Принципы и организационно-методическое обеспечение качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Принципы и организационно-методическое обеспечение качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Шипицина Елена Васильевна

Санкт-Петербург 2013

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН

Научный консультант: Савичева Алевтина Михайловна доктор медицинских наук профессор

Официальные оппоненты:

Зыбина Наталья Николаевна доктор биологических наук профессор ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России, заведующий отделом лабораторной диагностики

Иванов Андрей Михайлович доктор медицинских наук профессор ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО Российской Федерации, начальник кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

Карпищенко Анатолий Иванович доктор медицинских наук профессор СПбГУЗ «Медицинский информационно-аналитический центр», руководитель сектора клинической лабораторной диагностики и метрологии организационно-методического отдела мониторинга качества медицинской деятельности

Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» МЗ Российской Федерации

Защита состоится «_10_» _октября_ 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 197374, Санкт-Петербург, ул. Оптиков, д. 54.

Автореферат разослан «___» ___________________ 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук М.В. Санников

лабораторный диагностика урогенитальный амплификация нуклеиновый

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инфекции урогенитального тракта являются серьезной проблемой здравоохранения во всех странах мира (WHO, 2011). Очень часто урогенитальные инфекции не имеют специфических проявлений или протекают бессимптомно, поэтому ключевая роль в установлении диагноза отводится лабораторной диагностике.

Внедрение методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в микробиологическую диагностику значительно повысило ее эффективность. К их числу относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР), амплификация со смещением нити ДНК (strand displacement amplification, SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (transcription mediated amplification, TMA), амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA). Преимущества МАНК перед традиционными микробиологическими методами заключаются в том, что они сочетают высокую чувствительность с высокой специфичностью, быстры в исполнении, в высокой степени стандартизированы и автоматизированы, имеют высокую пропускную способность, не требуют сохранения жизнеспособности возбудителя. Кроме того, МАНК позволяют использовать материалы, полученные неинвазивным путем.

В последние годы МАНК находят все более широкое применение в диагностике урогенитальных инфекций, в том числе в нашей стране (Савичева А.М., 2009; Кубанова А.А., 2011). К числу урогенитальных инфекций, в диагностике которых широко используются МАНК, относятся инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) (гонорея, хламидийная инфекция, трихомониаз, инфекция, ассоциированная с Mycoplasma genitalium), а также этиологически связанная с раком шейки матки (РШМ) папилломавирусная инфекция. Культуральный метод до сих пор остается «золотым стандартом» диагностики гонококковой инфекции, несмотря на то, что гонококки - исключительно прихотливые бактерии и культуральный метод требует соблюдения очень строгих условий транспортировки и культивирования. Связано это с тем, что метод позволяет определять антибиотикорезистентность гонококков, которая представляет собой серьезную проблему (Tapsall J., 2001). Микроскопический метод выявления гонококков имеет невысокую чувствительность и специфичность и по международным стандартам может использоваться только у мужчин с острым уретритом; тем не менее, метод очень широко используется в нашей стране (Unemo M. et al., 2006). Культуральный метод также широко используется для диагностики трихомониаза, он достаточно чувствителен, но очень длителен. Микроскопическое исследование нативного материала - распространенный метод диагностики трихомониаза у женщин, однако его чувствительность невысока (Гущин А.Е., Рыжих П.Г., 2012). Таким образом, недостатки существующих методов выявления Neisseria gonorrhoeae и Trichomonas vaginalis не позволяют сомневаться в неизбежности широкого внедрения МАНК в диагностику гонореи и трихомониаза. В диагностике хламидийной инфекции МАНК в последние годы практически полностью заменили культуральный метод, метод прямой иммунофлюоресценции и другие методы выявления Chlamydia trachomatis (Gaydos C., 2005). M. genitalium - труднокультивируемые бактерии, и их определение в настоящее время полностью основывается на МАНК (Jensen J.S., 2006).

С установлением этиологической роли вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии РШМ тест на онкогенные типы ВПЧ стали использовать в скрининге этого заболевания наряду с цитологическим тестом. Тестирование на онкогенные типы ВПЧ обладает очень высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпителиальных поражений высокой степени (cervical intraepithelial neoplasia grade 2 и выше, CIN2+) (Cuzick J. et al., 2008), однако его специфичность недостаточно высока, что связано с широкой распространенностью транзиторной папилломавирусной инфекции. Кроме того, так как диагностика папилломавирусной инфекции основывается на высокочувствительных методах анализа его нуклеиновых кислот (Poljak M., Kocjan B., 2010), очень часто выявляются клинически незначимые концентрации вируса. Для эффективного скрининга РШМ тест на ВПЧ должен выявлять только клинически значимое количество вируса, и поэтому необходимость разработки и внедрения таких тестов не вызывает сомнения.

Несмотря на очевидные достоинства МАНК, их использование в диагностике урогенитальных инфекций сопряжено с рядом проблем, обусловленных как свойствами самих методов, так и свойствами определяемых аналитов. Известно, что высокая чувствительность МАНК связана с высоким риском получения ложноположительных результатов вследствие контаминации, а присутствие в реакции субстанций, ингибирующих энзиматическую амплификацию, может привести к получению ложноотрицательных результатов. Генетическая изменчивость микроорганизмов может быть источником как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Так, высокая степень гомологии нуклеотидных последовательностей и частый генетический обмен между гонококками и другими видами рода Neisseria, а также высокий уровень генетического полиморфизма разных штаммов N. gonorrhoeae являются серьезной проблемой молекулярной диагностики гонореи (Palmer H.M. et al., 2003; Whiley D.M. et al., 2006; Tabrizi S.N et al., 2011). В диагностике хламидийной инфекции исследователи недавно столкнулись с проблемой появления нового (Шведского) варианта С. trachomatis (нвСТ), имеющего мутацию в криптической плазмиде, которая применяется в качестве мишени в большинстве тестов на основе МАНК (Ripa T. A., Nilsson P.A., 2006). Таким образом, внедрение МАНК в рутинную диагностику урогенитальных инфекций существенно повышает ее эффективность, но вместе с тем требует оптимизации системы обеспечения качества исследований.

Степень разработанности темы. Эффективность молекулярной диагностики урогенитальных инфекций в нашей стране в значительной мере ограничивается недостаточной разработанностью нормативной базы по обеспечению качества исследований с использованием неколичественных методов, к числу которых относятся методы анализа нуклеиновых кислот возбудителей инфекций. В частности, не регламентируются процедуры клинической оценки тестов и критерии приемлемости тестов. Применение тестов, не получивших объективную характеристику своих аналитических и функциональных свойств, сопряжено с высоким риском получения недостоверных лабораторных результатов (Эмануэль В.Л., Домейка М., 2008; Меньшиков В.В., 2011, 2012). Принципы клинической оценки неколичественных тестов обобщены в ряде международных стандартов (European Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990; Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008), однако способы оценки тестов в разных областях лабораторной медицины различаются как в аспектах экспериментального дизайна, так и анализа данных, и должны разрабатываться с учетом специфики методов и аналитов. Для диагностики наиболее значимых урогенитальных инфекций предлагается ряд международных тестов на основе МАНК, аналитические и диагностические параметры которых определены в независимых клинических исследованиях и описаны в литературе. В нашей стране повсеместно используются тесты Российского производства, однако объективная информация об их аналитических и особенно диагностических характеристиках практически отсутствует. В этих условиях основным способом проверки точности результатов молекулярных микробиологических исследований является внешняя оценка качества, осуществляемая в нашей стране Федеральной системой внешней оценки качества (ФСВОК) (Малахов В.Н. и соавт., 2002), которая, однако, только дополняет, но не заменяет контроль качества диагностики (Мошкин А.В., Долгов В.В., 2004; Арефьева И.А. и соавт., 2005; Кишкун А.А., Миколаускас, 2006). Таким образом, актуальность данного исследования обусловлена необходимостью оптимизации и стандартизации системы обеспечения качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, что будет способствовать как их своевременному выявлению и лечению, так и получению достоверных эпидемиологических данных и разработке профилактических программ.

Цель исследования:

Обоснование принципов и разработка организационно-методического обеспечения качества лабораторной диагностики урогенитальных инфекций с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

Задачи исследования:

1. Оценить диагностические характеристики тестов Российского производства на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium), с использованием международных валидированных тестов в качестве референтных стандартов. Определить аналитическую чувствительность и специфичность тестов.

2. Выявить распространенность нового варианта C. trachomatis в популяции пациентов гинекологических и урологических клиник Санкт-Петербурга и оценить способность ПЦР-тестов, разработанных и используемых в России для диагностики хламидийной инфекции, выявлять новый вариант.

3. Определить диагностические характеристики теста Российского производства для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска и оценить его соответствие требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

4. Проанализировать возможность использования клинических образцов, полученных неинвазивным путем (отделяемое влагалища у женщин, первая порция мочи у женщин и мужчин), для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, с применением методов амплификации нуклеиновых кислот.

5. Провести оценку традиционных методов диагностики гонококковой инфекции (микроскопического и культурального) в сравнении с методами амплификации нуклеиновых кислот.

6. Разработать и обосновать структурно-функциональную модель обеспечения качества аналитического этапа молекулярной диагностики урогенитальных инфекций с методической детализацией ее ключевого компонента - клинической оценки тестов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработана структурно-функциональная модель системы аналитического качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, компоненты которой, функционируя комплементарно друг другу, обеспечивают точность результатов лабораторных исследований.

Впервые получены данные, объективно характеризующие аналитические и диагностические параметры тестов Российских производителей на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики наиболее значимых инфекций, передаваемых половым путем.

Впервые получены данные о распространенности нового варианта С. trachomatis в России. Теоретически обоснована возможность его дальнейшего распространения, определяющая перспективность изучения путей и динамики его трансмиссии.

Впервые охарактеризован тест Российского производства для выявления клинически значимого количества ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска и показано его соответствие требованиям, предъявляемым к тестам для скрининга рака шейки матки.

Валидация молекулярных тестов отечественного производства для диагностики урогенитальных инфекций в сравнении с международными тестами открывает возможности получения достоверных эпидемиологических данных в различных популяциях Российской Федерации и их сопоставления с соответствующими показателями в других странах.

Разработана доказательная база для использования клинических образцов, полученных неинвазивным путем, при молекулярной диагностике инфекций, передаваемых половым путем.

Установлена неприемлемо низкая чувствительность микроскопического и культурального методов выявления гонококков по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот при тестировании клинических материалов от женщин, определяющая высокий процент (до 70%) ложноотрицательных результатов у женщин с гонореей.

Практическая значимость работы. Проведена клиническая валидация целого ряда молекулярных тестов, применяющихся в нашей стране для диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и скрининга рака шейки матки. Полученные данные позволили определить отечественные тесты с оптимальными аналитическими и диагностическими параметрами, как для применения в лабораторной диагностике данных заболеваний, так и для использования в качестве референтных стандартов при клинической оценке новых отечественных тестов.

Обоснована возможность дальнейшего распространения нового варианта C. trachomatis в Российской Федерации, что определяет необходимость использования тестов, способных его идентифицировать, а также перспективность включения данного варианта C. trachomatis в контрольные панели Федеральной системы внешней оценки качества.

Показано, что при молекулярной диагностике инфекций, передаваемых половым путем, могут использоваться клинические пробы, полученные неинвазивным путем. Неинвазивный способ является предпочтительным, так как позволяет пациентам получать материал самостоятельно, что благоприятствует большему вовлечению населения в обследование на урогенитальные инфекции и способствует их своевременному выявлению и лечению.

Данные, полученные при сравнении методов диагностики гонореи, свидетельствуют о необходимости ограничения использования микроскопического метода, оптимизации культурального метода и внедрения молекулярных методов в рутинную диагностику этого заболевания.

Предложена модель обеспечения аналитического качества молекулярной диагностики инфекций, которая может быть использована при создании внутрилабораторной системы качества.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основополагающим принципом обеспечения качества молекулярной диагностики урогенитальных инфекций, определяющим точность результатов исследований и сопоставимость результатов, полученных в разных лабораториях, является установление соответствия аналитических и диагностических параметров применяемых тестов клиническим задачам.

2. Возможность дальнейшего распространения нового варианта C. trachomatis в Российской Федерации определяет необходимость использования тестов, способных его идентифицировать, и перспективность его включения в контрольные панели Федеральной системы внешней оценки качества для выявления C. trachomatis.

3. Применение клинических материалов, полученных неинвазивным путем, для молекулярной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, не уступает в информативности использованию материалов, полученных стандартным методом.

4. Микроскопический и культуральный методы, являющиеся регламентированными методами диагностики гонореи в нашей стране, обладают низкой чувствительностью по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот. Внедрение валидированных молекулярных тестов в диагностику этого заболевания существенно повысит ее качество.

Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы теоретический анализ литературы, лабораторные методы и методы статистической обработки данных.

Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.

Основные положения работы, а также содержание её отдельных этапов были представлены на 6-ом международном конгрессе Еврогин (Париж, Франция, 2006); 22-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Версаль, Франция, 2006); международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики» (Санкт-Петербург, 2006); международной конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье» (Санкт-Петербург, 2007); 10-ом Всемирном конгрессе IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Сиэтл, США, 2007); 23-ей конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Дубровник, Хорватия, 2007); международном конгрессе «Новые технологии в акушерстве и гинекологии» (Санкт-Петербург, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2007» (Москва, 2007); 6-ой конференции Европейского общества по хламидийным инфекциям (Орхус, Дания, 2008); 24-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Милан, Италия, 2008); 25-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Тбилиси, Грузия, 2010); 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Вена, Австрия, 2010); 7-ой Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010); 17-ой конференции Скандинавского общества урогенитальной медицины (Осло, Норвегия, 2010); 12-ом международном симпозиуме по хламидийным инфекциям человека (Зальцбург, Австрия, 2010); 26-ой конференции Европейского отделения IUSTI по ИППП и ВИЧ/СПИД (Рига, Латвия, 2011); 22-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Лондон, Великобритания, 2012).

Результаты исследования внедрены в диагностическую работу лаборатории микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН и клинико-диагностической лаборатории Городского консультативно-диагностического молодежного центра «Ювента», а также отражены в методических рекомендациях по лабораторной диагностике урогенитальных инфекций, утвержденных Комитетами по здравоохранению Санкт-Петербурга и Ленинградской области: «Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Neisseria gonorrhoeae» (2009), «Лабораторная диагностика урогенитальной хламидийной инфекции» (2009), «Лабораторная диагностика инфекции, вызванной Mycoplasma genitalium» (2010), «Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза» (2011).

По теме диссертации опубликовано 52 работы, в их числе 27 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях и 6 методических руководств.

Личное участие автора. Диссертант лично участвовала в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, обработке, анализе, обобщении и представлении полученных данных.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 254 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 43 таблицами. Список литературы включает 406 публикаций, из них 34 - отечественных авторов и 372 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. материалы и методы

1.1. Обследованные популяции

Для оценки аналитических и диагностических параметров молекулярных тестов Российского производства для диагностики урогенитальных инфекций было проведено несколько исследований (табл. 1). Общее число обследованных пациентов составило 10981 человек, общее количество исследованных клинических образцов - 12851, общее количество проведенных тестов - 37406.

Таблица 1 Популяции и клинические материалы

Исследование	Популяция	Количество исследованных образцов	Количество проведенных тестов
Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП	Пациенты молодежных центров (n=497) и КВД (n=33)	1311	22270
Оценка распространенности нового варианта C. trachomatis	Пациенты гинекологических и урологических клиник (n=9294)	9294	9567
Оценка теста для выявления клинически значимого количества ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска	Женщины старше 30 лет, обратившиеся к гинекологу для планового обследования (n=823)	1646	2469
Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции	Пациенты КВД (n=334)	620	3100

1.2. Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП

1.2.1. Пациенты и клинические образцы

Всего в исследование было включено 447 пациентов (319 женщин и 128 мужчин) трех молодежных центров Санкт-Петербурга, обратившихся к врачу с целью обследования на ИППП и не принимавших антибиотики в течение 4 недель до участия в исследовании. Клиническим материалом служили цервикальные и вагинальные образцы у женщин и уретральные образцы у мужчин, а также первая порция мочи у женщин и мужчин (табл. 2). Для оценки аналитической специфичности тестов на гонорею были получены экстрагенитальные пробы от 50 женщин. Кроме того, ввиду низкой распространенности трихомониаза в молодежной популяции, были получены клинические материалы от 33 пациентов городского КВД (30 женщин и трех мужчин) с диагнозом трихомониаза.

Таблица 2 Клинические пробы, использованные для оценки тестов Российского производства на основе МАНК для диагностики ИППП

Клинические пробы	Оценка МАНК для выявления N. gonorrhoeae	Оценка МАНК для выявления С. trachomatis	Оценка МАНК для выявления T. vaginalis	Оценка МАНК для выявления M. genitalium
Цервикальные образцы	319	319	-	-
Вагинальные образцы	-	298	317	281
Образцы мочи от женщин	317	-	-	281
Фарингеальные образцы	50	-	-	-
Ректальные образцы	50	-	-	-
Уретральные образцы	127	127	131	125
Образцы мочи от мужчин	127	127	-	125
Общее количество клинических проб	990	871	448	812

1.2.2. Оцениваемые тесты

Всего оценивалось 22 теста (20 тестов на основе ПЦР и 2 теста на основе NASBA) (табл. 3).



Таблица 3 Оцениваемые тесты на основе МАНК для диагностики ИППП

Производи-тели	Методы	Оцениваемые тесты (приведено условное обозначение теста)
		Neisseria gonorrhoeae	Chlamydia trachomatis	Trichomonas vaginalis	Mycoplasma genitalium
ДНК-Технология (Москва)	ПЦР с детекцией электро-форезом	ПЦР-эф-ДT-NG	ПЦР-эф-ДТ-CT	ПЦР-эф-ДТ-TV	ПЦР-эф-ДТ-MG
	ПЦР в реальном времени	ПЦР-рв-ДT-NG	ПЦР-рв-ДТ-CT	ПЦР-рв-ДТ-TV	ПЦР-рв-ДТ-MG
Литех (Москва)	ПЦР с детекцией электро-форезом	ПЦР-эф-Л-NG	ПЦР-эф-Л-CT	ПЦР-эф-Л-TV	ПЦР-эф-Л-MG
ЦНИИ Эпидемио-логии (Москва)	ПЦР с детекцией электро-форезом	ПЦР-эф-ИЭ-NG	ПЦР-эф-ИЭ-CT	ПЦР-эф-ИЭ-TV	ПЦР-эф-ИЭ-MG
	ПЦР в реальном времени	ПЦР-рв-ИЭ-NG	ПЦР-рв-ИЭ-CT	ПЦР-рв-ИЭ-TV	ПЦР-рв-ИЭ-MG
	NASBA в реальном времени	NASBA-NG	NASBA-CT	-	-

1.2.3. Взятие, транспортировка и хранение клинических проб

Цервикальные, вагинальные и уретральные образцы собирали в пробирки с реагентом ДНК-экспресс (Литех) (для анализа с использованием тестов производства ДНК-Технология и Литех) и в пробирки, содержащие 1 мл сахарозо-фосфатного буфера (для анализа с использованием тестов производства ЦНИИ Эпидемиологии и для референтного тестирования). Очередность взятия материалов в ДНК-экспресс и сахарозо-фосфатный буфер меняли каждый день с целью рандомизации. Образцы мочи собирали в контейнеры объемом 25 мл. Все клинические пробы транспортировали в лабораторию микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН, где их анализировали с применением оцениваемых тестов в течение 1-2 дней. Перед тестированием пробы вортексировали и отбирали аликвоты для референтного тестирования, которые хранили при ?70°С и транспортировали в замороженном виде в референтные лаборатории.

1.2.4. Анализ клинических проб с применением оцениваемых тестов

Выделение нуклеиновых кислот, реакции амплификации, анализ и интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями производителей тестов.

1.2.5. Референтное тестирование

Референтное тестирование выполняли вслепую, с целью исключения фактора субъективности, с использованием международных валидированных тестов. Референтные тесты и лаборатории, в которых осуществлялось референтное тестирование, представлены в таблице 4.

Таблица 4 Референтные тесты для оценки отечественных тестов на ИППП

	N. gonorrhoeae	C. trachomatis	T. vaginalis	M. genitalium
Тесты	ПЦР в реальном времени для выявления псевдогена N. gonorrhoeae porA (Hjelmevoll S.O. et al., 2006)	COBAS AMPLICOR CT/NG Test (Roche Molecular Systems, США), LightMix 480HT (TIB MOLBIOL, Германия)	ПЦР в реальном времени для выявления фрагмента повторяющейся ДНК T. vaginalis (Pillay A. et al., 2007)	ПЦР в реальном времени для выявления гена MgPa M. genitalium (Jensen J. et al., 2004), ПЦР для выявления гена 16S рРНК M. genitalium (Jensen J. et al., 2003), ПЦР для выявления гена MgPa M. genitalium (Jensen J. et al., 1991)
Учрежде-ния	Отделение микробиологии и инфекционного контроля университетского госпиталя г. Тромсё, Норвегия	Отделение клинической микробиологии университетского госпиталя г. Оребро, Швеция	Отделение ИППП центра контроля над заболеваниями (CDC), Атланта, США	Лаборатория микоплазм Государственного института сывороток, Копенгаген



1.2.6. Референтная панель микоплазм

Для определения аналитической чувствительности и специфичности ПЦР-тестов для выявления M. genitalium использовали контрольную зашифрованную панель, любезно предоставленную доктором Jensen J. S. (лаборатория микоплазм, Государственный институт сывороток, Копенгаген, Дания), которая включала 58 проб ДНК, выделенной из 6 штаммов M. genitalium (G37, M30, M2288, M2300, M2321 и M2341) и 18 проб ДНК, выделенной из 14 других видов микоплазм: M. pneumoniae (n=5), M. hominis (n=1), M. fermentans (n=1), M. penetrans (n=1), M. alvi (n=1), M. arginini (n=1), M. pirum (n=1), M. primatum (n=1), M. lipophilum (n=1), M. amphoriforme (n=1), M. faecium (n=1), M. buccale (n=1), M. orale (n=1) и M. gallisepticum (n=1).

1.2.7. Определение пределов детекции ПЦР-тестов

Пределы детекции ПЦР-тестов для выявления N. gonorrhoeae, C. trachomatis и T. vaginalis определяли с использованием серийных разведений коммерческих количественных стандартов Neisseria gonorrhoeae Quantitated Bacterial DNA Control (Advanced Biotechnologies, США), Chlamydia trachomatis (VIRCELL, Испания) и Trichomonas vaginalis ATCC^® 30001D (ATCC, США), соответственно. Для определения пределов детекции ПЦР-тестов для выявления M. genitalium использовали пробы ДНК штаммов M. genitalium в различных концентрациях из референтной панели.

1.2.8. Анализ результатов

Диагностические характеристики тестов (чувствительность, специфичность, прогностическую значимость положительных и отрицательных результатов (ПЗПР и ПЗОР)) с доверительными интервалами с уровнем значимости 95% (95% ДИ) рассчитывали по отношению к результатам референтных тестов. Данные представляли в виде диапазона показателей для разных тестов и/или клинических образцов. При сравнении разных клинических материалов применяли тест Мак-Немара; различия в частоте выявления возбудителей в разных материалах считали статистически значимыми при p<0,05. Статистический анализ проводили с использованием пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

1.3. Оценка распространенности нового варианта C. trachomatis и оценка способности ПЦР-тестов его выявлять

1.3.1. Пациенты и клинические образцы

В работе были использованы клинические образцы от 9294 пациентов, поступившие в лабораторию микробиологии ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН из гинекологических и урологических клиник Санкт-Петербурга для рутинного тестирования на C. trachomatis.

1.3.2. Тестирование клинических проб на нвСТ

Анализ клинических проб, в которых в ходе рутинного тестирования была выявлена ДНК C. trachomatis, на нвСТ проводили с применением метода мультиплексной ПЦР в реальном времени, использующей в качестве мишеней два фрагмента криптической плазмиды C. trachomatis (Ripa T. A., Nilsson P.A., 2007). Один фрагмент расположен в пределах делеции, другой фрагмент - за пределами делеции, что позволяет выявлять как штаммы дикого типа C. trachomatis (два ПЦР-сигнала), так и нвCT (один ПЦР-сигнал).

1.3.3. Генотипирование C. trachomatis

Для установления идентичности штамма нвCT, выявленного в Санкт-Петербурге, штаммам нвCT, выявленным ранее в Швеции и других Североевропейских странах, было проведено высокоразрешающее генотипирование методом вариабельного числа тандемных повторов (variable number of tandem repeats, VNTR) (Pedersen L.N. et al., 2008).

1.3.4. Оцениваемые ПЦР-тесты

Шесть ПЦР-тестов, выпускаемых 4 Российскими компаниями, были проанализированы на способность выявлять нвCT: 1) Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis: формат Форез (ДНК-Технология, Москва); 2) Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis: формат Rt (ДНК-Технология); 3) Полимик-Хл (Литех); 4) АмплиСенс Chlamydia trachomatis EPh (ЦНИИ Эпидемиологии); 5) АмплиСенс Chlamydia trachomatis FL (ЦНИИ Эпидемиологии); 6) РеалБест ДНК Chlamydia trachomatis (Вектор-Бест, Новосибирск). Для анализа использовали образец ДНК, выделенной из лабораторного штамма нвCT Sweden2, любезно предоставленный доктором Unemo M. (отделение клинической микробиологии университетского госпиталя г. Оребро, Швеция).

1.4. Оценка теста для выявления клинически значимого количества ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска

1.4.1. Пациенты и клинические образцы

Оценка теста основывалась на рекомендациях международной группы экспертов (Meijer C.J. et al., 2009), согласно которым ВПЧ-тест должен оцениваться в сравнении с тестом Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test (HC2) (Qiagen, США) на выборке женщин старше 30 лет из скрининговой популяции. В нашей стране скрининг РШМ осуществляется на оппортунистической основе, поэтому в качестве обследуемой популяции были выбраны женщины, обратившиеся к гинекологу для планового обследования. В исследование были включены 823 женщины в возрасте от 30 до 65 лет, не беременные и не имевшие CIN2+ в анамнезе. С помощью цитощетки DNAPAP Cervical Sampler (Qiagen, США) получали материал из цервикального канала, который наносили на предметное стекло для цитологического исследования, после чего цитощетку опускали в пробирку, содержащую 1 мл транспортной среды Specimen Transport Medium (Qiagen, США). Перед тестированием материал вортексировали и делили на две равные части по 0,5 мл. Одну аликвоту анализировали с использованием теста HC2. Вторую аликвоту тестировали с применением оцениваемого теста.

1.4.2. Цитологические и гистологические исследования

Цитологические исследования проводили по методу Папаниколау. При выявлении плоскоклеточных интраэпителиальных поражений любой степени (при любом результате теста HC2), а также при положительном результате теста HC2 было рекомендовано проведение кольпоскопии и, в случае необходимости, гистологического исследования биопсии шейки матки.

1.4.3. Оцениваемый тест

Из ряда отечественных тестов на ВПЧ для оценки был выбран только один тест, который по выявляемому спектру типов ВПЧ и по наличию порога клинической значимости вирусной нагрузки соответствовал требованиям, предъявляемым к скрининговым ВПЧ-тестам (Stoler M.H. et al, 2007). Тест АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр FL (ЦНИИ Эпидемиологии) основан на мультиплексной ПЦР-амплификации и количественной детекции (без дифференциации) в режиме реального времени фрагментов ДНК 12 онкогенных типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59). Тест включает количественную оценку ДНК человека, что позволяет контролировать адекватность взятия материала и этапы анализа, а также нивелировать эффект вариации при взятии материала. Анализ проводили в соответствии с инструкцией производителя. Результат считали положительным, если количество ДНК ВПЧ равнялось или превышало 10³ копий на 10⁵ клеток человека.

1.4.4. Референтный тест

Tест HC2 основан на гибридизации ДНК ВПЧ с РНК-зондами и последующей хемилюминесцентной детекции образующихся гибридов и предназначен для выявления 13 онкогенных типов ВПЧ (без дифференциации), а именно, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68. Анализ проводили в соответствии с инструкцией производителя с небольшой модификацией, заключающейся в уменьшении объема денатурирующего реагента, пропорциональном уменьшению объема тестируемой пробы (вдвое).

1.4.5. Секвенирование ДНК для определения генотипа ВПЧ

Для подтверждения наличия ДНК ВПЧ и определения типа вируса в дискордантных образцах проводили реакцию ПЦР с праймерами MY11/ MY09 и GP5+/GP6+ к гену капсидного белка ВПЧ L1 с последующим секвенированием продуктов амплификации (Lee S.H. et al., 2007).

1.4.6. Анализ результатов

Расчет чувствительности и специфичности оцениваемого теста с определением 95% ДИ производили после разрешения дискордантных результатов по отношению к результатам теста HC2 с использованием статистического пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

1.5. Сравнение методов диагностики гонококковой инфекции

1.5.1. Пациенты и клинические образцы

В исследовании участвовали 334 пациента (286 женщин и 48 мужчин) двух КВД Санкт-Петербурга, обратившихся с симптомами урогенитальной инфекции. Клиническим материалом служили цервикальные и уретральные образцы от женщин и уретральные образцы от мужчин. Каждую пробу наносили на предметное стекло для микроскопического исследования, затем делали посев на питательные среды Комплегон (Институт вакцин и сывороток, Санкт-Петербург) и VCA3 (bioMйrieux, Marcy l'Etoile, Франция). После этого получали еще один образец для анализа с применением МАНК, который помещали в пробирку, содержащую 1 мл сахарозно-фосфатного буфера.

1.5.2. Микроскопические и культуральные исследования

Микроскопические и культуральные исследования проводили в лабораториях КВД в соответствии со стандартными протоколами. В обоих КВД проводилась лишь предварительная идентификация N. gonorrhoeae, то есть обнаружение в культуре типичных грамотрицательных оксидазаположительных диплококков. Для окончательной видовой идентификации образцы культур собирали в сахарозо-фосфатный буфер для последующего секвенирования фрагмента гена 16S рРНК.

1.5.3. Выявление N. gonorrhoeae методами ПЦР и NASBA

Анализ клинических проб методами ПЦР и NASBA проводили с использованием тестов АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae EPh и АмплиСенс Neisseria gonorrhoeae Риботест (ЦНИИ Эпидемиологии), соответственно, согласно инструкциям производителя.

1.5.4. Секвенирование фрагмента гена 16S рРНК N. gonorrhoeae

Для видовой идентификации образцов культур и верификации всех положительных клинических образцов использовали метод определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК.

1.5.5. Анализ результатов

При расчете диагностических характеристик методов за истинно положительные принимали образцы, положительные любым методом, если наличие в этих образцах ДНК гонококков было подтверждено секвенированием. Характеристики методов с определением 95% ДИ рассчитывали по отношению к числу инфицированных пациентов с использованием пакета StatsDirect (StatsDirect, Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Оценка тестов на основе МАНК для диагностики ИППП

2.1.1. Характеристики тестов для выявления N. gonorrhoeaе

При референтном тестировании ДНК N. gonorrhoeae была обнаружена у 7 женщин (2,2%) и 5 мужчин (3,9%). Все оцениваемые тесты показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референтным тестом - 99,4-100%. Дискордантные результаты были получены для трех проб (табл. 5).

Таблица 5 Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления N. gonorrhoeae

Клинические материалы	Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов	Количество образцов с несовпадающими результатами тестов	Уровень совпадения результатов, %
	+	-
Цервикальные образцы (n=319)	5	313	1	99,7
Образцы мочи от женщин (n=317)	4	311	2	99,4
Уретральные образцы от мужчин (n=127)	4	123	0	100
Образцы мочи от мужчин (n=127)	5	122	0	100

При исследовании проб, полученных от женщин, чувствительность оцененных тестов варьировала от 67 до 100%. При исследовании проб от мужчин все тесты имели 100% чувствительность. Специфичность и ПЗПР всех тестов равнялись 100%, ПЗОР - 99-100% (табл. 6).



Таблица 6 Диагностические характеристики тестов на основе МАНК для выявления N. gonorrhoeae

Клинические материалы	Тест	Чувствитель-ность, % [95% ДИ]	Специфич-ность, % [95% ДИ]	ПЗПР, % [95% ДИ]	ПЗОР, % [95% ДИ]
Цервикальные образцы (n=319)	ПЦР-эф-ДT-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	ПЦР-рв-ДT-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	ПЦР-эф-Л-NG	83 [36-100]	100 [99-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	NASBA-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
Образцы мочи от женщин (n=317)	ПЦР-эф-ДT-NG	83 [36-100]	100 [99-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ДT-NG	83 [36-100]	100 [99-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-Л-NG	67 [22-96]	100 [99-100]	100 [47-100]	99 [98-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
	NASBA-NG	100 [61-100]	100 [99-100]	100 [61-100]	100 [99-100]
Уретральные образцы от мужчин (n=127)	ПЦР-эф-ДT-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ДT-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-Л-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
	NASBA-NG	100 [47-100]	100 [98-100]	100 [47-100]	100 [98-100]
Образцы мочи от мужчин (n=127)	ПЦР-эф-ДT-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ДT-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-Л-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]
	NASBA-NG	100 [55-100]	100 [98-100]	100 [55-100]	100 [98-100]

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-NG, ПЦР-рв-ДТ-NG, ПЦР-эф-Л-NG, ПЦР-эф-ИЭ-NG и ПЦР-рв-ИЭ-NG составили 1-3, 1-3, 3-6, 1-3 и 1 копий ДНК на реакцию, соответственно.

Для оценки аналитической специфичности тестов были исследованы образцы со слизистой глотки и из прямой кишки, которые являются типичными локализациями нейссерий-комменсалов. Ни для одного из экстрагенитальных образцов не было зарегистрировано неспецифических реакций.

2.1.2. Характеристики тестов для выявления C. Trachomatis

По результатам референтного тестирования, 40 женщин (12,5%) и 16 мужчин (12,6%) были инфицированы C. trachomatis. Уровень совпадения результатов тестов составил 98,1-99,2%. Дискордантные результаты были получены для 15 образцов, большинство из которых - от женщин (табл. 7).

При исследовании клинических проб от женщин чувствительность оцениваемых тестов составила 86-92%. При тестировании проб от мужчин чувствительность была несколько выше - 92-100%.

Таблица 7 Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления C. trachomatis

Клинические материалы	Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов	Количество образцов с несовпадающими результатами тестов	Уровень совпадения результатов,%
	+	-
Цервикальные образцы (n=319)	34	279	6	98,1
Продолжение таблицы 7
Вагинальные образцы (n=298)	31	261	6	97,9
Уретральные образцы от мужчин (n=127)	13	113	1	99,2
Образцы мочи от мужчин (n=127)	12	113	2	98,4

Специфичность тестов составила 99-100%. ПЗПР оцениваемых тестов варьировала от 92 до 100%, ПЗОР - от 98 до 100% (табл. 8).



Таблица 8 Диагностические характеристики тестов на основе МАНК для выявления C. trachomatis

Клинические материалы	Тест	Чувствительность, % [95% ДИ]	Специфичность, % [95% ДИ]	ПЗПР, % [95% ДИ]	ПЗОР, % [95% ДИ]
Цервикаль- ные образцы (n=319)	ПЦР-эф-ДT-CT	92 [79-98]	100 [98-100]	97 [86-100]	99 [97-100]
	ПЦР-рв-ДT-CT	92 [79-98]	100 [98-100]	97 [86-100]	99 [97-100]
	ПЦР-эф-Л-CT	87 [73-96]	100 [98-100]	97 [85-100]	98 [96-99]
	ПЦР-эф-ИЭ-CT	87 [73-96]	100 [99-100]	100 [92-100]	98 [96-99]
	ПЦР-рв-ИЭ-CT	87 [73-96]	100 [99-100]	100 [92-100]	98 [96-99]
	NASBA-CT	90 [76-97]	100 [99-100]	100 [92-100]	99 [96-100]
Вагиналь- ные образцы (n=298)	ПЦР-эф-ДT-CT	92 [78-98]	100 [98-100]	97 [85-100]	99 [96-100]
	ПЦР-рв-ДT-CT	92 [78-98]	100 [98-100]	97 [85-100]	99 [96-100]
	ПЦР-эф-Л-CT	86 [71-95]	100 [98-100]	97 [84-100]	98 [96-99]
	ПЦР-эф-ИЭ-CT	86 [71-95]	100 [99-100]	100 [91-100]	98 [96-99]
	ПЦР-рв-ИЭ-CT	86 [71-95]	100 [99-100]	100 [91-100]	98 [96-99]
	NASBA-CT	92 [78-98]	100 [99-100]	100 [91-100]	99 [97-100]
Уретральные образцы от мужчин (n=127)	ПЦР-эф-ДT-CT	93 [66-100]	100 [97-100]	100 [79-100]	99 [95-100]
	ПЦР-рв-ДT-CT	93 [66-100]	100 [97-100]	100 [79-100]	99 [95-100]
	ПЦР-эф-Л-CT	100 [81-100]	100 [97-100]	100 [81-100]	100 [97-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-CT	100 [81-100]	100 [97-100]	100 [81-100]	100 [97-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-CT	100 [81-100]	100 [97-100]	100 [81-100]	100 [97-100]
	NASBA-CT	100 [81-100]	100 [97-100]	100 [81-100]	100 [97-100]
Пробы мочи от мужчин (n=127)	ПЦР-эф-ДT-CT	92 [64-100]	99 [95-100]	92 [64-100]	99 [95-100]
	ПЦР-рв-ДT-CT	92 [64-100]	99 [95-100]	92 [64-100]	99 [95-100]
	ПЦР-эф-Л-CT	92 [64-100]	100 [97-100]	100 [78-100]	99 [95-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-CT	92 [64-100]	100 [97-100]	100 [78-100]	99 [95-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-CT	92 [64-100]	100 [97-100]	100 [78-100]	99 [95-100]
	NASBA-CT	100 [79-100]	100 [97-100]	100 [79-100]	100 [97-100]

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДТ-CT, ПЦР-рв-ДТ-CT, ПЦР-эф-Л-CT, ПЦР-эф-ИЭ-CT и ПЦР-рв-ИЭ-CT составили 2-4, 4-6, 4-6, 2-4 и 2-4 копий ДНК на реакцию, соответственно.

2.1.3. Характеристики тестов для выявления T. vaginalis

Среди посетителей молодежных центров ДНК T. vaginalis была выявлена у 5 из 287 женщин (1,7%) и ни у одного мужчины. Все образцы, полученные от пациентов городского КВД (n=33) с диагнозом трихомониаза, были подтверждены как истинно положительные. Результаты оцениваемых тестов и референтного теста совпали для 315 из 317 (99,4%) вагинальных образцов и для 130 из 131 (99,2%) уретральных образцов от мужчин (табл. 9).

Таблица 9 Совпадение результатов тестов на основе МАНК для выявления T. vaginalis

Клинические материалы	Количество образцов с совпадающими результатами всех тестов	Количество образцов с несовпадающими результатами тестов	Уровень совпадения результатов,%
	+	-
Вагинальные образцы (n=317)	33	282	2	99,4
Уретральные образцы от мужчин (n=131)	2	128	1	99,2

Для трех истинно положительных образов, от двух женщин и одного мужчины, ложноотрицательные результаты были получены при анализе с использованием теста ПЦР-эф-Л-TV. Таким образом, чувствительность данного теста составила 94% для вагинальных образцов и 67% для уретральных образцов от мужчин. Чувствительность остальных тестов равнялась 100%. Специфичность всех тестов равнялась 100% (табл. 10).

Таблица 10 Диагностические характеристики тестов на основе МАНК для выявления T. vaginalis

Клинические материалы	Тест	Чувствительность, % [95% ДИ]	Специфичность, % [95% ДИ]
Вагинальные образцы (n=317)	ПЦР-эф-ДT-TV	100 [92-100]	100 [99-100]
	ПЦР-рв-ДT-TV	100 [92-100]	100 [99-100]
	ПЦР-эф-Л-TV	94 [81-99]	100 [99-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-TV	100 [92-100]	100 [99-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-TV	100 [92-100]	100 [99-100]
Уретральные образцы от мужчин (n=131)	ПЦР-эф-ДT-TV	100 [37-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ДT-TV	100 [37-100]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-Л-TV	67 [9-99]	100 [98-100]
	ПЦР-эф-ИЭ-TV	100 [37-100]	100 [98-100]
	ПЦР-рв-ИЭ-TV	100 [37-100]	100 [98-100]

Пределы детекции тестов ПЦР-эф-ДT-TV, ПЦР-рв-ДT-TV, ПЦР-эф-Л-TV, ПЦР-эф-ИЭ-TV и ПЦР-рв-ИЭ-TV составили 1, 1, 5, 1 и 1 копий ДНК на реакцию, соответственно.

2.1.4. Характеристики тестов для выявления M. genitalium

Частота выявления M. genitalium составила 2,5% (7 из 281) среди женщин и 9,6% (12 из 125) среди мужчин. Уровень совпадения результатов оцениваемых и референтных тестов составил 99,3%, 97,5%, 97,6%, 95,1% для вагинальных проб и проб мочи от женщин и уретральных проб и проб мочи от мужчин, соответственно. Дискордантные результаты были получены для 18 проб (табл. 1...