Патогенетические механизмы иммунной дисфункции у новорожденных с респираторными нарушениями

*** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Содержание хемокина RANTES и ростового GM-CSF было достоверно сниженным по сравнению с группой контроля, но содержание RANTES повышалось во все сроки динамического наблюдения. Содержание GM-CSF достоверно снижалось на 3-5 сутки и повышалось к 20-м суткам заболевания по сравнению с первыми сутками.

У новорожденных с РДС по сравнению со здоровыми новорожденными, имело место достоверное снижение уровня NO. Полученные нами данные свидетельствовали об отсутствии системного воспаления без присоединения инфекционного процесса.

Так, проведенные нами исследования иллюстрируют, что у новорожденных с РДС количество моноцитов, экспрессирующих CD14⁺CD282⁺, CD14⁺CD284⁺, CD14⁺⁺ оказалось достоверно сниженным как в относительных, так и абсолютных значениях в сравнении с группой контроля (табл. 14).

Следует отметить, что у анализируемой группы новорожденных детей было достоверно снижено как абсолютное, так и относительное содержание NK(CD3^-CD16⁺56⁺) и T-NK(CD3⁺CD16⁺56⁺) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных.

На 3-5-е сутки динамического наблюдения и к 20-м суткам заболевания не наблюдалось увеличения содержания в периферической крови NK(CD3^-CD16⁺56⁺) и T-NK(CD3⁺CD16⁺56⁺).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженной супрессии клеток, обладающих киллерной активностью.

Таблица 14

Показатели врожденного иммунитета у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Анализ экспрессии молекул адгезии на моноцитах выявил, что у новорожденных с РДС по сравнению с контрольной группой, было достоверно снижено содержание CD14⁺CD11b⁺, CD14⁺CD11с⁺, CD14⁺CD54⁺. Указанный феномен был выражен не только в относительных, но и в абсолютных величинах и в динамике наблюдения (табл. 15).

Таблица 15

Показатели функциональной активности моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с РД на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Таким образом, у новорожденных с РДС была нарушена способность моноцитов к миграции для осуществления основной функции иммунного надзора.

При изучении активационных маркеров CD69⁺, CD71⁺ на моноцитах оказалось, что у новорожденных с РДС было статистически достоверно увеличено содержание CD14⁺CD69⁺, CD14⁺CD71⁺ по сравнению с группой контроля и на 3-5 сутки наблюдения по сравнению с первыми сутками.

В рамках исследования нами было установлено, что количество моноцитов, экспрессирующих FcгRI (CD64) и CR1 (CD35) у новорожденных с РДС было статистически достоверно сниженным относительно группы контроля во все сроки динамического наблюдения.

Установленное нами существенное снижение числа моноцитов, экспрессирующих HLA-DR (CD14⁺HLA-DR⁺), свидетельствует о выраженной редукции функциональной активности моноцитов у новорожденных с РДС.

Указанный феномен отчетливо прослеживается на всем периоде динамического наблюдения. В силу этого можно предположить, что у новорожденных с РДС нарушены процессы распознавания и презентации антигенов.

Анализируя содержание параметров апоптоза AnnexinV⁺ и AnnexinV⁺PI⁺ на моноцитах, было установлено их достоверное повышение относительно группы здоровых новорожденных и сохраняющихся в динамике наблюдения (табл. 16).

Таблица 16

Показатели апоптоза моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Нами установлено, что у новорожденных с РДС, наблюдалось выраженное статистически достоверное угнетение спонтанной и индуцированной НСТ-активности нейтрофилов и моноцитов при одновременном снижении фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ) (табл. 17).

Таблица 17

Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС и здоровых новорожденных

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

Так, снижение показателей стимулированного НСТ-теста свидетельствует о негативном кондиционировании нейтрофилов и моноцитов и их неспособности развить адекватный ответ на антигенную стимуляцию.

Нами были проведены исследования иммунного статуса у 11-ти новорожденных с РДС, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом и закончилось благоприятно с переводом в отделение патологии новорожденных.

Несравненно большую информацию для установления отличительных признаков состояния иммунной системы при РДС документированным сепсисом дали тесты углубленной оценки маркеров врожденного иммунитета. У новорожденных с РДС и документированным сепсисом имело место достоверное снижение экспрессии TLR-2 (CD282⁺) и CD14⁺⁺ на моноцитах периферической крови по сравнению со здоровыми новорожденными. При этом уровень экспрессии TLR-4 (CD284⁺) соответствовал возрастной норме. Так, в процессе динамического наблюдения на 3-5 сутки происходило достоверное снижение CD14⁺⁺ и достоверное повышение TLR-2 (CD282⁺) относительно первых суток наблюдения (табл. 18).

Таким образом, при сепсисе у новорожденных с МАС достоверное увеличение экспрессии TLR-2 (CD282⁺) на моноцитах прослеживается при первоначальных признаках воспаления. Измерение количества CD14⁺CD282⁺ моноцитов может служить ранним маркером развития бактериального осложнения.

Не исключено, что такой высокий уровень экспрессии TLR-2 индуцирует выработку цитокинов, вызывает опосредованный цитокинами апоптоз иммунокомпетентных клеток и различные осложнения.

Таблица 18

Показатели врожденного иммунитета у доношенных новорожденных детей с РДС, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

У новорожденных с РДС и документированным сепсисом отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3^-CD16⁺56⁺) и T-NK(CD3⁺CD16⁺56⁺) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных (табл. 18). В процессе динамического наблюдения продолжалось достоверное снижение NK(CD3^-CD16⁺56⁺) и T-NK(CD3⁺CD16⁺56⁺) во все сроки наблюдения.

Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что эта особенность эффекторного звена иммунного реагирования, по-видимому, свидетельствует о напряжении защитной функции натуральных киллеров на фоне бактериальной инфекции и может лежать в основе сниженной резистентности новорожденных детей к инфекционным агентам.

Анализ относительного количества HLA-DR⁺ на моноцитах периферической крови, отражающих состояние презентации антигена Т-лимфоцитам, выявил достоверное снижение данного параметра у новорожденных с РДС и документированным сепсисом по сравнению со здоровыми новорожденными (65,07±1,51% и 86,07±0,92%). К 3-5 суткам динамического наблюдения наблюдалось достоверное снижение CD14⁺HLA-DR⁺ по сравнению с первыми сутками (38,78±1,59% и 65,07±1,51%, соответственно) (р<0,05). К 20-м суткам заболевания уровень экспрессии HLA-DR⁺ моноцитами периферической крови составил 50,47±2,57%, однако нормализации указанного параметра не происходило.

Таким образом, достоверно сниженная экспрессия CD14⁺HLA-DR⁺ на мембранах моноцитов у данной когорты новорожденных с высокой определенностью указывает на фактор риска развития бактериальных осложнений.

Таблица 19

Показатели апоптоза лимфоцитов и моноцитов у доношенных новорожденных детей с РДС, осложненных бактериальным сепсисом без летального исхода и здоровых новорожденных в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению со здоровыми статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 3-5-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

*** - различия показателей новорожденных с РДС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с 20-ми сутками статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Вилкоксона).

Как показали результаты проведенных нами исследований, у новорожденных с РДС и документированным сепсисом отмечалась чрезмерная гибель пула клеток (лимфоцитов и моноцитов), а воспалительные процессы у этих новорожденных развивались на фоне интенсивного апоптоза иммунокомпетентных клеток (табл. 19).

Таким образом, развившийся сепсис у новорожденных с МАС и РДС имеет однотипные изменения иммунной системы, вне зависимости от того, на каком фоне он развился.

Развитие воспалительного процесса в легких и реализация механизмов защиты легочной ткани от повреждения также во многом определяются функциональной активностью альвеолярных макрофагов.

Макрофаги легкого активно участвуют в формировании специфического иммунитета путем синтеза цитокинов и медиаторов, играющих роль регуляторов иммунного ответа. Известно, что альвеолярные макрофаги играют основную роль в легочной защите и элиминации бактерий из легких.

Нашими исследованиями установлено, что доля альвеолярных макрофагов в БАЛ оказалась достоверно ниже у новорожденных с МАС и РДС относительно здоровых новорожденных (61,81±1,23% и 62,05±0,86% против 81,83±2,51%, соответственно) (р<0,05).

При этом необходимо отметить, что на первые сутки наблюдения достоверных различий между новорожденными с МАС и РДС по содержанию альвеолярных макрофагов не выявлялось. Однако к 3-5 суткам наблюдения происходило заметное снижение содержания альвеолярных макрофагов у новорожденных с МАС и РДС, при этом у новорожденных с МАС верифицировался достоверно более низкий уровень содержания альвеолярных макрофагов (36,18±1,9% и 45,75±1,39%, соответственно) (р<0,05).

Как показали результаты в динамике проведенных нами исследований, у новорожденных с МАС и РДС к 20-м суткам заболевания отмечался незначительный прирост содержания альвеолярных макрофагов, который носил не достоверный характер и не достигал нормативных значений (43,62±1,23% и 53,5±0,88% против 81,83±2,51%, соответственно). К 20-м суткам заболевания у новорожденных с МАС содержание альвеолярных макрофагов было достоверно ниже относительно группы с РДС (43,62±1,23% и 53,5±0,88%, соответственно) (р<0,05).

У новорожденных с МАС и РДС были выражены воспалительные изменения в трахеобронхиальном дереве, что подтверждалось высоким содержанием провоспалительных цитокинов (табл. 20).

Сравнительная характеристика цитокинов в БАЛ выявила, что у доношенных новорожденных с РДС содержание IL-1в в бронхоальвеолярном лаваже, аспирированном после поступления новорожденных в отделение реанимации, оказалось достоверно выше по сравнению с новорожденными с МАС (табл. 20). Небезинтересно, что к 3-5 суткам происходило увеличение продукции этого цитокина у новорожденных с РДС и МАС, однако при этом уровень IL-1в оставался достоверно выше у новорожденных с РДС и коррелировал с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (r_s=0,47, p=0,04). Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания регистрировалось снижение продукции IL-1в в обеих группах, однако у доношенных новорожденных с РДС уровень IL-1в достоверно отличался от уровня новорожденных с МАС.

Таблица 20

Содержание цитокинов и хемокинов у новорожденных детей с МАС и РДС в бронхоальвеолярном лаваже в динамике наблюдения

Примечание: * - различия показателей новорожденных с МАС на 1-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 1-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

** - различия показателей новорожденных с МАС на 3-5-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 3-5-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

*** - различия показателей новорожденных с МАС на 20-е сутки наблюдения по сравнению с новорожденными с РДС на 20-е сутки наблюдения статистически обоснованы с ошибкой первого рода р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

Продукция IL-6 - мультифакториального протеина, продуцируемого активированными альвеолярными макрофагами, у новорожденных с РДС была достоверно выше по сравнению с новорожденными с МАС на 1-е сутки наблюдения. На 3-5 сутки у новорожденных с РДС и МАС отмечалось увеличение содержания IL-6, причем различия между группами носили достоверный характер. При этом высокий уровень IL-6 у новорожденных с РДС на 3-5-е сутки динамического наблюдения коррелировал с высокой концентрацией IL-8 в сыворотке крови (r_s=0,44, p=0,04) и сниженной продукцией хемокина RANTES (r_s=0,46, p=0,04). Необходимо отметить, что у новорожденных с МАС высокое содержание IL-6 в БАЛ имело корреляционную зависимость с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (r_s=0,58, p=0,02) и корреляционную зависимость с низким уровнем RANTES в сыворотке крови (r_s=0,5, p=0,02).

Примечательно, что к 20-м суткам заболевания имело место снижение продукции IL-6, как маркера активности воспаления, в обеих группах и достоверных различий между ними не наблюдалось, хотя концентрация данного цитокина оставалась на высоком уровне у новорожденных с МАС и РДС. В этих группах также отмечена положительная клиническая динамика: дыхательная недостаточность разрешилась, и новорожденные были экстубированы.

Наиболее высокие показатели IL-8 отмечены на 3-5 сутки наблюдения у новорожденных с РДС и МАС. К 20-м суткам заболевания регистрировалось напротив снижение содержания в БАЛ IL-8 в обеих группах, однако у новорожденных с РДС содержание IL-8 было все же достоверно выше относительно группы новорожденных с МАС.

Динамика содержания TNF-б в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС была следующей: нами не отмечено достоверных отличий содержания TNF-б в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС на момент поступления новорожденных в отделение реанимации. При этом обнаружена корреляционная связь между TNF-б в БАЛ у новорожденных с РДС и TGF-в в сыворотке крови на первые сутки наблюдения (r_s=0,47, p=0,03).

На 3-5 сутки динамического наблюдения высокий уровень TNF-б в БАЛ у новорожденных с МАС коррелировал с высоким содержанием IL-6 в сыворотке крови (r_s=0,5, p=0,05).

Высокий уровень TGF-в в БАЛ у новорожденных с РДС на первые сутки наблюдения коррелировал с высоким содержанием TNF-б в сыворотке крови (r_s=0,46, p=0,04). К 3-5 суткам динамического наблюдения наблюдалось увеличение продукции TGF-в в БАЛ в обеих группах новорожденных. Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания уровень TGF-в снижался в обеих группах, оставаясь у новорожденных с МАС достоверно выше относительно группы с РДС.

Нами было установлено, что у новорожденных с РДС имело место достоверное снижение содержания RANTES в БАЛ относительно группы с МАС во все сроки динамического наблюдения. Такое низкое содержание RANTES в БАЛ может свидетельствовать о нарушении физиологического процесса экспансии активированных клонов лимфоцитов в ткани легкого при РДС.

Следует особо подчеркнуть, что у новорожденных с МАС выявлена корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на первые сутки наблюдения и TNF-б в сыворотке крови (r_s=0,52, p=0,04), корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TNF-б в сыворотке крови (r_s=0,55, p=0,03), обратная корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TGF-в в сыворотке крови (r_s= -0,52, p=0,02).

Таким образом, резюмируя представленные результаты исследования, необходимо заключить, что при аспирации ферменты, соли желчных кислот и жиров в меконии новорожденных являются индуктором серьёзного химического воспаления лёгких, которое сопровождается повышением продукции IL-1в, IL-6, IL-8, TNF-б, RANTES и снижением количества альвеолярных макрофагов. Полученные нами данные согласуются с работами Cayabyab R.G. et al., (2007) и Okazaki K et al., (2008), которые утверждают, что меконий вызывает химическую пневмонию сходную с бактериальной.

Оценка продукции цитокинов в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС выявила различные варианты цитокиновой регуляции.

Выявленные нарушения свидетельствуют в большей степени о важной роли провоспалительных цитокинов и хемокинов в патогенезе дыхательных расстройств у новорожденных, обусловленных мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.

Используя полученные данные, можно контролировать степень выраженности и течение воспалительного процесса в легких.

Для клинического использования нами предложены новые способы и разработаны алгоритмы прогнозирования развития и исхода септических осложнений у новорожденных с МАС и РДС (рис. 1 и рис. 2).

Сложность патогенеза, глубина иммунных повреждений указывают на невозможность быстрого восстановления нарушенных функций иммунной системы.

На основании изложенного выше материала можно сделать вывод, что расшифровка тонких механизмов патогенеза повреждений иммунной системы у новорожденных с респираторными нарушениями открывает перспективу разработки новых методов профилактики бактериальных осложнений.

Схема 1 Алгоритм раннего прогнозирования септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями

Схема 2 Алгоритм прогнозирования исхода септических осложнений у новорожденных с респираторными нарушениями

ВЫВОДЫ

1. Выявлены патогенетически значимые изменения в иммунном статусе у новорожденных с респираторными расстройствами, обусловленными МАС и РДС, проявляющиеся иммуносупрессией клеточного и гуморального звеньев иммунной системы (снижение количества CD3⁺CD19^-, CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺, CD3^-CD19⁺, концентрации IgG) c одновременным угнетением цитотоксических реакций, маркируемых CD3^-CD16⁺56⁺ и CD3⁺CD16⁺56⁺, наиболее выраженные у новорожденных с МАС.

2. Реакция адаптивного иммунитета в образцах крови новорожденных с респираторными нарушениями характеризуется усилением экспрессии маркеров активации CD25⁺, CD69⁺, CD71⁺, CD-HLA-DR⁺, CD95⁺ в общей популяции лимфоцитов и моноцитов и снижением экспрессии CD4⁺CD25⁺ и CD16⁺CD25⁺, а также усилением процессов раннего (Annexin V⁺) и позднего апоптоза (Annexin V⁺PI⁺) лимфоцитов и моноцитов периферической крови, наиболее выраженная в образцах крови новорожденных с МАС.

3. При респираторных нарушениях, обусловленных МАС и РДС, выявлены высокие уровни IL-1в, IL-6, IL-8, TNF-б в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже, при сниженном уровне NO и разнонаправленное содержание IFN-г и IFN-б.

4. В периферической крови новорожденных с респираторными нарушениями выявлены низкие уровни хемокина RANTES и GM-CSF наряду со снижением экспрессии CD14⁺⁺_, TLR-2 (CD14⁺CD282⁺) и TLR-4 (CD14⁺CD284⁺).

5. Неэффективный хемотаксис и фагоцитоз в крови новорожденных с респираторными нарушениями верифицировался снижением CD14⁺CD11b⁺, CD14⁺CD11c⁺, CD14⁺CD54⁺, а также СD14⁺СD64⁺ и СD14⁺СD35⁺ и сочетался со снижением кислородзависимого механизма микробицидн...