Эксперименты проведены на 58 беспородных взрослых собаках обоего пола весом от 6 до 30 кг. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Тюменской Государственной Медицинской Академии. Все экспериментальные животные разделены на 4 группы (Таблица 2).

Таблица 2 Группы экспериментальных животных

Группа	Название и методика	Количество животных
I	Контрольная группа: модель открытой травмы ПЖ без повреждения Вирсунгова протока железы	9
II	Контрольная группа: модель открытой травмы ПЖ с повреждением Вирсунгова протока	9
III	Криоаппликация раны ПЖ без повреждения Вирсунгова протока	20
IV	Криоаппликация раны поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока	20
	Всего	58

1. На 9 животных создана модель открытой травмы поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока. Выполнялась срединная лапаротомия, в рану выводилась правой доля поджелудочной железы, скальпелем наносилась сквозная рана длиной 1см по краю поджелудочной железы в продольном направлении (чтобы избежать повреждения Вирсунгова протока), в случае кровотечения из раны гемостаз достигался прижатием области раны салфетками, либо прошиванием кровоточащего края раны (только с гемостатической целью). Сама рана поджелудочной железы не ушивалась. После чего брюшная полость ушивалась наглухо (рис.2).

Рис.2 Проекция раны поджелудочной железы в опыте создания модели открытой раны поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока.

2. На 9 животных второй группы моделирована рана поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока, то есть сквозная рана наносилась в поперечном направлении длиной 1см по середине правой доли поджелудочной железы (рис.3).

Рис.3 Проекция раны поджелудочной железы в опыте создания модели открытой раны поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока.

3. У 20 животных третьей группы после нанесения раны поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока выполнялась локальная криоаппликация раны поджелудочной железы криоаппликатором из пористого никелид-титана с рабочей поверхностью 1см в диаметре, охлажденным до -195 градусов по Цельсию в течении 120 секунд в жидком азоте (Гиршин Г.С., 1983).

4. У 20 животных четвертой группы после нанесения открытой травмы поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока выполнялась криоаппликация всей правой доли поджелудочной железы криоаппликатором из пористого никелид-титана по 120 секунд в каждой точке, за исключением участков прилежащих к двенадцатиперстной кишке, чтобы не вызвать некроза ее стенки.

Все животные прошли необходимый карантин, к эксперименту допускались только здоровые взрослые животные без признаков беременности. Для премедикации, выполняемой внутримышечно, использовали атропин, димедрол и аминазин, дозируя препараты на 1кг массы тела. Премедикация осуществлялась за 25-30 мин до начала наркоза и предназначалась для снятия у животных напряжения, агрессии и для уменьшения саливации. Все операции выполнялись только под наркозом. Осуществляли его путем внутримышечного введения кетамина в дозе 20 мг/кг. Основной наркоз осуществляли путем дробного введения внутримышечно кетамина в дозе 5-10 мг/кг, аминазина. После премедикации и вводного наркоза животному выбривали шерсть на передней брюшной стенке и взвешивали его для более точного дозирования препаратов. Собаку фиксировали лежа на спине к операционному столу. Обработка операционного поля проводилась раствором йодоната и спирта. Для поддержания необходимой глубины наркоза через каждые 25-30 минут повторяли введение кетамина из расчета 5 мг\кг. Средняя продолжительность операции составила 50 минут. Операцию выполняли бригадой из 4 человек (хирург, ассистент, анестезиолог, операционная сестра) в операционной экспериментально-хирургического отдела ЦНИЛ с соблюдением правил асептики.

Тотчас после завершения операции или в конце ее животному вводили дыхательный аналептик (этимизол). С начала 2-х суток оперированные животные получали воду, а с 3-х суток переводили сначала на питание кашами, с 5 суток на обычный рацион.

У каждого животного до операции и в дальнейшем через 1,3,7,14,21,60 суток осуществлялся забор крови для биохимического исследования.

После операций животных выводили из опыта для забора материала на 1,3,7,14,21,30,60, сутки. Забор материала осуществляли в одно и то же время суток, животное перед выведением из опыта не кормили. Собаку вводили в наркоз внутриплевральной инъекцией тиопентала натрия в дозе 50мг\кг и осуществляли эвтаназию струйным внутриплевральным введением раствора бриетала, в дозе, заведомо превышающей LD₁₀₀.

Сроки наблюдения во всех сериях опытов были стандартны и составили 2 часа; 1-3-7-14-21-30-60 сутки. Эти периоды взяты на основании закономерностей раневого процесса в области криогенной травмы. собаки выводились из эксперимента путем эвтаназии (внутривенное введение больших доз тиопентала натрия). Труп животного подвергали секции.

Во время секции оценивались изменения в брюшной полости, устанавливались изменения всей брюшины (наличие ферментативного перитонита). Оценивались степень выраженности рубцовых (спаечных) изменений, остаточных явлений, изменение тканей самой поджелудочной железы. Далее производился забор материала для микроскопического исследования, обычно участок поджелудочной железы, подвергшийся травме и криовоздействию, фиксировали в 10% растворе формалина на 3 суток.

Во время проведения опыта проводилась оценка разработанных критериев эффективности выполненной методики:

1. Состояние экспериментального животного в ближайший послеоперационный период, наличие или отсутствия клинических признаков осложнений (кровотечения, перитонита и т.д.), проявляющиеся вялостью, сонливостью, отсутствием аппетита, неадекватностью поведения животного, отсутствием реакции на внешние раздражители, двигательная активность и питание.

2. Оценка биохимических показателей крови в сроки: через 1-3-7-14-21-30-60 сутки.

3. Критерии макроскопической оценки изменений при вскрытии животного после выведения животного из эксперимента:

- присутствие признаков повторного кровотечения - наличие в брюшной полости свежей и старой крови.

- наличие или отсутствие признаков перитонита.

- выраженность или отсутствие спаечного процесса.

- состояние раны на поджелудочной железе и выраженность рубцовых изменений.

- реакция брюшины и прилегающих органов (тонкий кишечник, большой сальник, желудок, желчный пузырь);

- наличие некроза и нагноения раны поджелудочной железы

Микроскопические исследования проводили на базе Централизованного патологоанатомического отделения 2 ОКБ г. Тюмени (зав. отделением - врач высшей категории Золотухин В.М.), при участии врача-патологоанатома высшей категории Якимова С.А. и врача- патологоанатома Розбаева А.А., а также на базе кафедры патологической анатомии Тюменской Государственной Медицинской Академии (заведующий кафедрой профессор Бычков В.Г.) при непосредственном участии кандидата медицинских наук доцента Молоковой О.А.. По истечении сроков фиксации в формалине кусочки поджелудочной железы заливали в парафин. Всего было изготовлено 58 парафиновых блоков. Изготавливали серийные срезы толщиной 3-4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по Слинченко

Подвергнуто изучению по 100 гистологических срезов на каждую окраску.

При изучении препаратов оценивали качественный состав клеток, описывали изменения стромы и паренхимы поджелудочной железы, состояние цитоплазмы и степень некробиоза, наличие отсутствие лизиса ядер, воспалительный процесс и его клеточный состав, изучали последовательность формирования соединительной ткани на месте погибшей ткани поджелудочной железы, процесс регенерации ткани поджелудочной железы.

На каждый препарат составлялся протокол, где были представлены визуальная характеристика зоны формирующегося рубца, количественные параметры клеточного состава по конкретным срокам наблюдения. Выполняли микрофотографии по каждой серии опыта и каждому сроку.

Кроме того, изучался биохимический состав крови каждого животного, основными объектами изучения взяты такие показатели, как амилаза и сахар, на базе биохимической лаборатории ОКБ № 2 г. Тюмени.

Методика создания модели открытой травмы поджелудочной железы.

У всех животных перед началом экспериментов забиралась кровь в пробирки для проведения биохимических анализов.

Первая серия опытов: модель открытой травмы поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока.

Выполняется срединная лапаротомия. В рану выводится правая доля поджелудочной железы животного, обкладывается салфетками (рис.4)

Рис. 4 На снимке неизмененная правая доля поджелудочной железы.

По краю поджелудочной железы в продольном направлении наносится сквозная рана длиной 1см с диастазом краев раны 0.1-0.2см. В случае возникновения небольшого кровотечения рана прижимается салфетками до гемостаза, при неудачной попытке остановки кровотечения прижатием накладывается шов на кровоточащий край раны, при этом сама рана не ушивается. После гемостаза брюшная полость ушивается наглухо.

Вторая серия опытов: модель открытой травмы поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока.

Во второй серии опытов создавали модель открытой травмы поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока. После срединной лапаротомии выведения в рану правой доли поджелудочной железы наносили сквозную рану скальпелем по середине доли поджелудочной железы размерами 1см (рис.5), с тем, чтобы вызвать повреждение Вирсунгова протока. Кровотечение также останавливали прижатием салфетками, либо прошиванием одного из краев раны.

Рис.5 Рана поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока.

Перед проведением этой серии опытов была изучена анатомия протоковой системы поджелудочной железы собак, установлено, что главный проток поджелудочной железы собак, как правило, проходит продольно, по середине вдоль обеих долей поджелудочной железы.

Для того, чтобы убедиться, что Вирсунгов проток при данной локализации раны был действительно поврежден, после гибели животных выполняли катетеризацию холедоха через просвет двенадцатиперстной кишки, общий желчный проток у ворот печени перевязывался и под давлением поршня шприца вводили метиленовую синь, при этом появлялось прокрашивание области раны поджелудочной железы метиленовой синью (рис 6).

Рис.6 После нанесения раны через холедох проведен катетер и через него введена метиленовая синь - через поврежденный проток окрашивание раны.

Третья серия опытов: криоапликация раны поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока.

В третьей серии опытов также моделировалась открытая травма поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока, после чего выполнялась локальная криоаппликация поврежденного участка поджелудочной железы с помощью криоаппликатора из пористого никелид-титана с использованием в качестве хладагента жидкого азота. Криовоздействие осуществлялось в течение 120 секунд, этого времени оказывалось достаточно для гемостаза и формирования ледяного шарика на всю толщу поджелудочной железы животного (рис.7).



Рис.7 Вид поджелудочной железы после нанесения раны и криоаппликации поврежденного участка поджелудочной железы.

Четвертая серия опытов: криоаппликация поджелудочной железы с поврежденным Вирсунговым протоком.

В четвертой серии опытов после лапаротомии моделировалась рана правой доли поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока. После чего выполнялась криоаппликация в первую очередь самой раны с целью гемостаза, и криоаппликация в нескольких точках по всей правой доле с тем, чтобы вызвать охлаждение всей правой доли поджелудочной железы для угнетения экзокринной функции. При этом криовоздействие ограничивали в области двенадцатиперстной кишки, чтобы не вызвать некроза ее стенки. В каждой точке криоаппликация длилась 120 секунд. После оттаивания контролировали гемостаз области раны поджелудочной железы и на этом операцию заканчивали.

2.3 Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных проводилась при помощи профессиональных компьютерных статистических пакетов Statistica for Windows 4.3 (StatSoft Inc., USA). Согласно наиболее распространенному алгоритму анализа биомедицинской информации (Лакин Г.Ф., 1990; Гмурман В.Е., 2000; Омельченко В.П., 2001) первоначально производился расчет базовых параметров:

1. Исключение из результатов наблюдений грубых погрешностей (промахов) и известных систематических погрешностей;

2. Вычисление среднего арифметического М (математического ожидания) результатов прямых измерений с учетом известных систематических погрешностей;

3. Расчет средней квадратической ошибки () среднего арифметического для большой (n30) или малой (n30) выборки данных;

4. Оценка наибольшей возможной ошибки отдельного измерения по правилу «трех сигм», т.е. отклонение случайной величины от среднего значения по абсолютной величине, если случайная величина распределена по нормальному закону, не должна превосходить утроенного значения среднего квадратического отклонения ;

5. Определение точности прямого измерения - абсолютной величины разности между истинным значением измеряемой величины и средним выборочным;

6. Записывается доверительный интервал измеряемой величины, и с учетом этого интервала фиксируется окончательный ответ.

В качестве методов оценки распределения измеряемых величин использовали критерий согласия Колмогорова и ² (Пирсона) (Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 2003). В исследованиях доверительный интервал принимался равным 95%, уровень значимости =0,05 (Гланц С., 1998). В диссертационном исследовании результаты обработки измерений представлены в виде М, где М - среднее, а - среднее квадратическое отклонение измеряемой величины. Использование записи Mm, где m - стандартная ошибка среднего, на наш взгляд, не представлялось возможным вследствие того, что m стремится к нулю при увеличении количества измерений, что не может обеспечить адекватную оценку ширины распределения измеряемой величины в случае биомедицинских исследований (Флетчер Р. и др., 1998; Платонов А.Е., 2000).

В случае соответствия изучаемого распределения нормальному или квазинормальному распределению по примененным критериям согласия для оценки достоверности различий в опытной и контрольной группах использовали методы параметрической статистики, позволяющие сравнить как достоверность различия математического ожидания (критерий Стьюдента для независимых выборок), так и достоверность различия дисперсий выборок (критерий Фишера-Снедекора), при этом данные считали достоверно различными при р0,05 (Гмурман В.Е., 2000; Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 2003; Платонов А.Е., 2000).

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Результаты макроскопического и микроскопического исследования в первой серии опытов: при открытой травме поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока

В первой серии опытов создана контрольная группа из 9 животных, на которых моделирована открытая травма поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока.

Из 9 оперированных животных этой группы 5 (55,6%) погибло в сроки от 3 до 5 суток. Причиной смерти явился разлитой ферментативный перитонит. Во время секции в брюшной полости был выявлен геморрагический выпот, кишечник был вздут, в области раны поджелудочной железы был обнаружен некроз, вся поджелудочная железа была отечна, брюшина тусклая, с множественными кровоизлияниями.

4 (44,5%) оставшихся животных выжили. В послеоперационном периоде животные отказывались от пищи в течении 7-8 суток, были вялые.

У выживших животных на аутопсии через сутки в брюшной полости изменений практически не было, выпот не определялся, в зоне раны было небольшое количество геморрагического выпота.

При микроскопическом исследовании в первые сутки в области раны определяется кровоизлияние небольших размеров. Вокруг него сформировался пропитанный нейтрофилами инфильтрат, окружающий это кровоизлияние по всему периметру (Рис. 8).



Рис. 8. 1-е сутки после операции. Кровоизлияние, вокруг которого воспалительная инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

В мелких сосудах в пограничной зоне выраженное полнокровие, лимфостаз. В области раны диффузное пропитывание тканей эритроцитами (Рис. 9).

Рис. 9. 1 сутки. Диффузное пропитывание тканей эритроцитами в области раны. Окраска по Слинченко. Увел. 7х40..

В области раны секреторная паренхима некротизирована, границы ацинусов были хорошо видны, однако ядра клеток разрушены. В виде узкого пояска выявлялись сохранные ацинусы, расположенные по краю поврежденной дольки (Рис. 10).



Рис. 10. 1 сутки. Некроз ацинусов в области раны, по периферии ацинусы сохранены. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

На 3 сутки после операции у животных в брюшной полости определялся выпот геморрагического характера в относительно умеренном количестве (150-200 мл.). К области ранения рыхло подпаяны сальник, кишечник. Сама область раны на поджелудочной железе инфильтрирована, отечная, плотная, с кровоизлиянием.

При микроскопическом исследовании на 3 сутки в области раны поджелудочной железы, выявляется гематома с некрозом в центре. Вокруг гематомы ткань железы находилась в состоянии некроза (Рис 11).

Рис.11 3 сутки. Гематома с перифокальным некрозом в области раны поджелудочной железы.Увел 7х10.

В некотором отдалении от раны выявляются выраженные нарушения кровообращения, проявляющиеся отеком, плазморрагией, мелкоточечными кровоизлияниями и полнокровием сосудов в междольковой соединительной ткани (Рис.12).

Рис.12 3 сутки. Выраженные нарушения кровообращения, отек, плазморрагия, мелкоточечные кровоизлияния в междольковой соединительной ткани. Полнокровие сосудов междольковой соединительной ткани. Увел7х10.

Через 7 суток в брюшной полости от 50 до100 мл прозрачного геморрагического выпота. В области раны поджелудочной железы определялся плотный инфильтрат, подпаянные к ране сальник и петли кишечника разделяются с трудом. Дольчатость строения ткани поджелудочной железы в зоне раны и рядом с ней практически не определяется.

При микроскопическом исследовании через 7 сут после операции в области раны сохраняется кровоизлияние, выраженный отек соединительной ткани (Рис. 13).



Рис. 13. 7 сутки после операции. Кровоизлияние в области раны, отек междольковой соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Через 14 суток в брюшной полости следы геморрагического выпота, сохраняется описанный выше инфильтрат в зоне раны поджелудочной железы, хотя менее плотный. При микроскопическом исследовании отмечалось формирование соединительнотканного рубца. Рубец незрелый, состоял из грубых коротких коллагеновых волокон. Рубец очень плотный, содержал большое количество межуточного вещества, волокон мало. В составе рубца выявлялось большое количество новообразованных мелких капилляров (Рис. 14).

Рис. 14. 14 сутки после операции. Незрелый соединительнотканный рубец состоит из коротких коллагеновых волокон, много мелких новообразованных капилляров. Окраска по Слинченко. Увел. 7х40.

Через 21 сут после операции в брюшной полости выпота нет. Поджелудочная железа в зоне повреждения уплотнена, сохраняется спаечный процесс.

При микроскопическом исследовании в области раны отчетливо сформировался соединительнотканный рубец. Степень его зрелости недостаточная. Он отличался плотным расположением коллагеновых волокон, сохранялись мелкие кровеносные сосуды (Рис. 15).

Рис. 15. 21 сутки после операции. Незрелый соединительнотканный рубец в области раны. Окраска по Слинченко. Увел. 7х40.

Начался процесс пролиферации железистого компонента. В составе рубца выявлены мелкие новообразованные выводные протоки железы (Рис. 16).

Рис. 16. 21 сутки после операции. Мелкие новообразованные выводные протоки. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

В большом количестве по краю рубца появились очень мелкие железы, по размерам соответствующие ацинусам, с хорошо выраженным просветом, которые, возможно дифференцируются в ацинусы (Рис. 17).

Рис. 17. 21 сутки после операции. Новообразованные мелкие железы с просветом выявляются по краю рубца. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х100.

На границе с рубцом выявлены крупные по размерам ацинусы с яркой эозинофильной цитоплазмой, представляющие собой гипертрофированные ацинусы (Рис. 18).

Рис. 18. 21 сутки после операции. Гипертрофированные ацинусы на границе с рубцом в сохранных дольках. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х100.

Новообразованные железистые дольки на границе рубца и сохраненной паренхимы перестали выявляться. При этом восстановилось типичное строение долек железы. Границы долек стали определяться четче, вокруг них прослеживалась междольковая соединительная ткань. Ацинусы, расположенные по краю дольки, на границе с соединительнотканным рубцом образовывали сплошной массив, лежали на близком расстоянии друг от друга. Вероятно, это были участки дольки, восстановившие свое строение за счет завершения дифференцировки эпителиальных клеток в секреторные, с образованием ацинусов (Рис.19).

Рис.19. 30 сутки после операции. Сплошной массив из новообразованных ацинусов по краю дольки на границе с рубцом. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

При выведении из эксперимента на 60 сутки на секции был обнаружен выраженный спаечный процесс в брюшной полости, плотный конгломерат в области поджелудочной железы, состоявший из плотно спаянных кишечника, поджелудочной железы и сальника.



Рис.20 Секция 60 сутки. Плотный спаечный конгломерат в области правой доли поджелудочной железы. Рана поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока. Контроль.

На 60 сутки микроскопически зона повреждения определялась только по наличию рубцовых изменений. Железистые дольки имели разные формы и размеры, некоторые имели неправильную форму, состояли из нескольких ацинусов. Эти изменения долек железы свидетельствуют об их атрофических изменениях. Атрофичные дольки были разделены широкими соединительнотканными прослойками. Это и есть зона рубца. Она представлена соединительнотканной прослойкой, идущей через весь микропрепарат (Рис.21).

Рис.21. 60 сутки после операции. Широкие прослойки соединительной ткани. Атрофированные дольки железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Таким образом, в контрольной группе животных, где создана модель открытой травмы поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока из 9 животных выжили 4 (44,5%). В динамике развития формирования рубца можно увидеть, что заживление раны поджелудочной железы идет через воспалительный процесс, что подтверждается гистологическими исследованиями. Вокруг раны формируется плотный клеточный инфильтрат, состоящий из нейтрофилов. Однако в дальнейшем, после стихания воспалительных явлений, формирование рубца и регенерация тканей поджелудочной железы идет по обычному пути.

3.2 Результаты макроскопического и микроскопического исследования второй серии опытов: создание модели открытой травмы поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока

Во второй серии опытов создана контрольная группа из 9 животных, на которых моделирована открытая травма поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока.

В этой группе погибли все 9 животных (100%) в сроки от 3 до 5 суток. На секции обнаружены признаки ферментативного перитонита с довольно большим количеством геморрагического выпота, кишечник вздут, брюшина тусклая, выраженный отек поджелудочной железы с признаками геморрагического панкреонекроза. Область раны зияла, края ее были некротизированы (Рис.22).



Рис. 22 3 сутки после операции. Явления ферментативного перитонита. Аутопсия.

При микроскопическом исследовании погибших на третьи сутки животных выявлен полный ферментативный лизис долек железы. В препарате на большом протяжении определялась только соединительнотканная строма, которая обнажилась после разрушения секреторной паренхимы. Оставшаяся паренхима выявлялась в виде небольших островков среди отечной соединительнотканной стромы. Воспалительная инфильтрация стромы практически не выражена, определялись единичные лимфоидные элементы (Рис.23).

Рис 23. 3 сутки после операции. Обнажившаяся строма на месте некротизированной экзокринной паренхимы. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Рис.24 3 сутки после операции. Вирсунгов проток в области раны поджелудочной железы. Отсутствует эпителиальная выстилка. Стенка протока отечна, коллагеновые волокна набухшие, гомогенные. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10

В области раны поджелудочной железы выявляется поврежденный Вирсунгов проток, в котором отсутствует эпителиальная выстилка. Стенка протока отечна, коллагеновые волокна набухшие, гомогенные (рис.24).

Таким образом, при повреждении Вирсунгова протока развивается ферментативный перитонит, приводящий к гибели экспериментальных животных. Микроскопически на месте поврежденной ткани поджелудочной железы остается обнажившаяся строма, как результат некроза клеток ацинусов.

3.3 Результаты макроскопического и микроскопического исследования в третьей серии опытов: криоаппликация раны поджелудочной железы

В третьей серии опытов на 20 животных исследованы последствия лечения сверхнизкими температурами открытой травмы поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока.

В данной группе 20 животных, выжили все. В послеоперационном периоде к концу первых суток животные ходили по клетке, пили воду, к 3 суткам принимали обычную пищу.

В этой группе для изучения процессов заживления раны выполнялась эвтаназия в следующие сроки: через 2 часа, 1-3-7-14-21-30-60 суток.

Через 2 часа с момента оперативного вмешательства в брюшной полости небольшое количество геморрагического выпота, в области раны поджелудочной железы отек, кровоизлияние темно-вишневого цвета до 1.7 см в диаметре (после криоаппликации).



Рис.25 2 часа после операции. Отек, плазморрагия междольковой соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином Увеличение 7х10.

При микроскопическом исследовании через 2 часа после криоаппликации раны дольковое строение железы не нарушено. Отмечалось выраженное расширение междольковых септ за счет их отека и белкового пропитывания (Рис. 25).

В междольковой соединительной ткани диффузное геморрагическое пропитывание, а также другие нарушения кровообращения, проявляющиеся полнокровием артериол и венул, расширением лимфатических сосудов. Наряду с геморрагическим пропитыванием выявлены очаговые кровоизлияния разного размера(Рис 26).

Рис.26 2 часа после операции. Массивное кровоизлияние в междольковой соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.



Рис.27 2 часа после операции. Коагуляционный некроз ацинусов, выраженное полнокровие капилляров в соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином.. Увел. 7х10.

Значительно пострадала и экзокринная паренхима.

Условно в микроскопической картине можно было выявить 3 зоны с разной степенью морфологических изменений.

1 зона- собственно повреждения, некротические изменения в ней были выражены очень сильно. В дольках имелись очаги, где структура некоторых ацинусов была полностью нарушена. Они находились в состоянии коагуляционного некроза. Отчетливо выявлялись контуры ацинусов, но ядра в секреторных клетках разрушены, цитоплазма имела интенсивный розовый цвет. В межацинарной соединительной ткани просвет капилляров расширен, в них выявлялся стаз эритроцитов (Рис. 27). Островки Лангерганса в этой зоне не определялись.

2 зона - пограничная. Деструктивные изменения в ней выражены в меньшем объеме. Четко определялись границы ацинусов, в которых многие секреторные клетки были сохранны. Полнокровие стромы выражено в меньшей степени. Островки Лангерганса тоже в состоянии казеозного некроза (рис.28)



Рис.28 2часа после операции. Структура ацинусов нарушена в меньшей степени, многие секреторные клетки не повреждены. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

Рис.29. 2 часа после операции. Неповрежденная часть железы. Умеренные нарушения кровообращения. Неповрежденные островки Лангерганса. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

3 зона- неизмененная ткань. Структура ацинусов полностью сохранилась. Секреторные клетки имели четко выраженные ядра, расположенные асимметрично, зимогенные гранулы в цитоплазме сохранялись. Нарушения кровообращения были умеренно выражены, в основном в виде полнокровия капилляров. Островки Лангерганса не повреждены (рис.29). Обращает на себя внимание тот факт, что макроскопически все отмеченные зоны при микроскопии находятся в пределах непосредственного воздействия криоаппликатора.

Через сутки после операции в брюшной полости обнаруживалось до 50 мл геморрагического выпота, к месту ранения был рыхло припаян сальник и брыжейка тонкой кишки, сохранялось темно-вишневое окрашивание места криоаппликации.

При микроскопическом исследовании преобладали деструктивные изменения, особенно в 1 зоне повреждения. Далее ближе к краю зоны криоаппликации определялись сохраненные островки экзокринной паренхимы, сама строма железы отечная (Рис. 30).

Рис.30. 1 сутки после операции. Сохраненные островки экзокринной паренхимы среди отечной стромы железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

К третьим суткам послеоперационного периода выпота в брюшной полости практически не определялось, к месту ранения также подпаяны тонкий кишечник и сальник, сохранялся небольшой отек тканей поджелудочной железы в зоне травмы и криоаппликации. При гистологическом исследовании по - прежнему четко выявлялись 3 зоны поврежденных тканей поджелудочной железы в зоне воздействия криоаппликатора.

В 1 зоне - собственно повреждения - деструктивные изменения преобладали. Дольки органа были полностью лизированы, при этом обнажалась отечная, пропитанная белками и геморрагическим экссудатом строма (рис 31). Нарушения кровообращения были выражены в достаточной степени. Сохранялись массивные очаговые кровоизлияния.

Рис. 31. 3 суток после операции. Отечная строма, пропитанная белковым и геморрагическим экссудатом. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Во 2 -ой переходной зоне дольки железы практически полностью были сохранены, в междольковой соединительной ткани выявлялись выраженные нарушения кровообращения в виде геморрагического пропитывания, полнокровия сосудов (рис 32).

Рис. 32 3 сутки после операции. Сохраненные дольки в пограничной зоне. Геморрагическое пропитывание междольковой соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Увел 7х10 .

Начиная с этого срока, стала развиваться репаративная регенерация. Она началась типично для органов желудочно-кишечного тракта - с пролиферации железистого компонента. На границе с некрозом выявлены единичные трубчатые образования мелкого и очень мелкого диаметра (рис. 33).

Рис. 33. 3 сутки после операции. Единичные новообразованные железистые трубочки на границе с некрозом. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

К 7 суткам полностью сформировался спаечный инфильтрат без признаков абсцедирования в зоне ранения поджелудочной железы, а микроскопически деструктивные изменения сохранялись. Происходила секвестрация участков железы с уплотнением, коагуляцией некротических масс. При гистологическом исследовании это выглядело, как образование многочисленных мелких плотных тяжей из погибшей ткани (рис.34). Эти участки диффузно пропитаны лейкоцитами, лимфоцитами, плазматическими клетками. Встречались участки, где сохранялось геморрагическое пропитывание.



Рис. 34. 7 сутки после операции. Секвестрация погибших участков экзокринной паренхимы. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Появились тонкие, новообразованные коллагеновые волокна, формирующие тонкие соединительнотканные прослойки (рис. 35). Эти изменения соответствовали развитию неполной репаративной регенерации с формированием соединительнотканного рубца.

Рис.35 7 сутки после операции. Соединительнотканные прослойки среди некротических масс. Окраска гематоксилином и эозином. Увел 7х20 7 сутки после операции.

На границе с очагом некроза дольки имели неправильную форму, образовывая как бы выросты в зону некроза. Вокруг этих выростов междольковая соединительная ткань не выявлялась. Пролиферация эпителия отмечалась также и в эпителии крупного выводного протока. Эпителий протока образовывал множественные сосочковые выросты (папилломатоз) в просвет протока и железы (аденоматоз) в толще стенки.

В соединительнотканной оболочке выводного протока выявлены множественные новообразованные железистые трубочки небольшого диаметра, выстланные сочным однорядным кубическим эпителием.

К 14 суткам обнаружить саму рану поджелудочной железы практически невозможно. Ее местонахождение определили только по подпаянной к месту криоаппликации брыжейке тонкой кишки и сальнику.

Микроскопически сохранялась выраженная воспалительная инфильтрация, клеточный состав которой представлен лимфоцитами, гистиоцитами, фибробластами. Сохранялись нарушения кровообращения, проявляющиеся диффузным геморрагическим пропитыванием некротических участков и полнокровием сосудов междольковой соединительной ткани, даже в интактной зоне. Регенераторные процессы выражены отчетливо. Сформировался первичный соединительнотканный рубец, состоящий из длинных и коротких грубых коллагеновых волокон. Первоначально рубец начал формироваться в переходной зоне, на границе с неповрежденной тканью железы (Рис36).

Рис. 36. 14 сутки после операции. Зрелый рубец, состоящий из коротких коллагеновых волокон. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Параллельно с этим активно регенерировала экзокринная паренхима. На границе зоны некроза с дольками выявлены множественные пролиферирующие эпителиальные клетки, формирующие тяжи из железистых долек в которых просвет отсутствовал (Рис. 37).

Рис. 37. 14 сутки после операции. Железистые трубочки на границе долек с зоной некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

Ближе к границе дольки железистые трубочки больше напоминали ацинусы. Ядра в клетках смещены к периферии, цитоплазма большого объема, розового цвета. Данное явление, по-видимому, можно расценить как дифференцировку эпителиальных клеток в секреторные с образованием типичных ацинусов (рис38).

Рис. 38. 14 сутки после операции. Дифференцировка эпителиальных клеток в секреторные клетки ацинусов. Окраска гематоксилином и эозином. Увел.7х40.

Там же выявлялись и кистовидно расширенные железы (рис.39).

Рис. 39. 14 сутки после операции. Кистовидно расширенные новообразованные железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

Развивалась репаративная регенерация нервных волокон. В составе междольковой соединительной ткани выявлено нервное волокно, подросшее к рубцу (рис. 40).

Рис. 40. 14 сутки после операции. Регенерировавшее нервное волокно. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20

В зоне повреждения оставались участки секвестрации ткани железы, пропитанные воспалительным инфильтратом. Процесс образования соединительнотканного рубца в этой зоне еще продолжался. Отмечены участки грануляционной ткани с мелкими кровеносными сосудами. Выявлены кистозно расширенные лимфатические сосуды (рис. 41).

Рис. 41. 14 сутки после операции. Расширенные лимфатические сосуды в рубце. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

На 21 сутки в брюшной полости выпот не определялся. Сохранялся спаечный процесс в зоне оперативного вмешательства, воспалительных инфильтратов не определялось.

Микроскопически регенерационные процессы как в паренхиме, так и в строме были выражены активно. Пролиферирующий железистый эпителий появился в зоне соединительнотканного рубца. Железистый эпителий протоков по-прежнему активно пролиферировался и образовывал множественные железистые разрастания в толще стенки.

Процессы формирования железистых трубочек продолжались на всем протяжении пограничной зоны. Образовывались тяжи, состоящие из желез разного диаметра, имеющих кистовидно расширенный просвет. Они были окружены небольшими прослойками соединительной ткани (Рис.42).



Рис.42 21 сутки после операции. Тяжи из новообразованных желез имеют кистовидно расширенный просвет. Новообразованный выводной проток в рубце.

Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Впоследствии в эпителиальных тяжах формировались железы с просветом (Рис. 43).

Рис.43. 21 сутки после операции. Новообразованные железы с просветом в соединительнотканном рубце. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

Наряду с процессами пролиферации эпителия и коллагеновых волокон в зоне рубца продолжалось новообразование сосудов. Новообразованные артериолы и венулы имели большие размеры, утолщенные стенки (Рис.44).



Рис.44. 21 сутки после операции. Новообразованные артериолы и венулы в рубце. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

В первой зоне - некротических изменений - продолжали выявляться некротические массы однородного розового цвета, напоминающие белок. Они были отграничены зоной воспалительного инфильтрата, преобладающими клетками которого были лимфоциты. В этих участках формирование соединительнотканного рубца продолжалось. Среди некротических масс выявлялись коллагеновые волокна в виде рыхлых тяжей (рис.45).

Рис. 45. 21 сутки после операции. Незрелый соединительнотканный рубец в зоне повреждения.Множество капилляров, коллагеновые волокна лежат рыхло. Окраска гематоксилином и эозином. Увел.7х10.

Крупные кровоизлияния подвергались инкапсуляции, эритроциты в них подвергались распаду с образованием гемосидерина (Рис.46).

Рис.46. 21 сутки после операции. Соединительнотканная капсула вокруг кровоизлияния. Местный гемосидероз ткани железы . Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10. .

В соединительнотканном рубце выявлены пролиферирующие нервные стволики (Рис.47).

Рис. 47 21 сутки после операции. Пролиферирующие нервные стволики в рубце. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

Через 30 суток после операции регенераторные процессы в зоне повреждения и в пограничной зоне продолжали развиваться. Репаративная регенерация со стороны экзокринной паренхимы и дальнейшее формирование соединительнотканного рубца были взаимосвязаны.

В некоторых новообразованных дольках структура ацинусов выражена хуже. Контуры новообразованной дольки прослеживались, междольковая соединительная ткань была выражена, однако секреторные клетки находились в состоянии дистрофии и некроза, так как ядра имели нечеткие границы, в некоторых клетках они были разрушены. Вероятно, такие изменения обусловлены нежизнеспособностью новообразованной дольки, подвергшейся атрофии (Рис.48).

Рис. 48 30 сутки после операции. Подвергающаяся атрофии новообразованная железистая долька. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.



Рис. 49. 30 сутки после операции. Крупные гипертрофированные ацинусы на границе с рубцом, в других участках ацинусы более мелкие. Нервные стволики в рубце. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40.

Третий вид изменений со стороны секреторных клеток заключался в том, что на границе с рубцом некоторые ацинусы были более крупных размеров, состояли из гиперхромных секреторных клеток (Рис.49). Эти изменения можно расценить как компенсаторную регенерационную гипертрофию, возникающую в ответ на разрушение экзокринной паренхимы. В других отдаленных от зоны повреждения участках секреторные клетки были обычных размеров. В эпителиальной выстилке протоков пролиферация эпителия перестала выявляться. Продолжались процессы созревания соединительной ткани в рубце. По строению рубец оставался неоднородным. Он стал более рыхлым, содержал крупные кровеносные сосуды, встречались диапедезные мелкоточечные кровоизлияния (Рис.50).

Рис.50. Рыхлая соединительная ткань рубца с крупными кровеносными сосудами. Окраска по Слинченко. Увел 7х40. 30 сутки после операции.

В рубце были выявлены нарушения кровообращения в виде полнокровия и лимфостаза. Продолжалась регенерация нервных волокон, проявлявшаяся врастанием в рубец нервных стволиков.

Через 60 суток микроскопическая картина изменилась. Железистые дольки хорошо определялись, В неповрежденной зоне они были разделены узкими прослойками соединительной ткани. Регенераторных процессов со стороны паренхимы не выявлено.

В зоне повреждения выявлен соединительнотканный рубец, в составе которого определялись атрофированные дольки железы и нервные стволики (Рис.51). Поэтому описанные изменения можно считать остаточными изменениями.

Рис. 51. 60 сутки после операции. Прослойки соединительной ткани между атрофированными дольками с нервными стволиками. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Таким образом, при использовании сверхнизких температур в лечении открытой травмы поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока все животные выжили. Послеоперационный период протекал относительно легко. Заживление раны поджелудочной железы идет практически без воспалительных явлений, клеточный воспалительный инфильтрат в зоне раны не выражен. Уже с 3 суток отмечена регенерация ткани поджелудочной железы. К 21 суткам практически сформирован соединительнотканный рубец без остаточных воспалительных изменений. К концу 60 суток послеоперационного периода в поджелудочной железе выявлялись остаточные изменения, проявляющиеся формированием небольшого соединительнотканного рубца.

Репаративные процессы в экзокринной части паренхимы характеризовались развитием компенсаторной регенерационной гипертрофии секреторных ацинусов на границе с рубцом.

3.4 Результаты макроскопического и микроскопического исследования в четвертой серии опытов: криоаппликация поджелудочной железы с поврежденным Вирсунговым протоком

В четвертой серии опытов на 20 животных исследованы последствия лечения сверхнизкими температурами открытой травмы поджелудочной железы с повреждением Вирсунгова протока.

Клинически у этой группы из 20 животных послеоперационный период протекал более тяжело. Одно животное (5%) в послеоперационном периоде погибло через сутки после криоаппликации. На секции выявлен панкреонекроз, ферментативный перитонит. Это был один из первых экспериментов, при анализе протокола операции выяснилось, что криоаппликация выполнена в недостаточном объеме (только место нанесения раны), в связи с чем и наступило указанное осложнение, в дальнейшем выполнялась криоаппликация всей правой доли поджелудочной железы, что дало хорошие результаты.

У остальных животных к концу третьих суток стал появляться аппетит, однако до 5 суток животные оставались вялые, больше спали. Полностью состояние нормализовалось к 7 суткам.

На секции согласно срокам через 2 часа после операции примерно такая же картина, что и в третьей серии опытов.

Через сутки в брюшной полости обнаружено до 150-200 мл выпота, вся правая доля поджелудочной железы резко увеличена в объеме, отечная, темно-вишневого цвета, идет формирование рыхлого конгломерата из кишечника, сальника и правой доли поджелудочной железы, хотя явных признаков ферментативного перитонита нет.

Рис.52 2 часа после операции. Геморрагическое пропитывание междольковой соединительной ткани Окраска гематоксилином и эозином увел 7х10.

При микроскопическом исследовании в междольковой соединительной ткани, так же, как и в третьей серии опытов, диффузное геморрагическое пропитывание, а также другие нарушения кровообращения, проявляющиеся полнокровием артериол и венул, расширением лимфатических сосудов (Рис.52).

Через трое суток сохранялся выпот в брюшной полости, геморрагического характера, ткань поджелудочной железы вишневого цвета, плотная, спаяна рыхло с кишечником, брыжейкой, сальником. Микроскопически изменился и характер воспалительной экссудации, он стал фибринозно-гнойным (Рис. 53)



Рис. 53. 3 суток после операции. Фибринозно-гнойный экссудат в зоне деструкции. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х40 .

К 7 суткам выпот в брюшной полости определялся в незначительном количестве, в тканях правой доли поджелудочной железы сохранялся отек, довольно плотный конгломерат из правой доли поджелудочной железы и большого сальника. Микроскопически воспаление приобрело подострый характер, так как изменился состав воспалительного экссудата. Значительно уменьшилось количество нейтрофильных лейкоцитов, появились фибробласты. Фибробласты хаотично, тяжами врастали в зону деструктивно-воспалительных изменений (Рис. 54).

Рис.54. 7 сутки после операции. Активная пролиферация фибробластов в зоне деструктивно-воспалительных изменений. Окраска гематоксилином и эозином. Увел 7х20.

К 14 суткам общая реакция брюшины полностью купирована, выпота нет, сохраняется конгломерат в области правой доли поджелудочной железы, при разделении которого, к ране поджелудочной железы очень плотно припаян участок сальника, а от самой поджелудочной железы сальник довольно легко отделился. Сохранялся отек поджелудочной железы. Микроскопически в зоне повреждения рубец менее зрелый, инфильтрирован клетками воспалительного экссудата (рис. 55).

Рис. 55. 14 сутки после операции. Незрелая соединительная ткань. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х20.

К 21 суткам сохранялся выраженный спаечный процесс в зоне правой доли поджелудочной железы, однако без признаков абсцедирования, следов кровоизлияния практически нет.

Рис.56. 21 сутки после операции. Группа новообразованных желез окружена соединительнотканной капсулой. Окраска гематоксилином и эозином.. Увел. 7х20.

Микроскопически среди фиброзной ткани выявлен проток среднего калибра, с кистообразно расширенным просветом, выстланный высоким гиперхромным железистым эпителием. Он имел выраженную соединительнотканную стенку, в которой определялись новообразованные железы. Появление такого протока в соединительнотканном рубце можно рассматривать как положительное явление, свидетельствующее о восстановлении системы выводных протоков железы. Рядом с этим протоком выявлялись тоже новообразованные мелкие железы в виде тяжей или гнезд. Именно эти новообразованные железы можно рассматривать как источники новообразования выводных протоков железы. Часть из этих желез подвергнется дифференцировке в ацинусы, часть запустеет (Рис.56)..

К 30 суткам воспалительный процесс в брюшной полости практически не выражен, поджелудочная железа оставалась довольной плотной, дольчатость ее практически не определялась, к зоне ранения был плотно припаян сальник и петли кишечника.

Рис. 57. 30 сутки после операции. Группы ацинусов среди соединительнотканного рубца на границе с неповрежденной экзокринной паренхимой. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 7х10.

Микроскопически впервые на этом сроке выявлены изолированные мелкие структуры, напоминающие дольки железы, состоящие из 2-3 ацинусов, окруженные тонкой прослойкой соединительной ткани. Эти образования выявлены в составе соединительнотканного рубца (Рис.57). Структура клеток в ацинусе соответствовала нормальной. Клетки имели эксцентрично расположенные ядра, розового цвета цитоплазму, маленький просвет.

На 60 сутки после операции в брюшной полости обнаруживалась примерно та же картина, что и на 30 сутки. Спаечный процесс менее выражен, ткань правой доли поджелудочной железы все еще оставалась довольно плотной, лишь рядом с двенадцатиперстной кишкой сохраняла свою обычную структуру (область, где криоаппликация не выполнялась).

Микроскопически зона повреждения определялась только по наличию рубцовых изменений (рис. 58).

Рис. 58. 60 сутки после операции. Рыхлая соединительная ткань в рубце. Новообразованные нервные стволики. Окраска по Слинченко. Увел. 7х10.

Таким образом, восстановительные процессы в этой серии эксперимента характеризовались развитием неполной рапаративной регенерации сформированием в области раны соединительно-тканного рубца.

Процесс регенерации экзокринной паренхимы выражен в меньшей степени, чем при криоаппликации раны поджелудочной железы без повреждения Вирсунгова протока. При этом происходило новообразование мелких выводных протоков, способствующее восстановлению системы выводных протоков железы.

На основании морфологической картины в течение восстановительного послеоперационного периода при криохирургическом лечении травм поджелудочной железы можно выявить 3 стадии.

Первая стадия деструктивно - воспалительная продолжается до седьмых суток. Характеризуется развитием деструкции долек железы, выраженными нарушениями кровообращения. Воспаление, начиная с третьих суток приобретает характер острого фибринозно - гнойного, к седьмым суткам оно переходит в подострое.

Вторая стадия - восстановительных изменений развивается с седьмых по тридцатые сутки. Характеризуется развитием регенераторных процессов и в паренхиме, и в строме. В железе развивается неполная репаративная регенерация с недостаточным объемом регенераторных процессов в паренхиме и формированием нежного соединительнотканного рубца в строме. Регенерация железистого компонента осуществляется за счет пролиферации железистого эпителия с образованием трубочек на границе с разрушенной тканью железы, в междольковой строме, в стенке выводных протоков, в рубце. Ранним проявлением регенераторных процессов является образование кистевидно расширенной полости, которая отграничивает зону деструкции. Первоначально регенераторные процессы развиваются в пограничной зоне, в то время как в зоне собственно повреждения продолжают до двадцать первых суток выявляться очаги секвестрации паренхимы. По мере формирования соединительнотканного рубца в нем появляются тяжи из пролиферирующих эпителиальных клеток, железистые трубочки. С двадцать первых суток начинается дифференцировка железистых трубочек в ацинусы. За счет этого границы долек становятся четкими, вокруг них восстанавливается междольковая соединительная ткань. Новообразованные ацинусы имеют более яркую цитоплазму и более гиперхромные ядра. Некоторые ацинусы по периферии долек подвергаются регенерационной гипертрофии, за счет чего увеличиваются их размеры, они лежат более плотно друг к другу.

Соединительнотканный рубец образовывается не сразу. Наиболее быстро процессы созревания и резорбции соединительнотканного матрикса рубца идут в пограничной зоне. Развитие рубца в зоне собственно повреждения задерживается за счет длительного сохранения очагов деструкции паренхимы и очаговых кровоизлияний, которые постепенно подвергаются инкапсуляции. К концу этого периода формируется нежный волокнистый рубец, который прослеживается на протяжении зоны повреждения и пограничных изменений. Выраженного объема репаративная регенерация железистого компонента не достигает, восстановления исходного состояния железы не происходит. В зоне повреждения и в пограничной зоне выявляются атрофичные, деформированные дольки. В составе соединительнотканного рубца выявляются деформированные дольки, группы, состоящие из нескольких ацинусов, новообразованные ацинусы, подвергающиеся атрофии. В остальной части железа не изменена. Островковая ткань железы распределена более или менее равномерно, некоторые островки Лангерганса гиперплазированы.

...