Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Роль апоптоза и оксида азота в патогенезе ревматоидного артрита

14.00.39 - Ревматология

Дубиков А.И.

Москва - 2005

Актуальность проблемы

Ревматические заболевания (РЗ) в последние годы привлекают все большее внимание ученых в силу своей высокой распространенности и социальной значимости. Поражая преимущественно лиц трудоспособного возраста, они приводят к ранней инвалидизации, имеют тенденцию к прогрессированию, значительно укорачивают продолжительность жизни. Среди РЗ особое теоретическое и медико-социальное значение имеет ревматоидный артрит (РА), классический пример хронических воспалительных заболеваний человека [Насонов Е.Л., 2001]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется около 300 тысяч больных РА, а болезненность по этому заболеванию по данным статистики составляет 2,75 на 1000 лиц 18 лет и старше [Насонова В.А., Фоломеева О.М., 2001; Насонова В.А. и др., 2003; Шостак Н.А. и др., 1999].

Высокая социально-экономическая значимость РА связана с тем, что на лечение больных расходуются огромные средства, существенно превышающие бюджет других хронических заболеваний [Лила А.М., 2001]. Распространенность РА в мире составляет 0,5 - 1% [Насонова В.А., 1997; Эрдес Ш. и др., 1999; Harris E.D., 1997; Silman A.J., 1988]. Прямые медицинские затраты на лечение больных РА в США оцениваются, согласно различным источникам, от 3,7 до 8,6 млрд. долларов в год [Bloom B.C., 1988]. При этом пациенты, страдающие РА, используют ресурсы здравоохранения в значительно большей степени, чем страдающие другими заболеваниями внутренних органов. Так, в Швеции стоимость медицинского обеспечения больных РА в 2,5 раза выше, чем прямые затраты на обслуживание пациентов, не страдающих РА [Jonsson B. et al., 1992]. Показано также, что средняя продолжительность жизни при РА достоверно на 10 - 15 лет короче ожидаемой возрастных уровней, а 5-летняя выживаемость у больных с системными вариантами не превышает 50% [Насонов Е.Л., 2002]. Прогноз заболевания при РА со значительной деструкцией суставов сравним с таковым у больных атеросклеротическим поражением трех коронарных сосудов и у больных с IV стадией ходжкинской лимфомы [Насонов Е.Л., 2003].

Существенными звеньями или составляющими элементами борьбы с РЗ являются их своевременная диагностика, выяснение этиологии и патогенеза заболеваний, их профилактика и лечение. Многие аспекты этих вопросов при РА остаются неясными и, как следствие этого, сохраняется запоздалая диагностика, хронизация течения, отсутствие надежной этиопатогенетической терапии, позволяющей в ранние сроки прервать прогрессирование патологического процесса и, тем более, привести к регрессу наступивших патологических органических изменений. Исследования в этом направлении не потеряли актуальности.

Проведенный анализ литературы показал, что развитие научно-обоснованной концепции патогенеза РА за последние годы достигло заметных успехов. Они связаны, главным образом, с выяснением ряда важных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса, свойственного этому заболеванию, и возможностью их нейтрализации с помощью специфических антител. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза РА не существует, что иллюстрируется недостаточной клинической эффективностью используемых терапевтических подходов [Сигидин Я.А., Лукина Г.В., 2001].

Раскрытие механизмов гиперплазии синовиальной оболочки, сопровождающейся появлением пренеопластических характеристик у синовиальных макрофагов и фибробластов в виде экспрессии протоонкогенов и особой инвазивности [Smith M.D., 2004] невозможно без уточнения следующих проблем:

- роль апоптоза в развитии РА на ранней и поздней стадиях патологического процесса;

- роль NO-синтазной компоненты на разных этапах развития РА;

- взаимосвязь продукции оксида азота и апоптоза в процессе эволюции РА;

- взаимоотношения цитокиновой сети с феноменом апоптоза и продукцией оксида азота при РА.

Изучение этих механизмов даст новое, более целостное, концептуальное представление о патогенезе РА, особенно ранних стадий, что позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторинга и лечения этого тяжелого заболевания.

Цель работы: определить значение апоптоза и оксида азота в механизмах развития ревматоидного артрита и оценить возможность прогнозирования течения, эффективности проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние и динамику NO-синтазной функции у больных РА.

2. Определить роль про- (Fas, p53) и антиапоптотических (Bcl-2) механизмов в развитии РА.

3. Установить характер изменения нитрооксидпродуцирующей функции клеток синовиальной оболочки в условиях экспериментального адъювантного артрита.

4. Выяснить роль апоптоза (Fas, p53, Bcl-2 опосредованные звенья) в развитии экспериментального адъювантного артрита.

5. Оценить взаимосвязь между нитрооксидпродуцирующей функцией, феноменом апоптоза и цитокиновым профилем у больных РА.

6. Установить соотношения между продукцией оксида азота, апоптозом, синтезом цитокинов и клинико-лабораторными характеристиками РА.

7. Установить влияние различных терапевтических программ на нитрооксидпродуцирующую функцию, апоптоз, цитокины у больных РА.

Научная новизна работы

В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота и апоптоза у больных РА.

Впервые выявлены специфические особенности экспрессии про- и антиапоптотических маркеров на ранней и поздней стадиях патологического процесса, что проясняет роль апоптоза в эволюции РА.

Впервые установлена протективная роль индуцибельной нитрооксидсинтазы в развитии аутоиммунного воспаления суставов.

Представлены в динамике взаимоотношения между продукцией оксида азота, апоптозом и цитокиновым профилем, что позволило выяснить новые звенья патогенеза РА.

Продемонстрирована возможность прогнозирования степени тяжести и течения РА путем мониторинга маркеров апоптоза (Bcl-2, sFas).

Оценена динамика нитроксидсинтетической функции, апоптоза и цитокинового профиля в зависимости от проводимой терапии. Показана возможность использования биохимических и иммуноцитохимических показателей для объективизации контроля за эффективностью проводимой терапии.

Практическая ценность

Проведенные исследования показали, что установленная закономерность экспрессии Bcl-2, р53 и sFas молекул апоптоза на ранних и поздних стадиях РА позволяет прогнозировать течение патологического процесса и, соответственно, подбирать адекватные терапевтические программы.

Доказанная протективная роль индуцибельной нитрооксидсинтазы на ранних стадиях аутоиммунного воспаления суставов определяет нецелесообразность использования в лечебных схемах селективных блокаторов последней и определяет необходимость синтеза противовоспалительных препаратов доноров оксида азота.

Продемонстрирована способность некоторых базисных препаратов инициировать апоптоз синовиальных клеток и положительно влиять на цитокиновый профиль у больных РА.

С новых позиций обоснована необходимость как можно более ранней базисной терапии у больных РА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интенсивность апоптоза клеточных элементов синовиальной оболочки значительно различается на ранней и поздней стадиях развития РА.

2. Основным механизмом, определяющим активность апоптоза на разных стадиях эволюции РА является различный уровень экспрессии молекул p53, Bcl-2 и sFas.

3. Активная фаза РА сопровождается присутствием в синовиальной оболочке всех трех изоформ NOS с различным паттерном экспрессии в зависимости от длительности течения заболевания.

4. Цитокиновый профиль синовиальной жидкости на разных стадиях РА отличается гетерогенностью и наличием связей с нитрооксидпродуцирующей функцией синовиальной оболочки, а также клиническими индексами активности заболевания.

5. Определение активности про- и антиапоптотических молекул, метаболитов оксида азота, цитокинов синовиальной жидкости у больных РА позволяет прогнозировать течение заболевания и эффективность проводимой терапии.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Приморского краевого терапевтического общества (Владивосток, 2001-2003), на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2004; Владивосток, 2004), в рамках научной сессии ДВО РАН и СО РАМН «Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Владивосток, 2004), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, 2004), Конгрессе европейской противоревматической лиги (EULAR, Берлин, 2004), Конгрессе международной ассоциации по остеоартрозу (OASI, Чикаго, 2004).

Публикация результатов работы

По теме диссертации опубликовано 18 статей в отечественных и международных журналах и сборниках (8 - в центральной и 2 - в зарубежной печати), а также 1 монография.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя.

Диссертация изложена на 187 страницах машинописного текста и иллюстрирована 47 таблицами, 28 рисунками, 1 схемой. Библиографический указатель содержит 346 источников из них 48 отечественных и 298 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных

В исследование были включены 174 больных, общая характеристика которых представлена в Табл. 1. Средний возраст больных составил 42,34±1,49 лет, средняя продолжительность заболевания - 5,32±0,75 лет. Диагноз РА у всех больных соответствовал критериям Американской Ревматологической Ассоциации [Arnett F.C. et al., 1988]. У всех больных был «классический» серопозитивный РА, течение которого отличалось стойко сохраняющейся активностью, несмотря на применение НПВП и отсутствием спонтанных и лекарственно индуцированных ремиссий.

Условия отбора больных были следующими:

- наличие признаков активной фазы заболевания;

- серопозитивность по ревматоидному фактору;

- наличие показаний для применения базисной терапии;

- отсутствие противопоказаний для всех применявшихся базисных средств;

- отсутствие базисной терапии в течение двух предшествовавших месяцев.

В исследование не включались больные с функциональными нарушениями 4 класса, тяжелыми сопутствующими заболеваниями (сахарный диабет 1 или 2 типа, хроническая сердечная недостаточность 3, 4 функционального класса, хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии, дыхательная недостаточность 2, 3 степени, злокачественные опухоли), требующими активного лечения. Так же не включались больные с синдромом Фелти, болезнью Стилла, синдромом Шегрена, вторичным амилоидозом, цитопениями. Исключались больные, получавшие системную глюкокортикоидную терапию, а в случае локального введения стероидов соблюдался перерыв в течение 6 месяцев после последней инъекции.

Больные отбирались по мере поступления в стационар, после клинического, лабораторного и инструментального обследования. В этот период проводилась симптоматическая терапия только нестероидными противовоспалительными препаратами. За сутки до забора исследуемого материала симптоматическая терапия отменялась.

Активным признавался такой вариант РА, при котором число воспаленных суставов составляло не менее 6 (при отсутствии необратимых нарушений со стороны этих суставов), число болезненных суставов - не менее 9, длительность утренней скованности - не менее 45 мин., СОЭ - не менее 21 мм/час (обязательным считалось наличие первого признака и любых 2 из 3 других) [Paulus H.E. et al., 1990].

Стадии РА оценивались на основании изменений, выявляемых на рентгеновских снимках суставов кистей и дистальных отделов стоп, в соответствии с критериями Steinbroker [Steinbroker O. et al., 1949297].

Для характеристики активности воспаления использовался индекс активности болезни DAS28 [Prevoo M.L.L. et al., 1995], в котором оценивались болезненность и припухлость 28 суставов, скорость оседания эритроцитов (CОЭ), общее состояние здоровья пациента по 100 мм визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Низкая активность соответствовала значениям индекса DAS28 < 3,2, средняя - 3,2 -5,1, высокая - >5,1.

Функциональный класс больных РА оценивался по классификации Американской коллегии ревматологов [Hochberg M.C. et al., 1992].

Больных разделяли на две группы: с ранним РА (длительность течения от 2 месяцев до 3 лет) и поздним РА (более 3 лет), соответственно. В группе раннего РА различали очень ранний РА (длительность течения от 2 до 9 месяцев) и поздний ранний РА (9 месяцев до 3 лет) [Nell V.P. et al., 2004].

В зависимости от наличия или отсутствия эрозий костных структур в суставах кистей или стоп, по истечении 24 месяцев от начала заболевания, выделяли неэрозивный РА и эрозивный РА [Larsen A. et al., 1977; Vencovsky J., 2003].

Таблица 1

Методы выявления апоптоза достаточно разнообразны. Более доказательные подходы к оценке апоптоза основаны на выявлении формирующихся разрывов ДНК, ее деградации. В своей работе мы использовали метод, основанный на синтезе олигонуклеотидов из меченных предшественников, катализируемом дезоксирибонуклеотодилтрансферазой (TdT), и их встраивании в ДНК через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов с помощью иммуноцитохимического метода TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling), основанного на выявление фрагментированных цепочек ДНК. Интраоперационный и полученный в ходе эксперимента материал фиксировали в течение 2 ч при 4°С в охлажденном 4% параформальдегиде, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рH 7,4). Образцы промывали в течение суток в 0,1 М фосфатном буфере с 7-8 кратной сменой раствора, а затем погружали в 15% забуференный раствор сахарозы. Срезы толщиной 20 мкм изготавливали в криостате, монтировали на предметные стекла и дополнительно фиксировали в охлажденном растворе этанол -уксусной кислоты в течение 5 минут при -20°C, после чего промывали дважды по 5 минут в фосфатном буфере. На срезы наносили 75 мкл уравнивающего буфера, в котором выдерживали не менее 10 сек при комнатной температуре. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag Fluoresсein In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). Срезы инкубировали в течение 1 час в растворе Fap-фрагмента вторичных антител свиньи против Ig кролика, конъюгированные с FITC (Dako). Срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, заключали в глицерин и просматривали в фильтре FITC-типа (В1 450-490 нм) через микроскоп Polyvar. Часть срезов окрашивали толуидиновым синим.

Количественную оценку TUNEL-позитивных ядер проводили с помощью окуляр-морфометрической сетки на участках ткани хряща и синовии размерами 100х100 мкм. Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL- позитивных ядер () к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизированное ядро () по формуле АИ=(х100)/ . Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t-критерия достоверности по Стьюденту (Р<0,05).

Определение уровня цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости

Количественное определение цитокинов в исследуемых сыворотках крови и пробах синовиальной жидкости проводилось методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов BioSource International для IL-1в, IL-10, IL-6, TNF-б и набора Bender MedSystems для определения растворимого Fas-рецептора на базе иммунологической лаборатории Городского ревматологического центра г. Владивостока.

Перед проведением анализа приготавливались реагенты в соответствии с прилагаемыми рекомендациями.

В лунки планшета, покрытого антителами вносились исследуемые образцы и стандарты. После промывки добавлялись вторые биотинилированные моноклональные антитела, которые связывались с иммобилизованными в лунках антителами, захваченными на первом этапе.

После удаления избытка вторых антител добавлялась стрептавидин-пероксидаза, которая связывалась с биотинилированными антителами с образованием сэндвич-комплекса из четырех реагентов.

После инкубации и промывки удалялся несвязавшийся фермент, после чего добавляли субстратный раствор TMB, который взаимодействовал в ферментом с образованием цветного комплекса. Интенсивность окраски полученного раствора, прямо пропорциональна концентрации цитокина, присутствующего в пробе.

Оптическую плотность стандартов и образцов измеряли на универсальном микропланшетном ридере для иммуноферментного анализа (Humareader Single, ФРГ) при длине волны 450 нм.

Далее, используя графическую бумагу, отмечали точки считанных значений поглощения стандартов на вертикальной оси Y, а соответствующие концентрации на горизонтальной оси X. Строили калибровочную кривую и определяли концентрацию цитокинов в образцах по построенной кривой в пг/мл.

Определение метаболитов оксида азота

Определение концентрации нитрита и нитрата в пробах сыворотки крови, мочи и синовиальной жидкости выполнялось на базе Лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (заведующий лабораторией профессор П.А. Лукьянов).

Пробы мочи центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин на настольной центрифуге MPW-310 (Польша). К пробам (0,1 мл) последовательно добавляли 1%-ный раствор сульфаниламида в 5%-ной фосфорной кислоте (0,05 мл) и 0,1%-ный раствор N-(1-нафтил)этилендиамина в дистиллированной воде (0,05 мл). Оптическую плотность, полученных растворов измеряли при длине волны 570 нм на микропланшетном спектрофотометре µQuant (Biotek Instruments Inc., США). Концентрацию нитрит-ионов в пробах рассчитывали с помощью калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали раствор нитрита натрия в концентрациях от 0 до 50 мкМ.

Подготовка кадмия для восстановления нитрат- до нитрит-ионов в пробах сыворотки крови и синовиальной жидкости проводили следующим образомю. Кадмиевую стружку тщательно промывали водой, затем для осаждения белка 0,1 М соляной кислотой, 4 %-м раствором сульфата меди и снова водой. К пробам (0,25 мл) добавляли дистиллированную воду (0,7 мл), 30%-ный раствор сульфата цинка (0,05 мл), встряхивали и инкубировали при 20^оС в течение 15 мин. Пробы центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин. К полученным супернатантам добавляли кадмиевую стружку (5 мг) и оставляли на ночь при комнатной температуре на качалке Heidolph Duomax 1030 (Германия) при 50 об/мин. Затем пробы центрифугировали, как описано выше. К надосадочной жидкости (0,1 мл) последовательно добавляли 2%-ный раствор сульфаниламида в 3 N соляной кислоте (0,05 мл) и 0,2%-ный раствор N-(1-нафтил)этилендиамина в дистиллированной воде (0,05 мл). Измеряли оптическую плотность полученных растворов и рассчитывали концентрацию суммарных нитрит-ионов по той же калибровочной кривой в мкМ/мл. Концентрацию нитрат-ионов определяли по формуле: C_NO3 =C_NO3+NO2 - C_NO2

Статистическая обработка цифровых данных

Статистическая обработка всех полученных цифровых данных проводилась с использованием персонального компьютера по программе «Статистика 2». Подсчитывались следующие показатели: средняя арифметическая (М), среднее квадратичное отклонение (д), средняя ошибка средней арифметической (±m), коэффициент достоверности показателя (t) и различий (t и p), коэффициент линейной корреляции (±r), ошибка и достоверность коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Резюмируя содержание настоящей работы, остановимся на нескольких ключевых вопросах:

I. Интенсивность апоптоза клеток синовиальной оболочки на разных стадиях развития РА.

II. Экспрессия про-(р53) и антиапоптотических молекул (sFas, Bcl-2) на ранней и поздней стадиях РА, а также их клиническое значение.

III. Активность индуцибельной и конститутивной форм NOS в процессе эволюции РА. Клинические аспекты оценки уровня метаболитов NO в синовиальной жидкости.

IV. Динамика цитокинового профиля системного кровотока и синовиальной жидкости у больных РА, клинические параллели.

Результаты, полученные нами, указывают на низкую интенсивность апоптоза на ранних стадиях РА (Табл. 3). Причем эта особенность прослеживалась как у больных РА, так и в экспериментальной модели адьювантного артрита, что иллюстрируется небольшим количеством TUNEL-позитивных клеток в образцах синовиальной оболочки.

ревматоидный артрит апоптоз адъювантный