Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Экспериментально-теоретическое обоснование создания лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Фетисова Анжелика Николаевна

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава.

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, доктор педагогических наук, действительный член РАО, профессор Попков Владимир Андреевич.

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Белобородов Владимир Леонидович,

доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семенович,

доктор фармацевтических наук, профессор Даргаева Тамара Дарижаповна.

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора" (ФГУ НЦ ЭСМП).

Защита состоится "___" _____________ 2009 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан "___" ______________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор Садчикова Наталья Петровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Критический анализ медико-социальной проблемы лекарственной полипрогмазии указывает на целесообразность углубления теоретических и эмпирических знаний в области разработки лекарственных средств природного происхождения, обладающих сочетанным фармакологическим действием за счет содержания комплекса биологически активных веществ (БАВ). В контексте проблемы актуальным представляется проведение изысканий по созданию лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.

Перспективным технологическим способом получения липофильных фракций природного происхождения, обладающих указанным комбинированным фармакологическим действием, является экстракция сверхкритическими флюидами (СКФ), в частности, сверхкритическим диоксидом углерода. Разработки по экстракции липофильных фракций из растительного сырья диоксидом углерода в сверхкритических условиях имеют отечественный приоритет и находят широкое применение в пищевой отрасли промышленности с 60-х гг. XX века. С 90-х гг. XX века по настоящее время отмечается возрастание практического интереса фармацевтической отрасли к созданию лечебно-профилактических средств на основе липофильных фракций, извлекаемых из растительного сырья сверхкритическим диоксидом углерода. Данные изыскания имеют локальный характер и в целом направлены на разработку биологически активных добавок (БАД).

Системный анализ научных информационных источников показывает, что в контексте решения проблемы лекарственной полипрогмазии и ятрогенной патологии актуальным направлением также является изыскание средств и способов получения из отечественных видов лекарственного растительного сырья (ЛРС) и пищевых растительных источников фармакологически активных конституентов для производства мягких лекарственных форм (суппозиториев и мазей).

Однако современная тенденция роста производства, распространения, использования низкокачественных и фальсифицированных лекарственных препаратов и БАД природного происхождения, в частности изготовленных на основе масличного растительного сырья, определяет несовершенство существующих подходов к процессу их разработки, стандартизации и валидации производства. Увеличение доли фальсифицированных лекарственных средств представляет значимую медико-социальную проблему, связанную с угрозой здоровью населения страны и оборачивающейся многомиллионными убытками для государственной казны и частных производителей. В соответствии с разработанным ВОЗ "Планом действий по борьбе с фальсифицированными лекарственными средствами" определение показателей состава и качества (ПСК) лекарственных средств является одной из основных составляющих процесса выявления фальсифицированной и низкокачественной продукции среди препаратов и БАД, изготовленных из масличного ЛРС.

Вышеуказанная проблематика обусловливает необходимость проведения комплексных изысканий, базирующихся на постулатах фармацевтической и медицинской науки и направленных на формирование единообразных подходов к разработке, стандартизации и валидации производства лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, обладающих сочетанным фармакологическим действием. Направление исследований предусматривает сопоставительный априорный и апостериорный анализ особенностей производства, характеристик показателей состава и качества липофильных фракций растительного сырья, извлекаемых с использованием различных по химической природе экстрагентов; формирование экспериментально-теоретической базы и синтез аутентичной системы, позволяющей создавать качественные лечебно-профилактические средства на основе липофильных фракций растительного сырья, обладающих сочетанной фармакологической активностью.

Целью исследования является создание аутентичной системы разработки и спецификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.

Сформулированная цель исследования обусловила постановку следующих задач исследования:

1. Провести сопоставительный анализ показателей состава и качества липофильных фракций, полученных из различных видов растительного сырья экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями, и обосновать критерии спецификаций для контроля качества СО2-экстрактов, как новых лекарственных средств растительного происхождения, содержащих комплекс биологически активных веществ, обладающих сочетанной фармакологической активностью.

2. Разработать способ получения фармакологически активных конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм из отечественного сырья.

3. Обосновать концептуальные подходы обнаружения недоброкачественной продукции и потенциальных фальсификаций среди препаратов и биологически активных добавок, изготовленных из масличного растительного сырья.

4. Разработать эмпирическую расчетную методику скрининговой оценки доброкачественности объектов растительного происхождения, характеризующихся неспецифичным составом биологически активных веществ, в частности ацилглицеринов жирных кислот.

5. На основании результатов теоретических и эмпирических изысканий сформировать аутентичную систему разработки и спецификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ММА им. И.М. Сеченова и является составной частью комплексной программы НИР кафедры общей химии "Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)" (номер Государственной регистрации 01.200.118.796).

Научная новизна. Впервые проведено теоретическое обобщение и обоснование априорной информации, касающейся процесса получения липофильных фракций из ЛРС экстракцией жидким оксидом углерода (IV) и перспектив использования СО ₂-экстрактов ЛРС для производства лечебно-профилактических лекарственных средств, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью. Апостериорные сопоставительные экспериментальные исследования липофильных фракций, полученных из 7 родов растительного сырья экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, позволили, с учетом требований Государственных стандартов качества лекарственных средств (ГСКЛС), разработать аутентичную систему спецификаций для контроля качества СО ₂-экстрактов, как новых лекарственных средств природного происхождения. Впервые доказана бактериостатическая и фунгистатическая активность СО ₂-экстрактов семян винограда культурного (Vitis vinifera L.), жома плодов смородины черной (Ribes nigrum L.), а также СО ₂-экстракта шрота семян тыквы в отношении Staphylococcus aureus и Candida albicans. Также впервые выявлена фунгистатическая активность СО ₂-экстрактов плодов кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.) и травы полыни горькой (Artemisia absinthium L.) в отношении наиболее распространенных поверхностных дерматофитов, а именно Microsporum canis и Trichophyton rubrum.

Разработан способ получения конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм из отечественных видов растительного сырья. Способ основан на использовании ЛРС, произрастающего на территории Российской Федерации, и экстрагента (гексана), широко применяемого в фармацевтическом и пищевом производстве. Оригинальная технологическая схема позволяет упростить процесс извлечения твердой липофильной фракции (ТЛФ) из плодов растений семейства Сельдерейные, увеличить в ней содержание сбалансированного комплекса БАВ, обладающих антиоксидантным и противовоспалительным действием (каротиноидов, токоферолов, фосфолипидов), обеспечивает получение стабильного целевого продукта. Предложенный способ предусматривает рациональное применение отечественных сырьевых запасов лекарственных растений и позволяет провести замены импортных конституентов для производства мягких лекарственных форм.

Впервые обоснованы принципиальные подходы и разработаны критерии для обнаружения недоброкачественной продукции и потенциальных фальсификаций среди препаратов и биологически активных добавок, изготовленных из масличного растительного сырья, характеризующегося неспецифичным составом биологически активных веществ. Для скрининговой оценки потенциальных фальсификаций и выявления недоброкачественной продукции среди указанной группы лекарственных средств разработана методика расчета состава жирных кислот и глицеринов на основании значений эмпирических показателей состава и качества.

Экспериментально-теоретические исследования формируют основу аутентичной системы создания и стандартизации лекарственных средств растительного происхождения на основе липофильных фракций, обладающих сочетанной фармакологической активностью. Аутентичная система показателей состава и качества включает спецификации и общедоступные сертифицированные методы и позволяет достоверно обнаруживать потенциальные фальсификации или несоответствия требованиям, предъявляемым Государственными стандартами качества к оценке и валидации технологии производства лекарственных средств природного происхождения.

Степень новизны проведенных исследований подтверждена шестью патентами РФ.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования. В результате проведенных изысканий сформирована экспериментально-теоретическая база для создания лечебно-профилактических лекарственных средств природного происхождения, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.

Разработанная аутентичная система спецификаций для контроля качества лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, позволяет объективно установить подлинность изученных объектов и обнаружить потенциальные фальсификации или несоответствия требованиям, предъявляемым Государственными стандартами качества к лекарственным средствам, получаемым из растительного сырья. Предварительные результаты доклинических испытаний являются основой для достоверного выявления, оценки и доказательства прогнозируемой терапевтической активности в ходе отдаленных клинических исследований лекарственных препаратов на основе СО 2-экстрактов растительного сырья.

Результаты исследования положены в основу инновационной разработки и инновационного бизнес-предложения: "Лекарственные средства на основе липофильных фракций лекарственного растительного сырья для профилактики и лечения воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы: технология создания и перспективы применения". Данный инновационный проект был представлен в финале конкурсной программы инновационных проектов "Фабрика инноваций: прорыв в будущее", проводившейся в рамках V Московского Международного Салона инноваций и инвестиций (15-18 февраля 2005 г.), и награжден Дипломом Федеральной Службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

Разработанная автором методика расчета состава жирных кислот и глицеринов объектов природного происхождения внедрена в учебный процесс на химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова и используется при изучении разделов, связанных с анализом подлинности и доброкачественности объектов липофильной природы. Указанная методика также внедрена в ГОУ ВПО РУДН (медицинский факультет, кафедра общей фармацевтической и биомедицинской технологии) при изучении модулей, включающих принципы валидации технологии производства и качества препаратов, изготовленных на основе липофильных фракций растений.

По результатам исследования в рамках реализации "Программы формирования инновационного образовательного пространства ММА им. И.М. Сеченова" (приоритетный национальный проект "Образование") автором выполнен проект "Разработка учебно-методического пособия курса дистанционного обучения "Технологии получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья природного происхождения" (тема № 138, приказ № Р-98 от 27 марта 2007 г.) и создан одноименный учебник, являющийся основой учебно-методического обеспечения курса дистанционного обучения для повышения квалификации и переподготовки специалистов, работающих на фармацевтическом производстве и в аптечной сети, имеющей рецептурно-производственные отделы. Учебник "Технологии получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья природного происхождения (курс дистанционного обучения)" рекомендован Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России для системы послевузовского профессионального образования провизоров (УМО-51-Д 12 февраля 2008 г.). Курс дистанционного обучения "Технологии получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья природного происхождения" внедрен в ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, факультет послевузовского профессионального образования провизоров, кафедра фармации с курсом социальной фармации и в ГОУ Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА) России, кафедра фармации.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены для обсуждения на следующих конференциях, съездах, конгрессах: III, IX-XI, XV и XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996; Москва, 2002-2004; Москва, 2008; Москва 2009); 51-ой региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров ПГФА (Пятигорск, 1996); научно-практической конференции, посвященной 50-тилетию Ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 1996); юбилейной конференции "Актуальные вопросы фитотерапии" РОО "Фитотерапевтическое общество" (Москва, 2002); I и II научно-практических конференциях Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН "Традиционные методы лечения в акушерско-гинекологической практике" (Москва, 2001; Москва, 2003); 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии ПГФА "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Восстановительная медицина и традиционные методы профилактики и лечения в акушерстве, гинекологии и перинатологии" (Волгоград, 2004); III-IX Международных съездах "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999; Великий Новгород, 2000; Санкт-Петербург, 2001; Санкт-Петербург, 2002; Санкт-Петербург-Пушкин, 2003; Миккели (Финляндия), 2004; Санкт-Петербург, 2005); Республиканской научно-практической конференции "Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Р.Л. Хазанович (Ташкент, 2006); VIII Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации" (Москва, 2007); научно-практической конференции "Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации" (Ташкент, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, в том числе монография, учебник для системы послевузовского профессионального образования провизоров, созданный в рамках программы формирования инновационного образовательного пространства ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (Приоритетный национальный проект "Образование"), 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 6 патентов на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту:

· Результаты исследования липофильных фракций растительного сырья, полученных экстракцией жидким оксидом углерода (IV). Разработка аутентичной системы спецификаций для контроля качества лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.

· Технологические основы получения фармакологически активных конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм.

· Концепция обнаружения потенциальных фальсификаций и недоброкачественной продукции среди лекарственных средств, изготовленных из масличного растительного сырья.

· Методика эмпирического расчета состава жирных кислот и глицеринов объектов растительного происхождения и руководство по ее использованию для скрининговой оценки доброкачественности растительного сырья, лекарственных средств, БАД липофильной природы, имеющих неспецифичный состав БАВ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава I), 5 глав собственных исследований, выводов, глоссария, библиографического указателя и приложений. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 18 рисунками. Библиографический указатель включает 250 источников, в том числе 106 на иностранных языках.

В обзоре литературы представлен критический анализ традиционных способов и современных технологий получения липофильных фракций из сырья природного происхождения; рассмотрены теоретические основы извлечения БАВ из растительного сырья сжиженными и сжатыми газами; изложены современные подходы к процессу разработки, стандартизации и валидации производства лекарственных средств растительного происхождения. Во второй главе обоснован выбор объектов исследования, представлена их характеристика, описание технологии получения липофильных фракций из растительного сырья экстракцией жидким оксидом углерода (IV) в сверхкритических условиях. Представлен анализ технологических особенностей извлечения липофильных фракций из плодов растений семейства Сельдерейные неполярными органическими растворителями по предложенному нами способу (А.Н. Фетисова с соавт., патент РФ 2147890, 2000). Вторая глава также содержит детальное описание методик анализа, использованных в настоящем исследовании, принципов статистической обработки и интерпретации полученных результатов. Третья глава включает исследование липофильных фракций растительного сырья, полученных экстракцией жидким оксидом углерода (IV); разработку аутентичной системы спецификаций для контроля их качества и результаты экспериментального доклинического изучения. Четвертая глава посвящена изысканию средств и способов получения конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм. В пятой главе обоснованы принципиальные подходы к обнаружению потенциальных фальсификаций и недоброкачественной продукции среди лекарственных средств, изготовленных из масличного растительного сырья; изложена методика расчета состава жирных кислот и глицеринов и руководство по ее использованию в оценке качества лекарственных средств растительного происхождения, имеющих неспецифичный состав БАВ. Шестая глава включает патогенетическое обоснование целесообразности применения лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, обладающих сочетанной фармакологической активностью, в комплексе лечебно-профилактических мероприятий при социально значимых заболеваниях человека.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В соответствии с целью исследования предварительные этапы разработки лекарственных средств на основе липофильных фракций ЛРС, обладающих сочетанным противовоспалительным и антиоксидантным действием, бактерио- и фунгистатической активностью, включали скрининг источников липофильных фракций, а также выбор экстрагента и, соответственно, способа получения липофильной фракции из ЛРС.

Скрининг видов ЛРС (источников липофильных фракций) проводился по содержанию БАВ, которые должны сочетать противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью. Для получения препарата с низкой себестоимостью необходимо наличие достаточной сырьевой базы, т.е. в качестве источников липофильных фракций целесообразно использовать виды ЛРС, имеющие либо обширный ареал произрастания, либо широко культивируемые или являющиеся отходами пищевых производств.

Экспериментально-теоретическое обоснование единообразных подходов к процессу создания лекарственных средств на основе липофильных фракций ЛРС, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, проведено в настоящей работе на примере видов растительного сырья, относящегося к разным семействам и морфологическим группам. Объектами для создания аутентичной системы разработки и спецификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, явились официальные виды ЛРС и пищевые растительные источники, являющиеся отходами соответствующих производств: плоды кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.), облепихи крушиновидной (Hippophaё rhamnoides L.), трава полыни горькой (Artemisia absinthium L.), семена винограда культурного (Vitis vinifera L.), жом плодов смородины черной (Ribes nigrum L.), шрот семян тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo L.), тыквы большой (Cucurbita maxima Duch.), тыквы мускатной (Cucurbita moschata (Duch.) Poir.) (аптечная смесь).

СО ₂-экстракты из указанных видов растительного сырья были получены на экспериментально-промышленном оборудовании экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода с учетом индивидуальных параметров процесса для конкретной морфологической группы и вида сырья и в соответствии с ТУ 9169-001-51032622-99 и ТУ 9169-001-96932037-99 "Экстракты из растительного сырья". Неполярными органическими растворителями липофильные фракции извлекались с использованием способа ступенчатого орошения растворителем противоточно перемещающегося обрабатываемого материала. Липофильные фракции и СО₂-экстракты получали из соответствующего сырья одной серии.

БАД масло семян тыквы (ТУ 9141-002-334-44-04-76-97), тыквин (ТУ 9141-001-34683967-2000), витадиойл (ТУ 9141-001-104073978-00), масло зародышей пшеницы (ТУ 9141-013-180622042-96), препарат тыквеол (ФС 42-3651-98) были выбраны в качестве модельных образцов для разработки критериев и обоснования принципов выявления недоброкачественной продукции и потенциальных фальсификаций среди препаратов и БАД, изготовленных из масличного растительного сырья, жирное масло которого имеет неспецифичный состав ацилглицеринов жирных кислот. Исследование проведено на пяти сериях каждого из объектов.

Так как спецификация является необходимой составляющей сертификации как липофильной фракции, извлекаемой из ЛРС или пищевых растительных источников, так и разрабатываемого в последующем препарата, принцип соответствия ПСК лекарственных средств на основе липофильных фракций ЛРС требованиям ГСКЛС был положен нами в основу создания аутентичной системы спецификаций для контроля качества получаемых липофильных фракций.

В работе использовались следующие физико-химические методы анализа: газожидкостная хроматография (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), потенциометрия, спектрофотометрия, гравиметрия.

Состав триацилглицеринов (ТАГ) жирных кислот липофильных фракций изучали с использованием метода ГЖХ. Исследование проводили на приборе "Биохром-1" с пламенно-ионизационным детектором. Для анализа применялись стеклянная или кварцевая капиллярные колонки, имеющие длину 54 м или 25 м и внутренний диаметр 0,27 мм или 0,32 мм, соответственно. Неподвижная фаза - OV-101 или SE-30 (полидиметилсилоксан). Условия хроматографирования: газ-носитель - гелий, давление гелия на входе в колонку - 0,15 МПа, скорость потока - 2,4 мл/мин, коэффициент деления потока - 1:20 или 1:100; расход воздуха - 300 мл/мин, водорода - 20 мл/мин; температура испарителя - 360^оС, детектора - 310^оС. Температура термостата колонки программировалась от 160^оС до 260^оС, время экспозиции при начальной температуре - 0 мин, при конечной температуре - 5 мин, градиент - 4 градуса/мин, диапазон чувствительности усилителя - 4,810^-10А, объем вводимой пробы - 1,5 мкл. Для идентификации метиловых эфиров жирных кислот изучаемых объектов использовался масс-селективный детектор. Результаты анализа обрабатывались с помощью компьютерных баз данных Wiley и Wist 98.

Методика, позволяющая установить подлинность липофильных фракций, полученных из жома плодов черной смородины, включает идентификацию -линоленовой кислоты. Методика определения -линоленовой кислоты, специфичной для растений семейства Saxifragaceae, основанная на ГЖХ, была модифицирована к условиям производства. В анализе использовался газожидкостной хроматограф марки ЛХМ-8М, укомплектованный пламенно-ионизационным детектором; металлическая колонка длиной 2 м с внутренним диаметром 3 мм, заполненная Chrommosorb W (1 % H₃PO₄, 18 % НДЭГС). Температура испарителя - 250^оС, температура детектора - 260^оС, температура термостата колонки - 200^оС. Скорость газа-носителя (азот) - 30 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, объем вводимой пробы - 1,5 мкл.

Состав основных групп неомыляемых БАВ - каротиноидов, токоферолов, фосфолипидов, определен с применением известных методик спектрофотометрического, гравиметрического анализа и ТСХ.

Для идентификации и количественного определения добавок синтетических аналогов витаминов (-токоферола ацетата и ретинола пальмитата) методом ВЭЖХ использовалась система фирмы "Gilson" (Франция): однопоршневой насос (модель 302) с манометрическим модулем (модель 802 С); инжектор для ввода проб ("Rheodyne", США); ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны "Holochrom"; персональный компьютер IBM PC с программой "МультиХром" для записи и обработки хроматограмм (Ampersand, Россия); стальные аналитические колонки: Ultrasphere ODS - 5 µ (4,6 Ч 250 мм) с предколонкой Ultrasphere ODS - 10 µ (4,6 Ч 50 мм) и Separon SG-C₁₈-5 µ (4 Ч200 мм) с предколонкой Separon SG-C₁₈-10 µ (4 Ч 50 мм). Скорость потока элюирующей смеси (метанол 100 %) - 1 мл/мин. Пробоподготовка проводилась в соответствии с известными методиками. Детектирование -токоферола ацетата осуществлялось при л_мах поглощения в УФ области для данного соединения 292 нм. В качестве стандарта использовался Vitamin E acetate фирмы ICN (США). Детектирование ретинола пальмитата осуществляли при л_мах=326 нм. В качестве стандартного образца использовался ретинола пальмитат (1800000 МЕ/г) фирмы Hoffman La Roche (Швейцария, США).

Для исследования элементного состава липофильных фракций ЛРС объекты подвергали поэтапному озолению в соответствии со следующей методикой: точную навеску (около 1 грамма) исследуемого образца помещали в калориметрическую "бомбу" из тефлона, прибавляли 4 мл концентрированной азотной кислоты, "бомбу" плотно завинчивали и выдерживали в СВЧ печи при температуре 30оС. По истечении 24 часов к содержимому "бомбы" прибавляли 2 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл 30 % пероксида водорода. После чего калориметрическая "бомба" выдерживалась в СВЧ печи последовательно при температуре 80оС в течение 8 часов и при температуре 96оС - 98оС в течение 1 часа. Элементный состав липофильных фракций ЛРС определяли с использованием портативного микропроцессорного спектрофотометра DR/2010 (Mach, США) и портативного сканирующего кристалл-дифракционного рентгеновского спектрометра "Спектрослан". Предел обнаружения элементов составлял 10-6.

Статистическая обработка проведена с учетом указаний Общей статьи ГФ XI "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний", в основу которых положены принципы дескриптивного анализа и аналитической статистики. В исследовании использован программный комплекс SPSS for Windows 11.0.1. Результаты анализов представлены с указанием рассчитанного доверительного интервала (f = 5; Р = 0,95).

Микробиологический контроль объектов исследования осуществлялся в соответствии с Изменением № 2 к Общей статье Государственной Фармакопеи XI издания (ГФ XI) "Методы микробиологического контроля лекарственных средств". Исследование микробиологической активности проведено с использованием стандартных методов микробиологического анализа. Доказательство, а также оценка медико-биологической эффективности и безопасности использования липофильных фракций по декларируемым медицинским показаниям проводилась в соответствии с Федеральным законом № 86-ФЗ "О лекарственных средствах", Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств и международными правилами, предъявляемыми к фармакологическим и токсикологическим исследованиям лекарственных средств.

Результаты и обсуждение.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОФИЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, ПОЛУЧЕННЫХ ЭКСТРАКЦИЕЙ ЖИДКИМ ОКСИДОМ УГЛЕРОДА (IV), И РАЗРАБОТКА СПЕЦИФИКАЦИЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА.

Сравнительный анализ состава биологически активных веществ липофильных фракций растительного происхождения, извлекаемых сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями. Изучение и обобщение тенденций экспериментально-теоретических исследований в области современных технологий получения липофильных фракций растительного происхождения указывает на целесообразность использования СКФ в качестве экстрагентов БАВ, обладающих широким спектром фармакологической активности. К достоинствам процесса сверхкритического экстрагирования БАВ липофильной природы по сравнению с экстракцией неполярными органическими растворителями относят: энергосберегающий характер процесса; высокие массообменные характеристики и селективность экстрагирования; значительную степень извлечения соответствующих БАВ, сочетающуюся с высоким качеством конечного продукта; легкость процесса регенерации большинства СКФ, их нетоксичность и химическую инертность.

Диоксид углерода является наиболее широко применяемым в сверхкритическом состоянии экстрагентом БАВ липофильной природы, т.к. использование его во флюидном состоянии гарантирует осуществление процесса экстракции в температурном режиме, обеспечивающем отсутствие термической деградации БАВ. Экстракт, получаемый в процессе сверхкритического экстрагирования диоксидом углерода, характеризуется практическим отсутствием остаточного растворителя.

Нами проведено сравнительное изучение качественного и количественного состава основных групп, омыляемых и неомыляемых БАВ (ТАГ жирных кислот, токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов) фракций, полученных из ряда видов пищевого и лекарственного растительного сырья, экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями - пищевым бензином марки "Нефракс" и гексаном.

Как показано в таблице 1, липофильные фракции, извлекаемые сверхкритическим диоксидом углерода и традиционными неполярными органическими растворителями, имеют идентичный жирнокислотный состав, который также сопоставим по общему содержанию насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Известно, что при использовании сверхкритического диоксида углерода отмечается инактивация пероксидазы, активность которой в указанном случае уменьшается приблизительно в 10 раз. Данный факт подтверждается в проведенном эксперименте и наглядно иллюстрируется значительно меньшим содержанием пальмитолеиновой (цис-9-гексадеценовой) кислоты в экстрактах, извлекаемых из плодов растений семейства Сельдерейные неполярными органическими растворителями, по сравнению с СО ₂-экстрактами тех же видов растительного сырья. Содержание пальмитолеиновой кислоты в СО₂-экстракте плодов кориандра посевного на 92,3 % превышает соответствующий показатель для экстрактов, извлекаемых органическими растворителями. Для СО₂-экстракта плодов укропа пахучего - на 19 %. Содержание пальмитиновой кислоты в СО₂-экстрактах плодов кориандра посевного и укропа пахучего на 80 % и 15 %, соответственно, меньше, чем в экстрактах, извлеченных с использованием бензина "Нефракс" и гексана.

Таблица 1. Состав жирных кислот липофильных фракций растительного сырья, полученных с использованием различных экстрагентов

Примечание: 1 - сверхкритический диоксид углерода; 2 - пищевой бензин марки "Нефракс"; 3 - гексан; * - изомеры С _18:1 cis-9 и С _18:1 cis-6 суммарно.

Использование сверхкритического диоксида углерода позволяет получать экстракты из анализируемых видов растительного сырья идентичные по качественному составу БАВ неомыляемой фракции экстрактам, извлекаемым неполярными органическими растворителями по традиционной технологии (таблица 2). Однако суммарное содержание БАВ неомыляемой фракции в полученных СО ₂-экстрактах в целом меньше, чем для соответствующих экстрактов, извлеченных с использованием бензина "Нефракс" и гексана.

Таблица 2. Содержание неомыляемых БАВ в липофильных фракциях, полученных с использованием различных экстрагентов

Примечание: 1 - сверхкритический диоксид углерода; 2 - пищевой бензин марки "Нефракс"; 3 - гексан.

Это может быть объяснено с точки зрения того, что в зависимости от технологических параметров процесса экстракции изменяется избирательная способность жидкого диоксида углерода, как экстрагента БАВ липофильной природы.

Оптимальным для обеспечения максимального выхода БАВ считается температурный режим экстракции в пределах 15-20^оС; повышение температуры процесса экстракции БАВ из растительного сырья жидким диоксидом углерода до его критической температуры (31,1^оС) - фактор, снижающий выход экстрактивных веществ. Снижение выхода экстрактивных веществ при повышении температуры процесса экстракции жидким диоксидом углерода объясняется: агрегативной неустойчивостью жидкофазного состояния экстрагента в зоне его критической температуры; уменьшением градиента химических потенциалов по составу компонентов; снижением величины изотермической молекулярной диффузии извлекаемых компонентов в экстрагенте (несмотря на существование градиента концентрации).

Кроме того, изменяя давление в среде сверхкритического диоксида углерода можно получать вариабельные по составу экстракты. Но при этом ни одно из полученных извлечений не будет идентичным, в частности по количественному составу БАВ неомыляемой фракции, экстрактам, извлекаемым неполярными растворителями.

Также известно, что применение неполярных органических растворителей обычно способствует увеличению содержания БАВ, сопутствующих глицеринам жирных кислот в липофильных фракциях растительного сырья.

Необходимо отметить, что в изученных СО ₂-экстрактах растительного сырья не обнаружены фосфороорганические соединения. Этот факт согласуется с имеющимися данными, указывающими на то, что фосфолипиды в липофильных фракциях, полученных экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, либо не обнаруживаются, либо присутствуют в следовых количествах. Указанный феномен объясняется малой растворимостью фосфолипидов в сверхкритическом диоксиде углерода.

Сравнительный анализ состава БАВ липофильных фракций растительного происхождения, извлекаемых с использованием сверхкритического диоксида углерода и неполярных органических растворителей, показывает, что полученные экстракты имеют тождественный качественный состав ТАГ жирных кислот. Это объясняется соизмеримыми значениями величины диэлектрической проницаемости для сверхкритического диоксида углерода и неполярных органических растворителей, как экстрагентов БАВ липофильной природы: ТАГ, жирорастворимых витаминов, пигментов и др. Экстракция в среде сверхкритического диоксида углерода за счет отсутствия эффекта аэрации и инактивации пероксидазы обусловливает ингибирование окислительных процессов. В эксперименте данный факт подтверждается статистически достоверно большим выходом ТАГ ненасыщенных жирных кислот в условиях экстрагирования сверхкритическим диоксидом углерода по сравнению с экстракцией неполярными органическими растворителями. Качественный состав БАВ неомыляемой фракции изученных экстрактов растительного сырья в целом также является идентичным и включает группы БАВ, сопутствующих ТАГ жирных кислот, в частности токоферолы и каротиноиды. Однако экстракция в среде сверхкритического диоксида углерода способствует меньшему выходу указанных групп БАВ по сравнению с извлечениями, полученными с использованием неполярных органических растворителей. Указанный факт объясняется изменением избирательной способности диоксида углерода в зависимости от технологических параметров процесса экстракции, в частности от температуры. Кроме того, в изученных экстрактах растительного сырья, полученных в среде сверхкритического диоксида углерода в отличие от экстрактов, полученных с использованием неполярных органических растворителей, не обнаружена группа фосфороорганических соединений. Этот феномен согласуется с имеющимися данными о малой растворимости фосфолипидов в сверхкритическом диоксиде углерода.

Исследование влияния химической природы экстрагента на элементный состав липофильных фракций растительного сырья.

Анализ научных информационных источников и патентной документации по проблеме извлечения БАВ из растительного сырья СКФ указывает на практическую целесообразность сопоставительного анализа элементного состава липофильных фракций растительного сырья, получаемых с использованием сверхкритического диоксида углерода и органических растворителей.

В представленном исследовании влияния химической природы экстрагента на элементный состав липофильных фракций растительного происхождения в качестве экстрагентов использовались сверхкритический диоксид углерода и пищевой бензин марки "Нефракс".

В результате проведенного сопоставительного анализа элементного состава СО ₂-экстрактов и липофильных фракций, полученных из соответствующего растительного сырья способом ступенчатого орошения растворителем (пищевым бензином марки "Нефракс") противоточно перемещающегося обрабатываемого материала, были выявлены следующие закономерности (таблица 3, 4). Качественный элементный состав изученных липофильных фракций в целом соответствует элементному составу исходного растительного сырья. Содержание техногенных элементов, таких как кадмий, медь и цинк не превышает значений соответствующих предельно допустимых концентраций.

Таблица 3. Содержание элементов в липофильных фракциях растительного сырья, полученных экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода

Таблица 4. Содержание элементов в липофильных фракциях растительного сырья, полученных экстракцией пищевым бензином марки "Нефракс"

Химическая природа используемых экстрагентов (сверхкритического оксида углерода (IV) и пищевого бензина марки "Нефракс") не влияет на содержание магния, алюминия, кремния, общего хрома и марганца в липофильных фракциях плодов кориандра посевного, укропа пахучего, травы полыни горькой, семян винограда культурного. Исключением в данном случае являются липофильные фракции плодов облепихи крушиновидной. В частности, в липофильной фракции плодов облепихи крушиновидной, полученной экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, не обнаружены (или содержатся в количествах ниже предела обнаружения) общий хром и марганец. Известно, что плоды кориандра посевного, укропа пахучего, трава полыни горькой, а также семена фармакопейных видов тыкв относятся к селенофилам, то есть характеризуются особенностью концентрировать селен. Однако при анализе липофильных фракций указанного сырья селен не был обнаружен (или концентрация селена была ниже предела обнаружения). Экстракция пищевым бензином марки "Нефракс" способствует, по сравнению с экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, увеличению содержания в исследуемых липофильных фракциях растительного сырья железа и молибдена в среднем в 1,3 раза; никеля, меди, цинка - в 1,2 раза. Липофильные фракции травы полыни горькой и семян винограда культурного, полученные экстракцией пищевым бензином марки "Нефракс", содержат токсичный элемент свинец в концентрациях значительно превышающих значения содержания тяжелых металлов в экстрактах ЛРС, нормируемые ГСКЛС.

Результаты проведенного сопоставительного анализа элементного состава показывают, что химико-технологические характеристики сверхкритического диоксида углерода, как экстрагента липофильных фракций, позволяют получать экстракты из ЛРС и пищевых растительных источников, соответствующие требованиям ГСКЛС по показателю "содержание тяжелых металлов".

Разработка спецификаций для контроля качества СО ₂-экстрактов растительного сырья и экспериментальное доклиническое изучение.

Результаты проведенных нами экспериментально-теоретических изысканий в области создания лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, указывают на необходимость интенсификации процесса внедрения способа экстракции БАВ растительного происхождения СКФ на предприятиях фармацевтической промышленности. Современные ГСКЛС запрещают или ограничивают использование в экстракционных процессах в фармацевтической отрасли ряда органических растворителей, кроме того, повышаются требования к нормированию допустимого содержания остаточного растворителя в конечном продукте. В указанном аспекте проведенные нами исследования свидетельствуют о целесообразности широкого применения технологии экстракции БАВ липофильной природы сверхкритическим диоксидом углерода в фармацевтическом производстве лекарственных средств на основе растительного сырья.

Спецификации для контроля качества липофильных фракций, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, были разработаны на примере СО ₂-экстрактов, полученных из 7 родов растительного сырья с использованием стандартных методов физико-химического анализа.

Растворимость объектов исследования определялась в растворителях различной природы, которые использовались в качестве реагентов при исследовании ПСК СО ₂-экстрактов. Изученные СО ₂-экстракты практически нерастворимы в воде, легко растворимы в диэтиловом и петролейном эфире, хлороформе, гексане, ацетоне, пиридине, мало растворимы в спирте метиловом. Характерной особенностью является растворимость СО ₂-экстрактов растительного сырья в 95 % спирте этиловом: СО ₂-экстракт плодов облепихи крушиновидной очень мало растворим, СО ₂-экстракты плодов кориандра посевного ...