют о том, что оксид азота действует как на пре-, так и на постсинапс в механизме долговременной потенциации. В постсинаптическом окончании оксид азота участвует в транспорте АМРА-рецепторов, а именно в перестройке субъединиц этого белка во время ДВП.

На это счет у исследователей есть доминирующая пока что точка зрения, которая приписывает оксиду азота участие во встраивании GluR2-содержащих АМРА рецепторов в мембрану постсинаптического нейрона. Согласно ей, оксид азота S-нитрозилирует NSF, тем самым способствуя связыванию этой молекулы с GluR2-субъединицей и встраиванию соответствующих каналов в мембрану, что было продемонстрировано в статье Huang Y(Huang Y, Man HY, Sekine-Aizawa Y, Han Y, Juluri K, Luo H, Cheah J, Lowenstein C, Huganir RL, Snyder SH, 2005). Через 2 года американские нейробиологии, исследуя фосфорилирование NMDA-рецепторов во время ДВП, подтвердили этот факт (Gerald A. et al, 2007). В этом же году вышла статья, уточняющая этот механизм: NSF не просто связывается с GluR2-AMPA, он способствует распаду кластера белка PICK1, который удерживает рецептор под мембраной и далее уже помогает ему встроиться (Sossa et al, 2007). Еще год спустя Phillips et al. опубликовал исследование, в котором смог вызвать долговременную потенциацию у кнокаутных по GluR1 мышей, но она пропадала, если блокировать работу NO-синтазы (Phillips et al., 2008). Потенциацию удалось вызвать только с помощью протокола TBS с удвоенной длительностью пульса. Аппликация L-NNA на срезы мозга GluR1-/- - NOS-1-/- и GluR1-/- - NOS-3-/- мышей снижало долговременную потенциацию, что говорит о том, что оксид азота критически важен для потенциации с участием GluR2-содержащих АМРА рецепторов.

Помимо этого, существуют данные, которые свидетельствуют о том, что NO необходим для экспрессии субъединицы GluR1. Например, в 2007 году в Neuron была опубликована статья, в которой демонстрируется, что оксид азота ответственен за активацию цГМФ-зависимой киназы II (через активацию растворимой гуанилатциклазы), которая фосфорилирует S845 субъединицы GluR1 и повышает ее количество на плазматической мембране (Ziff et al, 2007). Кроме того, 8 лет спустя исследователи из Гонг-Конга показали, что оксид азота вызывает зависимый от протеасом распад белка р35 (через нитрозилирование этого белка с последующей деградацией), который, в свою очередь, снижает количество GluR1 на поверхности клеток. Это значит, что в норме оксид азота вызывает деградацию этого белка, и тогда GluR1 встраивается в синапс. Когда оксид азота заблокирован, этот белок не разрушается и уменьшает количество GluR1 на мембране (Zhang P, Fu WY, Fu AK, Ip NY, 2015). Таким образом, вероятно, оксид азота участвует в транспорте обеих субъединиц.



2. Материалы и методы исследования

Чтобы проверить роль оксида азота в перестройке субъединиц АМРА- рецепторов мы индуцировали ДВП на фоне добавления в перфузионный раствор блокатора синтазы оксида азота, заблокировав при этом GluR2- несодержащие АМРА-рецепторы.

2.1 Материалы исследования

Исследование проводилось на переживающих срезах головного мозга (толщиной 300 мм) крыс линии Wistar возрастом от 14 до 18 дней.

В исследовании были использованы следующие вещества и растворы:

1. Блокатор синтазы оксида азота NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) в концентрации 100мМ в перфузионном растворе;

2. Антагонист GluR2-не содержащих АМРА-рецепторов Philantotoxin- 74 (PhTx-74) в концентрации 10мМ;

3. Антагонист ГАМК-рецепторов picrotoxin в концентрации 50мМ;

4. Раствор в камере для срезов содержал (в мМ): NaCl, 124; NaHCO3, 26; Glucose, 25; KCl, 3; NaH2PO4, 1.4; CaCl2, 4; MgCl2, 4 с постоянным насыщением карбогеном 95% О2 и 5% СО2.

5. Внутриклеточный раствор с Cs+ в роли главного катиона содержал (в мМ): Cs-gluconate, 110; CsCl, 30; HEPES, 10; NaCl, 8; MgATP, 4; Na2GTP, 0.3; phosphocreatine, 10; spermine, 0.01 (pH 7.3 с CsOH).

6. Внутриклеточный раствор с К+ в роли главного катиона содержал (в мМ): K-gluconate, 132; KCl, 20; MgATP, 4; Na2GTP, 0.3; Na-phosphocreatine, 10; HEPES, 10; spermine, 0.01; pH 7.2. 2.

Дополнительные материалы исследования:

· Инкубационная камера для срезов;

· Набор инструментов для изъятия головного мозга экспериментальных животных;

· Вибратом LEICA VT 1200S;

· Автоматические пипетки Pipetman объемом 1-10мл, 10-100мл и 100-1000мл;

· Пуллер микропипеток Флеминга-Брауна Р-97;

· Пэтч-пипетки с сопротивлением 4-7МЩ;

· Установка для регистрации методом пэтч-клэмп;

· Программа для усилителя Clampex 9.2;

· Программа для обработки электрофизиологических записей Clampfit;

· Многоканальный перистальтический насос Minipuls 3;

· Водяная баня WB-4MS.

· Термоконтроллер Temperaturcontroller III, Luigs and Neumann, Germany;

· Усилитель Axoclamp-2B, Axon Instruments, Union City, CA, USA

Полученные результаты были обработаны с помощью программ Clampfit, Origin Pro, и Excel. Статистическая обработка данных проводилась в программе SigmaPlot методом U-критерия Манна-Уитни.

2.2 Методика исследования

Исследование условно можно поделить на 2 части: подготовка материалов (переживающих срезов) и экспериментальная часть.

Для приготовления переживающих срезов гиппокампа готовится искусственная спинномозговая жидкость (ACSF) с концентрацией Ca2+ 1 мМ и часть раствора (250 мл) помещается в морозильную камеру на ~20 минут. Инкубационная камера для срезов, погруженная в ACSF помещается в водяную баню, нагретую до 30єС на все время порезки. Спустя 20 минут сосуд с охлажденным раствором погружается в лед и пробулькивается 95% О2 и 5% СО2. После декапитации экспериментального животного производятся горизонтальные срезы изъятого головного мозга на вибратоме. Полученные срезы помещаются в инкубационную камеру, охлажденную до комнатной температуры, на 40-60 минут.

После инкубации срез помещается в экспериментальную камеру установки, омываемую внеклеточным раствором и нагретую до 34єС. Емкость с внеклеточным раствором помещается в водяную баню, нагретую до 34єС. Внеклеточный раствор насыщается карбогеном (95% О2 и 5% СО2) на протяжении всего эксперимента.

2.2.1 Экспериментальная установка

Для избежания механических колебаний, механическая часть (камера для регистрации, микроманипуляторы, микроскоп, проток перфузионного раствора) размещались на антивибрационном столе. Сам стол был помещен внутрь металлической коробки, которая служила экраном от электрических наводок. Параметры регистрации и стимуляции задавались с помощью компьютера. От компьютера через АЦП, командный сигнал подавался на стимуляторы и далее на стимулирующие электроды. От регистрирующего электрода сигнал подавался на вход усилителя (Axopatch-1D или Axoclamp- 2B, Axon Instruments, Union City, CA, USA) и затем через АЦП, записывался в компьютер. Регистрируемый сигнал выводился на монитор компьютера. Для подведения электродов использовались микроманипуляторы позволяющие перемещать электроды в трех плоскостях. В ходе эксперимента регистрировали разность потенциалов или протекающий ток между регистрирующим и индифферентным электродами. В качестве индифферентного электрода использовалась хлорированная серебряная проволока, опущенная непосредственно в камеру для регистрации.

При пэтч регистрации использовался метод погруженных срезов. Камера для регистрации представляла собой открытую сверху пластиковую емкость, имеющую входное и выходное отверстия и рабочий резервуар. Легкое прижатие среза стимулирующим электродом к дну камеры было достаточно для его фиксации. Температура поддерживалась с помощью термостата (Temperaturcontroller III, Luigs and Neumann, Germany).

Рис 8Схема экспериментальной установки для пэтч-клэмпа

Манипулятор с регистрирующим электродом

Манипулятор со стимулирующим электродом

2.2.2 Регистрация клеток

Чтобы избежать влияния тормозящих проекций интернейронов, во внеклеточный раствор до помещения среза в камеру добавляется антагонист ГАМК-рецепторов Picrotoxin в концентрации 50 мМ. Далее, с помощью микроскопа, установленного над предметным столиком установки с камерой со срезом, необходимо найти подходящий пирамидальный нейрон в поле СА1 гиппокампа. Над нейроном устанавливаются 2 стимулирующих электрода (экспериментальный и контрольный) на расстоянии ~50мм и ~200мм от клетки (рис 9). Второй стимулирующий электрод помечен на рисунке как «контрольный путь» и необходим для стимуляции контрольного входа.

Рис. 9 Схема установки стимулирующих и регистрирующего электродов

В раствор, заполняющий микропипетку, была погружена хлорированная серебряная проволока, которая соединялась с входной головкой усилителя. Пэтч осуществляли под визуальным контролем с помощью микроскопа в режиме фиксации потенциала (0 мВ). В микропипетке создавали небольшое повышенное давление, так чтобы раствор постоянно вытекал через отверстие на кончике, благодаря чему он оставался чистым. Через усилитель на микропипетку подавали контрольную ступеньку потенциала (1-10 мВ, длительностью 100 мс, с интервалом 200 мс). По величине ответа на контрольную ступеньку определялось сопротивление микропипетки. При приближении к соме нейрона убирали давление в микропипетке. В случае образования плотного контакта (гигасил, сопротивление на границе присасывания более гигаома, практически элиминируется электрическое шунтирование) между кончиком микропипетки и мембраной нейрона возрастало видимое сопротивление микропипетки. Получившаяся таким образом конфигурация носит название cell attached. В этой конфигурации с помощью усилителя компенсировали емкость микропипетки. Затем потенциал микропипетки фиксировали на значении -60 мВ. Далее в микропипетке на доли секунды создавали отрицательное давление и разрушали фрагмент мембраны под кончиком микропипетки (рвали внутрь). В случае удачного проникновения ответ клетки на контрольную ступеньку потенциала начинал соответствовать току перезарядки емкости клеточной мембраны. Неизменность формы ответа на контрольную ступеньку на протяжении всей записи свидетельствовала о хорошем качестве пэтча.



Рис. 10 А. Схема конфигурации cell-attached. Б. Фотография регистрирующей пипетки, припэтченной к пирамидному нейрону

Для индукции ДВП мы использовали «двойной» протокол: низкочастотная синаптическая стимуляция (120 пульсов, 1.5 Гц) на фоне деполяризации в режиме voltage-clamp длительностью 3 минуты. Перед потенциацией мы записывали примерно 50 базовых стимулов, после потенциации регистрация производилась на протяжении 50 минут.

...