Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Цитологические особенности вторичных миелодисплазий при лимфомах

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

14.00.29 - гематология и переливание крови

кандидата медицинских наук

Дьячкова Наталья Юрьевна

Новосибирск - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Поспелова Татьяна Ивановна

доктор медицинских наук, Ковынев Игорь Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Зюбина Лариса Юрьевна

доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич

Ведущая организация: НИИ гематологии и переливания крови ФГУ (Киров)

Защита состоится «____»______2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д001.048.01 при Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦКЭМ СО РАМН.

Автореферат разослан «_____»____________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.б.н. Пальчикова Н.А.

Резюме

миелодисплазия анемический лимфома выживаемость

На основании проведенного исследования можно заключить, что развитие вторичной миелодисплазии и, как следствие, цитопенического синдрома является серьезной проблемой у больных гемобластозами. Цитопенический, и в том числе анемический синдром ухудшает течение основного заболевания, эффективность проводимой химио- и лучевой терапии и значительно снижает качество жизни пациента.

В основе патогенеза развития цитопении лежит взаимодействие между популяцией опухолевых клеток, иммунной системой и нормальным гемопоэзом, что приводит к снижению пролиферации ранних эритроидных предшественников, развитию диспластических изменений, угнетению продукции эритропоэтина и снижению на поверхности эритроидных клеток рецепторов к эритропоэтину.

Изменения, происходящие в костном мозге у больных лимфомами, можно объяснить не только механической экспансией опухолевого клона с вытеснением нормальных ростков кроветворения, но и дефектом микроокружения в результате воздействия на него опухолевых клеток (качественные и количественные изменения клеток стромы костного мозга с нарушением синтеза цитокинов), что является одним из механизмов развития миелодисплазии, в основе которой лежит усиление программированной клеточной гибели клеток-предшественников гемопоэза (Волкова М.А., 2005). Исходя из современных литературных данных и результатов настоящего исследования, становится понятным, что причина возникновения миелодисплазии заключается в активизации проапоптозных механизмов, имеющих целью подавление опухоли, которая способна ускользать от этого воздействия, в результате супрессорное влияние охватывает нормальный гемопоэз. Вследствие этого происходят поломки на генетическом уровне стволовых кроветворных клеток, диспластические изменения клеток костного мозга, а это, в свою очередь, является причиной неэффективного гемопоэза, и в периферической крови пациентов обнаруживается анемия, лейкоцито- и тромбоцитопения.

Важным критерием опухолевой прогрессии и первичной химиорезистентности является повышение экспрессии продуктов ведущих семейств генов - регуляторов апоптоза, пролиферативной активности и лекарственной резистентности на опухолевых клетках гемопоэтической системы. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что гиперэкспрессия p-gly, ki-67, bcl-2, c-myc и мутантной формы р-53 на опухолевых клетках у больных лимфомами сочетается с выраженными диспластическими изменениями клеток костного мозга, с появлением морфологических признаков повышенного апоптоза (наличие апоптозных телец, сморщивание клеточных ядер, появление ядерных фрагментов и т.д.), плохим ответом на лечение и неблагоприятным прогнозом.

Все вышеизложенные механизмы объясняют выявленную взаимосвязь миелодисплазии с неблагоприятным прогнозом при онкогематологических заболеваниях. Выживаемость пациентов вне зависимости от варианта гемобластоза без признаков миелодисплазии значительно превышает показатели выживаемости пациентов с наличием диспластических изменений в костном мозге.

При анализе прогностической ценности маркеров апоптоза и пролиферативной активности в группах с отсутствием и наличием миелодисплазии высокий уровень прогностической значимости отмечен для маркеров - вcl-2 , мутантной формы р53, p-gly. Менее выраженной прогностической ценностью обладали c-myc и Ki-67. Эти данные косвенным образом подтверждают наше предположение о том, что при опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом реализуется закрепленная генетически программа внутриклеточного подавления апоптоза, что обеспечивает низкую уязвимость опухоли к внешним факторам онкосупрессии и обусловливает прогрессирование опухоли и ее химиорезистентность. Именно поэтому совокупность молекулярно-биологических признаков, отражающих динамику этих нарушений, имеет прямое отношение к прогнозированию клинических проявлений опухолевой прогрессии и общей эффективности циторедуктивной химиотерапии. Быстрота накопления в субстрате опухоли химиорезистентных клонов отражается на общей выживаемости больных.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В последние десятилетия в гематологии произошли значительные успехи, принципиально изменились подходы в лечении, улучшился прогноз для больных гемобластозами (Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., 2002). Заболевания, для которых раннее не существовало эффективной специфической терапии, стали потенциально излечимыми, увеличились число и продолжительность ремиссий. В настоящее время полная ремиссия достигается у 60% больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и более чем у 80% пациентов с лимфомой Ходжкина (Поддубная И.В., 2007, Chapuy., M.Shipp, 2009, Gisselbrecht C., 2009). Однако существуют факторы, которые снижают эффективность противоопухолевой терапии. Одним из них является вторичная миелодисплазия, которая обнаруживается еще до начала специфической терапии. Под вторичной миелодисплазией или дисмиелопоэзом понимают комплекс морфологических нарушений в клетках костного мозга, который выявляется на фоне существующей опухоли крови, при злокачественных образованиях, после химио- и лучевой терапии, при анемиях и других заболеваниях (Detlef Haase, 2008). Ее следует отличать от первичного миелодиспластического синдрома, который является клональным заболеванием, возникающим на уровне стволовой клетки и характеризующимся неэффективным гемопоэзом, клинически проявляющимся цитопениями в периферической крови (Boultwood J., Galili N., Raza A., 2009, Brunning R. D. et al., 2008, Wainscoat J. S., 2001). В последнее десятилетие особое внимание уделяется изучению биологических и клинических особенностей гемобластозов с диспластическими изменениями клеток. Ряд исследовательских групп рассматривают вторичную миелодисплазию (ее отдельные варианты) в качестве неблагоприятного прогностического признака (Френкель М.А., 2005, Goasquen J. et al., 2006). Вместе с тем, многие вопросы патогенеза дисмиелопоэза при онкогематологических заболеваниях, причины и роль дисплазии кроветворения в формировании цитопении и неэффективного гемопоэза, влияние миелодисплазии на течение заболеваний и эффективность терапии изучены недостаточно. Остаются неуточненными морфологические особенности клеток костного мозга, нет четких критериев его диагностики. Мало изучены проявления дисплазии и неэффективного гемопоэза в зависимости от иммуноморфологических особенностей клеток, уровня пролиферации и апоптоза.

Наиболее частым проявлением миелодисплазии, наряду с тромбоцитопенией и лейкоцитопенией, является анемия (Vabpel P., 2001, Cazzola M., Malcovaty L., 2005). Патофизиология анемии при злокачественных новообразованиях включает взаимодействие ряда факторов. В том числе - между популяцией опухолевых клеток и иммунной системой, что способствует активации макрофагов и повышенной экспрессии различных цитокинов, которые приводят к укорочению периода жизни эритроцитов, нарушению реутилизации железа костным мозгом, неадекватной продукции эритропоэтина (ЭПО), супрессии эритроидных предшественников, что и вызывает развитие анемии при неопластических процессах (Бредер В.В., 2003, Kunikane H., 2001). Неадекватная продукция ряда растворимых ингибиторов миелопоэза клетками опухоли, активированными иммунокомпетентными клетками в период онкогенеза, приводит к неэффективному эритропоэзу, тромбоцито- и лейкопении (Павлов А.Д., 1999, Hellstrom-Lindberg E., Cazzola M., 2008, Papadaki H., 2009).

Учитывая вышеизложенное, изучение цитоморфологических проявлений миелодисплазии при гемобластозах является актуальным, так как позволит уточнить молекулярно-биологические особенности изменений кроветворения при лимфомах, определить влияние дисмиелопоэза на выживаемость этих пациентов.

Цель исследования: изучить цитологические и молекулярно-биологические особенности вторичных миелодисплазий у больных лимфомами и оценить влияние миелодисплазии на эффективность терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить цитологические проявления вторичных миелодисплазий у больных лимфомами.

2. Исследовать особенности анемического синдрома у больных лимфомами с вторичной миелодисплазией и без нее.

3. Выявить взаимосвязь между степенью выраженности миелодисплазии и экспрессией антигенов-маркеров апоптоза и пролиферативной активности на опухолевых клетках.

4. Проанализировать выживаемость больных гемобластозами с миелодисплазией и без диспластических изменений костного мозга.

Научная новизна. Впервые показаны структура и цитологические особенности вторичных миелодисплазий у больных лимфомами, которые, в отличие от дисплазий у больных первичным миелодиспластическим синдромом, характеризуются отсутствием бластных форм, гиперплазии эритрона, макроцитоза зрелых эритроцитов и высоких показателей сидероцитов костного мозга, менее выраженной мегалобластоидностью ядер эритрокариоцитов. Выявлено, что наличие вторичной миелодисплазии, выявляемой на этапе первичной диагностики, ухудшает течение опухолевого процесса и снижает эффективность противоопухолевой терапии. Обнаружено, что у пациентов с дисплазией кроветворения чаще выявляют анемию и тромбоцитопению. Доказано, что проведение химиотерапии увеличивает степень выраженности цитоморфологических проявлений дисмиелопоэза. Отмечено, что случаи с наиболее выраженными диспластическими изменениями сопровождаются гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантного р-53) и активацией механизмов множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) и сочетаются с худшим прогнозом, низкой четырехлетней выживаемостью.

Практическая значимость работы. Показана высокая частота встречаемости вторичных миелодисплазий у больных лимфомами на этапе диагностики основного заболевания. Доказано, что дисплазия кроветворения оказывает отрицательное влияние на течение лимфопролиферативных заболеваний. При выраженных диспластических изменениях кроветворения в большем проценте случаев наблюдается низкая эффективность химиотерапии и частые рецидивы заболевания. Выявлена связь вторичной миелодисплазии со снижением экспрессии рецепторов к ЭПО, что может способствовать развитию резистентности к эритропоэтину. Доказано, что варианты гемобластоза с наиболее выраженными морфологическими проявлениями вторичной миелодисплазии и гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантного р-53) и множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) сочетаются с худшим прогнозом, что определяет необходимость выявления признаков вторичной миелодисплазии на этапе диагностики опухолевого процесса для последующей прогностической оценки эффективности терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вторичные миелодисплазии у больных лимфомами характеризуются отсутствием бластных форм, гиперплазии эритрона, макроцитоза зрелых эритроцитов и высоких показателей сидероцитов костного мозга, менее выраженной мегалобластоидностью ядер эритрокариоцитов.

2. В генезе анемического синдрома у больных неходжкинскими лимфомами с миелодисплазией большую роль играет снижение экспрессии рецепторов к эритропоэтину и числа клеток, экспрессирующих эти рецепторы.

3. Цитоморфологические проявления вторичных миелодисплазий обнаруживают высокую прямую корреляцию с гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантной формы р-53), множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) и неблагоприятным течением заболевания, что ухудшает показатели выживаемости пациентов.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на Юбилейной конференции, посвященной 40-летию гематологической службы г.Новосибирска (2004); 21(XLIV) сессии общего собрания Сибирского отделения РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы онкологии» (2003); международных конференциях «Фундаментальные науки - биологии и медицине» (Новосибирск, 2005, 2006, 2007, 2008); на ежегодных научно-практических конференциях «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2003, 2004, 2005, 2006); на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005); на выездной сессии Президиума СО РАМН, посвященной проблемам онкологии и онкогематологии (Новосибирск, 2006), на 3-межрегиональной научно-практической школе-семинаре «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2006).

Внедрение результатов исследования. Полученные в работе результаты внедрены в практику работы гематологического отделения МУЗ ГКБ № 2 г. Новосибирска. Материалы диссертации получили отражение в учебном процессе на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета.

Работа выполнена на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета Новосибирского государственного медицинского университета (зав. кафедрой - проф. Т.И. Поспелова), на базе Городского гематологического центра МУЗ ГКБ № 2 (главный врач - проф. Л.А. Шпагина, зав. отделением - к.м.н. И.Н. Нечунаева).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 183 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных результатов исследования, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка цитированной литературы. Содержит 38 таблиц, 12 рисунков, 4 фотографии. Библиография включает 45 отечественных и 229 иностранных авторов. Весь представленный материал получен, обработан и проанализирован лично автором.

Материал и методы исследования

Общая характеристика обследованных больных. Группу обследуемых составили 143 больных онкогематологическими заболеваниями: неходжкинскими злокачественными лимфомами (НХЗЛ) - 73 пациента, лимфомой Ходжкина (ЛХ) - 30 больных и 40 - первичным миелодиспластическим синдромом (МДС), госпитализировавшихся в 2000-2005г. в специализированное гематологическое отделение муниципального учреждения здравоохранения городской клинической больницы №2 г. Новосибирска.

Среди пациентов, страдающих гемобластозами, преобладали мужчины - 88 человек (61,5%), женщин было 55 (38,5%). Возраст обследуемых варьировал от 16 до 74 лет, преобладали лица среднего и старшего возраста 50-69 лет (50,2%), при этом средний возраст составил 46,2±3,5 года.

В анализируемой группе больных лимфомами наибольшее число пациентов - 61 человек (59,2%) страдали неходжкинскими лимфомами IV стадии, у 5 человек (4,9%) диагностирована I стадия, 5 человек (4,9%) имели II стадию и 2 человека (1,9%) - III стадию. В группе больных лимфомой Ходжкина II стадия была диагностирована у 13 пациентов (12,6%), III стадия - у 9 (8,7%), IV стадия - у 8 человек (7,8%), I стадия не выявлена ни у одного больного.

В группе больных первичным миелодиспластическим синдромом у наибольшего числа пациентов - 23 человек (57,5%) была диагностирована рефрактерная анемия (РА), у 10 пациентов (25,0%) - рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами (РАСК), у 7 (17,5%) - рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ).

Больные, включенные в исследование, получили от 4 до 8 курсов полихимиотерапии, в среднем 4,7 курсов. В терапии использовались следующие протоколы: при индолентных НХЗЛ - СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон), СНОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон, доксорубицин), при агрессивных НХЗЛ - СНОР, СНОЕР (циклофосфан, винкристин, преднизолон, доксорубицин, вепезид), DНАР (дексаметазон, цитозар, цисплатин), при лимфоме Ходжкина - ABVD (адриабластин, блеомицин, винбластин, дакарбазин), BEACOPP (циклофосфан, доксорубицин, вепезид, прокарбазин, преднизолон, винкристин, блеомицин).

Общеклинические методы исследования. Пациенты обследовались с использованием стандартного набора клинических и инструментальных методов, включавших исследование показателей гемограммы, миелограммы, трепанобиоптата. При наличии лимфаденопатии или органных поражений проводилась обязательная биопсия опухоли с морфологическим исследованием ткани лимфоидной неоплазии. В целях изучения распространенности НХЗЛ и верификации стадии заболевания использовались инвазивные (ЭФГДС, ФКС и другие) и неинвазивные методы (УЗИ внутренних органов, рентгеновская компьютерная томография или магниторезонансная томография). Исследовались основные биохимические показатели, в том числе общая лактатдегидрогеназа, уровень белка плазмы крови, билирубин, трансаминазы, щелочная фосфатаза. На этапе первичной диагностики, в динамике наблюдения и лечения все больные проходили предусмотренные стандартными протоколами химиотерапии обследования.

Специальные методы исследования. Проводилось цитологическое исследование препаратов периферической крови и пунктатов костного мозга с оценкой морфологии элементов и наличия диспластических изменений. Оценку дисплазии элементов костного мозга проводили в соответствии с критериями, предложенными J. Goasquen и соавторами, принятыми в качестве стандарта в классификации ВОЗ (2000). В эритроидном ряду в процентах определяли число клеток с мегалобластоидными признаками, многоядерные формы, наличие анизо- и пойкилоцитоза эритрокариоцитов, наличие цитоплазматических мостиков, элементов с признаками кариорексиса, наличием базофильной пунктации эритроцитов, телец Жолли. Дисплазия эритроидного ростка диагностировалась при наличии более 50% измененных форм. Оценивали не менее 25 клеток. Гранулоцитарный росток расценивался как дисплазированный при наличии более 50% клеток с признаками дисплазии: анизоцитозом гранулоцитов, гиперсегментацией ядер нейтрофилов, гипогрануляцией, наличием пельгероидных форм. Анализировали не менее 25 клеток. Дисплазия мегакариоцитарного ростка устанавливалась при наличии микроформ и/или одноядерных форм мегакариоцитов более чем в 50% клеток. Подсчитывали не менее 6 клеток. Ростки гемопоэза со сниженной клеточностью рассматривались как недисплазированные.

Проводилось измерение среднего диаметра эритроцитов с помощью окуляра-микрометра.

Использовалась методика цитохимического окрашивания препаратов пунктатов костного мозга на выявление гранул гемосидерина с подсчетом процентного содержания сидероцитов.

Исследование обмена железа (сывороточное железо, общая железосвязывающая способность сыворотки крови (ОЖСС), коэффициент насыщения трансферрина (КНТ)) осуществлялось в лаборатории МУЗ ГКБ№2. Также определялся уровень ферритина сыворотки крови методом иммуноферментного анализа в лаборатории Областного диагностического центра. Уровень сывороточного эритропоэтина, витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке крови исследовались в лаборатории ООО «Лабораторная диагностика» методом ферментативно-усиленной хемилюминесценции (технология DPC, США), являющимся модернизированным иммуноферментным анализом с высокой специфичностью и чувствительностью (исследование выполнено совместно с к.м.н. А.С.Лямкиной).

Основной молекулярно-биологической технологией данной работы являлось иммуноцитохимическое исследование биопсийного материала опухоли.

С целью характеристики иммунологического фенотипа была использована панель моноклональных антител (МКА). Использовались концентрированные, лиофилизированные и ready-to-use МКА, приобретенные у компаний-лидеров по производству реактивов для молекулярно-генетических исследований: DAKO, Novocastra, R&D и других.

Список моноклональных антител (МКА), входивших в исследовательскую панель, включал следующие позиции и соответствующие им гибридомные клоны:

1. МКА против белков-регуляторов апоптоза и онкопротеинов (CD95 (Fas-лиганд) (DX2), p-53 (DO7), вcl-2 (клон 100/D5), с-myc (онкопротеин) (9E11)).

2. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67 (MIB-1)).

3. МКА против белка - продукта гена множественной лекарственной резистентности (MDR1) (p-glycoprotein (клон JSB-1)).

Метод иммуноцито(гисто)химического исследования фенотипа клеток опухолевого субстрата

Исследование иммунологического фенотипа опухолевых клеток осуществлялось с помощью систем визуализации (LSAB+, LSAB2 (DAKO), основанных на стрептавидин-биотиновой или полимерной (EnVision Systems (DAKO)) методиках с использованием цитохимической метки щелочной фосфатазой (для иммуноцитохимического исследования) или пероксидазой.

Использовался стандартный метод иммуногисто(цито)химического исследования.

Основным материалом для работы являлся субстрат опухоли, полученный методом открытой или пункционной (при поражении костного мозга) биопсии опухоли. Исследовались мазки стернального пунктата или трепанобиоптата.

Статистическая обработка результатов исследования

Первичным материалом исследования являлись истории болезни пациентов с гемобластозами, амбулаторные карты, компьютерная база данных Городского гематологического центра, содержащая паспортные, клинические и клинико-лабораторные показатели по каждому случаю, протоколы иммуноцито(гисто)химических исследований и заключения по ним.

Вся информация была преобразована в формат электронных таблиц Exсel. Сформированная база данных настоящего исследования в последующем проходила математическую обработку с помощью пакета прикладных математических программ STATISTIKA 6 версия (StatSoft Inc.) с использованием статистических возможностей Excel.

При анализе клинических, морфологических и параклинических данных были использованы методы описательной статистики с подсчетом средних величин числовых показателей, ошибки средних (р<0,05)и другие варианты анализа:

- непараметрическое сравнение (критерии Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица, Колмогорова-Смирнова).

- коэффициент корреляции Спирмена для оценки взаимосвязи между параметрами с определением коэффициента ранговой корреляции (Боровиков В.П., 2001).

Целесообразность применения методик непараметрического сравнения диктовалась тем, что, по данным ряда исследований (Гублер Е.В., 1990), для медико-биологических показателей этот подход дает более стабильные и надежные оценки статистических характеристик.

Многолетняя выживаемость пациентов в группах исследовалась с помощью метода анализа цензурированных данных с использованием функции вероятности выживания по Каплану и Мейеру с расчетом логарифмического рангового критерия (log-rank) для оценки достоверности различий выживаемости.

Результаты исследования и их обсуждение

Цитоморфологические особенности кроветворения у больных лимфомами и первичным МДС до начала химиотерапии

Согласно литературным данным, миелодисплазия часто встречается при гематологических заболеваниях. Как показали О.Ю.Баранова с соавт. (2005), при остром миелобластном лейкозе частота миелодисплазии составляет 65,2%, А.Д.Кулагин с соавт. (2008) описывают эритроидную дисплазию у 16% больных типичной апластической анемией.

В нашем исследовании признаки дисплазии элементов костного мозга у больных лимфомами отмечены у 64,1% пациентов еще до начала специфической терапии. Частота встречаемости одно- и двухлинейной миелодисплазии достоверно не отличалась от таковой у больных первичным миелодиспластическим синдромом как до, так и после лечения, тогда как трехлинейная миелодисплазия до начала полихимиотерапии (ПХТ) встречалась реже: при неходжкинских злокачественных лимфомах (НХЗЛ) - в 38,4% случаев, лимфоме Ходжкина (ЛХ) - в 23,3% случаев. После проведения пациентам ПХТ трехлинейная миелодисплазия определялась уже у 50,0% больных ЛХ и 65,8% больных НХЗЛ, причем в последнем случае она достоверно не отличалась от таковой у больных первичным миелодиспластическим синдромом (МДС) (77,5%) (табл.1).

Таблица 1. Частота встречаемости мультилинейной миелодисплазии у больных лимфомами и первичным МДС

Среди признаков дисплазии эритроидного ряда наиболее часто отмечено наличие цитоплазматических мостиков - у 42,5% пациентов с неходжкинскими лимфомами до ПХТ и у 50,7% после лечения, что достоверно не отличалось от частоты встречаемости при первичном МДС - 55,0%. Многоядерные нормоциты встречены у 32,9% больных НХЗЛ до ПХТ и у 46,6% после, при первичном МДС - у 57,5% пациентов. Мегалобластоидность ядер эритрокариоцитов наблюдалась у 15,1% больных лимфомами до ПХТ и у 40,0% после полихимиотерапии и также достоверно не отличалась от частоты встречаемости при первичном МДС - у 37,5% (15) (табл. 2).

Таблица 2. Морфологические изменения клеток эритроидного ряда у больных лимфомами и первичным МДС

Дизгранулоцитопоэз до начала специфической противоопухолевой терапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями проявлялся гипогрануляцией нейтрофилов у 56,2% пациентов НХЗЛ до ПХТ и у 80,8% после, у 33,3% - с ЛХ до и 63,3% после ПХТ (р<0,05). Частота встречаемости гипогранулированных нейтрофилов при лимфомах после начала ПХТ достоверно не отличалось от показателей при первичном МДС - 80,0%. У 12,3% больных НХЗЛ до ПХТ отмечено появление пельгероидных форм гранулоцитов, число которых после ПХТ возросло до 34,2% и было аналогично таковому при первичном МДС - 55,0% случаев (р>0,05) (табл.3).

Таблица 3. Морфологические изменения клеток гранулоцитарного ряда у больных лимфомами и первичным МДС

Изменения морфологии элементов мегакариоцитарного ряда выражались в обнаружении одноядерных форм мегакариоцитов в 26,0% случаев у больных НХЗЛ и в 13,3% при ЛХ до ПХТ, в 56,2% и 46,5% после лечения соответственно, что достоверно не отличалось от данных при МДС - у 60,0% больных (р>0,05); мегакариоцитов с множественными округлыми ядрами - в 15,1% при НХЗЛ до и в 21,9% после ПХТ, столько же и при первичном МДС - 25,0% (р>0,05). Для МДС были также характерны микроформы мегакариоцитов - в 40,0% случаев, которые при лимфомах встречались реже - в 9,6% при НХЗЛ и в 6,6% при ЛХ (табл. 4).

Таблица 4. Морфологические изменения клеток мегакариоцитарного ряда у больных лимфомами и первичным МДС

Таким образом, вторичная миелодисплазия выявляется в клиническом дебюте лимфом у значительного числа больных. Отмечены выраженные изменения частоты встречаемости дисмиелопоэза после проведения индукционных курсов ПХТ. Анализ миелодиспластических изменений со стороны основных ростков миелопоэза - эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоциторного показал, что если дисплазия эритроидного ряда у больных НХЗЛ до ПХТ была встречена у 45 пациентов (61,7%), то после начала противоопухолевой терапии она регистрировалась достоверно чаще - уже у 62 пациентов (85,0%), что было сопоставимо с данными больных первичным МДС (97,5%) (табл. 5). У больных лимфомой Ходжкина до ПХТ дизэритропоэз был обнаружен у 30,0% пациентов, после прохождения индукционных курсов противоопухолевой терапии он отмечен уже у 63,3% обследованных (Р<0,05). Дизгранулоцитопоэз отмечен до ПХТ у 49 (67,1%) НХЗЛ, после лечения - у 59 человек (80,8%), что достоверно не отличалось от аналогичных показателей у больных первичным миелодиспластическим синдромом (87,5%). Также и у больных ЛХ - до ПХТ дисплазия гранулоцитарного ряда была выявлена у 50,0% (15) обследованных, после лечения - у 63,3% (19) (Р>0,05) и показатели также достоверно не отличались от таковых у больных первичным МДС. Дизмегакариоцитопоэз наблюдался до ПХТ у 35 больных (48,0%) НХЗЛ и у 7 (23,3%) - ЛХ, после специфической терапии диагностировался чаще - у 55 больных (75,3%) и 17 (56,7%) соответственно (Р<0,05), при первичном МДС (87,5%). Анализ изменений, выявленных у больных лимфомами после проведения ПХТ свидетельствует о том, что степень выраженности их значительно увеличилась и стала близка к таковой при первичном миелодиспластическом синдроме, что говорит об углублении диспластических изменений в костном мозге на фоне противоопухолевой химиотерапии.

Таблица 5. Влияние химиотерапии на углубление морфологических признаков миелодисплазии у больных лимфомами после индукции ремиссии

Следует отметить, что, если до начала противоопухолевой терапии морфологические признаки вторичной миелодисплазии у больных лимфомой Ходжкина были менее выражены, чем у больных неходжкинскими лимфомами, то после прохождения индукционных курсов ПХТ частота встречаемости диспластических изменений элементов костного мозга стала сопоставима с большинством показателей больных НХЗЛ, также как и с первичным миелодиспластическим синдромом.

При исследовании общего анализа крови у больных НХЗЛ и лимфомой Ходжкина было выявлено, что у пациентов с признаками дисплазии эритроидного ряда в костном мозге анемия встречалась чаще и показатели гемоглобина были достоверно ниже, чем при отсутствии изменений морфологии клеток костного мозга. В группе с дисплазией эритроидного ростка анемия различной степени тяжести наблюдалась в 46,7% случаев у больных ЛХ, в группе без признаков дизэритропоэза - в 20,0% (p<0,05), в 59,6% - при НХЗЛ с дисплазией, без дизэритропоэза - в 33,4% случаев (p<0,05). В группе с дисплазией мегакариоцитарного ростка тромбоцитопения отмечалась в 51,4% случаев у больных лимфомами. В группе больных без признаков дизмегакариоцитопоэза тромбоцитопения отмечена лишь в 10,5% случаев неходжкинских лимфом (p<0,05). Проследить связь диспластических изменений гранулоцитарного ряда с появлением лейкопении в периферической крови до начала химиотерапии у больных лимфомами сложно из-за специфического поражения данного ростка (повышенный лейкоцитоз за счет опухолевых элементов при НХЗЛ) (табл. 6).

Таблица 6. Глубина цитопенического синдрома у больных лимфомами с признаками миелодисплазии и при их отсутствии и у больных первичным МДС

При анализе данных миелограммы больных лимфомами не было характерно расширение эритроидного ряда и отсутствовали варианты с повышенным бластозом, в отличие от больных первичным МДС (табл.7).

Таблица 7. Изменения миелограммы у больных НХЛ, ЛХ и первичным МДС до ПХТ

Средний диаметр эритроцитов у больных гемобластозами не выходил за пределы нормы (7,0±0,8 мкм) в отличие от пациентов с первичным миелодиспластическим синдромом (7,47±0,4 мкм), где отмечался макроцитоз.

Количество сидероцитов костного мозга у большинства больных лимфомами не превышало границы пределов нормы (0-15%), но достоверно отличалось от больных первичным миелодиспластическим синдромом (41,3±3,7%) (табл.9).

Таблица 9. Количество сидероцитов костного мозга у больных лимфомами и первичным МДС

При анализе частоты ремиссий у больных лимфомами (табл. 10) отмечено, что при наличии миелодисплазии в дебюте заболевания безремиссионное течение и ранние рецидивы были характерны для 59,6% пациентов с НХЗЛ и 46,7% больных лимфомой Ходжкина, что достоверно отличалось от показателей пациентов с отсутствием диспластических изменений элементов костного мозга, где ремиссия после индукционных курсов не была достигнута у 33,3% больных НХЗЛ и 20,0% пациентов с ЛХ (Р<0,05). При отсутствии дисмиелопоэза ремиссия была достигнута у 66,7% больных неходжкинскими лимфомами и 80,0% - ЛХ, а у больных с миелодисплазией только в 40,4% случаев НХЗЛ и у 53,3% - при ЛХ.

Таблица 10. Частота ремиссий у больных лимфомами при наличии миелодисплазии в дебюте заболевания и при ее отсутствии

Полученные данные свидетельствуют о высокой частоте встречаемости миелодисплазии клеток костного мозга при гемобластозах, особенностью у больных лимфомами является отсутствие бластных форм, гиперплазии эритрона, макроцитоза эритроцитов и высоких показателей сидероцитов костного мозга.

Показатели обмена железа у больных вторичной миелодисплазией при лимфомах и первичным миелодиспластическим синдромом

Для уточнения генеза анемического синдрома у пациентов с лимфомами проводилось исследование показателей обмена железа (железо сыворотки крови, общей железосвязывающей способности (ОЖСС), коэффициент насыщения трансферрина (КНТ), уровень ферритина), уровня витамина В12 и фолиевой кислоты сыворотки крови. При оценке показателей феррокинетики выявлено, что у большинства больных неходжкинскими лимфомами (более 80%) показатели сывороточного железа, ОЖСС, КНТ, ферритина были в пределах нормальных значений. Признаки железодефицитного состояния (низкий уровень сывороточного железа, КНТ, повышение ОЖСС и низкий уровень ферритина) наблюдались лишь у 5,3% больных. У 3,2% обследованных больных были низкие показатели железа и КНТ при нормальном и повышенном уровне ферритина. Это может указывать на нарушение мобилизации железа из депо и его утилизации костным мозгом, а также на железоперераспределительный характер анемического синдрома у данной группы пациентов. В группе больных лимфомой Ходжкина признаки дефицита железа выявлены у 33,3% больных, среди которых преобладали молодые женщины с полименореей. В группе больных первичным миелодиспластическим синдромом показатели феррокинетики были в пределах нормальных значений у 38 пациентов из 40 (95,0%). У 2 пациентов, помимо диспластических изменений, наблюдались признаки дефицита железа (5,0%), а у 1 (2,5%) - признаки перераспределения железа (низкое железо сыворотки и нормальный уровень ферритина).

Уровень витамина В12 (446,3±18,8 pg/ml) и фолиевой кислоты (10,9±0,8 ng/ml) во всех группах был в пределах нормальных значений. Эти данные позволяют исключить В12- и фолиево-дефицитный генез анемического синдрома у обследованных больных. Наличие же диспластических изменений эритроидных клеток говорит о том, что в большинстве случаев анемический синдром при лимфомах связан с нарушениями кроветворения вследствие неэффективного гемопоэза.

Уровень сывороточного эритропоэтина и экспрессии рецепторов к эритропоэтину у больных вторичной миелодисплазией при лимфопролиферативных заболеваниях и первичным МДС

При анализе уровня сывороточного эритропоэтина продукция эндогенного эритропоэтина была неадекватной у 62,5% больных лимфопролиферативными заболеваниями, среди которых преобладали пациенты с признаками миелодисплазии, следовательно, большую роль в патогенезе анемического синдрома у больных гемобластозами играет неадекватная продукция эритропоэтина и недостаточная стимуляция ранних эритроидных предшественников костного мозга. У больных первичным миелодиспластическим синдромом, несмотря на довольно большой процент пациентов с высокими цифрами сывороточного эритропоэтина (с-ЭПО), не происходит восстановления уровня гемоглобина и уменьшения степени тяжести анемического синдрома вследствие снижения количества клеток, экспрессирующих рецепторы к эритропоэтину (ЭПО-Р) и увеличенного апоптоза (табл.11).

Таблица 11. Уровень сывороточного эритропоэтина у больных НХЗЛ с анемическим синдромом и первичным МДС

У 27,0% больных лимфомами с миелодисплазией обнаружено снижение количества клеток, экспрессирующих ЭПО-Р и у 49% снижение экспрессии ЭПО-Р при достаточном количестве эритрокариоцитов, что может быть причиной резистентности эритроидных предшественников костного мозга к эритропоэтину и неэффективности применения препаратов рекомбинантного человеческого эритропоэтина, что подтверждают исследования А.С. Лямкиной (2005). Эти изменения, вероятно, наблюдаются на фоне нарастания выбросов проапоптозных цитокинов со стороны микроокружения и иммунной системы как реакция на опухолевый рост, что приводит к снижению пролиферации ранних эритроидных предшественников, угнетению эндогенной продукции эритропоэтина, а также развитию миелодисплазии, результатом которой является снижение рецепторов к эритропоэтину на поверхности эритрокариоцитов костного мозга.

Экспрессия белков-регуляторов апоптоза на клетках различных морфологических вариантов неходжкинских злокачественных лимфом

Проводился комплексный анализ экспрессии важнейших белков-регуляторов апоптоза и клеточной пролиферации на опухолевых клетках при различных морфологических вариантах неходжкинских злокачественных лимфом

Для определения прогностической роли молекулярных маркеров опухолевой прогрессии были проанализированы все пациенты с лимфомами, в зависимости от наличия и отсутствия миелодисплазии и результатов лечения: с хорошим ответом (полная и частичная ремиссия) и отсутствием эффекта от лечения (безремиссионное течение).

Экспрессия маркеров апоптоза у больных лимфомами с миелодисплазией была выше, чем у пациентов без диспластических изменений клеток костного мозга: мутантного р-53 был выше - в 1,4 раза (51,9% в группе больных с миелодисплазией против 38,3% в группе больных с отсутствием дизмиелопоэза), онкопротеина c-myc - в 2,8 раза (40,4% против 14,3%; р0,05, соответственно) и bcl-2 - в 1,8 раза (76,9% в группе с миелодисплазией против 42,9% в группе с отсутствием дисплазии; (р0,05), маркер множественной лекарственной устойчивости p-gp - в 2 раза (43,2% против 19,3%; р0,05, соответственно) (таб.11).

Таблица 11. Частота встречаемости маркеров апоптоза у больных НХЗЛ с миелодисплазией и без нее

В группе больных лимфомами с хорошим ответом на лечение уровень экспрессии р-53, bcl-2, c-myc, ki-67, р-гликопротеина (p-gp) был ниже, чем в группе пациентов с отсутствием эффекта от проводимой терапии: р-53 ниже - в 2 раза (28,6% в группе больных с хорошим ответом на терапию против 58,1% в группе больных с отсутствием эффекта; р0,05), маркер пролиферативной активности ki-67 - в 3 раза (28,6% в группе с хорошим ответом на терапию против 77,4% в группе с отсутствием ответа на терапию; р0,03), онкопротеина c-myc - в 2 раза (23,8% против 41,9%; р0,05, соответственно) и bcl-2 - в 2 раза (42,9% в группе с хорошим ответом на терапию против 71,0% в группе с отсутствием ответа на терапию; р0,05), также маркер множественной лекарственной устойчивости p-gp - в 2 раза (9,5% против 19,4%; р0,05, соответственно). Уровень экспрессии рецепторной молекулы CD95 достоверно не различался в зависимости от ответа на терапию и составил (57,1% в группе с хорошим ответом на терапию против 67,7% в группе пациентов, у которых эффект от терапии отсутствовал) (рис.1).

Рис.1. Частота экспрессии регуляторных белков мутантного р-53, bcl-2, c-myc, ki-67, p-gp, CD95 в группах больных лимфомами с различным ответом на химиотерапию

*- р0,05 и ** - р0,03 по сравнению с группой больных лимфомами, у которых лечение оказало хороший эффект

Анализ результатов лечения свидетельствует о том, что в группе больных с высоким уровнем экспрессии мутантного р-53, bcl-2, c-myc, ki-67 и p-gp у большинства пациентов наблюдалась резистентность к проводимой терапии и плохой прогноз, безремиссионное течение отмечено у 62,1% обследуемых, а общий ответ на терапию составил 37,9%. Большинство пациентов (68%) демонстрировали мультилинейный (двух-и трехростковый) характер дисмиелопоэза.

В группе больных с низким уровнем или отсутствием экспрессии мутантной формы р-53, bcl-2, c-myc, ki-67, p-gp общий ответ на проводимую терапию составил 60% (полная и частичная ремиссия), что в 2,4 раза выше, чем у пациентов с высоким уровнем экспрессии исследуемых регуляторных белков, безремиссионное течение отмечено у 40% обследованных, что также меньше, чем в предыдущей группе. Изменения морфологии клеток костного мозга у данных больных были минимальными (15,8% - однолинейная и 7,9% - билинейная миелодисплазия).

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что гиперэкспрессия p-gp, ki-67, bcl-2, c-myc и мутантного р-53 у больных лимфомами сочетается с наиболее выраженными морфологическими проявлениями вторичной миелодисплазии, плохим ответом на лечение и неблагоприятным прогнозом. В группе больных с низким уровнем или отсутствием экспрессии изучаемых регуляторных молекул, напротив, диспластические изменения клеток костного мозга были минимальны, общий ответ на проводимую терапию составил 60% (полная и частичная ремиссия), а безремиссионное течение отмечено в данной группе у 40% обследованных, международный прогностический индекс соответствовал группе низкого и низкого/промежуточного риска.

Предпринят математический поиск взаимосвязи между степенью выраженностью миелодисплазии и отдельными маркерами. Для этого использовался корреляционный анализ между переменными по принципу формирования парных значений, которые образуются из рассматриваемых зависимых выборок. Для оценки факта наличия корреляционных связей, их силы и направленности был использован коэффициент корреляции Пирсона. Математический анализ выявил, что корреляционная связь между признаками действительно существует. Выраженность миелодисплазии (процентное отношение дисплазированных элементов костного мозга) хорошо коррелировала с пятью из шести показателей. Наиболее сильная прямая связь индекса была выявлена с p-гликопротеином (коэффициент Пирсона равен (+)0,83) и мутан...