1.3 Применение сверхнизких температур в хирургии ПЖ

Низкая эффективность имеющихся методов лечения ППРПЖ свидетельствует о том, что первоочередной задачей в лечении этого вида повреждений является адекватное устранение ферментной агрессии с сохранением эндокринной функции железы. Одним из методов, позволяющих выполнять операции в соответствии с данными требованиями, является применение сверхнизкой температуры (Кандель Э.И., 1974; Долецкий А.С., 1975; Альперович Б.И., 1983; Альперович Б.И. и др., 1989, 2003; Adam R. et al., 1998; Gage A.A., 1998).

Первые сообщения о воздействии сверхнизких температур на ПЖ опубликованы А. Carraro (1910). Клинико-морфологические исследования во время экспериментальной криоаппликации участков ПЖ осуществляли Э.И. Кандель (1974), А.С. Долецкий (1975), Б.И. Альперович с соавт. (1982, 1983), I. Fraser, W. Gill (1967) и ряд других исследователей. Впервые в мировой практике криовоздействие на измененной ПЖ в клинике (при лечении панкреонекроза) осуществлено Б.И. Альперовичем и Н.В. Мерзликиным в Томском медицинском институте в 1982 году (Альперович Б.И. и др., 1982). В том же году А.А. Шалимов сообщил о ряде оперативных вмешательств на ПЖ (при остром и хроническом панкреатите, опухолях ПЖ) с использованием криовоздействия (Шалимов А.А. и др., 1982).

Одним из наиболее важных вопросов, касающихся применения сверхнизких температур в хирургии ПЖ, является изучение морфологических изменений в тканях железы, возникающих при криовоздействии. По данным большинства авторов морфологические изменения в зоне криовоздействия характеризуются следующими особенностями: наблюдается развитие локализованного асептического коагуляционного некроза, который подвергается резорбции и замещению рыхлой соединительной тканью с формированием рубца на 3-5 неделе после криовоздействия (Альперович Б.И. и др., 1982; Альперович Т.Б. и др., 1985; Махнев А.В. и др., 2005; Chev W.Y., 1999); участки ПЖ после криовоздействия не подвергаются нагноению (Долецкии А.С., 1976; Мерзликин Н.В., 1984; Альперович Т.Б. и др., 1985; Clarke D.M., 1999); нет выраженной клеточной реакции на очаг некроза (Пачес А.И. и др., 1978; Альперович Б.И. и др., 1985; Махнев А.В. и др., 2005).

Механизмы репаративных процессов и особенности их течения в нормальных и патологических тканях после криогенного разрушения мало изучены, хотя исследование этих процессов очень важно для проблемы применения низкотемпературного воздействия на ПЖ (Пачес А.И. и др., 1978; Пермяков Н.К. и др., 1983; Rossi R.L., 1990). В отношении регенераторных процессов в ПЖ большинство авторов считают, что пограничные по отношению к центру криовоздействия участки ПЖ как менее поврежденные являлись источником репаративных процессов, которые развертывались по трем направлениям (Пушкарь Я.С., Сандомирский Б.П., 1982; Пермяков Н.К. и др., 1983; Патютко Ю.И. и др., 2001; Gage A.A., 1998):

а) внутриклеточная регенерация частично поврежденных ацинарных клеток;

б) пролиферация эпителия сохранившихся протоков;

в) активация фибробластов с образованием соединительнотканной капсулы.

Существенным при криовоздействии на ПЖ является то, что сохраняется соединительнотканный каркас железы, чего нет после резекционных вмешательств. Сохранение стромы органа важно для регенерации экзокринной части ПЖ в достаточном объеме, а также для восстановления островков Лангерганса (Жарков В.П. и др., 1995, 1996; Gage A.A., 1998).

Экспериментальные исследования показали, что в результате замораживания живых тканей вовлеченные в очаг деструкции сосуды поражаются неодинаково. Мелкие сосуды - артериолы, капилляры и венулы - тромбируются, а стенка их подвергается некрозу. Более крупные сосуды, особенно артерии, страдают в меньшей степени и их стенки сохраняют свою анатомическую структуру благодаря резистентности к холоду эластических и коллагеновых волокон. Последние остаются в виде каркаса, на котором происходит регенерация стенки сосуда. Поэтому, несмотря на выраженные морфологические изменения, кровоток в сосудах сохраняется и они продолжают выполнять свою функцию (Кандель Э.И., 1974; Долецкий А.С. и др., 1976; Пушкарь Я. С., Сандомирский Б.П., 1982; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Berger W.K., 2001).

Многочисленные исследования Э.И. Канделя (1974) доказали, что при криовоздействии на нервное волокно сверхнизкими температурами происходит гибель последнего с полным прекращением проводимости по нему. При этом наступают необратимые дегенеративные изменения в нервных стволах и окончаниях (Кандель Э.И., 1974). Установлено также, что в нервных стволах наступают необратимые дегенеративные изменения, достигающие максимума к седьмым суткам после криовоздействия. Аналогичные изменения наблюдаются в чувствительных нервных окончаниях (Мерзликин Н.В., 1984; Альперович Т.Б. и др., 1985; Burdiles P., 2001).

Таким образом, после криовоздействия на ПЖ развивается локализованный асептический коагуляционный некроз, который подвергается резорбции и замещению рыхлой соединительной тканью на 3-5 неделе после криовоздействия, причем участки крионекроза в послеоперационном периоде не подвергались нагноению, также не было выраженной клеточной реакции на очаг некроза. Одним из наиболее важных моментов при криовоздействии на ПЖ является то, что сохраняется соединительнотканный каркас ПЖ, что важно для последующей регенерации экзокринной части и островков Лангерганса.

Важным моментом в оценке влияния сверхнизких температур на ПЖ является исследование экзо- и эндокринной функции железы после криоаппликации. После криовоздействия при значительном снижении уровня экзокринной секреции эндокринная остается удовлетворительной. Гипергликемия, развивающаяся в первые 2 суток после криоаппликации ПЖ, имеет временный характер и не требует специальной коррекции. Нарушение функции пищеварения, связанное с выключением секрета ПЖ, компенсируется через 1,5 месяца, а поскольку регенерация экзокринной паренхимы выражена слабо, а на пищеварение это катастрофически не влияет, можно допустить, что утраченная функция ацинозной ткани восполняется в других отделах пищеварительного тракта (Долецкии А.С., 1975; Савельев В.С. и др., 1983; Альперович Т.Б. и др., 1985; Альперович Б.И., Мерзликин Н.В., 1988; Альперович Б.И. и др., 1989, 2000; Патютко Ю.И. и др., 2001).

Таким образом, криовоздействие на ткань ПЖ характеризуется незначительными и обратимыми изменениями показателей, характеризующих экзо- и эндокринной функцию.

Важным для оценки влияния криовоздействия на ПЖ является определение зависимости степени повреждения тканей ПЖ от температуры замораживания.

Изучая в эксперименте влияние низких температур на экзо- и эндокринный аппарат ПЖ, установлено, что при криовоздействии с температурой инструмента от +35 до +5°С угнетается лишь экзокринная функция железы без каких-либо структурных нарушений. Криовоздействие при температуре от +5 до -20°С сопровождается отеком, воспалением и последующей деструкцией экзокринной ткани, а при температуре от -20°С и ниже гибнет как экзокринная, так и эндокринная ткань. Приведенные данные свидетельствуют о высокой чувствительности панкреатической ткани к криовоздействию и дают основания полагать, что критический порог находится в интервале субнулевых температур (Шалимов А.А. и др., 1982; Альперович Б.И. и др., 1985; Шалимов С.А. и др., 1991; Патютко Ю.И. и др., 2001;).

В результате проведенных экспериментальных исследований было установлено, что наиболее чувствительной к криовоздействию оказалась ацинарная ткань ПЖ. Критическая температура ее определена в интервале от -2,1 до +1,5°С, а критическая скорость охлаждения ткани составляет 1-3°С/мин. Данные значения параметров объясняют практически полное совпадение размеров зоны замораживания и развивающегося некроза в пределах погрешности метода измерения. Данный факт существенно облегчает прогностическую оценку размеров развивающегося некроза, т.е. в качестве ориентиров зоны будущего некроза могут служить границы зоны замораживания (Белоус А.М., Бондаренко В. А., 1981; Шалимов С.А. и др., 1991; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995).

Наиболее важным вопросом при проведении криоаппликации на ПЖ, непосредственно контактирующей с двенадцатиперстной и тонкой кишкой, желудком, является вопрос о доступности вовлечения в зону воздействия стенки полого органа, так как от этого зависят безопасность и адекватность проведенной криооперации. По данным большинства авторов, для исключения некроза стенки полого органа необходимо соблюдение условия, чтобы температура в зоне контакта железы с полым органом не снижалась ниже критического порога, т.е. -25°С, либо чтобы видимая зона замораживания не распространялась ближе 3 мм до стенки органа (Долецкии А.С., 1975; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Патютко Ю.И. и др., 2001; Marshall M., 1996). В результате многочисленных экспериментальных исследований определена закономерность распределения температуры в зоне криовоздействия. При статистической обработке полученных результатов найдены следующие значения: критическая температура для стенки двеннадцатиперстной кишки равна -25,7±7,7°С, разность зон замораживания и некроза составила 3,6±0,7 мм, т.е. изотерма криоповреждения стенки полого органа находится на этом расстоянии от края видимой зоны замораживания (Филиппов Ю.П. и др., 1977; Пачес А.И. и др., 1978; Шалимов С.А. и др., 1991; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Патютко Ю.И. и др., 2001; Mazur P., 1970; Bilichik A.J., 2000)

При микроскопическом исследовании выявлена меньшая чувствительность протоковой системы ПЖ к криовоздействию, чем ацинозной ткани (Долецкии А.С., 1975; Патютко Ю.И. и др., 2001). Внепеченочные желчные пути оказались также устойчивыми к криовоздействию. По экспериментальным данным, даже криовоздействие при температуре -170°С в течение 5-7 мин на структурах ворот печени не вызывало последующих функциональных нарушений. После оттаивания печеночно-двенадцатиперстной связки с ее элементами возобновлялись кровоток и пассаж желчи по общему желчному протоку, ни в одном случае нарушений целости как протока, так и воротной вены не отмечено (Кандель Э.И., 1974; Долецкии А.С., 1975; Патютко Ю.И. и др., 2001; Pistorius G., 1999).

При изучении криорезистентности магистральных сосудов, в частности воротной и нижней полой вен, было выявлено, что обе эти вены оказались очень устойчивыми к глубокому замораживанию при температуре -179°С с полным прекращением кровотока в течение 5-7 мин; при этом геморрагические, а также тромботические осложнения не возникали. Исходя из этого, большинство исследователей считают, что непосредственная близость крупных сосудов при выполнении криооперации на ПЖ не является лимитирующим фактором и противопоказанием к криовоздействию (Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Pistorius G., 1999).

Таким образом, различия в показателях критических температур тканей ПЖ обусловливают возможность избирательного криовоздействия на экзо- и эндокринную паренхиму ПЖ. Важным является и то, что стенки полых органов имеют низкую резистентность к воздействию низких температур, что необходимо учитывать при расчете параметров криовоздействия, крупные сосуды и желчные пути, наоборот, имеют высокую резистентность к воздействию низких температур, что позволяет производить манипуляции вблизи них без риска развития осложнений.

Необходимо обратить внимание на основные эффекты воздействия низких температур на ПЖ по данным отечественных и зарубежных исследователей: криовоздействие обеспечивает снижение интенсивности болевого синдрома; подавляет секрецию ПЖ; снижает скорость метаболизма и ферментативного катализа; нормализует интраорганную гемодинамику; приостанавливает активность ферментов; снижает внутрипротоковую гипертензию; снижает скорость обменных процессов в железе и потребность тканей в кислороде, что увеличивает их толерантность к гипоксии; приводит к выключению функции охлаждаемого органа, что создает условия для его физиологического покоя; обеспечивает гемостаз; оказывает антибактериальное и противовоспалительное действие (Пачес А.И. и др., 1978; Пушкарь Я.С., Сандомирский Б.П., 1982; Земсков В.С. и др., 1988; Ермолов А.С. и др., 2000; Иванов Н.В. и др., 2004; Schuder G., 2000; Yang W.H., 2000).

Суммируя работы ученых, занимающихся криохирургией, можно сформулировать преимущества криохирургического воздействия (Кандель Э.И., 1974; Долецкии А.С., 1975; Пушкарь Я.С., Сандомирский Б.П., 1982; Альперович Б.И. и др., 1985, 2000, 2004): метод позволяет полностью разрушить заданный объем ткани как на поверхности, так и в глубине органа; очаг некроза после криовоздействия четко отграничен от окружающих тканей и обладает «биологической инертностью», вызывая лишь минимальную перифокальную реакцию; хороший «гемостатический» эффект метода; криовоздействие не вызывает грубых рубцовых процессов в очаге; по сравнению с экзокринной частью меньше страдает островковая часть; высокая резистентность стенки крупных сосудов к криовоздействию позволяет осуществлять криохирургические вмешательства вблизи магистральных артерий и вен; метод не требует специальной дорогостоящей аппаратуры и высокого уровня специализации персонала хирургического стационара; метод позволяет максимально сохранить анатомию окружающих органов; процесс регенерации ткани и формирования рубца после отторжения очага крионекроза развивается гораздо раньше, чем при использовании других «разрушающих» методов; сохраняется соединительно-тканный каркас поджелудочной железы. Сохранение стромы органа очень важно для регенераторного процесса, особенно для восстановления островков Лангерганса; локальное замораживание ткани может быть произведено без какого-либо повреждения здоровых клеток, окружающих очаг крионекроза.

Таким образом, криовоздействие на ПЖ позволяет быстро и эффективно купировать ферментную агрессию, которая является причиной большого числа осложнений, а также позволяет избирательно подавить функцию экзокринного аппарата при сохранении функции островков Лангерганса, поэтому не приводит к выраженным нарушениям углеводного обмена, т.к. в зонах гипотермии, окружающих фокусы холодового некроза, сохраняются и функционируют островки Лангерганса. Также криоаппликация, являясь органосохраняющей операцией, обеспечивает сохранение адекватного соединительно-тканного каркаса для последующей регенерации экзокринной части ПЖ в достаточном объеме.

На основании представленного аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы можно сделать следующее заключение. Одной из важнейших характеристик травматической эпидемии в настоящее время является значительное увеличение числа ЗТЖ. Повреждения органов живота продолжают оставаться одной из важнейших проблем ургентной хирургии, так как вопросы диагностики и хирургической тактики у пострадавших с ЗТЖ еще далеки от окончательного разрешения, а летальность среди больных с рассматриваемой патологией остается высокой.

В последнее время среди всех ЗТЖ отмечается рост числа ЗТПЖ, имеющих одни из наиболее высоких показателей частоты развития осложнений и летальности среди всех повреждений органов брюшной полости. Наиболее тяжелым видом ЗТПЖ является ППРПЖ ввиду трудности диагностики, частых сочетанных повреждений. ППРПЖ относятся к чрезвычайно тяжелым формам хирургической патологии, т.к. при них высокая частота и тяжесть осложнений. ППРПЖ занимает особое место в группе ЗТПЖ ввиду высокой, не имеющей тенденции к снижению, летальности. Необходимость хирургического лечения ППРПЖ в настоящее время общепризнанна. Лечение ППРПЖ является одной из наиболее сложных проблем ургентной хирургии. Все операции, предложенные для лечения ППРПЖ имеют свои недостатки. В послеоперационном периоде часто возникают тяжелые осложнения, основное место из которых, занимают ТПН и сахарный диабет. Необходимо отметить, что основными механизмами возникновения специфических осложнений после операций при ППРПЖ являются неадекватное подавление экзокринной функции железы и удаление части ПЖ, ответственной за эндокринную функцию. Следовательно, для снижения частоты развития осложнений, улучшения непосредственных и отдаленных результатов лечения этой группы необходима разработка таких методов лечения, которые сочетали бы в себе органосохраняющую направленность и адекватное подавление экзокринной функции ПЖ.

Одним из методов, позволяющих быстро и эффективно купировать ферментную агрессию является применение сверхнизких температур, которое позволяет избирательно подавить функцию экзокринного аппарата при сохранении функции островков Лангерганса, поэтому не приводит к выраженным нарушениям углеводного обмена. Немаловажно и то, что криоаппликация, являясь органосохраняющей операцией, обеспечивает сохранение адекватного соединительно-тканного каркаса для последующей регенерации экзо- и эндокринной частей ПЖ в достаточном объеме.

Таким образом, остается неосвещенным вопрос о возможностях применения криовоздействия на ПЖ в качестве метода лечения ППРПЖ. Указаний на использование криовоздействия для лечения ППРПЖ в эксперименте в отечественной и зарубежной литературе нет.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая характеристика эксперимента

Для изучения эффективности предлагаемого метода лечения ППРПЖ с использованием криоаппликации была выполнена серия экспериментальных исследований, на проведение которых получено разрешение Комитета по этике при ГОУ ВПО ТюмГМА (выписка из протокола заседания Комитета от 9 февраля 2005 года).

Большинство авторов, занимающихся экспериментальной хирургией ПЖ утверждают, что наиболее подходящим животным для моделирования патологии ПЖ и разработки методов оперативного вмешательства на ней является собака, которая и выбрана нами в качестве экспериментального животного (Лопухин Ю.М., 1971; Лоскутова З.Ф., 1980; Баранов В.Г. и др., 1983; Шалимов С.А. и др., 1989).

Исследование проведено на базе экспериментально-хирургического отдела ЦНИЛ ТюмГМА на 50 беспородных взрослых собаках обоего пола весом от 8 до 16 кг и ростом в холке от 40 до 60 см. Больные, травмированные собаки, щенки и щенные суки, собаки с повышенной возбудимостью для экспериментальных операций не использовались.

Все животные проходили необходимый карантин и находились в стандартных условиях содержания при естественном световом режиме и свободном доступе к воде. Кормили собак 2 раза в день по нормам, установленным приказом МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». За 12 часов до операции животные лишались пищи при оставлении свободного доступа к воде.

Для премедикации, выполняемой путем внутримышечной инъекции, использовали смесь атропина (0,1% раствор из расчета 0,05 мг/кг массы тела), димедрола (1% раствор из расчета 1,5 мг/кг массы тела), дроперидола (0,25% раствор из расчета 0,5 мг/кг массы тела), аминазина (2,5% раствор из расчета 2,5 мг/кг массы тела) и анальгина (50% раствор из расчета 70 мг/кг массы тела). Премедикация осуществлялась за 30 мин до начала наркоза и предназначалась для снятия у животных напряжения, агрессии, уменьшения саливации, кроме того, премедицированные животные требовали меньших доз препаратов для наркоза (Лопухин Ю.М., 1971; Петраков К.А. и др., 2001).

После премедикации животному выстригали шерсть на брюшной стенке (в проекции предполагаемого оперативного доступа) с последующим обмыванием теплой водой с мылом и просушиванием. Затем собак взвешивали для более точного дозирования препаратов.

Основной наркоз достигался путем внутримышечного введения ксилазина в дозе 0,15 мг/кг. Препарат ксилазин (торговое название «Xyla») используется в ветеринарной практике для проведения наркоза при полостных операциях. Для поддержания необходимой глубины наркоза через каждые 25 минут повторяли введение ксилазина из расчета 0,7 мг/кг дополнительно через подъязычную вену.

Собаку фиксировали к операционному столу в положении лежа на спине. Операцию выполняли бригадой из 4 человек (хирург, ассистент, анестезиолог, операционная сестра) с соблюдением правил асептики и антисептики.

Объективным показателем достаточной глубины наступившего наркоза считали поворот глазного яблока внутрь к носу и появление в глазной щели белковой оболочки, а также исчезновение мигательных движений век при раздражении внутреннего угла глазной щели (Шалимов С.А. и др., 1989).

Описание экспериментальных операций по моделированию ППРПЖ и проведению криоаппликации ПЖ подробно изложено в главе 3.

Во время всех оперативных вмешательств производилась фотосъемка цифровой видеокамерой SONY DCR-TRV 40E.

Тотчас после завершения операции животному вводили капельно 800 мл физиологического раствора под кожу боковой поверхности грудной клетки. После окончания оперативного вмешательства собака находилось в операционной до полного пробуждения. Перед помещением в клетку ей внутримышечно вводили димедрол (1% раствор из расчета 1,5 мг/кг массы тела) и анальгин (50% раствор из расчета 70 мг/кг массы тела).

С начала 2-х суток оперированные животные получали воду, с 3-х суток переводили на питание кашами, а с 5-х суток на стандартный рацион.

У всех животных до операции и в дальнейшем через 1, 3, 7, 14, 21, 30, 60 суток после операции осуществлялся забор крови из малой подкожной вены одной из тазовых конечностей для проведения биохимического исследования.

После операций животных выводили из эксперимента для забора материала на 1, 3, 7, 14, 21, 30, 60, сутки. Эти периоды определены на основании закономерностей течения раневого процесса в области криовоздействия (Долецкий А.С., 1975; Цацаниди К.Н. и др., 1982; Пермяков Н.К. и др., 1983; Цициашвили М.Ш. и др., 1988; Буянов В.М. и др., 1989; Альперович Б.И. и др., 2004; Adam R. et al., 1998; Yang W.H., 2000). Забор материала осуществляли в одно и то же время суток, животное перед выведением из опыта не кормили в течение 12 часов. Собаке проводили премедикацию, вводили в наркоз внутримышечной инъекцией ксилазина в дозе 0,15 мг/кг и осуществляли эвтаназию струйным внутривенным введением раствора ксилазина в малую подкожную вену одной из тазовых конечностей, в дозе, заведомо превышающей LD₁₀₀.

Для получения морфологического материала выполнялась релапаротомия по ходу первичного доступа. Во время секции оценивались характер изменений в брюшной полости и ПЖ. Далее производился забор материала для микроскопического исследования. Мобилизировалась ПЖ, а для исключения ее повреждения при выраженном спаечном процессе она бралась вместе с окружающими тканями, которые также включались в препарат. Доля ПЖ бралась полностью. ПЖ фиксировали на 3 суток в 10% растворе формалина при соотношении объемов ткани и жидкости не менее чем 1:10 (Лилли Р., 1969; Меркулов Г.А., 1969; Буянов В.М. и др, 1989; Шалимов С.А. и др., 1989; Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., 2001; Улумбеков Э.Г., Челышев Ю.А., 2001).

Экспериментальные животные были разделены на 2 группы (табл. 1).

Таблица 1. Количество экспериментальных животных и сроки наблюдения в эксперименте

Срок в эксперименте	Количество экспериментальных животных
	Первая группа (создание модели ППРПЖ)	Вторая группа (создание модели ППРПЖ с последующей субтотальной криоаппликацией ПЖ)
1 сутки	5	5
3 суток	5	5
7 суток	-	5
14 суток	-	5
21 сутки	-	6
30 суток	-	7
60 суток	-	7
Всего	50

Выделение первой группы животных (10 собак) было необходимым для оценки адекватности созданной модели ППРПЖ, определения влияния ППРПЖ на изменение биохимических показателей крови, выяснения особенностей клиники и патоморфологических изменений в ПЖ в динамике послеоперационного периода. У животных этой группы производилось моделирование ППРПЖ по оригинальной методике.

Для отработки метода лечения ППРПЖ с использованием сверхнизких температур выполнено 40 оперативных вмешательства на экспериментальных животных (они составили вторую группу), в ходе которых производилась модель ППРПЖ, а затем выполнялась субтотальная криоаппликация ПЖ по оригинальной методике.

Все животные были подобраны сходными по возрасту, полу, массе тела, длительности пребывания в виварии, получаемому рациону; были идентичными условия проведения наркоза и оперативного вмешательства, медикаменты, применяемые во время операции и в послеоперационном периоде; также были одинаковыми условия содержания и ухода за животными. Соблюдались одинаковые условия эвтаназии, сроки от момента наступления смерти до взятия материала.

2.2 Характеристика методов экспериментального исследования

Эффективность предлагаемого способа лечения ППРПЖ с использованием криоаппликации оценена комплексом различных объективных методов. По нашему мнению, комплекс лабораторно-клинических методов для оценки эффективности проведенного оперативного вмешательства должен включать в себя оценку клинического течения послеоперационного периода, данные макроскопического исследования брюшной полости, анализ биохимических показателей и патоморфологическую характеристику ПЖ в динамике послеоперационного периода.

Клиническое течение послеоперационного периода оценивалось по следующим критериям: двигательная активность животного, уровень сознания, аппетит, явления диспепсии, состояние видимых слизистых оболочек.

При макроскопическом исследовании брюшной полости после выведения животного из эксперимента оценивались:

1) характер изменений ПЖ (цвет, размер, плотность, наличие панкреонекроза и нагноения в области разрыва ПЖ);

2) наличие признаков внутрибрюшного кровотечения;

3) наличие признаков перитонита, количество, характер и преимущественную локализацию экссудата;

4) выраженность, преимущественную локализацию спаечного процесса;

5) выраженность рубцовых изменений фрагментов ПЖ;

Для оценки биохимических показателей кровь для исследования забирали в фиксированные сроки (до операции и через 1, 3, 7, 14, 21, 30, 60 суток после операции) из малой подкожной вены на одной из тазовых конечностей животного. Исследовались показатели концентрации амилазы и глюкозы крови. Анализ производился в биохимической лаборатории ОКБ №2 г. Тюмени на биохимическом автоматическом анализаторе фирмы «Bakmen» (Швейцария).

Морфологические исследования проводили на базе кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии (заведующий кафедрой - з.д.н. РФ, профессор В.Г. Бычков) при непосредственном участии кандидата медицинских наук, доцента О.А. Молоковой и ассистента кафедры И.Н. Сергеевой Для подготовки препаратов, по истечении сроков фиксации в формалине, кусочки ПЖ заливали в парафин. Всего было изготовлено 60 парафиновых блоков. Изготавливали серийные срезы толщиной 3-4 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилном и эозином, по Ван Гизон. Изучали выраженность воспалительных, некротических, регенераторных и склеротических процессов.

Количественная характеристика использованного материала по срокам наблюдения представлена в табл. 2.

Таблица 2. Количественная характеристика морфологического материала по срокам наблюдения

Сроки наблюдения, сутки	Первая группа, гистологические срезы	Вторая группа, гистологические срезы
1	14	12
3	18	14
7	-	16
14	-	22
21	-	22
30	-	20
60	-	22
Всего:	32	128
Итого:	160

Выполняли микрофотографии по каждой серии опыта и каждому сроку.

2.3 Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных биохимического исследования концентрации амилазы и глюкозы крови экспериментальных животных проводилась с использованием оборудования и профессиональных компьютерных статистических пакетов Statistica for Windows 4.3 (StatSoft Inc., USA), Microsoft Excel 97, Primer of Biostatistics (Version 4.03, USA) лаборатории информационных технологий ТюмГМА (зав. лабораторией - к.м.н., доцент А.Г. Санников).

Согласно наиболее распространенному алгоритму анализа биомедицинской информации (Гмурман В.Е., 2000; Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 2003) первоначально производился расчет базовых параметров:

1) исключение из результатов наблюдений грубых погрешностей и известных систематических погрешностей;

2) вычисление среднего арифметического (М) результатов прямых измерений с учетом известных систематических погрешностей;

3) расчет средней квадратической ошибки (у) среднего арифметического для большой (n30) или малой (n30) выборки данных;

4) оценка наибольшей возможной ошибки отдельного измерения по правилу «трех сигм»;

5) определение точности прямого измерения - абсолютной величины разности между истинным значением измеряемой величины и средним выборочным;

6) записывается доверительный интервал измеряемой величины, и с учетом этого интервала фиксируется окончательный ответ.

В исследованиях доверительный интервал принимался равным 95%, уровень значимости =0,05 (Гланц С., 1998). Данные считали достоверно различными при р0,05 (Гмурман В.Е., 2000; Платонов А.Е., 2000; Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 2003).

В диссертационном исследовании результаты обработки измерений представлены в виде М±у, где М - среднее, а у - среднее квадратическое отклонение измеряемой величины. Использование записи M±m, где m - стандартная ошибка среднего, не представлялось возможным вследствие того, что m стремится к нулю при увеличении количества измерений, что не может обеспечить адекватную оценку ширины распределения измеряемой величины в случае биомедицинских исследований (Платонов А.Е., 2000).

Для статистической обработки результатов биомедицинских исследований в последнее время отечественными и зарубежными авторами рекомендуются непараметрические критерии, среди которых наиболее важное место занимают так называемые ранговые критерии. Применение этих критериев основано на ранжировании членов сравниваемых групп. При этом сравниваются не сами члены ранжированного ряда, а их порядковые номера или ранги (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001; Wakefleld J., Walker S., 1997).

Для статистической обработки результатов исследований в настоящей работе мы использовали непараметрические аналоги критерия Стьюдента - критерий суммы рангов Манна-Уитни и критерий Уилкоксона (Гланц С., 1998; Berry D.A., 1995).

Критерий Манна-Уитни (Т) используется для проверки гипотезы о принадлежности сравниваемых независимых выборок к одной и той же генеральной совокупности (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001; Schumitsky A., 1991; Merle Y., Mentre F., 1997; Senn S., 1997).

В нашем исследовании критерий Манна-Уитни использовался для сравнения показателей концентрации амилазы или глюкозы крови экспериментальных животных первой и второй групп экспериментальных животных.

Порядок его вычисления таков (Гланц С., 1998):

1) данные обеих групп объединяют и упорядочивают по возрастанию. Ранг 1 присваивают наименьшему из всех значений, ранг 2 - следующему и так далее. Наибольший ранг присваивают самому большому среди значений в обеих группах. Если значения совпадают, им присваивают один и тот же средний ранг;

2) для меньшей группы вычисляют Т - сумму рангов ее членов. Если численность групп одинакова, Т можно вычислить для любой из них;

3) полученное значение Т сравнивают с критическими значениями. Если Т меньше или равно первому из них либо больше или равно второму, то нулевая гипотеза отвергается (различия статистически значимы).

Критические значения Т-критерия оценивались по таблице, приведенной в монографии С. Гланц (1998).

В случае попарно связанных выборок применяется критерий Уилкоксона (W). При этом ранжируют попарные разности - положительные и отрицательные (кроме нулевых) в один ряд так, чтобы наименьшая абсолютная разница (без учета знака) получила первый ранг, одинаковым величинам присваивают один ранг. Отдельно вычисляют сумму рангов положительных (W+) и отрицательных разностей (W-), меньшую из двух таких сумм без учета знака считают тестовой статистикой данного критерия (б=0,05). Нулевую гипотезу принимают на данном уровне значимости, если вычисленная статистика превзойдет табличное критическое значение (число парных наблюдений уменьшают на число исключенных нулевых разностей). Таким образом, можно сказать, что если нулевая гипотеза верна, статистики W+ и W- примерно равны, сравнительно малые или большие значения W-статистик заставят нас отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001; Goodman S.N., 1999). Критические значения критерия Уилкоксона оценивались по таблице, приведенной в монографии С. Гланц (1998).

В нашем исследовании критерий Вилкоксона использовался для сравнения показателей концентрации амилазы или глюкозы крови экспериментальных животных одной группы в динамике послеоперационного периода.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПЕРАЦИЙ

Цель эксперимента заключалась в том, чтобы проверить наше предположение о возможности использования криоаппликации для лечения ППРПЖ. Экспериментальные операции были выполнены в экспериментально-хирургическом отделе ЦНИЛ ТюмГМА. Всего выполнено 2 серии операций на 50 беспородных собаках (табл. 3).

Таблица 3. Группы экспериментальных животных

Группа	Экспериментальная операция	Количество животных
I	Создание модели ППРПЖ	10
II	Создание модели ППРПЖ в сочетании с субтотальной криоаппликацией правой доли ПЖ	40
	Всего	50

Выделение первой группы животных было необходимым для оценки адекватности созданной модели ППРПЖ, определения влияния ППРПЖ на изменение биохимических показателей крови, выяснения особенностей клиники и патоморфологических изменений в ПЖ при экспериментальном ППРПЖ в динамике послеоперационного периода. У животных этой группы производилось моделирование ППРПЖ по оригинальной методике.

Для отработки метода лечения ППРПЖ с использованием сверхнизких температур выполнено 40 оперативных вмешательства на экспериментальных животных (они составили вторую группу), в ходе которых производилась модель ППРПЖ, а затем выполнялась субтотальная криоаппликация ПЖ по оригинальной методике.

3.1 Способ создания модели ППРПЖ в эксперименте

Модель ППРПЖ создавалась всем экспериментальным животным (50 собак) по единой методике следующим образом. Обработка операционного поля перед операцией проводилась двукратно 1% раствором йодопирона. После фиксации животного на операционном столе обработанное операционное поле ограничивалось четырьмя стерильными простынями, после чего повторно обрабатывалось 1% раствором йодопирона.

Выводили из пасти животного язык, смазывали глицерином и самый кончик его захватывали языкодержателем. Это создавало возможность контролировать по изменению цвета языка качество легочной вентиляции и не допускать западения языка.

Для оперативного доступа к органам брюшной полости прибегали к срединной лапаротомии, как наименее травматичному доступу (разрез от мечевидного хряща до пупочного рубца или дистальнее его на 3-4 см, но, не доходя до лонного сочленения), причем разрез начинали отступя каудальнее на 2 см от мечевидного хряща, т.к. непосредственно под ним расположен мечевидный плевральный синус, повреждение которого ведет к двустороннему пневмотораксу и остановке дыхания (Шалимов С.А. и др., 1989).

Производили макроскопическую оценку железы и органов брюшной полости. В рану выводили правую долю ПЖ вместе с двенадцатиперстной кишкой (рис. 1). Окружающие органы тщательно изолировались с помощью марлевых салфеток.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. В операционную рану выведена неизмененная правая доля поджелудочной железы и петля двенадцатиперстной кишки.

На рис. 2 показана проекция разрыва в эксперименте по созданию модели ППРПЖ.

Рис. 2. Проекция разрыва при проведении эксперимента по созданию модели ППРПЖ (1 - пищевод; 2 - правая доля ПЖ; 3 - разрыв ПЖ; 4 - двенадцатиперстная кишка; 5 - желудок; 6 - левая доля ПЖ; 7 - поперечно-ободочная кишка).

Необходимо отметить, что правая доля ПЖ собаки выбрана в качестве объекта операции вследствие того, что:

а) операции на ней являются менее травматичными вследствие ее мобильности (правая доля расположена частично интраперитонеально в листках брыжейки двенадцатиперстной кишки, в отличие от левой доли, которая вместе с хвостом ПЖ почти под прямым углом спускается в глубину брюшной полости и идет вплоть до спинных мышц, несколько медиальнее края левой почки) (Слесаренко Н.А., Бабичев Н.В., 2004);

б) в ней находится до 90% панкреатических островков ПЖ (Михайличенко В.А., 1975; Баранов В.Г. и др., 1983; Слесаренко Н.А., Бабичев Н.В., 2004; Gage A.A., 1998), что является важным моментом в изучении влияния моделирования ППРПЖ и криоаппликации ПЖ на углеводный обмен.

Затем на середину доли накладывали два зажима параллельно друг к другу и перпендикулярно длиннику железы на всю ее ширину (рис. 3).

Рис. 3. Этап экспериментальной операции: на ПЖ наложены зажимы для моделирования ППРПЖ.

Зажимами производилось раздавливание ПЖ, после чего они разводились до полного перерыва ПЖ (рис. 4).

На этом этапе операции важным является исключение повреждения прилежащих поджелудочно-двенадцатиперстных сосудов во избежание массивного кровотечения и последующего некроза стенки двенадцатиперстной кишки.

Рис. 4. Этап экспериментальной операции: зажимы, наложенные на правую долю ПЖ, разведены до получения ППРПЖ.

Зажимы снимались и, в случае возникновения небольшого кровотечения, область разрыва прижималась салфетками до полного гемостаза в течение 2 минут, при неудачной попытке остановки кровотечения прижатием прецизионно накладывался шов на кровоточащий сосуд.

После гемостаза брюшная полость осушалась, производилась обработка раны 1% раствором йодопирона и брюшная стенка ушивалась наглухо отдельными узловыми швами в два ряда: первым сшивали брюшину и апоневроз, вторым - поверхностную фасцию, подкожную клетчатку и кожу. После наложения швов рану обрабатывали 1% раствором бриллиантового зеленого.

Средняя продолжительность операции создания модели ППРПЖ составила 30 минут.

Таким образом, использование разработанного способа моделирования ППРПЖ в эксперименте является обоснованным ввиду наглядности и простоты выполнения.

3.2 Способ лечения ППРПЖ с использованием криоаппликации

Во второй группе, которую составили 40 собак, также моделировался ППРПЖ по методике, которая подробно описана в предыдущем разделе, после чего выполнялась субтотальная криоаппликация ПЖ (способ защищен патентом РФ на изобретение №2261055) с помощью криогенного аппликатора, разработанного совместно НИИ медицинских материалов и имплантатов с памятью формы при Сибирском физико-техническом институте им. В.Д. Кузнецова, Томским государственным университетом и Тюменским государственным медицинским институтом (Малеткина Т.Ю. и др., 1990).

Криогенный аппликатор оказался удобным и эффективным при операциях на печени (Стрелин С.А., 2004) и ПЖ (Мусин В.М., 2005) в условиях эксперимента. Положительным свойствами данного криогенного аппликатора являются:

- удобство и простота использования;

- устойчивость к дезинфекции и стерилизации.

Криогенный аппликатор представляет собой цилиндрический рабочий наконечник. Последний выполнен в виде стержня из пористого проницаемого никелида титана с коэффициентом пор 30-70% и средним размером пор 0,01-0,25 мм, и имеет сглаженную торцевую контактную поверхность, коэффициент шероховатости которой не менее 2,5. В одном из торцов стержня жестко закреплен держатель, выполненный из эбонита. Особенности выполнения рабочего наконечника придают ему функции резервуара хладагента (рис. 5).

В эксперименте использовали криоаппликатор с диаметром рабочей поверхности наконечника - 0,6 см.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5. Криоаппликатор из никелида титана (1- резервуар для жидкого азота, выполненный из пористого никелида титана; 2 - ручка криоаппликатора, выполненная из эбонита; 3 - наконечник криоаппликатора, выполненный из пластичного никелида титана).

Экспериментально установлено, что оптимальной температурой, которая должна использоваться для воздействия на ткань ПЖ, является от -110°С до -196°С. При ее повышении выше -110°С происходит прилипание ткани ПЖ к криоаппликатору, что может привести к ее разрыву после окончания воздействия (Филиппов Ю.П. и др., 1977; Мерзликин Н.В., 1984; Буянов В.М. и др., 1989; Альперович Б.И. и др., 2004; Gage A.A., 1998), поэтому рабочая температура наконечника криоаппликатора в нашем исследовании была -196°С. Также, одним из факторов, предотвращающим примораживание (прилипание) тканей к инструменту, наряду со сверхнизкой рабочей температурой наконечника, является сглаженность контактной поверхности инструмента.

Криоаппликатор применяли следующим образом: устройство до ручки погружали в хладагент, находящийся в сосуде Дьюара (пористость материала обеспечивает наполнение резервуара в течение 2-3 секунд), после чего контактную поверхность устанавливали на ПЖ (рис. 6).

Рис. 6. Криогенный аппликатор установлен на поверхность ПЖ.

В качестве хладагента использовали жидкий азот, рекомендуемый в настоящее время большинством авторов как наиболее удобный для хранения, безопасный и дешевый хладагент, температура кипения которого составляет -196°С (Кандель Э.И., 1974; Боженков Ю.Г., Афанасьев В.А., 1990; Альперович Б.И. и др., 2004; Clarke D.M., 1999). Жидкий азот не огнеопасен, нетоксичен и инертен к биологическим тканям. Хранение жидкого азота осуществлялось в сосуде Дьюара, который представляет собой емкость с двойными стенками, пространство между которыми заполнено вакуумом. Испаряется жидкий азот из сосуда Дьюара со скоростью 1,5-8% объема в сутки. При испарении жидкого азота наблюдается резкое снижение температуры, что объясняется большим поглощением тепла при газообразовании (39 ккалл/л).

Необходимо остановиться на параметрах криовоздействия при лечении ППРПЖ в эксперименте.

Известно, что ткани обладают разной устойчивостью к глубокому замораживанию. Большинство исследователей для характеристики устойчивости ткани к криовоздействию используют два основных параметра - критическую, или предельно переносимую, температуру, при которой обратимые некробиотические изменения в ткани переходят в необратимые (некроз), и критическую скорость охлаждения ткани, т.е. минимальную скорость охлаждения, при которой еще возможно наступление некроза (Долецкий А.С. и др., 1976; Филиппов Ю.П. и др., 1977; Альперович Б.И. и др.,1985; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Clarke D.M., 1999; Bilchik A.J., 2000).

Экспериментально установлено, что наиболее чувствительной к криовоздействию оказалась ацинарная ткань. Учитывая то, что критическая температура для экзокринной паренхимы составляет +1,5°С, а эндокринной -20°С, это обусловливает возможность сохранения эндокринной паренхимы по периферии фокусов крионекроза в зонах глубокой гипотермии. Критическая температура ацинарной ткани определена в интервале от -2,1 до +1,5°С. Данные значения объясняют практически полное совпадение размеров зоны замораживания и развивающегося некроза. Данный факт существенно облегчает прогностическую оценку размеров развивающегося некроза, т.е. в качестве ориентиров зоны будущего некроза могут служить границы зоны замораживания.

Учитывая исследования ряда авторов по изучению величины температуры в зависимости от удаления от видимой границы промораживания (температура повышается по экспоненциальному закону в зависимости от расстояния от криоаппликатора) (Альперович Б.И. и др., 1982; Bilchik A.J., 2000; Yang W.H., 2000), определено расстояние между точками криовоздействия, равное 1,0±0,2 см, соответственно расстояние от края железы до криоаппликатора равно 0,5±0,2 см.

Учитывая то, что критическая скорость охлаждения ткани ПЖ составляет 1-3°С в 1 мин, оптимальной оказалась экспозиция 120 секунд воздействия криоаппликатором в каждой точке, при которой обеспечивается необходимый градиент изменения температуры.

Для исключения некроза стенки полого органа необходимо соблюдение условия, чтобы температура в зоне контакта железы с полым органом не снижалась ниже критического порога, т.е. -25°С, либо при контроле по поверхности видимая зона замораживания не распространялась ближе 3 мм до кишки. Соблюдение данного правила гарантирует исключение некроза и перфорации полых органов. Критическая температура для стенки двенадцатиперстной кишки равна -25,7±7,7°С, разность зон замораживания и некроза составила 3,6±0,7 мм, т.е. изотерма криоповреждения кишечной стенки находится на этом расстоянии от края видимой зоны замораживания (Филиппов Ю.П. и др., 1977; Пачес А.И. и др., 1978; Шалимов С.А. и др., 1991; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Патютко Ю.И. и др., 2001; Mazur P., 1970; Bilchik A.J., 2000).

Непосредственная близость крупных сосудов и желчных путей при выполнении криооперации на ПЖ не является лимитирующим фактором и противопоказанием к криовоздействию, т.к. установлено, что крупные сосуды и внепеченочные желчные пути очень устойчивы к глубокому замораживанию (Кандель Э.И., 1974; Долецкий А.С. и др., 1976; Пушкарь Я.С., Сандомирский Б.П., 1982; Данилов М.В., Федоров В.Д., 1995; Berger W.K., 2001).

Методика операции. Обработка операционного поля перед операцией проводилась двукратно 1% раствором йодопирона. После фиксации животного на операционном столе обработанное операционное поле ограничивалось четырьмя стерильными простынями, после чего еще раз обрабатывалось 1% раствором йодопирона. Выводили из пасти язык, смазывали глицерином, и самый кончик его захватывали языкодержателем.

Для оперативного доступа к органам брюшной полости прибегали к срединной лапаротомии, как наименее травматичному доступу. Производилась макроскопическая оценка железы и брюшной полости. В рану выводили правую долю ПЖ вместе с двенадцатиперстной кишкой. Окружающие органы изолировались с помощью марлевых салфеток.

Выполнялось моделирование ППРПЖ (часть 3.1). После чего производилась криоаппликация, в первую очередь, самого разрыва с целью гемостаза, и криоаппликация в 4-8 точках (в зависимости от площади ПЖ) по всей правой доле, в соответствии с разработанными параметрами.

При удалении криоаппликатора на поверхности ПЖ оставалось белое пятно (рис.7).

Рис. 7. Вид ПЖ после моделирования ППРПЖ и проведения криоаппликации (непосредственно после воздействия).

В каждой точке криовоздействие осуществлялось в течение 120 секунд, этого времени оказывалось достаточно для гемостаза и формирования ледяного шарика на всю толщу ПЖ. Время криовоздействия контролировали секундомером. Контроль за динамикой роста зоны замораживания осуществляли макроскопически (зона промораживания проявляется образованием ледяной корки) и прямым измерением при помощи мерного циркуля.

После оттаивания через 5 мин участок железы становился темно-вишневого цвета (рис. 8).

Рис. 8. Вид ПЖ после моделирования ППРПЖ и проведения криоаппликации ее правой доли (через 5 минут после криовоздействия).

Осуществляли криовоздействие до испарения хладагента из пор стержня, что проявляется образованием инея на боковой поверхности стержня (рис. 9).

Рис. 9. Появление инея в верхней части криоаппликатора.

Оттаивание в результате контакта с окружающей средой, самопроизвольное. После оттаивания контролировали гемостаз области разрыва. В случае возникновения небольшого кровотечения область разрыва прижималась салфетками до полного гемостаза в течение 2 минут, при неудачной попытке остановки кровотечения прижатием прецизионно накладывался шов на кровоточащий сосуд.

После гемостаза брюшная полость осушалась, производилась обработка раны 1% раствором йодопирона и брюшная стенка ушивалась наглухо отдельными узловыми швами в два ряда: первым сшивали брюшину и апоневроз, вторым - поверхностную фасцию, подкожную клетчатку и кожу. После наложения швов рану обрабатывали 1% раствором бриллиантового зеленого.

Средняя продолжительность операции криоаппликации при ППРПЖ составляла 60 минут.

Таким образом, несложная техника выполнения, малая продолжительность операции, отсутствие специфических осложнений позволяют говорить о технологичности методики. Наличие четких параметров криовоздействия позволяет рассчитать количество точек криоаппликации в зависимости от площади ПЖ, т.е. индивидуально.

Размещено на Allbest.ru

...