Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний

Леплина Ольга Юрьевна

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательском институте клинической иммунологии

Сибирского отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Елена Рэмовна Черных

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина

доктор медицинских наук Константин Валентинович Гайдуль

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Ирина Соломоновна Фрейдлин

Ведущая организация: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, г. Москва

Защита состоится «_22_»_декабря__2011 г. в__14.00_часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан «____»_________________2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии MHC антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ [Massard G. et al, 1996; Peters J. et al, 1996]. Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать коингибиторные молекулы и рецепторы (B7-H1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-в), [Reichardt W. et al, 2008; Fedoric B. et al, 2008] и индуцировать генерацию регуляторных Т-клеток (СD4+СD25+Т рег) [Suciu-Foca N. et al, 2005]. Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [Wesa A. et al, 2008, Chauvin C. et al, 2008]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-б, lymphotoxin-б1в2, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима [Wesa A. et al, 2008; Korthals M. et al, 2007] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа.

Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях [Duan X.Z. et al, 2005; Pinzon-Charry A. et al, 2005; Yang L. et al, 2004]. При этом снижение стимуляторной активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора [Della Bella S. еt al, 2006; Zhang Z. et al, 2006; Ulsenheimer A. et al, 2005; Chen L. et al, 2007], тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато угрозой преждевременного прерывания беременности [Scholz C. et al, 2008; Darmochwal-Kolarz D. et al, 2003].

Способность ДК индуцировать антигенспецифический иммунный ответ и наличие цитотоксической активности сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных [Akbar S.M. et al, 2004] и клинические испытания у человека [Steinman R.M. et al, 2001; Mashino K. et al. 2004, Chen L. et al, 2005] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается положительным клиническим эффектом. С другой стороны, толерогенные ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей [Lim D-S. et al, 2009].

Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК [Hart D.N. et al, 1997; Bender A. et al, 1996]. Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - GM-CSF и IL-4 [Thurner B. et al, 1999]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-б, IL-1, LPS, CD40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-клеточный ответ [Jonuleit H. et al, 2007]. Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном-б [Paquette R. et al, 1998; Santini S. et al, 2000; Santini S. et al, 2003; Santini S. et al, 2009; Santini S. et al, 2005]. Интерферон-б индуцированные ДК (ИФН-ДК) генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8 Т-лимфоциты. Кроме того, ИФН-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Th1-стимулирующей способностью обладают умеренной Th2-стимулирующей активностью [Parlato S. et al, 2001; Santini S. et al, 2003; Carbonneil C. et al, 2004]. Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [Lu G. et al, 2002; Chauvin C. et al, 2008; Papewalis C. et al, 2008] и ИФН-ДК по некоторым данным могут обладать более выраженной цитотоксической активностью [Korthals M. et al, 2007], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Однако до сих пор свойства этих клеток (включая спектр и уровень продуцируемых ДК цитокинов, экспрессию поверхностных молекул и способность активировать Th1 и Th2 ответ), особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при патологии и отличаются ли ИФН-ДК пациентов по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных с опухолевыми и инфекционными заболеваниями.

В связи с вышеизложенным, была сформулирована цель работы:

на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку поверхностных маркеров (стадиоспецифические, активационные, костимуляторные, коингибиторные, проапотогенные молекулы) в популяции ИФН-ДК и ИЛ4-ДК в группе здоровых доноров

2. Провести сравнительное исследование функциональной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (продукция цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторная активность ДК, Th1- и Th2 - стимулирующая активность ДК), генерируемых у здоровых доноров.

3. Оценить цитотоксическую и цитостатическую активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против клеток опухолевых линий.

4. Исследовать способность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК к индукции регуляторных Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов.

5. Охарактеризовать поверхностные маркеры и функциональную активность ИФН-ДК у больных с онкологическими заболеваниями (злокачественные опухоли головного мозга, гемобластозы).

6. Исследовать фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких)

7. Исследовать in vitro влияние цитокинов и иммуноактивных факторов (интерлейкин-2, смесь провоспалительных цитокинов, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека) на аллостимуляторную активность и цитотоксический потенциал ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

8. Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у женщин с физиологической гестацией и беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

9. Оценить влияние гормона дегидроэпиандростерона сульфата на экспрессию поверхностных маркеров и функциональную активность ИФН-ДК доноров.

10. Оценить безопасность и эффективность иммунотерапии с использованием ИФН-ДК в лечении больных злокачественными опухолями головного мозга. интерферон индуцированный дендритный онкологический

11. Провести апробацию ИФН-ДК-вакцин у больных с хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В, герпесвирусная инфекция).

Научная новизна

Исследование свойств LPS-активированных интерфероном- ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, СD11c/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83+ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-г, IL-2, IL-17, IL-1в, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1, более активно индуцируют генерацию CD3+IFNг+ T-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых клеток. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS интактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию СD4+FoxP3+, но также СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+- клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию СD4+FoxP3+- и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+-клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественные лимфомы, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3+IFNг+ T-клеток и/или усилением способности активировать CD3+IL4+ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных с онкопатологией). Причем выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах патологических состояний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием Th2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Th1-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-г и TNF-б, Th1-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56+CD16+ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция)

Теоретическая и практическая значимость

Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком цитотоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3+IFNг+ Т-клеток при сохранении умеренной Th2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологических состояниях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологиях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой гиперандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и в частности значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышение цитотоксической активности in vitro c помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активированные ИФН-ДК отличаются от ИЛ4-ДК менее зрелым фенотипом, повышенной экспрессией проапоптогенных молекул, а также более высоким уровнем продукции цитокинов (с преобладанием Th1/провоспалительных цитокинов), Th1- стимуляторной и цитотоксической активности.

2. При онкологических и инфекционных заболеваниях ИФН-ДК имеют признаки задержки дифференцировки/созревания и нарушения функциональной активности, наличие и выраженность которых существенно варьирует в зависимости от нозологической формы заболевания и может корригироваться in vitro рядом цитокинов или иммуноактивных факторов.

3. ИФН-ДК являются мишенями гормональной регуляции и опосредуют иммуностимулирующий эффект ДГЭАС, повышенный уровень которого у беременных с гиперандрогенией обусловливает снижение толерогенного потенциала ДК, характерного для физиологической беременности.

4. Использование ДК-вакцин характеризуется хорошей переносимостью, является безопасным, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями; прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий, 2003 г, на 14-ой научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2004 г, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет. Новосибирск, 2005 г, на 15-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г; на международном конгрессе «International conference Basic Science for Biotechnology and Medicine», Новосибирск 2006 г, на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» в Красноярске 2005 г, 2006 г; в Томске 2008 г; на 11 Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2007 г; на III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" Новосибирск 2007 г; на 2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nьrnberg 2008; на Объединенном иммунологическом форуме - Санкт-Петербург 2008 г, на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск 2010г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 64 печатных работы, в том числе 20 статей в центральной печати, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 255 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 17 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 300 литературных источника, в том числе 287 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель - профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка клеточных биотехнологий иммунодиагностики и иммунотерапии инфекционно-воспалительных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний», НИР 037: «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток», грантов РФФИ №09-04-00525-а «Гормонально-опосредованная регуляция толерогенной активности дендритных клеток» и №07-04-00967 «Роль дегидроэпиандростерона сульфата в регуляции дифференцировки, созревания и функциональной активности дендритных клеток», гранта ФЦП госконтракт № 14.740.11.0007. - «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 145 доноров крови и больных с онкологическими (94) и инфекционными (142) заболеваниями. Группа пациентов с онкологическими заболеваниями включала 68 больных с внутримозговыми опухолями, в том числе 46 больных со злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) и 22 - с опухолями низкой степени злокачественности и 26 пациентов со злокачественными лимфомами (ЗЛ), включая 5 пациентов с лимфомой Ходжкина, 7 больных с агрессивными вариантами неходжкинских лимфом и 14 пациентов с множественной миеломой (ММ). В группу с инфекционными заболеваниями вошли 37 пациентов с хроническими вирусными гепатитами В (ХВГВ, n=18) и С (ХВГС, n=19), у 15 из которых диагностировался цирроз печени (ЦП) как исход хронической вирусной инфекции; 90 больных туберкулезом легких (ТБ) и 15 пациентов с герпесвирусной инфекцией. Кроме того, в исследование были включены 60 женщин с физиологической беременностью и 36 беременных с гиперандрогенией надпочечникового генеза (все беременные со сроком гестации до 22 недель).

Иммунологические исследования.

Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом и в концентрации 0,1106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma, 15 мкг/мл), рекомбинантный IL-2 (50 ЕД/мл, Ронколейкин, ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ППД (очищенный дериват туберкулина, РАО «Биопрепарат», Санкт-Петербург) в концентрации 50 мкг/мл, лизат опухолевых клеток (0,01- 0,1мг/мл ), специфический рекомбинантный антиген HSV1gD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) 5 мкг/мл, HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) 5 мкг/мл.

Дендритные клетки генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл), INF- (Роферон-А, Roche, Швейцария, 1000 Ед/мл) - ИФН-ДК и в присутствии GM-CSF и IL-4 (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл) - ИЛ4-ДК течение 3 и 5 сут, соответственно. На последующие 24 ч в качестве дозревающего стимула вносился LPS (Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). Влияние ДГЭАС (Sigma-Aldrich, кат. № D5297) на фенотип и функциональную активность ДК оценивали, добавляя гормон (10-6М) либо в начале культивирования, либо на стадии дозревания за 24 ч до окончания культивирования.

Оценку поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные фикоэритрином (PE) анти-СD1а, анти-СD123 мАТ (BD PharMingen, США), анти-СD14, анти-CD16 мАТ (Сорбент, Москва), меченные АРС анти-СD11с мАТ (BD PharMingen, США), меченныеFITC анти-CD25, анти-СD83, анти-CD80, анти-CD86 мАТ (BD PharMingen, США) и анти-HLA-DR мАТ (Сорбент, Москва).

Оценку способности ДК к эндоцитозу проводили методом проточной цитофлюориметрии по захвату FITC-декстрана (мол. вес 40 000, Sigma).

Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). В качестве отвечающих клеток использовались МНК доноров (0,1х106/лунку), стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении 10:1 и 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 3-5 сут радиометрически по включению 3H-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования

Продукцию цитокинов (IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12p70, TNF-б, IFN-г, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP, MIP-1) в цельных культурах ДК оценивали методом проточной цитофлюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 17Plex (определяемый динамический диапазон 2 - 32000 пкг/мл) В отдельной серии экспериментов концентрацию цитокинов TNF-б, IL-4, IFN-г, IL-6 («Вектор-Бест», Новосибирск) и IL-10 («Цитокин»; Санкт-Петербург) определяли методом иммуноферментного анализа.

Определение внутриклеточной экспрессии цитокинов в CD3+-популяции лимфоцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson) с использованием APC-меченных моноклональных анти-CD3-антител, FITC-коньюгированных анти-INF- и PE-меченных анти-IL-4 антител.

Оценку клеточного цикла в различных субпопуляциях NK-клеток проводили с помощью окрашивания клеток Aсtinomycin D, 7-Amino (50 мкг/мл, Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Уровень клеточного цикла оценивали среди CD56+СD16+ клеток в популяции МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствие и присутствии интактных или ДГЭАС-модифицированных ИФН-ДК.

Цитостатическую активность ДК в отношении опухолевых клеток оценивали по способности ДК ингибировать пролиферацию клеток опухолевых линий HEp-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека), Jurkat (T-клеточная лимфома), U-87 (клетки глиобластомы человека). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина (1 мКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния ДК (ИВДК) рассчитывали как отношение пролиферативного ответа в опыте к контролю, а цитостатическую активность ДК определяли по формуле (1-ИВДК) х 100%. Цитотоксическую активность оценивали по лизису клеток-мишеней дендритными клетками в соотношениях 40:1, 20:1 и 10:1. Процент цитотоксичности рассчитывали по формуле: [1 - (имп/мин в культурах с эффекторными клетками/имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] x 100% .

Толерогенные свойства ДК оценивали по их способности индуцировать регуляторные Т-клетки в алло-СКЛ при совместном культивировании ДК с аллогенными МНК в соотношении 1:10. Относительное содержание CD4+FoxP3+, CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ клеток в культурах оценивали на 5 сутки методом проточной цитофлюориметрии

Клинические испытания иммунотерапии (ИТ) с использованием ИФН-ДК были проведены в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Ученым советом Института (протокол №1, апрель 2003г.) и одобренным локальным этическим комитетом. В исследование были включены 32 человека (основная группа) с гистологически верифицированным диагнозом внутримозговых опухолей высокой степени злокачественности, включая 20 пациентов с анапластической астроцитомой (Grade III) и 12 пациентов с глиобластомой (GradeIV), которым оперативное лечение и радиотерапия были дополнены иммунотерапией с использованием ДК. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии и курс вакцинаций дендритными клетками согласно разработанному патенту «Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 от 27.10.2005). Антигенный материал (лизат опухолевых клеток) для нагрузки ДК получали из фрагмента аутологичной опухоли больного, в результате 5-кратного замораживания/размораживания суспензии опухолевых клеток, и использовали в концентрации 0,1 мг/мл по белку. Исследование общего состояния включало изучение общемозговой симптоматики и оценку индекса качества жизни.

Клинические испытания иммунотерапии в лечении инфекционных заболеваний проводились в дизайне открытого проспективного пилотного исследования с контролем «до-после» в соответствии с разработанными протоколами, утвержденными Ученым советом Института (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г для ХВГВ и протокол №9 от 11 декабря 2007 для герпесвирусной инфекции) и одобренными локальным этическим комитетом. Группа пациентов составляла 9 больных ХВГВ и 7 женщин с орофациальной локализацией герпетической инфекции. ИТ включала два курса вакцинации дендритными клетками. Первый -4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженных HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) или рекомбинантными антигенами вируса герпеса HSV1gD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) c 2-недельным интервалом. Второй курс - 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию - 5-х106. При проведении вакцинаций в качестве адьюванта использовался ронколейкин в дозе 250 000. Ед. Интенсивность антигенспецифического ответа оценивали на 3 сут по пролиферации МНК больных в ответ на стимуляцию Hbs Ag антигеном (5 мг/мл) либо HSV1gD антигеном в отсутствие и присутствии ронколейкина (100 Ед/мл). Неспецифический ответ оценивали по пролиферации МНК в ответ на стимуляцию конканавалином А.

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo оценивали по выраженности кожной пробы в ответ на введение лизата опухолевых клеток. Реакцию ГЗТ in vitro оценивали в модифицированном тесте миграции лейкоцитов в ответ на аналогичную стимуляцию клеток лейковзвеси.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отправной точкой исследования стало сравнительное исследование фенотипа LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК. Поскольку дифференцировка моноцитов в ДК сопровождается закономерной сменой фенотипов, в частности, появлением молекулы СD1а и утратой СD14, а созревание ДК ассоциировано с экспрессией молекул CD83 и СD25 и утратой СD1а, а также усилением экспрессии молекул HLA-DR и CD86, оценка указанных маркеров послужила основой фенотипического анализа (табл.1).

Таблица 1

Фенотипическая характеристика ИЛ4-ДК и ИФН-ДК

Примечание: относительное содержание (%) различных субпопуляций ДК представлено в виде средних (M±SE.), медианных (Median) и диапазона 25-75% квартильных значений (LQ - UQ). * рt< 0,01 - достоверность различий показателей (t-критерий Стьюдента для связанных выборок)

ИФН-ДК были сходны с ИЛ4-ДК по количеству CD86, HLA-DR и CD25-позитивных клеток, однако содержали большее количество CD14 и меньшее - CD83 клеток, т.е. имели менее зрелый - промежуточный фенотип. Значительная доля ИФН-ДК экспрессировала молекулу CD123, что также указывало на меньшую зрелость, поскольку экспрессия данного маркера снижается по мере дифференцировки миелоидных ДК. Промежуточный фенотип ИФН-ДК подтверждался также их достаточно высокой фагоцитарной активностью, в частности, способностью поглощать FITC-меченный декстран, Так 74,96,2% интактных ДК активно поглощали FITC-декстран, но и после активации дозревающим стимулом (LPS) доля клеток с внутриклеточным содержанием FITC-декстрана оставалась высокой (62,08,6%).

Исследование поверхностных молекул, способных опосредовать цитотоксическую и/или супрессорную активность ДК (табл. 2), показало, что как интактные, так и LPS-стимулированные ИФН-ДК отличались более высокой экспрессией цитотоксической молекулы TRAIL. Интактные ИФН-ДК содержали большее количество B7-H1-позитивных и меньшее HLA-G -позитивных клеток. Однако после активации LPS экспрессия B7-H1 на ИФН-ДК снижалась, и эти клетки уже не отличались от ИЛ4-ДК по экспрессии толерогенных молекул.

Таблица 2

Экспрессия TRAIL, B7-H1 и HLA-G молекул на ИЛ4-ДК и ИФН-ДК

Примечание:относительное содержание (%) интактных и LPS-активированных ДК, экспрессирующих соответствующие маркеры, представлено в виде средних значений (M ± SE), # рU < 0,05 - достоверность различий интактных и LPS-активированных ДК, *рU<0,05 - достоверность различий ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Исследование функциональной активности ДК включало оценку продукции цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторной и Th1/Th2-стимуляторной активности ДК по их способности индуцировать в СКЛ возрастание количества IFN-г и IL-4-продуцирующих Т-клеток, а также продукции Th1- и Th2 цитокинов. Культуры ИФН-ДК характеризовались более высоким содержанием IFN-г, IL-2, IL-1в, TNF-б, IL-17, а также более высоким уровнем IL-10 и IL-5. т.е. ИФН-ДК могли более активно стимулировать Th1 и Th2 ответ (табл. 3). При этом соотношение концентрации TNF-б/IL-10 в супернатантах ИФН-ДК 2-кратно превышало аналогичный показатель в культурах ИЛ4-ДК, свидетельствуя о доминировании провоспалительного потенциала. Наконец, ИФН-ДК отличались более высокой продукцией G-CSF и MCP-1, но более низким уровнем IL-12p70 и IL-7, что могло указывать на более высокую способность рекрутировать моноциты и поддерживать их выживаемость, но меньшую эффективность в поддержании гомеостатической пролиферации.

Таблица 3

Продукция цитокинов дендритными клетками, генерированными в присутствии IL-4 и IFN-б

Примечание: представлены средние (M±SE) и медианные (Median) значения концентрации цитокинов (пг/мл) в супернатантах цельных культур ДК. * рU < 0,05, ** рU < 0,01 - достоверность различий значений между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Сравнение аллостимуляторной активности не выявило различий ИЛ4-ДК и ИФН-ДК (18625±909 и 18922±1743, соответственно, n=14). Вместе с тем ИФН-ДК более активно стимулировали генерацию IFN-г-продуцирующих Т-клеток, т.е. активировали Th1-клетки и в отличие от ИЛ4-ДК обладали умеренной Th2-стимуляторной активностью (табл. 4).

Таблица 4

Содержание Т-клеток с внутриклеточной экспрессией IFN-г и IL-4 в культурах СКЛ, индуцированных ИЛ-4-ДК и ИФН-ДК

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК - индекс влияния ДК, рассчитанный по формуле: ИВДК = ДК(+)/ДК(-), * - достоверность различий показателей по сравнению с контролем, # - достоверность различий между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Сравнение концентрации различных цитокинов в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК или ИФН-ДК, также показало, что ИФН-ДК более активно стимулируют Т-клетки к продукции IFNг, IL-5 и MIP-1в, что дополнительно свидетельствует о более выраженной способности этих клеток стимулировать Th1 и Th2 ответ, а также хемоаттрактивную активность Т-клеток.

Учитывая, что ИФН-ДК характеризуются повышенной экспрессией TRAIL и более высокой продукцией IL-10, на следующем этапе было проведено сравнительное исследование цитотоксической/статической активности анализируемых ДК против опухолевых клеток, а также их способности индуцировать регуляторные Т-клетки. ИФН-ДК обладали более высокой цитотоксической активностью против TRAIL-чувствительных клеток Jurkat и более высоким цитостатическим эффектом против TRAIL-резистентных клеток НЕр-2 (рис. 1).

Рисунок 1. Цитотоксическая активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК здоровых доноров против опухолевых линий НЕр-2 (A) и Jurkat (Б)

Представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий Jurkat и НЕр-2, n=9, *- pU<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Оценка способности ДК индуцировать генерацию Трег в СКЛ показала, что в отсутствие LPS стимуляции интактные ИФН-ДК обладали более высоким толерогенным/супрессорным потенциалом, поскольку стимулировали генерацию всех трех типов Трег. (CD4+FoxР3+. CD8+FохP3+ CD4+IL10+). В то же время после активации LPS ИФН-ДК теряли способность индуцировать CD4+FoxР3+ Т-клетки и не отличались от ИЛ4-ДК по способности стимулировать генерацию CD8+FохP3+ и CD4+IL10+ Т-лимфоцитов. Таким образом, LPS-активированные ИФН-ДК не отличались по толерогенному потенциалу от ИЛ4-ДК (табл. 5).

Суммируя полученные, данные можно заключить, что, несмотря на активацию LPS, ИФН-ДК сохраняют промежуточный фенотип и высокую поглотительную активность, отличаются более высоким провоспалительным и цитотоксическим потенциалом, более эффективно и сбалансированно активируют Т-клетки к продукции цитокинов 1 и 2 типа и при этом не обладают повышенной толерогенной активностью, что обосновывает перспективы использования данного типа клеток в качестве клеточных вакцин. Поэтому следующим этапом работы явилась оценка возможности генерации и характеристика свойств ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

Таблица 5

Сравнительная характеристика процентного содержания регуляторных клеток, индуцированных ИЛ-4ДК и ИФН-ДК в СКЛ

Примечание: представлены средние значения (M±SE) относительного содержания клеток (%) в СКЛ, индуцированной ИЛ4-ДК либо ИФН-ДК. ДК(0) - интактные, ДК(LPS)-после добавления дозревающего стимула. МНК-свежевыделенные МНК периферической крови, *- PU<0,05 - статистические различия по сравнению с МНК периферической крови, # - pU<0,05 -различия ИФН-ДК по отношению к ИЛ4-ДК, (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)ИФН-ДК больных злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) характеризовались повышенным содержанием CD14+ и CD1а+ клеток, включая незрелые-(CD1а+CD83-) и промежуточные (CD83+CD1а+/СD123+ CD11c+) ДК, а с другой стороны - снижением доли CD83+ и CD25+ ДК. ИФН-ДК у больных лимфомами также отличались признаками задержки дифференцировки и созревания. Эти изменения были наиболее выражены у больных злокачественными лимфомами (ЗЛ), что проявлялось снижением доли зрелых (СD83+), в том числе терминально дифференцированных (CD83+CD1a-), активированных (CD25+) ДК и увеличением ДК с незрелым (CD14+/CD1a+/CD1а+CD83-) и промежуточным (CD83+CD1a+) фенотипом. В то же время у больных множественной миеломой (ММ) ИФН-ДК фенотипически не отличались по структуре от таковых у здоровых доноров (рис. 2).

Рисунок 2. Фенотипическая характеристика ИФН-ДК у больных онкологического профиля

Представлены средние значения (М±SE) относительного содержания субпопуляций ДК (%)* -pU<0,05 - достоверность различий по сравнению с донорами, U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Сравнение цитокин-продуцирующей функции показало, что культуры ДК у больных ЗОГМ не отличались по уровню продукции Th1 и Th2 цитокинов, у больных ЗЛ характеризовались снижением IFN-г и повышением IL-10, у больных ММ - только усилением продукции IL-10. Аллостимуляторная активность ДК больных ЗОГМ не отличалась от таковой у доноров, тогда как у больных ЗЛ была существенно снижена. Угнетение аллостимуляторной активности у пациентов ММ было выражено существенно в меньшей степени. При этом ДК больных ЗОГМ и ММ обладали сходной с донорами Th1-стимуляторной активностью и не индуцировали Th2 ответ, тогда как ДК больных ЗЛ имели повышенную Th2-стимуляторную активность (табл. 6).

Таблица 6

Функциональные особенности ИФН-ДК у больных онкологического профиля

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК - индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Отличительным свойством ДК у больных глиомами явилось также снижение цитотоксической активности против опухолевых клеток линии HЕp-2 (рис. 3А).

Рисунок 3. Цитотоксическая активность ИФН-ДК у онкологических больных

А - представлены средние значения (M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2, *- pU<0,05 - достоверность различий между цитостатической активностью доноров и больных ЗОГМ(n=28), # pU<0,05-достоверность различий доноров и больных ЗЛ (n=9), (U - критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Б - представлены средние значения(M±SE) цитотоксической активности ДК против опухолевых клеток линий НЕр-2 у больных ЗОГМ разной степени злокачественности (n=16) *- pU<0,05 - достоверность различий

Анализ пациентов с учетом степени злокачественности опухолей показал выраженную гетерогенность цитотоксического потенциала. При этом снижение цитотоксической активности ДК было характерно для пациентов с высокой степенью злокачественности (Grade III-IV), тогда как больные с опухолями низкой степени злокачественности (Grade I-II) характеризовались сохранной цитотоксической активностью (рис. 3Б). Снижение цитотоксической активности ДК наблюдалось также у больных злокачественной лимфомой.

Исследования ИФН-ДК у больных с инфекционными заболеваниями выявило сходные закономерности. Так, ДК больных хроническими вирусными гепатитами имели признаки задержки созревания и активации ДК, повышенный уровень продукции IL-10, угнетение аллостимуляторной активности и повышение Th-2 стимуляторной активности. Эти признаки регистрировались у больных гепатитом С, максимально проявлялись у пациентов с циррозом печени (независимо от типа инфекции) и практически не наблюдались у пациентов с хроническим гепатитом В (табл. 7).

Таблица 7

Характеристика ИФН-ДК у больных хронической вирусной инфекцией

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК - индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

ДК больных ТБ (табл. 8) также характеризовались признаками меньшей зрелости, о чем свидетельствовало более высокое содержание CD14+ клеток в исследуемых культурах и снижение числа зрелых активированных ДК, экспрессирующих CD25+-молекулу. Кроме того, ИФН-ДК больных отличались повышенной продукцией IL-10 и IL-6, угнетением аллостимуляторной активности, снижением способности активировать IFN--продуцирующие Т-клетки и усилением Th2-стимуляторной активности. Эти изменения были более выражены в группе пациентов со сниженным антигенспецифическим ответом на ППД (табл. 8).

Примечание: данные представлены в виде средних (M±SE), ИВДК - индекс влияния ДК, * - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (pU <0,05, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 8

Характеристика ИФН-ДК у больных туберкулезом легких

Обнаруженные нами изменения фенотипа и функций ИФН-ДК при онкопатологии и инфекционных заболеваниях ставят вопрос о полноценности генерируемых ДК при использовании их в качестве клеточных вакцин и разработке подходов к коррекции нарушений ДК, генерируемых у больных с онкопатологией и инфекционными заболеваниями. Поэтому с целью изучения возможности коррекции функциональной активности ДК было проанализировано влияние различных иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность ДК, полученных от больных злокачественными лимфомами и туберкулезом легких. В качестве потенциальных модуляторов использовались рекомбинантный интерлейкин-2 человека («Ронколейкин»), сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида («Полиоксидоний»), комплекс провоспалительных цитокинов («Суперлимф») и двуцепочечная ДНК человека («Панаген»). Добавление указанных факторов на этапе созревания к ДК больных злокачественной лимфомой и ТБ повышало исходно низкий уровень аллостимуляторной активности. При этом ДК больных ТБ отличались меньшей чувствительностью к рИЛ-2 и ДНК, чем ДК больных ЗЛ (табл. 9).

Таблица 9

Влияние иммуноактивных факторов на аллостимуляторную активность пациентов злокачественной лимфомой

Примечание: представлены средние значения (M±SE) пролиферативной активности в СКЛ. Респондеры - аллогенные МНК, стимуляторы -интактные (ДК0) и предобработанные ДК (+), *-PU<0,05- достоверность различий показателей по отношению к культурам ДК(0), U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Наряду с аллостимуляторной активностью, важным свойством ДК, особенно в аспекте их использовании в качестве противоопухолевых вакцин, является прямая противоопухолевая цитотоксическая активность. Выявление дефектности указанной функции у больных с глиомами головного мозга высокой степени злокачественности и пациентов злокачественными лимфомами побудило исследовать возможность стимуляции цитотоксической активности ДК in vitro с помощью анализируемых факторов. Как следует из данных таблицы 10, анализируемые факторы усиливали исходно сниженную цитотоксическую активность ДК больных ЗОГМ и ЗЛ против клеток линии Hep-2. Таким образом, стимуляция ДК в культуре in vitro рядом иммуноактивных препаратов позволяет частично или полностью восстановить сниженную цитотоксическую активность ДК у больных онкологическими заболеваниями.

Таблица 10

Влияние иммуноактивных факторов на цитотоксическую активность ДК больных ЗОГМ (Grade IV) и ЗЛ против клеток линии НЕр-2

Прим...