Патоморфологический анализ карциносаркомы Walker 256: влияние общей гипертермии и противоопухолевых агентов (мелатонина и циклофосфана) на опухолевый рост
Изучение патоморфогенеза и основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар. Проведение противоопухолевой терапии с использованием общей гипертермии, циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 10.04.2018 |
| Размер файла | 134,5 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Патоморфологический анализ карциносаркомы Walker 256: влияние общей гипертермии и противоопухолевых агентов (мелатонина и циклофосфана) на опухолевый рост
14.03.02 - патологическая анатомия
Овсянко Елена Владимировна
Новосибирск - 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете Минздравсоцразвития РФ и в Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск).
Научные консультанты:
член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ефремов Анатолий Васильевич
доктор биологических наук, профессор Лушникова Елена Леонидовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Бакарев Максим Александрович
доктор медицинских наук Кливер Евгений Эдуардович
доктор медицинских наук Талалаев Сергей Владимирович
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск).
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, онкологические заболевания по частоте заболеваемости занимают второе, а в некоторых промышленно развитых странах - первое место; от них ежегодно умирает около 7 млн человек (Попович А.М., 2002). В структуре онкологической заболеваемости женщин почти во всех развитых странах первое место занимает рак молочной железы (Greenlee R. et al., 2000; Jemal A. et al., 2004 - 2010). По сравнению с другими злокачественными новообразованиями рак молочной железы является одной из наиболее частых причин смерти женщин (Аксель Е.М., 2005).
Основными методами лечения в онкологии являются: хирургический, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия. В настоящее время применение интенсивной или высокодозной химиотерапии при лечении пациентов с солидными опухолями не всегда позволяет добиться эффективных результатов (Davidson A. et al., 1997). С целью преодоления химиорезистентности и повышения эффективности терапии этой категории больных продолжается интенсивный поиск новых лечебных подходов. Одним из возможных направлений в этом плане является общая гипертермия (ОГ) (Жаврид Э.А. и др., 1997; Исмаил-Заде Р.С., 2004; Van der Zee J., 2002; Oldahm R.K., 2003), применение которой основано на том, что опухолевые клетки избирательно термочувствительны (при повышении температуры тела до 42 - 45°С).
В современных клинических и экспериментальных исследованиях при оценке эффективности противоопухолевой терапии и разработке новых методов терапии злокачественных новообразований основное внимание уделяется влиянию химических агентов и физических факторов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза (Летягин В.П., 2004; Кушлинский Н.Е. и др., 2005). Такие подходы обусловлены тем, что одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток (Белушкина Н.Н., 2008). Разные химические и физические воздействия вызывают разную интенсивность изменений перечисленных выше биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вариантов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной активностью.
Сочетание гипертермии с лучевой терапией оказывается эффективней, чем каждый из этих видов физического воздействия отдельно. При тепловом воздействии опухолевая ткань перенасыщается собственными продуктами обмена, кислотами, и в ней нарушаются важные системы регуляции. Вследствие этого опухолевая клетка становится более чувствительной к лучевой или химиотерапии, так что их дозировки могут быть значительно снижены. Возможность уменьшения дозы вводимых цитостатиков до 50% с одновременным усилением противоопухолевого эффекта позволяет в ряде случаев избегать выраженного нефротоксического, кардиотоксического, гепатотоксического действия химиопрепаратов. Влияние гипертермии на трансмембранный перенос и метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуногенности опухоли (Курнешов О.К. и др., 2003). Не являясь канцерогенным и мутагенным агентом, гипертермия может индуцировать в опухоли как апоптоз, так и некроз клеток (Yonezawa M. et al., 1996).
В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований стало создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза (Rafii S., 2000). Известно, что в опухоли образуется сосудистая сеть, которая значительно отличается от сосудов здоровой ткани (Dvorak H.F. et al., 1995; Bergers G. еt al., 2003). Сосудистое русло опухоли, с морфологической точки зрения, является атипичным и составляет значительную часть опухолевой стромы. Показано, что если опухоль имеет периферическую сосудистую сеть, то в центре опухоли имеются участки некроза. Если опухоль имеет центральную сосудистую сеть, то некроз располагается по периферии. Микроскопически сосуды выглядят расширенными, извитыми, со множеством слепых петель. Все эти структурные различия влияют на внутриопухолевый кровоток, кровь проходит через опухоль непредсказуемым образом, а это оказывает отрицательное влияние на доставку лекарственных препаратов.
Для разработки новых схем противоопухолевой терапии и создания новых лекарственных препаратов на первом этапе всегда используются модельные опухолевые системы in vitro (линии опухолевых клеток) и in vivo (перевиваемые и спонтанные опухоли разной локализации). Одной из модельных опухолей, используемых на крысах, является перевиваемая опухоль Walker 256, идентифицированная впервые профессором G.Walker в 1928 году как спонтанно возникшая в молочной железе беременной крысы альбиноса (Rattus norvegicus) (Simpkins H. et al., 1991). После нескольких пересадок на протяжении многих лет были выделены несколько ее субштаммов, которые характеризуются морфологическими различиями и классифицируются как карцинома, саркома и смешанная карциносаркома (Simpkins H. et al., 1991). Возможно, карциносаркома Walker 256 возникла как смешанная опухоль и состояла из стволовых клеток, которые дают начало разным типам клеток. Использование этой опухоли в доклинических исследованиях новых методов противоопухолевой терапии позволяет оценить действие как отдельных химических и физических факторов, так и их сочетаний на разные биологические характеристики опухолевого роста.
В этой связи представляется актуальным изучение интенсивности пролиферации и гибели опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 при действии общей гипертермии в сочетании с цитостатическими препаратами (циклофосфаном и мелатонином), обладающими разными механизмами действия на клеточные популяции.
Цель исследования - изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой терапии с использованием общей гипертермии, циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.
Задачи исследования:
1. Изучить морфогенез и основные параметры опухолевого роста (митотический индекс, выраженность некротической и апоптотической гибели, частоту метастазирования, степень дифференцировки) карциносаркомы Walker 256 после трансплантации опухолевых клеток в мышцу бедра крыс Вистар.
2. Изучить особенности гистоархитектоники опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.
3. Изучить ультраструктурные особенности основных типов опухолевых клеток и эндотелиоцитов карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном развитии и при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.
4. Провести иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии антиапоптотического и проапоптотических белков семейства Bcl-2 в карциносаркоме Walker 256 крыс в процессе спонтанного развития и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
5. Изучить динамику изменений содержания токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
6. Изучить уровень антиоксидантной и проаксидантной активности сыворотки крови у крыс с трансплантированной карциносаркомой Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
7. Изучить динамику изменения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный патоморфологический анализ опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии после трансплантации в мышцу бедра крыс и после модифицирующих воздействий общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Впервые на основании электронно-микроскопического исследования установлено, что в карциносаркоме Walker 256 в ходе ее прогрессивного развития присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки, представлены их ультраструктурные характеристики.
Впервые выявлены патоморфологические особенности модифицирующего влияния общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на гистоархитектонику карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста. Установлено, что данные виды воздействий, примененные изолированно или в сочетании друг с другом, оказывают разные по выраженности эффекты на процессы пролиферации, гибели и дифференцировки опухолевых клеток, а также их метастатическую активность. Впервые показано, что применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией и мелатонином вызывает значительную транзиторную редукцию эпителиоидных клеток и изменение архитектоники опухолевого узла через 7 сут после воздействий с реверсией опухолевого фенотипа в последующем, но при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином и общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.
Впервые установлено, что применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно в сочетании с циклофосфаном. Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.
Впервые показано, что общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы. Гистоархитектоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.
Впервые определена экспрессия проапоптогенных и антиапоптогенного белка семейства Bcl-2 в динамике развития карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что изолированное или сочетанное применение данных воздействий приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и усилению экспрессии проапоптотических белков Bax и Bad. Установлена отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптотическим индексом, с другой, что позволяет считать изменение соотношений этих белков в клетках карциносаркомы Walker 256 одним из механизмов индукции апоптоза.
Впервые изучены показатели реакции перекисного окисления липидов, прооксидантной (ПОА) и антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Установлено, что спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе и основных параметрах опухолевого роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном росте и после изолированного и сочетанного воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина как физических и химических агентов с разными механизмами противоопухолевого действия. Выявленные особенности противоопухолевого эффекта общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина и их сочетаний имеют большое значение для разработки более эффективных схем терапии онкологических заболеваний.
Проведенное исследование показывает важность комплексного морфологического анализа спонтанного и модифицированного опухолевого роста в динамике для установления возможных мишеней противоопухолевой терапии и оценки ее эффективности.
Основные положения, выносимые на защиту:
Морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Опухолевые клетки характеризуются высоким митотическим индексом, низким апоптотическим индексом, высокой частотой метастазирования по гематогенному и лимфогенному типам в регионарные лимфатические узлы, способностью индуцировать неопластическую кахексию.
Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гистоархитектоники трансплантированной карциносаркомы Walker 256. При сочетанном применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанном применении общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений - количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.
Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови как в сторону их понижения, так и повышения.
Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.
Апробация результатов исследования. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); IX Российско-Германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), межлабораторной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 15 - в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК РФ для публикации результатов докторских диссертаций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 295 страницах текста, иллюстрирована 76 таблицами и 180 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, включающих материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (445 источников, из которых 165 отечественных и 280 иностранных авторов).
Весь материал диссертации получен, собран, обработан и проанализирован лично автором.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использован перевиваемый штамм опухоли Walker 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker 256 вводили крысам Вистар в мышцу задней части бедра в дозе 1Ч106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl (Хегай И.И. и др., 2008; Jacobson M.D., 1996; Monte O. et al., 2005). Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации.
Через 5 сут с момента перевивки опухоли, когда ее объем достигал 2,51±0,42 см3, животных разделяли на 12 групп с целью выявления особенностей опухолевого роста под влиянием ОГ и противоопухолевых агентов (табл. 1). Макроскопический анализ проводили с вычислением объема опухоли, размеры измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях.
ОГ воспроизводили в полном соответствии со «Способом экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» (Ефремов А.В. и др., 2001). Предлагаемый способ предполагает разогревание экспериментальных животных в резервуаре универсального водного термостата BWT-U, предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С в водяной бане, при погружении в горячую воду до уровня шеи. Конструкция предусматривает автоматическое поддержание температуры нагрева воды и равномерное перемешивание ее слоев, что позволяет считать в эксперименте температуру постоянной величиной. Преимущество моделирования ОГ в водной среде перед воздушной заключается в том, что осуществляется равномерное, глубокое и быстрое нагревание организма животного (Lesnicar H. et al., 1989).
|
Таблица 1. Характеристика подопытных групп животных |
|||
|
Экспериментальные группы |
Условия воздействия |
Количество животных в группах |
|
|
1-я группа |
Интактные крысы Вистар |
7 |
|
|
2-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра («спонтанный» рост) |
21 |
|
|
3-я группа |
«Интактные» крысы Вистар после воздействия мелатонином |
21 |
|
|
4-я группа |
«Интактные» крысы Вистар после общей гипертермии |
21 |
|
|
5-я группа |
«Интактные» крысы Вистар после воздействия циклофосфаном |
21 |
|
|
6-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии |
21 |
|
|
7-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином |
21 |
|
|
8-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с циклофосфаном |
21 |
|
|
9-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие общей гипертермии в сочетании с мелатонином и циклофосфаном |
21 |
|
|
10-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонином |
21 |
|
|
11-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие циклофосфаном |
21 |
|
|
12-я группа |
Трансплантация клеток карциносаркомы Walker-256 в мышцу бедра и воздействие мелатонином в сочетании с циклофосфаном |
21 |
|
|
Итого |
238 |
Температурный режим нагрева горячей воды-теплоносителя подбирался экспериментально и составил 45°С. Эту температуру можно считать оптимальной при моделировании ОГ, так как более высокие значения плохо переносятся крысами и приводят к их гибели. Время разогревания каждой особи до уровня ректальной температуры 43,5°С было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы животного и составляло не более 17 мин.) Столь быстрое повышение температуры тела при разогревании в условиях 90 - 100% влажности объясняется полным прекращением процесса испарения пота и отсутствием эффективного охлаждения (Meyer F. et. al., 1992; Monte O. et al., 2005).
Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). При более высокой степени разогрева следовала гибель животных в момент ОГ или в ранние сроки постгипертермического периода, так как в этих пределах находится верхняя граница температурного диапазона, переносимого животным организмом. При измерении ректальной температуры нагреваемых животных один из спаев дифференциальной термопары вводили в прямую кишку на глубину 3 - 4 см, а второй опускали в тающий лед. Температурная разница между 0°С и ректальной температурой выражалась в микровольтах на шкале микровольтметра-микроамперметра. Всех животных нагревали однократно в полном соответствии с описанной методикой до стадии теплового удара (ректальная температура 43,5?С).
Циклофосфан (ЦФ) («Биохимик», Саранск, Россия) вводили однократно из расчета 25 мг/кг в 0,1 мл изотонического раствора NaCl внутрибрюшинно, спустя 5 сут с момента перевивки опухоли. При сочетанных воздействиях ЦФ вводили за 1 ч до начала сеанса ОГ ввиду особенностей фармакокинетики его активного метаболита. Мелатонин (МТ) (ICN Biomedicals Inc. USA) вводили в дозе 0,3 мг/кг внутрибрюшинно в течение 14 сут, начиная с 5-х суток после имплантации опухолевых клеток. Животных содержали при фиксированном световом режиме (свет - темнота - 12 ч: 12 ч с включением освещения в 8.00 ч и выключением в 20.00 ч).
У экспериментальных животных исследовали сыворотку крови и образцы опухолевой ткани. Материал забирали после декапитации животных под эфирным наркозом.
Оценка противоопухолевого эффекта препаратов in vivo. В качестве критериев оценки противоопухолевого эффекта препаратов выбраны динамика и торможение роста опухоли. Динамику опухолевого роста отслеживали периодически, измеряя размеры опухоли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях, вычисляли объем опухолевых узлов. Торможение роста опухоли (ТРО) оценивали по формуле:
ТРО = (V контроль - V опыт) / V контроль Ч 100%,
где Vконтроль - среднее значение объема опухоли в группе контрольных животных, Vопыт - среднее значение объема опухоли в группе опытных животных.
В работе представлены значения ТРО в тот день, когда разность между объемами опухолей в опытной и контрольной группах была максимальной.
Методы патоморфологического анализа. Опухолевую ткань для светооптического и электронно-микроскопического исследования забирали в следующих группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ; 3-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в сочетании с МТ; 4-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в сочетании с ЦФ; 5-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ в сочетании с МТ и ЦФ; 6-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после воздействия МТ; 7-я группа - перевиваемой карциносаркома Walker-256 после воздействия ЦФ; 8-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после воздействия МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа - через 5 сут с момента перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я, 7-я, 8-я группы - через 3, 7 и 14 сут с момента начала введения препаратов или воздействия ОГ.
Для светооптического исследования образцы опухоли фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин; окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по ван Гизону, азуром-2 - эозином. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм получали на ультратоме LKB-8800 с блоков, залитых в эпон 812, окрашивали толуидиновым синим. Срезы изучали в микроскопах MS300A (Австрия) и Leica DM 4000B (Германия). Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Leica DFC320 и компьютерной программы Leica QWinV3.
В качестве основных параметров опухолевого роста определяли следующие:
1. Митотический индекс - число опухолевых клеток, находившихся на различных стадиях митотического деления. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (‰). Анализировали не менее 5 тыс. клеток.
2. Объемную плотность (V) клеток с некротическими изменениями;
3. Объемную плотность дистрофически измененных опухолевых клеток;
4. Объемную плотность паренхиматозных клеток опухоли;
5. Апоптотический индекс - число опухолевых клеток, находившихся в состоянии апоптотической гибели. Результаты выражали в промилле к общему числу опухолевых клеток (‰). Анализировали не менее 5 тыс. клеток.
Для электронно-микроскопического исследования образцы карциносаркомы Walker 256 крыс (по 5 от каждого животного) фиксировали сначала в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4), затем в течение 1 ч дополнительно фиксировали в 1% четырехокиси осмия на фосфатном буфере (рН 7,4). После дегидратации образцы заключали в эпон 812.
С целью прицельной ультратомии различных зон карциносаркомы Walker 256 предварительно изучали в световом микроскопе полутонкие срезы. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800, контрастировали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. После напыления углеродом в вакууме контрастированные срезы изучали в электронном микроскопе JEM-7А.
Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии белков семейства Bcl-2 выполняли на парафиновых срезах опухолевой ткани толщиной до 5 мкм с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода (Эллиниди В.Н. и др., 2002).
Опухолевую ткань для иммуногистохимического исследования брали в следующих 6 группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256 после ОГ; 3-я группа - после воздействия ЦФ; 4-я группа - после воздействия МТ; 5-я группа - после сочетанного воздействия МТ и ЦФ; 6-я группа - после воздействия сочетанием ОГ, МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа - через 5 сут с момента перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я группы - через 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ; 5-я и 6-я группы - через 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.
Перед окрашиванием срезы депарафинировали, регидратировали, блокировали эндогенную пероксидазную активность и демаскировали антигены. Для обнаружения Bax применяли кроличьи поликлональные антитела к домену, играющему важную роль в образовании гомодимеров и гетеродимеров с антиапоптотическими членами семейства Bcl-2 («BD Biosciences», США), для Bcl-2 и Ваd - мышиные моноклональные антитела («BD Biosciences», США) в разведении 1:100. Наблюдаемое окрашивание от бледно-желтого до темно-коричневого свидетельствовало о специфическом связывании антител с исследуемыми антигенами.
Морфометрическое исследование проводили на фотографических снимках при помощи моторизованного микроскопа M200 (Zeiss) и камеры AxioCam HRc (Zeiss) при конечном увеличении Ч630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision - Release 4.7.1. (Zeiss) и блока автоматических измерений (Auto measure). При подготовке программы были использованы фильтр-маски Segmentation, Sigma. В программу вычислений вводили процентное значение площади позитивно окрашиваемых опухолевых элементов. Для каждой группы оценивали по 40 изображений. Площадь препарата, получаемого на одном изображении, составляла 39437 мкмІ.
Определение прооксидантной активности сыворотки крови. Определение прооксидантной активности (ПОА) сыворотки крови проводили по методу Д.Н.Маянского и соавт. (1996). В качестве тест-системы использовали лейковзвесь интактных крыс, которую получали следующим способом: пробирки с гепаринизированной кровью (5 ЕД/мл) интактных крыс отстаивали под углом 45° в течение 40 мин при 37°С. Затем слой лейкоцитов с прилежащим слоем плазмы осторожно отсасывали, центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 2 мл раствора Хэнкса без фенолового красного, повторно осаждали и ресуспендировали в 0,5 мл раствора Хэнкса. Полученные отмытые лейкоконцентраты от 5 крыс пулировали, подсчитывали общее количество клеток в камере Горяева и доводили раствором Хэнкса до концентрации 2х106 клеток/мл. Отдельно из лейкоконцентратов готовили мазки, окрашивали по Романовскому-Гимзе, подсчитывали процентное содержание нейтрофилов.
Определение антиоксидантной активности сыворотки крови. Общую антиоксидантную активность (АОА) сыворотки крови определяли с помощью хемилюминесценции (ХЛ) по степени торможения суммарной светимости ХЛ, запускаемой 3% Н2О2 по методу А.И.Журавлева (1983).
Расчет коэффициента соотношения КС прооксидантной и антиоксидантной активности сыворотки крови. Для объективной оценки баланса в системе «оксидант и антиоксидант» рассчитывали коэффициент соотношения (КС) про- и антиоксидантной активности сыворотки крови по формуле: КС = (ПОА/АОА) Ч 100.
Определение ПОА и общей АОА, содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови, баланс в системе «про-/антиоксиданты» с помощью коэффициента КС осуществляли в 8 группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker-256; 2-я группа - Walker-256 после ОГ; 3-я группа - Walker-256 после ОГ и МТ; 4-я группа - Walker-256 после ОГ и ЦФ; 5-я группа - Walker-256 после ОГ, МТ и ЦФ; 6-я группа - Walker-256 после воздействия МТ; 7-я группа - Walker-256 после воздействия ЦФ; 8-я группа - Walker-256 после воздействия МТ и ЦФ. Использовали следующие сроки: 1-я группа - через 5 сут после перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я, 7-я, 8-я группы - через 3, 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.
Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови. Первичные продукты ПОЛ - диеновые коньюгаты (ДК) определяли спектрофотометрическим методом (Колосова Н.Г. и др., 1988). Определение вторичных, стабильных продуктов ПОЛ по уровню малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови проводили по методу Y.Yagi et al. (1976), по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). В работе использовали 2-Thiobarbituric acid («Sigma», США). Для вычленения неспецифического компонента (ТБК-связанные комплексы с аминокислотами, пигментами и др.) проводили спектрофотометрию пробы при длине волны 580 нм. Результаты просчитывали с учетом коэффициента миллимолярной экстинции - 155 ммоль-1 см-1 (Staucliff R.S. et al., 1969).
Определение содержания жирорастворимых витаминов (антиоксидантов) в сыворотке крови. Анализ содержания жирорастворимых витаминов (ретинола и ?-токоферола) в сыворотке крови проводили с помощью метода ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе «Милихром» (Микичур Н.И., Сафронов И.Д., 1988). В качестве свидетелей жирорастворимых витаминов использовали калибровочные растворы ?-токоферола и ретинол-ацетата («Serva», США). Содержание жирорастворимых витаминов рассчитывали по величине амплитуды пиков, полученных на хроматограмме, в пересчете на стандарт, и выражали в мг% для ?-токоферола и мкг% для ретинола.
Определение содержания жирорастворимых витаминов антиоксидантов (ретинола и -токоферола) в сыворотке крови осуществляли в следующих 7 группах: 1-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256; 2-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после ОГ; 3-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия ЦФ; 4-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия МТ; 5-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после воздействия МТ и ЦФ; 6-я группа - перевиваемая карциносаркома Walker 256 после ОГ в сочетании с МТ и ЦФ; 7-я группа - интактная. Использовали следующие сроки: 1-я и 7-я группы - через 5 сут после перевивки опухоли; 2-я, 3-я, 4-я, 5-я, 6-я группы - через 3, 7 и 14 сут после введения препаратов или воспроизведения ОГ.
Статистические методы обработки полученных результатов. Полученные цифровые данные подвергнуты статистическому анализу (Гланц С., 1998). Математические расчеты выполнены с помощью пакета статистического анализа Microsoft Excel. Вычисляли среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего (m), коэффициент корреляции (r). Значимость различий в сравниваемых группах определяли с помощью t-кpитеpия Стьюдента. Достоверными считали результаты при уровне значимости p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Патоморфологические изменения карциносаркомы Walker 256 после трансплантации в мышцу бедра. Через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток в бедро опухоль была представлена уже сформированным узлом (2,5±0,4 смі). Гистогенетически карциносаркома Walker 256 относится к опухолям молочной железы и является смешанной опухолью, образованной как саркоматозными (условно стромальными), так и эпителиоидными (условно паренхиматозными) компонентами; характеризуется инфильтративным ростом. Опухолевые клетки образовывали солидные комплексы, пласты и тяжи, которые внедрялись в мышечную ткань вдоль мышечных волокон и кровеносных сосудов, нарушая архитектонику и кровоснабжение скелетной мышцы.
Стромальные компоненты были представлены саркоматозными клетками (клетки 1-го типа, «темные» клетки) разной формы (веретоновидной, звездчатой) и размеров с гиперхромными ядрами. Эпителиоидные клетки (клетки 2-го типа, «светлые») по периферии опухолевого узла образовывали мелкие гнезда (псевдофолликулярные структуры) и солидные пласты. Подобные образования, как правило, нечетко отграничивались от окружающей саркоматозной стромы, но в некоторых участках формировались четко очерченные эпителиальные структуры, как бы обособленные от саркоматозного компонента. В центре узла плейоморфизм ядер и клеток был менее выражен, ткань - менее структурирована.
Эпителиоидные клетки отличались умеренным полиморфизмом, содержали преимущественно гипохромные ядра, часто подвергались митотическому делению. Некоторые эпителиоидные клетки были перстневидными и характеризовались смещением ядер к периферии. Эпителиоидные клетки - преобладающая клеточная популяция карциносаркомы Walker 256 (их объемная плотность через 5 сут после трансплантации составляла 88,5±1,8%). Прогрессивный рост карциносаркомы характеризовался достаточно высоким митотическим индексом (34,8±1,4‰) и низким апоптотическим индексом (0,7±0,2‰). Кроме апоптотической гибели в опухолевых узлах регистрировались разных размеров очаги некроза опухолевых клеток, которые располагались преимущественно в центральных зонах и были инфильтрированы нейтрофилами и моноцитами. Между клетками формировались кровеносные сосуды.
По мере дальнейшего роста и старения опухолевого узла (через 12 и 19 сут после трансплантации опухолевых клеток) его объем достигал соответственно 25,5±5,4 и 37,7±3,5 см3 (p<0,05), в нем отмечалось усиление «структурирования», которое проявлялось в разрастании тяжей саркоматозных («темных») клеток, между которыми гнездами располагались эпителиоидные клетки (формирование псевдофолликулярных структур). Усиление морфогенетических процессов проявлялось также в активном неоангиогенезе, врастании кровеносных сосудов в опухоль. В некоторых участках с сохранившимися мышечными волокнами отмечались их лизис и «расплавление» под действием протеолитических ферментов, синтезируемых опухолевыми клетками. В опухолевой ткани присутствовали очаги некроза опухолевых клеток, возрастало количество апоптотических телец (2,5±1,2‰).
По данным ультраструктурного анализа, в карциносаркоме Walker 256 при светооптическом и электронно-микроскопическом исследовании выявлены 2 типа опухолевых клеток. Опухолевые клетки 1-го типа отличались высокой электронной плотностью как ядра, так и цитоплазмы. Клетки 2-го типа имели большие размеры и меньшую электронную плотность. Клетки каждого типа различались по размерам и насыщенности органеллами и были разбиты на 5 стадий дифференцировки.
Клетки 1-го типа на 1-й стадии дифференцировки были мелкими, электронно-плотными, с большим количеством микроворсинок, небольшим объемом цитоплазмы и с крупными глыбками гетерохроматина в округлом ядре. Клетки на 2-й стадии дифференцировки были электронно-плотными с большим количеством микроворсинок, большим объемом цитоплазмы, с крупными глыбками гетерохроматина в удлиненном. Клетки, находившиеся на 3-й стадии дифференцировки, были крупными электронно-плотными, с большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и вытянутым электронно-плотным ядром. Клетки, находившиеся на 4-й стадии дифференцировки, отличались большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и вытянутым электронно-плотным ядром и крупным ядрышком. Клетки, находившиеся на 5-й стадии дифференцировки, были крупными с электронно-плотной цитоплазмой, большим количеством митохондрий, лизосом, свободных рибосом и вытянутым электронно-плотным ядром с крупным ядрышком.
Клетки 2-го на 1-й стадии дифференцировки были представлены мелкими электронно-плотными клетками с большим количеством свободных рибосом. Клетки, находившиеся на 2-й стадии дифференцировки, имели вытянутую форму с удлиненным ядром и крупным ядрышком; в цитоплазме - большое количество свободных рибосом и небольшие цистерны гранулярной цитоплазматической сети, расположенные по периферии клеток. Клетки на 3-й стадии дифференцировки были крупными, вытянутыми, распластанными, с удлиненным ядром и крупным ядрышком; в цитоплазме - большое количество цистерн гранулярной цитоплазматической сети и свободных рибосом. Дифференцировка клеток данного типа проявлялась в увеличении количества цистерн гранулярной цитоплазматической сети. Клетки на 4-й стадии дифференцировки отличались крупными размерами, большим количеством цистерн гранулярной цитоплазматической сети, вытянутым ядром с изрезанными краями. Клетки на 5-й стадии дифференцировки имели еще более крупные размеры и еще большее количество цистерн гранулярной цитоплазматической сети.
Таблица 2. Морфометрический анализ эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 после трансплантации в мышцу бедра (M±m)
|
Исследованные параметры |
Контроль |
5 сут с момента трансплантации |
12 сут с момента трансплантации |
19 сут с момента трансплантации |
|
|
Митохондрии (Vv) |
8,4±0,15 |
7,8±0,12 |
8,2±0,17 |
8,5±0,32 |
|
|
Митохондрии: Sv внутр. мембрана Sv наружн. мембрана |
2,1±0,12 |
2,6±0,14* |
2,5±0,24* |
2,3±0,15* |
|
|
Митохондрии (NA) |
4,6±0,32 |
4,2±0,25 |
4,0±0,16 |
4,1±0,28 |
|
|
Гранулярная цитоплазматическая сеть (Vv) |
10,2±0,14 |
18,3±0,19* |
16,9±0,53* |
19,3±0,45* |
|
|
Рибосомы прикрепленные (NА) |
25,1±1,28 |
38,6±1,22* |
36,1±1,48* |
42,5±1,67* |
|
|
Рибосомы свободные (NА) |
28,4±1,13 |
32,1±1,18* |
29,7±1,32* |
35,4±1,76* |
|
|
Лизосомы (Vv) |
2,1±0,22 |
2,2±0,15 |
2,3±0,19 |
2,2±0,12 |
|
|
Лизосомы (NА) |
2,0±0,17 |
2,2±0,36 |
2,1±0,25 |
2,3±0,34 |
|
|
Люминальные микропиноцитозные везикулы (Vv) |
21,6±0,42 |
7,1±0,27* |
6,9±0,36* |
6,2±0,11* |
|
|
Цитоплазматические микропиноцитозные везикулы (Vv) |
24,3±0,55 |
7,4±0,39* |
7,0±0,44* |
6,5±0,27* |
|
|
Базальные микропиноцитозные везикулы (Vv) |
18,1±0,34 |
8,9±0,16* |
8,5±0,12* |
5,3±0,14* |
|
|
Примечание. Vv - объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); NА - численная плотность структур (число в тестовой площади); Sv - поверхностная плотность структур (мкм2 / мкм3); * - p<0,05 по сравнению с интактными крысами. |
По данным ультраструктурного анализа, на ранней стадии развития опухоли преобладающими были «высокодифференцированные» клетки обоих типов, часть из которых подвергалась деструкции, некрозу и апоптозу. В дальнейшем на 7-е сутки преобладали малодифференцированные опухолевые клетки 1-го типа и высокодифференцированные клетки 2-го типа, а к концу эксперимента картина была «зеркально» противоположной - малодифференцированные опухолевые клетки 2-го типа и дифференцированные клетки 1-го типа.
Эндотелиоциты кровеносных капилляров были представлены как темными, так и светлыми формами. На протяжении всего срока эксперимента после трансплантации опухолевых клеток для ультраструктуры эндотелиоцитов кровеносных капилляров было характерно большое содержание органелл белкового синтеза (цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом), но практически не определялись микропиноцитозные везикулы. В эндотелиоцитах кровеносных капилляров, расположенных на периферии опухолевого роста, присутствовали немногочисленные микропиноцитозные везикулы. Численная плотность прикрепленных рибосом и объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети возрастали в большей степени к 14-м суткам (табл. 2). Однако концентрация крист митохондрий была увеличена в большей мере на ранней стадии развития опухоли.
Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после воздействия общей гипертермии. Одним из критериев оценки противоопухолевого эффекта ОГ была динамика торможение роста опухоли (ТРО). Начиная с 3-х суток и до конца эксперимента объем опухолевого узла после воздействия ОГ был больше, чем в контроле (соответственно в 9,8; 1,7 и 1,13 раза - 24,6±2,2, 42,3±5,3 и 42,5±3,5 см3, p<0,05). Поэтому показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал и был отрицательным (соответственно -878, -65 и -13%). Преобладал солидный рост опухолевого узла.
Через 3 сут после воздействия ОГ отмечалось снижение полиморфизма опухолевых клеток; опухоль была представлена преимущественно «светлыми» крупными клетками, которые образовывали гроздьевидные скопления, в центре - преобладали клетки с умеренным полиморфизмом ядер. По периферии узла встречались единичные соматические мышечные волокна, подвергавшиеся литическим превращениям. В центральной зоне и по периферии регистрировались очаги некроза опухолевых клеток, различавшиеся по размерам. Отмечались значительный отек опухолевой ткани и полнокровие сосудов. Преобладали сосуды капиллярного типа, чаще ветвящиеся. Через 7 сут после воздействия ОГ происходило усиление структурированности опухолевого узла, формировались псевдофолликулярные структуры, между которыми располагались тяжи из «темных» клеток. Сохранялись рассеянные очаги некроза. Через 14 сут структурированность опухолевого узла сохранялась, преобладали «светлые» клетки. По периферии узла встречались единичные соматические мышечные волокна, подвергавшиеся литическим превращениям. Отмечалась инвазия опухолевых клеток в мышечные волокна с резорбцией саркоплазмы. В центральной зоне и по периферии регистрировались очаги некроза опухолевых клеток, различающиеся по размерам.
Через 3 сут после ОГ митотический индекс снижался в 1,2 раза по сравнению со «спонтанным» ростом (до 28,6±1,3‰, p<0,01), но к концу эксперимента отмечалось его некоторое увеличение (до 30,5±0,8‰, p<0,05). Количество дистрофически измененных опухолевых клеток после воздействия ОГ было наиболее значительным на 3-и и 7-е сутки эксперимента (соответственно 30,8±3,5 и 41,5±3,4%) по сравнению со «спонтанным» развитием карциносаркомы (соответственно 16,2±1,9 и 18,8±1,6%).
Паренхиматозный компонент карциносаркомы Walker 256 был уменьшен через 3, 7 и 14 сут после воздействия ОГ соответственно в 1,27, 1,29 и 1,2 раза. Уменьшение объемной плотности паренхимы было обусловлено увеличением зон некроза (в 2,6 раза), нарастающим отеком и кровоизлияниями. Апоптотическая гибель клеток после воздействия ОГ возрастала соответственно в 4,0 и 2,8 раза на 3-и и 7-е сутки исследования; доля таких клеток составляла 2,8±0,5 и 3,3±0,3‰.
Через 3 сут после воздействия ОГ отмечалась гетерогенность эндотелиальных клеток кровеносных капилляров. В одних эндотелиоцитах наблюдалось большое содержание органелл белкового синтеза (цистерн гранулярной цитоплазматической сети, прикрепленных и свободных рибосом); в других - цитоплазма была слабо структурирована. На 7-е сутки и в большей степени на 14-е сутки после ОГ в кровеносных капиллярах карциносаркомы Walker 256, расположенных по периферии опухолевого роста, сохранялись и возрастали структурные изменения, связанные с набуханием клеток, потерей связи эндотелиоцитов с базальной мембраной и разрыхлением межэндотелиальных контактов, уменьшением содержания цитоплазматических органелл.
При сравнении морфометрических показателей эндотелиоцитов кровеносных капилляров карциносаркомы Walker 256 после воздействия ОГ и эндотелиоцитов при «спонтанном» развитии опухолевого процесса на 3-и и 7-е сутки было выявлено снижение объемной плотности митохондрий на 52 и 65%, микропиноцитозных везикул: люминальных - на 70 и 48%, цитоплазматических - на 70 и 40%, базальных - на 50 и 28%. Концентрация крист митохондрий была снижена на 29 и 46%, по сравнению с показателями контрольной группы (7,80,12 и 8,20,17, соответственно). Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была больше соответствующего значения в контроле на 35 и 54%, соответственно. На 7-е сутки достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных рибосом, по сравнению с соответствующими величинами в контроле и с соответствующими величинами при спонтанном развитии опухоли.
На 14-е сутки после воздействия ОГ отмечали возрастание объемной плотности митохондрий на 74% из-за набухания. При этом концентрация крист митохондрий снижалась на 54%. Объемная плотность микропиноцитозных везикул уменьшилась: люминальных - на 57%, цитоплазматических - на 30%, базальных - на 46%. Достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных рибосом, по сравнению с интактными животными и «спонтанным» развитием опухоли. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была меньше на 11%, чем при «спонтанном» развитии опухолевого процесса.
Патоморфологические изменения перевиваемой карциносаркомы Walker 256 после воздействия циклофосфана. После воздействия ЦФ, начиная с 7-х суток и до конца эксперимента, размеры карциносаркомы Walker 256 уменьшались по сравнению со «спонтанным» ростом (соответственно в 2,6 и 3,7 раза - 9,7±2,3 и 10,3±1,5см3, p<0,05). Показатель ТРО, начиная с 7-х суток эксперимента, возрастал (соответственно на 62 и 73%), достигая наибольшего значения к концу эксперимента.
Через 3 сут после воздействия ЦФ опухоль была представлена преимущественно светлыми клетками, темные клетки образовывали небольшие скопления и немногочисленные тяжи. Отмечалось уменьшение полиморфизма ядер опухолевых клеток. Сосуды были полнокровными, содержали лейкоциты. Наиболее значительные изменения архитектоники карциносаркомы Walker 256 происходили через 7 сут после введения ЦФ. В опухолевом узле практически не регистрировались «светлые» клетки, основную массу составляли мелкие округлые или вытянутые клетки с гиперхромными ядрами. Сохранившиеся светлые клетки часто были многоядерными, обособлялись, цитоплазма их образовывала выросты; такие морфологические превращения клеток отражали их миграционную способность, т.е. способность к метастазированию. Сохранявшиеся в опухолевом узле мышечные волокна подвергались значительным литическим изменениям. Отмечалось фиброзирование опухолевого узла. Опухоль содержала значительное количество тонкостенных сосудов капиллярного типа, чаще ветвящихся. Через 14 сут после воздействия ЦФ происходила реверсия фенотипа опухоли, в ней опять преобладали светлые клетки, которые образовывали гроздьевидные скопления по периферии опухолевого узла. В центре опухолевого узла располагались более мономорфные клетки меньших размеров. По всему объему опухоли встречались варьирующие по размерам очаги некроза.
Митотический индекс опухолевых клеток снижался через 3 и 7 сут после воздействия ЦФ в 1,4 раза по сравнению со «спонтанным» ростом (34,8±1,4‰ и 30,0±1,2‰); к 14-м суткам отмечалось его некоторое увеличение, но прирост был незначительным.
Объемная плотность дистрофически измененных опухолевых клеток при воздействии ЦФ возрастала только через 7 сут эксперимента (38,5±1,8), в остальные сроки она достоверно не изменялась. Объемная плотность очагов некроза после воздействия ЦФ возрастала, но не достоверно. Апоптотический индекс достигал максимальных значений на 3-и и 7-е сутки исследования и был выше соответственно в 6,3 и 5,0 раза, чем при «спонтанном» росте.
По данным ультраструктурного анализа, через 3 сут после введения ЦФ в карциносаркоме Walker 256 присутствовали 2 типа опухолевых клеток, находившихся на разных стадиях дифференцировки. В кровеносных капиллярах отмечалось набухание одних эндотелиоцитов; в других - сохранялось повышенное содержание органелл белкового синтеза. На протяжении всего эксперимента практически не определялись микропиноцитозные везикулы. Начиная с 7-х суток после введения ЦФ наблюдалось увеличение электронной плотности эндотелиоцитов. Объемная плотность митохондрий в эндотелиоцитах снижалась в динамике эксперимента (соответственно на 33, 41 и 49%). Объемная плотность микропиноцитозных везикул также снижалась: люминальных - на 81, 52 и 35%, цитоплазматических - на 85, 62 и 57%, базальных - на 77, 56 и 57%, относительно «спонтанного» развития карциносаркомы. На протяжении всего срока эксперимента достоверно снижались численные плотности митохондрий, свободных и прикрепленных рибосом. Объемная плотность гранулярной цитоплазматической сети была уменьшена на 61, 69 и 72%.
...Подобные документы
Действия мелатонина в зубном развитии и применение при кариесе. Применение мелатонина в качестве противовоспалительного средства в полости рта при пародонтозе, инфекции герпеса, кандидозе. Цитотоксичность и генотоксичность стоматологических материалов.
реферат [43,8 K], добавлен 22.09.2016Понятие гипертермии в медицине как перегревания организма, накопления в нем избыточного тепла. Красная белая гипертермия у детей: лечебные мероприятия. Защитная реакция организма с помощью гипертермии. Лечение гипертермии - терапия основной болезни.
презентация [928,3 K], добавлен 23.11.2014Распространение опухоли в природе, в фило- и онтогенезе. Онкогенные вирусы, классификация, структура, пути распространения. Значение наследственных факторов в развитии опухолей. Биологические особенности, профилактика и терапия опухолевого роста.
лекция [33,8 K], добавлен 16.05.2009Общие принципы химиотерапии. Факторы определения показаний для ее применения. Оценка характера опухолевого процесса. Стандарты определения эффекта лечения (ВОЗ). Ожидаемая эффективность терапии. Описание некоторых методик. Основы химиоэмболизации.
презентация [734,1 K], добавлен 19.11.2014Анализ заболеваемости злокачественными новообразованиями у населения г. Давлеканово. Статистика рака, причины его появления. Классификация нарушений тканевого роста. Злокачественные и доброкачественные опухоли. Факторы противоопухолевой резистентности.
реферат [110,1 K], добавлен 14.11.2010Основные принципы лечения дерматологических больных. Основы терапии кожных болезней. Коррекция механизмов течения и развития патологического процесса, выявленных нарушений со стороны органов. Проведение патогенетической и симптоматической терапии.
презентация [30,4 K], добавлен 21.01.2016Эпидемиология рака прямой кишки. Диагностические исследования заболевания. Применения предоперационной термолучевой терапии (гипертермии) в плане комбинированного лечения. Виды оперативных вмешательств. Динамика безрецидивной выживаемости у больных.
презентация [682,1 K], добавлен 04.06.2014Гипертермический синдром как неспецифическая защитно-приспособительная реакция организма, характеризующаяся повышением температуры тела при заболеваниях. Показания к проведению жаропонижающей терапии и профилактика судорог у детей раннего возраста.
презентация [101,5 K], добавлен 17.09.2016Исследование основных видов внутримышечной общей анестезии, наилучшим средством которой является кетамин. Отличительные черты перорального и ректального метода общей анестезии. Методы проведения электромедикаментозной и электроакупунктурной аналгезии.
реферат [31,5 K], добавлен 27.04.2010Признаки передне-верхнего вывиха правого бедра. Умеренная боль в области тазобедренного сустава при попытке сесть, невозможность самообслуживания. Устранение вывиха под общей анестезией. Конгруэнтность суставных поверхностей. Скелетное вытяжение с грузом.
история болезни [27,2 K], добавлен 23.04.2011Развитие экспериментальной язвенной болезни (ЯБ) желудка у 3-х месячных самцов крыс линии Вистар. Клиническое исследование сыворотки крови животных после формирования ЯБ желудка. Действие фармакологического препарата актовегин на заживление ЯБ желудка.
курсовая работа [125,2 K], добавлен 08.09.2011Направления развития терапии злокачественных опухолей. Классификация противоопухолевых препаратов. Методика идентификации препаратов. Противоопухолевые антибиотики, гормональные средства, антагонисты гормонов и средства растительного происхождения.
дипломная работа [1,0 M], добавлен 21.08.2011Иммунная система против рака. Понятие врожденного и приобретенного иммунитета. Главные элементы активной противоопухолевой защиты: цитотоксические Т-лимфоциты. Рассмотрение некоторых противоопухолевых вакцин: флюиды Вильяма Коли, пицибанил, иммуцин.
презентация [370,7 K], добавлен 06.12.2015Исследование факторов риска дисплазии тазобедренного сустава у новорожденных. Изучение основных симптомов дисплазии и врожденного вывиха бедра. Диагностика и принципы современного консервативного лечения у младенцев. Осложнения врожденного вывиха бедра.
презентация [3,1 M], добавлен 06.04.2016Классификация переломов бедра. Переломы бедра у детей. Открытые повреждения тазобедренного сустава. Переломы диафиза бедра. Переломы головки бедренной кости, шейки бедра, проксимального конца бедренной кости. Осложнения при переломах шейки бедра.
реферат [22,7 K], добавлен 26.06.2009Проведение общей анестезии при неотложных хирургических заболеваниях. Задачи анестезиологического обеспечения. Участие анестезиолога в предоперационной подготовке больных. Сочетанное применение общей, проводниковой или местной инфильтрационной анестезии.
презентация [91,9 K], добавлен 04.10.2016Причины гипотермии и гипертермии. Факторы, способствующие переохлаждению и перегреванию. Патофизиологические изменения в организме в зависимости от внутренней температуры тела. Компенсаторные реакции при нарушении теплового баланса. Солнечный удар.
презентация [742,7 K], добавлен 16.12.2014Влияние семьи и ее здоровья на демографическую политику. Анализ семейного состава врачебного участка, оценка состояния здоровья семей и получаемой ими медицинской помощи. Функциональные обязанности и клинические навыки медицинской сестры общей практики.
дипломная работа [363,8 K], добавлен 15.02.2012Первая пересадка сердца животного человеку. Показания, противопоказания к трансплантации. Требования к донору сердца. Индукция терапии в предоперационном периоде. Включение искусственного кровообращения. Хирургический доступ, соединение крупных сосудов.
презентация [355,5 K], добавлен 13.11.2014Описание системы терморегуляции организма. Различные виды ее нарушения, связанные с тепловым воздействием: судороги, тепловое истощение, удар, гипертермия, их симптомы и лечение. Другие причины возникновения гипертермии помимо тепловой экспозиции.
реферат [19,2 K], добавлен 15.06.2009
