Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Роль различных типов антиген-презентирующих клеток в регуляции апоптоза лимфоцитов и репликации ВИЧ-1 при ВИЧ-инфекции

03.03.03 - иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Макарова Маргарита Владимировна

Москва 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор медицинских наук Мустафин Ильшат Ганиевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор Воробьева Мая Сергеевна

доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич

Защита диссертации состоится « 23 » марта 2011 г. в 14-00 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «______» _______________ 20__ года

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук Сеславина Лия Сергеевна

антиген апоптоз лимфоцит иммунодефицит

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества CD4⁺-лимфоцитов (Fauci A.S., 1988; Levy J.A., 1993; Mellors J., 1996; Badley A.D., 2006). Кроме того, CD4⁺-лимфоциты не являются единственной мишенью для ВИЧ-1. Вирус способен проникать в макрофаги, гистиоциты, дендритные клетки, составляющие периферическое микроокружение Т-лимфоцитов.

Ведущим фактором, обуславливающим снижение абсолютного числа CD4⁺-лимфоцитов, безусловно, является их гибель по механизму апоптоза (Gougeon M.-L., 1993; Badley A.D., 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧ-ассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gp120/160-связывание CD4-рецептора; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, В-клетками и CD8+Т-клетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, инициирующих гибель неинфицированных СD4⁺ Т-клеток. Нарушения в регуляции апоптоза лимфоцитов при ВИЧ-инфекции на сегодняшний день не вызывают сомнения. Однако механизмы апоптоза инфицированных и неинфицированных ВИЧ-1 CD4⁺-лимфоцитов остаются до сих пор дискуссионными (Antoni B., 1995; Noraz N., 1997; Herbein G., 1998; Gandhi R., 1998; Rapaport E., 1998).

Установлено, что пусковыми механизмами активации СD4⁺-лимфоцитов (Лф), являющихся основными мишенями для ВИЧ-1, являются их взаимодействия с профессиональными антиген-презентирующими клетками (АПК), локализующимися, в основном, в лимфоидной ткани. Данный факт, являющийся убедительно доказанным и неоспоримым, тем не менее, не объясняет механизмов репликации ВИЧ-1 и выраженности виремии на стадиях прогрессирования заболевания и развития СПИДа, сопровождающихся, как известно, деструктивными изменениями герминативных центров лимфоидных органов.

В связи с этим, было высказано предположение о возможности активации Лф и индукции репликации ВИЧ-1 за пределами лимфоидной ткани, а именно, непосредственно в кровеносном русле. Эндотелиальные клетки (ЭК) сосудов, известные как полупрофессиональные АПК (Rose M.L., 1998, Pober J. S., 1999) способны вызывать активацию Лф (Ma W., 1998, Mestas J., 1999) и могут индуцировать репликацию ВИЧ-1.

ВИЧ-1 обладает важным для своего выживания свойством - способностью менять фенотип и функции эндотелиальных клеток (ЭК). Несмотря на отсутствие экспрессии CD4 на поверхности ЭК, существует возможность инфицирования ЭК различными штаммами ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (Lafon M., 1993; Scheglovitova O., 1993) через конститутивно экспрессирующиеся хемокиновые рецепторы CXCR4 (Gupta S., 1998; Molino M., 2000). ЭК можно отнести к абортивно-инфицируемым клеткам, являющимися транзиторными резервуарами ВИЧ-1 и способными инфицировать CD4⁺-клетки (Scheglovitova O., 1993, Dianzani F., 1996). Кроме того, абортивно инфицированные ЭК способны продуцировать высокий уровень цитокинов (Corbeil, J., 1995), повышая активацию Т-клеток и вирусную репликацию (Borghi M, 2000).

Вирусные белки, продуцируемые инфицированными клетками, влияют на функциональную активность ЭК. Так, Tat-белок ВИЧ-1 использует интегриновые рецепторы для инфицирования ЭК (Barillari G., 1993). Кроме того, Tat повышает экспрессию промоторов многих цитокиновых генов (ИЛ-6, ИЛ-8), воздействуя на активность фактора транскрипции NF-B (Cota-Gomez A., 2002). Инкубация человеческих ЭК с Tat индуцирует экспрессию на клеточной поверхности молекул адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-selectin (Dhawan S., 1997; Mrowiec T., 1997). При этом gp120 ВИЧ-1 избирательно снижает экспрессию ICAM-1, но не другие молекулы адгезии на поверхности ЭК (Ren Z., 2002).

Исследования, проведенные Yarwood H. с соавт. (2000), показали, что ЭК активируют Т-лимфоциты и их субпопуляции. Кроме того, существует и обратная сторона этих межклеточных взаимодействий. Показано, что продуцируемые Т-клетками факторы способны активировать ЭК, что, в свою очередь, повышает вероятность их участия в последующей регуляции репликации ВИЧ-1. Например, цитокин-зависимое повышение экспрессии молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1) на мембранах ЭК вызывает активацию Т-клеток (Dianzani F., 1996, Abbate L., 1999; Murakami S., 2001), что является предпосылкой для инициирования вирусной репликации в Т-лимфоцитах, культивируемых с ЭК. Кроме того, такие цитокины, как ИФН-, ФНО-, и хемокины (RANTES) также способны стимулировать трансмиссию ВИЧ-1 от абортивно-инфицированных ЭК Т-клеткам путем повышения экспрессии молекул адгезии ICAM-1 (Dianzani F., 1996, Abbate L., 1999).

Учитывая низкий уровень виремии на протяжении длительного периода времени (даже в отсутствии проводимой антиретровирусной терапии) у группы пациентов, инфицированных ВИЧ-1, имеющим делецию гена nef (Huang Y., 1995, Kestler H. W., 1991, Kirchhoff F., 1995, Learmont J. C., 1999), представляло интерес изучение роли данного белка ВИЧ-1 в механизмах вирусной репликации, индуцированнной ЭК.

Базируясь на традиционных представлениях о том, что одним их характерных признаков патогенеза ВИЧ-инфекции является тенденция к прогрессированию заболевания, характеризующаяся нарастанием виремии и неуклонным снижением абсолютного числа CD4+T-лимфоцитов (Wei X., 1995; O'Brien W.A., 1996; Mellors J., 1997), представляет интерес изучение взаимосвязи вышеуказанных процессов. Данные литературы, иллюстрирующие зависимость между вирусной нагрузкой и апоптозом иммунокомпетентных клеток, противоречивы. В частности, ряд исследователей не обнаружил связи между этими процессами (Meyaard L., 1992; Muro-Cacho C., 1995).

В связи с этим, представляет интерес исследование способности АПК регулировать апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и оказывать влияние на репликации ВИЧ-1.

Известно, что применение современных антиретровирусных препаратов способно подавлять репликацию ВИЧ-1 и также влиять на процессы апоптоза Лф в лимфоидной ткани и периферическом русле. Тем не менее, воздействие препаратов на резервуары ВИЧ-1 и индукцию апоптоза латентно инфицированных клеток существенно ограничено и неэффективно. Следовательно, понимание механизмов регуляции апоптоза может явиться предпосылкой для создания новых и перспективных методов терапии ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита.

Исходя из этого, предпринято настоящее исследование, в котором были поставлены следующие цель и задачи.

Цель работы: Изучить способность профессиональных и полу-профессиональных антиген-презентирующих клеток регулировать апоптоз лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и оказывать влияние на репликацию ВИЧ-1

Задачи исследования:

1) Оптимизация способов выделения и культивирования различных типов антиген-презентирующих клеток (дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, эндотелиальные клетки).

2) Сравнительный анализ способности профессиональных (дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты) и полупрофессиональных (эндотелиальные клетки) антиген-презентирующих клеток активировать различные популяции Т-лимфоцитов и индуцировать репликацию ВИЧ-1

3) Оценка способности различных типов антиген-презентирующих клеток модулировать процессы апоптоза лимфоцитов при их инфицировании ВИЧ-1 in vitro

4) Оценка способности антиген-презентирующих клеток регулировать процессы апоптоза инфицированных и неинфицированных лимфоцитов

5) Изучить взаимосвязь между процессами репликации ВИЧ-1, апоптоза и активационного статуса лимфоцитов, культивированных с различными типами антиген-презентирующих клеток.

6) Изучить роль белка ВИЧ-1 Nef в механизмах репликации ВИЧ-1, индуцированной различными типами антиген-презентирующих клеток

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что лиганд-рецепторные взаимодействия являются ведущим фактором межклеточных взаимодействий между профессиональными, полупрофессиональными антиген-презентирующими клетками и CD4-лимфоцитами, инициирующим репликацию ВИЧ-1. Впервые показано, что только эндотелиальные клетки, но не дендритные и макрофаги, обладают способностью инициировать репликацию ВИЧ-1 в CD4⁺-лимфоцитах при минимальном изменении их активационного статуса. Впервые установлено, что эндотелиальные клетки индуцируют устойчивость к апоптозу продуктивно инфицированных лимфоцитов, в то время как профессиональные антиген-презентирующие клетки (дендритные клетки и макрофаги) не обладают данной способностью. Развитие устойчивости продуктивно инфицированных лимфоцитов к апоптозу обусловленно их лиганд-рецепторными межклеточными взаимодействиями с эндотелиальными клетками. Впервые показано, что способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах связана с экспрессией в инфицированных клетках вирусного белка Nef в то время как дендритные клетки и макрофаги инициируют репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах Nef-независимым путем.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Совершенствование диагностики ВИЧ-инфекции, проведение адекватной терапии невозможно без глубоких знаний о патогенезе и механизмах формирования иммунодефицитного состояния при данном заболевании. Полученные данные о свойствах антиген-презентирующих клетках модулировать процессы вирусной репликации и апоптоза различных популяций CD4⁺-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции открывают путь к созданию новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Модель оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов может быть использована как в комплексном исследовании процессов ПКГ и функциональной активности клеток, участвующих в патогенезе вирусных заболеваний с нарушениями апоптоза, так и для направленного поиска средств фармакологического контроля.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы иммунологами, патофизиологами, инфекционистами в научной, практической и учебной работе.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Эндотелиальные клетки обладают способностью усиливать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах и обеспечивают их устойчивость к программированной клеточной гибели. Выявленный феномен является результатом межклеточных лиганд-рецепторных взаимодействий и не связан с секрецией растворимых факторов (цитокинов).

2. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах, взаимодействующих с эндотелиальными клетками, сопровождается их минимальной активацией и происходит в непролиферирующих клетках.

3. Способность эндотелиальных клеток инициировать репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах и их устойчивость к апоптозу обусловлена вирусным белком Nef. Репликация ВИЧ-1 в лимфоцитах, взаимодействующих с дендритными клетки и макрофагами, является Nef-независимой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения и результаты работы доложены на заседании комиссии общества молекулярных биологов, вирусологов и эпидемиологов (Йельский Университет, США; 2003, 2004); 11 международной конференции “СПИД, рак и родственные проблемы” (Санкт-Петербург, 2003); 12 международной конференции “СПИД, рак и родственные проблемы” (Санкт-Петербург, 2004); 1,3-ей научно-практической конференции с международным участием “Проточная цитофлуорометрия и ее использование в практической медицине” (Санкт-Петербург, 2001,2004); Всероссийском семинаре “Проблемы определения субпопуляций лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц методом проточной цитометрии” (Смоленск, 2004); Российской науч-практ. конф-ция, посвящ-я 110-летию кафедры инф-х.болезней ВМА им.С.М.Кирова (С-Петербург, 2006); XVI International AIDS Conference (Toronto, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006), IX Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006г.), V Симпозиуме с международным участием “Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний” (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 2007г.), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008), Х международном конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (Казань, 2009г.), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунолгии - междисциплинарные проблемы» (С-Петербург, 2010).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 30 печатная работа, в том числе: 9 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Методы культивирования и исследования апоптоза лимфоцитов, предложенные в диссертации, внедрены в практическую работу лаборатории иммунологии РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ Республики Татарстан. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры патофизиологии и кафедры клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков, 7 таблиц. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы».

Библиография включает 341 источник, в том числе 17 отечественных и 324 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. Объектом исследования явились мононуклеары периферической крови доноров, эндотелиальные клетки пуповинной вены, дендритные клетки, В-лимфоциты, макрофаги.

Для проведения исследований выделяли мононуклеары периферической крови 80 здоровых доноров в возрасте от 17 до 35 лет обеих полов. У доноров проводилось общеклиническое и лабораторное обследование, включавшее в себя общий анализ крови с лейкоформулой, общий анализ мочи, ФПП, серологические и вирусологические анализы.

Методы исследования.

Методы выделения и культивирования клеток.

Мононуклеары периферической крови (МНПК) получали из периферической крови серонегативных доноров центрифугированием с использованием градиента плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia).

Моноциты и СD4⁺-Лф выделяли из МНПК методом отрицательной иммуномагнитной селекции (Dynal). Активированные СD4⁺-Лф удаляли из клеточной суспензии методом позитивной иммуномагнитной селекции (Dynal) с использованием моноклональных антител (мАТ) к активационным маркерам CD25, 69 и HLA-DR (Pharmingen). Чистоту выделенных популяций (неактивированные СD4⁺-Лф и моноциты) оценивали методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD) с использованием мАТ к CD4, CD14, CD25, CD69 и HLA-DR (Pharmingen). Т-клетки памяти (CD45RO⁺) и наивные Т-клетки (СD45RA⁺) выделяли методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием соответствующих мАТ.

Для получения макрофагов (Мф) из моноцитов периферической крови последние культивировали в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Falcon) течение 5 дней в присутствии ГМ-КСФ (80 нг/мл) (Leucomax, Shering-Plaugh) с последующим определением эстеразной активности. Для дифференцировки ДК из моноцитов последние инкубировали в течение 6 дней в присутствии ГМ-КСФ (40 нг/мл) (Leucomax, Shering-Plaugh) и ИЛ-4 (10 нг/мл)(R&D Systems). Для получения зрелых ДК в среду RPMI 1640 вносили TNF- (20 нг/мл)(Sigma) и ПГ E₃ (250 нг/мл)(ICN) за 1 день до их культивирования с неактивированными CD4⁺-Лф. Чистоту полученных популяций ДК и их дифференцировку оценивали методом проточной цитометрии с использованием мАТ к CD80, 83, 86 и HLA-DR (Pharmingen).

Эндотелиальные клетки (ЭК) выделяли из вены пуповины c использованием коллагеназы IV типа (Sigma) и культивировали в покрытых желатином пластиковых планшетах (Falcon) в среде 199 (Sigma) с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen), 2,5 mM L-глутамина (Invitrogen), гепарина (Sigma) и фактора роста эндотелиальных клеток (BD). Для индукции экспрессии молекул МНС II класса, ЭК инкубировали в течение 3-4 дней с IFN- (1000 ME/мл) (BioSource).

Культивирование неактивированных СD4⁺-Лф (1х10⁵) с различными типами АПК (1х10⁶) осуществляли в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Falcon) в 1,5 мл среды RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков (все реагенты - Invitrogen) в течение 15 дней при 37⁰С и 5% СО₂.

Инфицирование ВИЧ-1 in vitro. В качестве источника ВИЧ-1 использовали лабораторный штамм вируса NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA). Плазмидную ДНК последовательно обрабатывали эндонуклеазой EcoR1 и лигазой Т4 (New England Biolabs) и клонировали с использованием клеточной линии UltraСompetent -X10-Gold (Stratagene), с последующим выделением плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Трансфекцию генома ВИЧ-1 в клеточную линию СЕМх174 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA) проводили с использованием DEAE-декстрана (Sigma). Полученный штамм ВИЧ-1 использовали для инфицирования Лф периферической крови доноров, серонегативных по ВИЧ-1. Для этого Лф, выделенные центрифугированием на градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia), инкубировали в течение 3 дней в среде RPMI 1640 с добавлением ФГА (Gibco) (4мкг/мл) и IL-2 (Sigma) (10 МЕ/мл) с последующим внесением ВИЧ-1 (р24^gag - 100 нг/мл), полученного в результате трансфекции вирусного генома в СEMх174. Супернатанты аликвотировали, титр вируса определяли методом ИФА (р24^gag, Bio-Rad). Инфицирование СD4⁺-Лф, культивированных с различными типами АПК осуществляли путем внесения эквивалентных доз ВИЧ-1, продуцентами которого были ФГА-активированные Лф. Через 12 часов осуществляли полную замену среды RPMI 1640 для удаления не связавшегося ВИЧ-1. Клетки культивировали в течение 15 дней при 37⁰С и 5% СО₂. Замену половины среды RPMI 1640 осуществляли каждые 3 дня.

Уровень репликации ВИЧ-1 оценивали путем определения р24^gag антигена ВИЧ-1 в супернатантах клеточных культур методом ИФА (Bio-Rad). Количество Лф, являющихся продуцентами ВИЧ-1, определяли методом проточной цитометрии с использованием р24^gag мАТ (Сoulter).

Оценку уровня активации клеток-продуцентов ВИЧ-1 осуществляли по экспрессии активационных маркеров CD25, CD69, CD71 и HLA-DR с помощью соответствующих мАТ (PharMingen). Пролиферативный ответ Лф оценивали методом проточной цитометрии по снижению интенсивности флуоресценции CFSE (Molecular Probes).

Культивирование ЭК с CD4⁺-Лф. Для индукции экспрессии молекул МНС II класса, ЭК инкубировали в течение 3-4 дней с IFN- (1000U/ml) (BioSource) в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Linbro). В лунки, содержащие ЭК (1х10⁵), вносили Лф (1х10⁶) в 1 мл среды RPMI 1640 с добавлением 10% ФБС, L-глутамина и антибиотиков (GIBCO BRL). В это же время осуществляли инфицирование культуры ЭК/Лф. Через 12 часов осуществляли полную замену среды RPMI 1640 с целью удаления не связавшегося ВИЧ-1. Клетки культивировали в течение 15 дней при 37⁰С и 5% СО₂. Замену половины среды RPMI 1640 осуществляли каждые 3 дня. Определение уровня секреции цитокинов (IL-2 и IFN-), а также уровня репликации вируса ВИЧ-1 осуществляли методом имммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем (R&D Systems и Coulter, соответственно). Количество ВИЧ-инфицированных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием р24^gag мАТ (Сoulter).

В ряде случаев культивирование Лф с ЭК осуществляли в присутствии aнти-СD2 мАТ (TS2/18)(American Type Culture Collection (ATCC), USA), aнти-CD58 мАТ (AICD58, Immiunotech), анти-ICAM-1 мАТ (MCA532, Serotec), анти-HLA-DR (L243) (ATCC) или изотипических (IgG1) не связывающихся мАТ (HB64 или К16/16)(ATCC). В отдельных экспериментах осуществляли культивирование Лф, разделенных от ЭК посредством полупроницаемой мембраны (0.2m) (Nunc Life Technologies).

Определение уровня ИЛ-2 и ИФН-г в супернатантах клеточных культур проводили методом ИФА (BioScore).

Исследование апоптоза лимфоцитов

Исследование апоптоза Лф проводили методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACSСalibur (“Весton Dickinson”), включая определение фрагментации ДНК по выявлению гиподиплоидного пика при окраске PI, выявление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности Лф флуоресцентной меткой мероцианин 540 (МС540) и аннексином V, измерение митохондриального потенциала клеток по интенсивности флуоресценции CMX-Ros и DiOC₆:

1. Фрагментацию ДНК определяли по наличие гиподиплоидного пика, характерного для апоптоза, оцениваемого с помощью флуорохрома пропидия йодида (PI) (“Sigma”) (Nicoletti I., 1991).

2. Изменение клеточной мембраны определяли окрашиванием Лф с помощью флуорохрома мероцианина 540 (МС540) и аннексина V, меченого FITC (AnnV-FITC), специфически связывающихся с молекулами фосфатидилсерина (ФС).

3. Динамику изменения величины трансмембранного митохондриального потенциала (_m) Лф, проводили с использованием флюорохромов DiOC₆ (Chen L.B. 1988) и CMXRos (Кroemer G., 1996).

Плазмиды и клеточные линии.

В качестве источника ВИЧ-1 использовали штамм NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA), геном которого был представлен в виде 2 плазмид (р83-2 и р83-10), содержащих соответственно 5'- и 3'- последовательности генома ВИЧ-1. Плазмида p83-10, содержавшая делецию по гену nef, была любезно предоставлена д-ром Л. Александером (Yale University, USA). Плазмидную ДНК последовательно обрабатывали эндонуклеазой EcoR1 и лигазой Т4 (New England Biolabs) и клонировали с использованием клеточной линии Ultracompetent-X10-Gold (Stratagene). Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Трансфекцию рекомбинантных плазмид в клеточную линию СЕМх174 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA) осуществляли с использованием DEAE-декстрана (Sigma). Клетки СЕМх174 культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO BRL) общепринятым способом, супернатанты аликвотировали и хранили при -70⁰С. Титр ВИЧ-1 в супернатантах определяли методом ИФА (EIA р24^gag Coulter). Полученный штамм ВИЧ-1 использовали для инфицирования Лф периферической крови доноров. Лф инкубировали в течение 3 дней в полной среде RPMI 1640 с добавлением ФГА (GIBCO BRL) (4g/ml) и IL-2 (Sigma) (10U/мл) с последующим внесением ВИЧ-1 (р24^gag - 100 ng/мл), полученного в результате трансфекции вирусного генома в СEMх174. Титр вируса определяли методом ИФА (EIA р24^gag, Coulter). Количество ВИЧ-инфицировнных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием мАТ к р24^gag белку ВИЧ-1 (Coulter). Определение инфекционной активности ВИЧ-1 проводили с использованием клеточных линий HeLa/CD4--gal и MAGI-CCR-5 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA).

Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с применением пакетов прикладных программ “Excell ” и “Statgraphics”. Достоверность различий полученных результатов оценивали по критерию Стьюдента. Корреляционный анализ полученных результатов проводили с применением методов Пирсона (параметрический) или Спирмена (непараметрический).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль эндотелиальных клеток в репликации ВИЧ-1.

Для оценки взаимосвязи процессов активации клеток-мишеней и последующей в них вирусной репликации из периферической крови методом отрицательной иммуномагнитной селекции выделяли неактивированные СD4⁺-лимфоциты (СD4⁺-Лф) и инфицировали их in vitro лабораторным штаммом ВИЧ-1 NL4-3. При инфицировании СD4⁺-Лф, не экспрессирующих активационные маркеры (CD25, 69, НLA-DR), репликация ВИЧ-1 не наблюдалась. В то же время, внесение в культуру ФГА-активированных Лф аналогичных инфекционных доз ВИЧ-1 приводило к его репликации, пик которой регистрировался на 4-5 сутки культивирования клеток (рис.1).

Рис.1 Репликация ВИЧ-1, оцениваемая по содержанию корового белка ВИЧ-1 (p24^gag) в супернатантах неактивированных (курсив) и ФГА-активированных (сплошная линия) СD4⁺-Лф. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - содержание антигена р24^gag в нг/мл

Для изучения возможности эндотелиальных клеток (ЭК) инициировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, проводили предварительное культивирование ЭК с ИФН-. Данная процедура было необходима для активации ЭК и повышению уровня экспрессии молекул, способных вовлекаться в межклеточные взаимодействия с СD4⁺-Лф. Например, было выявлено, что культивирование ЭК в течение 3-4 дней с ИФН- (1000 ME/мл) приводило к существенному увеличению экспрессии на их поверхности молекул гистосовместимости II класса (MHC II) и подавляющее число (более 98%) ЭК экспрессировало данную молекулу на своей поверхности.

Внесение ВИЧ-1 в культуру неактивированных СD4⁺-Лф, культивированных с ЭК, приводило к вирусной репликации, пик которой регистрировался на 9-12 сутки культивирования. Выраженная репликация ВИЧ-1 (р24^gag - 120-150 ng/ml) наблюдалась только в случае культивирования CD4⁺-Лф с ЭК, преактивированных с помощью IFN-. В то же время, уровень репликации ВИЧ-1 в CD4⁺-Лф, культивированных с неактивированными ЭК составил лишь 5-15 ng/ml на аналогичных сроках их совместной инкубации (рис. 2). ЭК в данной экспериментальной модели не являлись источником репликации ВИЧ-1, так как уровень p24gag ВИЧ-1 в супернатантах инфицированных вирусом ЭК, культивированных в отсутствии СD4⁺-Лф, был ниже порога чувствительности используемых тест-систем.

Рис. 2 Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, оцениваемая по содержанию корового белка ВИЧ-1 (p24^gag) в супернатантах культур. СD4⁺-Лф, культивированных в присутствии неактивированных (курсив) и преактивированных (сплошная линия) ЭК. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24^gag антигена в нг/мл

Аналогичная закономерность была выявлена при оценке внутриклеточного содержания р24^gag антигена. Количество клеток-продуцентов ВИЧ-1, именуемых в дальнейшем как продуктивно инфицированных клеток, было большим среди в СD4⁺-Лф, культивированных с преактивированными ЭК по сравнению с неактивированными ( рис.3 А и Б, соответственно). В то же время, как ЭК, так и неактивированные СD4⁺-Лф, культивированные по отдельности, не являлись продуцентами ВИЧ-1 (рис. 3В и Г, соответственно).

а б

в г

Рис. 3. Уровень экспрессии р24gag антигена ВИЧ-1, определяемого внутриклеточно в СD4⁺-Лф, культивированных с преактивированными (а), неактивированными (б) ЭК, а также СD4⁺-Лф (в) и ЭК(г), культивированных по отдельности. По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТ к р24^gag , меченых FITC, по оси ординат - количество клеток

Следующим этапом исследований явилось идентификация популяции Лф, являющейся источником вирусной репликации в культуре СD4⁺-Лф/ЭК. С этой целью были проведены эксперименты по культивированию ЭК c “наивными” СD4⁺-Лф или СD4⁺-Лф, представляющими собой пул клеток-памяти. Разделение данных клеточных популяций проводили с использованием мАТ к CD45RА и СD45RО, соответственно. Чистота выделенных популяций Лф составила 98% и 89% соответственно.

Внесение лабораторного штамма ВИЧ-1 NL4-3 в культуру “наивных” Лф, культивированных с ЭК, индуцировало репликацию ВИЧ-1, уровень которой был с 100-150 раз меньшим по сравнению с культурами клеток, содержащих эквивалентные количества СD4⁺-Лф, являвшимися клетками - памяти (рис.4). Эффект был дозо-зависимым. Культивирование ЭК без СD4⁺-Лф, а также “наивных” СD4⁺-Лф или клеток-памяти без ЭК не приводило к вирусной репликации (контроль).

Рис. 4. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺CD45RA⁺-Лф (курсив) и СD4⁺CD45RО⁺-Лф (сплошная линия), культивированных в присутствии ИФН-г -активированных ЭК. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена. в нг/мл

Базируясь на традиционной точке зрения о существовании неразрывной связи между процессами вирусной репликации и активацией продуктивно инфицированных клеток, следующим этапом работы явилась оценка уровня активации СD4⁺-Лф, культивированных с ЭК. Критериями активации клеток-продуцентов ВИЧ-1 являлись синтез и секреция цитокинов, определяемых в супернатантах клеточных культур, а также экспрессия ранних (CD69), промежуточных (CD25, VLA-1) и поздних (HLA-DR) активационных маркеров, определяемых одновременно с внутриклеточным содержанием р24gag антигена ВИЧ-1. Было выявлено существенное увеличение уровня ИЛ-2 и ИФН-г в супернатантах клеточных культур СD4⁺-Лф, культивированных с ЭК. Пик синтеза и секреции данных цитокинов регистрировался на 1 и 3 сутки культивирования (для ИФН-г и ИЛ-2, соответственно) и имел тенденцию к дальнейшую снижению. На 6 сутки культивирования уровень содержания цитокинов в супернатантах всех клеточных культур был ниже порога чувствительности использованных тест-систем.

Культивирование как инфицированных, так и неинфицированных СD4⁺-Лф в отсутствие ЭК, не приводило к спонтанной активации клеток и секреции ИЛ-2 и ИФН-г. Культивирование неинфицированных ЭК в отсутствие СD4⁺-Лф также не сопровождалось синтезом вышеназванных цитокинов. В то же время, внесение ВИЧ-1 в культуру ЭК приводило к появлению ИФН-г в супернатантах клеточных культур. Тем не менее, содержание данного цитокина было существенно ниже по сравнению со значениями в супернатантах СD4⁺-Лф, культивированных в присутствии ЭК (таблицы 1 и 2).

Таблица 1

Уровень секреции ИЛ-2

Тип культивируемых клеток	Уровень продукции ИЛ-2 (пг/мл)
	24 ч	48ч	72ч	96 ч	12 дн
ЭК	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
СD4+Лф	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
ЭК/СD4+Лф	9.3±2.6	20.6±1.9	27.0±2.9	н.о.	н.о.
ЭК + NL4-3	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
СD4+Лф + NL4-3	2.1±0.2	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
ЭК/СD4+Лф + NL4-3	7.9±1.4	19.1±2.2	30.3±3.3	н.о.	н.о.

Таблица 2

Уровень секреции ИФН-г

Тип культивируемых клеток	Уровень продукции ИФН-г (пг/мл)
	24 ч	48ч	72ч	96 ч	12 дн
ЭК	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
СD4+Лф	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.	н.о.
ЭК/СD4+Лф	19,9±3.2	41,4±7.8	н.о.	н.о.	н.о.
ЭК + NL4-3	4.4±1.3	6.2±1.6	н.о.	н.о.	н.о.
СD4+Лф + NL4-3	1.2±0.3	0	н.о.	н.о.	н.о.
ЭК/СD4+Лф + NL4-3	21,7±2.4	44,7±6.2	н.о.	н.о.	н.о.

Примечание: н.о. - неопределяемый уровень цитокина

Таким образом, культивирование неактивированных СD4⁺-Лф в присутствии ЭК индуциирует их активацию, о чем свидетельствует повышение уровня секреции цитокинов, в первую очередь, ИЛ-2. Это, в свою очередь, может являться фактором, способствующим вирусной репликации в СD4⁺-Лф.

Прямым доказательством существования связи между процессами вирусной репликации и активации продуктивно инфицированных клеток являлось одновременное исследование данных параметров на уровне одной клетки. Было обнаружено, что продуктивно инфицированные СD4⁺-Лф, культивируемые в присутствии ЭК, не экспрессируют промежуточных и поздних маркеров активации и лишь незначительная часть клеток-продуцентов ВИЧ-1 экспрессирует ранний активационный маркер - молекулу CD69 (верхние правые квадраты режима dot-plot на рис. 5). В то же время, экспрессия активационных маркеров была зарегистрирована исключительно на СD4⁺-Лф, не являвшихся продуцентами ВИЧ-1 (верхние левые квадраты режима dot-plot на рис.6).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что ЭК обладают инициировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф. СD4⁺-Лф, являющиеся продуцентами ВИЧ-1, представлены пулом неактивированных и/или минимально активированных клеток, не экспрессирующих «традиционные активационные» маркеры. Следовательно, вирусная репликация в СD4⁺-Лф, культивированных в присутствии ЭК, происходит по иным, принципиально отличающимся от традиционных, механизмам.

Рис. 56 Экспрессия активационных маркеров на поверхности продуктивно инфицированных (р24^gag -позитивных) и неинфицированных (р24^gag -негативных) Лф, культивированных с ЭК. По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТ к р24gag , меченых FITC, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к маркерам активации

Действительно, результаты проведенных исследований показали, что уровень экспрессии активационных маркеров на продуктивно инфицированных клетках существенно выше, а пул клеток-продуцентов ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф представлен преимущественно активированной популяцией клеток (рис. 6).

Рис. 6. Экспрессия СD25 на поверхности продуктивно инфицированных (р24^gag -позитивных) и неинфицированных (р24^gag -негативных) Лф, в культуре ФГА-активированных Лф. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции мАТ к СD25, конъюгированных с FITC, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к p24gag конъюгированных с РЕ

Специфичность фенотипа продуктивно инфицированных Лф, культивированных с ЭК, подтвердилась при изучении уровня пролиферации продуктивно инфицированных и неинфицированных СD4⁺-Лф. Культивирование ЭК с СD4⁺-Лф вызывает пролиферацию лимфоцитов, что проявляется в снижении интенсивности флюоресценции CFSE (рис. 7А). Инфицирование ВИЧ-1 СD4⁺-Лф, культивируемых в присутствии ЭК, приводит к образованию пула продуктивно инфицируемых клеток, определяемых по наличию в них р24^gag антигена ВИЧ-1. Количество Лф, являющихся продуцентами ВИЧ-1, было существенно выше в культуре СD4⁺-Лф, культивированных в присутствии ИФН-г-преактивированных ЭК, по сравнению с неактивированными ЭК (рис.7 Б и В, соответственно). Клетки-продуценты ВИЧ-1 не являются пролиферирующими, что подтверждает высокий уровень флуоресценции CFSE у клеток, окрашивающихся по р24^gag.

антигену ВИЧ-1.

а б

в

Рис.7. Уровень пролиферации в СD4⁺-Лф, культивированных с ЭК. А - без внесения в культуру ВИЧ-1 (контроль), Б и В - внесение в культуру ВИЧ-1; Б- неактивированные ИФН-г ЭК; В- ИФН-г-активированные ЭК. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции CFSE, по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к p24gag конъюгированных с РЕ

Таким образом, ЭК способны индуцировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф периферической крови, что сопровождается минимальными изменениями их фенотипа. Пул продуктивно инфицированных СD4⁺-Лф представлен непролиферирующими и неактивированными (или минимально активированными клетками).

В то же время, оценка взаимосвязи между уровнем пролиферации и репликации ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф выявила обратную зависимость. Подавляющее число клеток продуцентов ВИЧ-1 было представлено пролиферирующим пулом клеток. Об этом свидетельствовал низкий уровень флюоресценции CFSE (зона М1 в гистограмме В), определяемый в клетках с высоким содержанием р24gag антигена ВИЧ-1 (рис.9). Клеток с указанным выше фенотипом было подавляющее большинство (92% на рис.8В). В то же время Лф, клетки, не являвшиеся продуцентами ВИЧ-1 в культуре ФГА-активированных Лф (рис.8Б), были геторогенной популяцией клеток. Наряду с пролиферирующей популяцией Лф (зона М1 в гистограмме Б), большая часть клеток была представлена непролиферирующей популяцией Лф.

Рис. 8. Уровень пролиферации в инфицированных (М1 на гистограмме А) и неинфицированных Лф, преактивированных ФГА. По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции мАТ к p24^gag конъюгированных с РЕ (гистограмме А); интенсивность флуоресценции CFSE ( гистограммы Б и В)

Следующим этапом исследований явилось изучение механизмов ЭК-индуцированной репликации ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф. Очевидно, что репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф являлась следствием межклеточных взаимоотношений между инфицированными СD4⁺-Лф с ЭК, а также неинфицированными СD4⁺-Лф, активированными со стороны ЭК, так как инфицирование неактивированных СD4⁺-Лф, культивированных в отсутствие ЭК, не приводило к репликации ВИЧ-1. Межклеточные взаимодействия, способные инициировать репликацию ВИЧ-1 в инфицированных СD4⁺-Лф, могли быть обусловлены как секрецией ЭК растворимых факторов (в первую очередь, цитокинов), так и лиганд-рецепторными взаимоотношениями между вышеназванными типами клеток.

Для выяснения роли растворимых факторов, способных индуцировать репликацию ВИЧ-1 в данной экспериментальной модели были проведены эксперименты с раздельным культивированием ЭК и СD4⁺-Лф. Было выявлено, что инфицирование вирусом СD4⁺-Лф, разделенных от ЭК полупроницаемой мембраной, существенным образом снижало репликацию ВИЧ-1 (рис.9).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль растворимых факторов, способных инициировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивируемых с ЭК, минимальна.

Рис.9. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивируемых с ЭК. (сплошная линия - совместное культивирование; прерывистая - культивирование клеток, разделенных полупроницаемой мембраной). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена в супернатантах (нг/мл)

При исследовании роли лиганд-рецепторных взаимоотношений между ЭК и СD4⁺-Лф в репликации ВИЧ-1 были использованы “блокирующие” мАТ к молекулам CD2, LFA1, DS-SIGN и МНС II класса. Для достижения оптимальной концентрации мАТ, последние вносили в культуру клеток каждые 3 дня во время замены половины среды для культивирования. Было выявлено, что внесение в культуру ЭК/CD4⁺-Лф мАТ, блокирующих СD58/LFA-3, CD2/LFA-2 и ICAM-1/LFA-1 взаимодействия индуцировало снижение репликации ВИЧ-1. Наибольшее снижение уровня вирусной репликации достигалось при использовании мАТ к молекулам гистовсовместимости II класса (рис. 10). Применение мАТ к CD2 молекуле, а также LFA-1 в меньшей степени ингибировало репликацию ВИЧ-1. Использование мАТ к молекуле DS-SIGNR не оказывало влияния на репликацию ВИЧ-1 в использованной нами экспериментальной модели.

Рис.10. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивируемых с ЭК без мАТ, в присутствии изотипических мАТ, мАТ к CD2, МНС II класса, DC-SIGNR, LFA-1. По оси абсцисс - продолжительность культивирования (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена в супернатантах ( в нг/мл)



Роль эндотелиальных клеток в регуляции апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных СD4⁺ - лимфоцитов.

Было выявлено, что наиболее восприимчивой к апоптозу популяцией Лф, культивированных с ЭК, являются пул неинфицированных (или латентно инфицированных) СD4⁺-Лф. Это иллюстрировали исследования по изучению фрагментации ДНК продуктивно инфицированных и неинфицированных Лф, культивированных в присутствии ЭК (рис.11). Было выявлено, что количество гиподиплоидных клеток (регион М1) среди неинфицированной популяции Лф почти в 3 раза превышает данный показатель у продуктивно инфицированных Лф (рис.12 А и Б, соответственно). Аналогичная закономерность была выявлена и при исследовании других параметров апоптоза Лф, культивированных в присутствии ЭК. Об этом свидетельствовал низкий процент клеток с признаками фрагментации ДНК (рис.13 А), сниженной величиной митохондриального потенциала (рис.13Б) и экспрессией фосфатидилсерина (рис.13 В).

а б

Рис.11. Интенсивность флуоресценции пропидиум йодида, окрашивающего ДНК продуктивно инфицированных (А) Лф и неинфицированных (Б), культивированных с ЭК

а б в

Рис. 12. Уровень фрагментации ДНК (А - нижние квадранты dot-plot), снижения величины митохондриального потенциала (Б - нижние квадранты dot-plot) и экспрессии фосфатидилсерина (В - верхние квадранты dot-plot) у продуктивно инфицированных (правые квадранты dot-plot) и неинфицированных (левые квадранты dot-plot) СD4⁺-Лф, культивированных в присутствии ЭК. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции мАТ к p24 gag; по оси ординат - интенсивность флуоресценции пропидиум йодида (А); хлорометил-Х-розамина (Б); аннексина V (В)

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ЭК обладают способностью индуцировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф. Основным пулом клеток-продуцентов ВИЧ-1 в этой экспериментальной модели являются СD4⁺-Лф, относящиеся к клеткам-памяти (СD45RO). Продуктивно-инфицированные СD4⁺-Лф, обладают специфическим фенотипом, заключающимся в отсутствии классических маркеров клеточной активации и признаков пролиферации. Кроме того, пул продуктивно инфицированных Лф обладает устойчивостью к программированной клеточной гибели, что может способствовать длительной персистенции данных клеток в организме ВИЧ-инфицированных лиц и обеспечивать поддержание виремии в течение продолжительного периода времени.

Профессиональные антиген-презентирующие клетки и их роль в репликации ВИЧ-1.

Было проведено сравнительное изучение способности различных типов антиген-презентирующих клеток (АПК) инициировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф. Из категории профессиональных АПК, экспрессирующих на своей поверхности основные ко-стимулирующие молекулы семейства В7(CD80, CD86) были выбраны дендритные клетки (ДК) и макрофаги.

Было выявлено, что при культивировании моноцитов, выделенных из периферической крови доноров методом положительной иммуномагнитной селекции в течение 5 дней в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4, происходило их созревание в незрелые ДК, сопровождавшееся утратой экспрессии молекулы CD14 и появлением молекул HLA-DR и СD209. Дальнейшее их культивирование в течение 2 дней с ГМ-КСФ, ФНО-б и ПГЕ₃ приводило к появлению на их поверхности молекул CD83, являвшихся одним из основным критериев их созревания. Источником макрофагов (Мф), использованных в качестве профессиональных АПК для культивирования с СD4⁺-Лф, также являлись моноциты периферической крови доноров. Культивирование моноцитов в течение 6-7 дней в присутствии ГМ-КСФ индуцировало их дифференцировку в макрофаги, определяемую по появлению эстеразной активности в клетках.

Было выявлено, что культивирование профессиональных АПК с СD4⁺-Лф приводило к их активации, а внесение ВИЧ-1 в культуры ДК/СD4⁺-Лф или Мф/СD4⁺-Лф инициировало репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф.

В качестве критериев активации СD4⁺-Лф, культивированных с ДК или Мф, использовали только уровень экспрессии активационных маркеров, не определяя при этом в супернатантах культур уровень секреции цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-г). Это было обусловлено тем, что как ДК, так и макрофаги могли стать источником синтеза данных цитокинов и поэтому не могли быть использованы в качестве критерия активации СD4⁺-Лф, культивированных с данными типами АПК. Было показано, что культивирование профессиональных АПК с СD4⁺-Лф инициирует активацию последних, проявлявшуюся в экспрессии всех активационных маркеров (СD25, 69, 71, НLA-DR, VLA-1). Было отмечено, что процент СD4⁺-Лф, экспрессирующих маркеры активации в данных экспериментальных условиях, был достоверно выше по сравнению с СD4⁺-Лф, культивированными с ЭК. Данная закономерность была выявлена при исследовании практически всех активационных маркеров, за исключением экспрессии VLA-1 (табл. 3).

Таблица 3

Экспрессия маркеров активации у СD4⁺-Лф (в %), культивированных с ДК, Мф и ЭК.

	СD25*	CD69	CD71	НLA-DR	VLA-1
СD4+Лф	0	0	0	0	0
СD4+Лф (ВИЧ-1)	1,1±0.2	0	0	0	0
ЭК/СD4+Лф	14,9±2.6	8,9±1.2	8,9±2.2	4,9±0.6	6,2±1.2
ЭК/СD4+Лф (ВИЧ-1)	16,1±3.2	11,9±2.6	7,2±3.6	2,7±1.2	4,4±0.8
ДК/СD4+Лф	24,8±4.1**	17,1±2.6**	12,0±0.8**	9,9±2.2 **	3,6±0.4
ДК/СD4+Лф (ВИЧ-1)	22,6±3.4**	19,8±3.2**	12,8±3.4**	8,0±2.8**	4,0±1.0
Мф/СD4+Лф	20,9±1.8**	15,9±1.8**	11,4±0.6**	11,9±3.2**	1,9±0.2
Мф/СD4+Лф (ВИЧ-1)	19,4±2.2**	17,0±2.8**	13,6±2.8**	12,0±2.4**	3,4±1.2

* - экспрессию СD69 оценивали 3 сутки культивирования, CD25, HLA-DR, VLA-1 - на 6 сутки культивирования, CD71 - на 9 сутки культивирования

** - р<0.05 по сравнению с аналогичными условиями культивирования СD4⁺-Лф в присутствии ЭК.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что “активирующий” потенциал профессиональных АПК значительно превосходит таковой у полупрофессиональных АПК.

Результаты дальнейших исследований подтвердили традиционную точку зрения о способности профессиональных АПК инициировать репликацию ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф. Было показано, что пик репликации ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивированных с ДК и Мф наблюдался на 6 и 9 сутки культивирования, соответственно. Тем не менее, уровень репликации ВИЧ-1 в этих случаях был достоверно ниже по сравнению с уровнем вирусной репликации в СD4⁺-Лф, культивированных с ЭК (рис.13). ДК и Мф не являлись источниками репликации ВИЧ-1 в использованной нами экспериментальной модели, так как белок ВИЧ-1 р24gag в супернатантах ДК или Мф, культивированных в отсутствие СD4⁺-Лф, не определялся.

Рис.13. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивируемых с ДК (б), Мф (а) и ЭК (в). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена в супернатантах в нг/мл

Помимо различий в динамике вирусной репликации в СD4⁺-Лф, культивированных с различными типами АПК, были также обнаружены существенные различия в фенотипе продуктивно инфицированных клеток. Если популяция клеток-продуцентов ВИЧ-1 в культурах ЭК/СD4⁺-Лф была представлена неактивированными и непролиферирующими клетками, то популяция клеток продуцентов ВИЧ-1 культуре ДК/СD4⁺Лф была гетерогенной. Помимо характерной для культуры ЭК/СD4⁺-Лф неактивированной популяции Лф, значительная часть клеток-продуцентов экспрессировала активационные маркеры (рис.14). Аналогичные результаты были получены и при исследовании маркеров активации на поверхности продуктивно инфицированных СD4⁺Лф, культивированных с Мф.

а б

Рис.14. Экспрессия активационных маркеров на поверхности продуктивно инфицированных (р24^gag -позитивных - М2 на верхней гистограмме) и неинфицированных (р24^gag -негативных М1 на верхней гистограмме) Лф, культивированных с ДК. A-CD25, Б -HLA-DR; По оси абсцисс - интенсивности флуоресценции мАТ к р24gag, меченых FITC (верхняя гистограмма),- интенсивность флюоресценции мАТ к маркерам активации. (нижние гистограммы А и Б)

Оценка уровня пролиферации продуктивно-инфицированных клеток, культивированных с профессиональными АПК подтвердила точку зрения о гетерогенности данного пула клеток-продуцентов ВИЧ-1. Было обнаружено, что в данных экспериментальных условиях большая часть продуктивно инфицированных клеток была представлена пролиферирующими клетками.

Инфицирование вирусом как CD45RА, так и СD45RО, культивированных с ДК, приводит к репликации ВИЧ-1, оцениваемой по содержанию белка р24^gag в супернатантах. Тем не менее, было выявлено, что уровень и динамика репликации ВИЧ-1 в культурах ДК/CD45RO и ДК/CD45RА отличаются друг от друга (рис.15).

1 3 6 9 12 15

Рис.15. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺CD45RA⁺-Лф (курсив) и СD4⁺CD45RО⁺-Лф (сплошная линия), культивированных в присутствии ДК. По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена ( нг/мл)

Мф также обладали способностью индуцировать репликацию ВИЧ-1 в наивных Т-Лф и клетках памяти. Были выявлены аналогичные отличия в динамике и уровне репликации между исследуемыми популяциями Т-Лф.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что профессиональные АПК (ДК и Мф) обладают способностью инициировать репликацию ВИЧ-1 как в “наивных” Т-Лф, так и Т-Лф, относящихся к пулу клеток-памяти.

Рис.16. Репликация ВИЧ-1 в СD4⁺-Лф, культивируемых с ДК (А - совместное культивирование; Б - культивирование клеток, разделенных полупроницаемой мембраной). По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни), по оси ординат - количество р24gag антигена в супернатантах (нг/мл).

Раздельное культивирование ДК или Мф с СD4⁺-Лф с использованием полупроницаемой мембраны приводило к значительному снижению уровня вирусной репликации вплоть до полного его подавления (рис.17). Это свидетельствует о том, что основные сигналы, необходимые для инициирования вирусной репликации в инфицированных СD4⁺-Лф, исходят со стороны профессиональных АПК.

...