Взаимодействие структур врожденного и адаптивного иммунитета в пораженной коже больных тяжелыми формами псориаза на фоне системной антицитокиновой терапии (иммуноморфологическое исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СТРУКТУР ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В ПОРАЖЕННОЙ КОЖЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛЫМИ ФОРМАМИ ПСОРИАЗА НА ФОНЕ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ (ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.10 - кожные и венерические болезни 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

КАТУНИНА Оксана Рахимовна

МОСКВА 2011

Работа выполнена в отделах дерматологии и лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и заболеваний кожи Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты: академик РАМН доктор медицинских наук, профессор Анна Алексеевна Кубанова

доктор медицинских наук, профессор Александр Михайлович Вавилов

доктор медицинских наук, профессор Валентина Павловна Быкова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Елена Владиславовна Матушевская

доктор медицинских наук, профессор Вероника Владимировна Мордовцева

доктор медицинских наук, профессор Елена Леонидовна Туманова

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «____» ______________ 2012 г. на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 при ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «____» _____________2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Псориаз - один из тяжелых дерматозов мультифакториальной природы, имеющий наследственную предрасположенность. Заболевание характеризуется рецидивирующим течением с частыми обострениями (Griffiths C.E., 2007; Lowes M.A., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). Нередко сочетается с патологией органов желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы, вовлечением в патологический процесс суставов (Neimann A.L., 2006; Katsambas A., 2008; Navarini A.A., 2010).

Кожные высыпания при псориазе формируются за счет гиперпролиферации и нарушения дифференцировки кератиноцитов, развития воспалительной инфильтрации в дерме, опосредованной активированными Т лимфоцитами (Liu Y.,Krueger J.G. et.al., 2007; Griffithc C.E., Barker J.N., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009 и др.). Существуют данные, что появление основных патоморфологических феноменов в очагах пораженной кожи больных псориазом (акантоза эпидермиса, паракератоза, микроабсцессов Мунро, воспалительной инфильтрации дермы) опосредовано биологическим эффектом продукта активированных клеток кожи - провоспалительного цитокина - фактора некроза опухоли альфа (ФНО-б) (Nickoloff B.J., 1991; Griffiths C.E., 2007; Lin J., 2008). Относительно клеток-продуцентов ФНО-б, его рецепторов, клеток-мишеней и биологических эффектов этого цитокина, имеются многочисленные публикации в научной литературе, однако они касаются процессов, происходящих только в органах иммунной системы. Данные о степени экспрессии ФНО-б, как показателя активированного состояния клеток непосредственно в очагах пораженной кожи, в отечественной литературе отсутствуют.

Клетки кожи с разнообразными распознающими рецепторами - кератиноциты эпидермиса, антигенпрезентирующие клетки кожи (клетки Лангерганса), нейтрофильные лейкоциты, антибактериальные пептиды - относятся к структурам врожденного иммунитета и участвуют, прежде всего, в осуществлении барьерных функций. Если при внедрении патогена эти структуры не могут обеспечить его элиминации, то врожденные механизмы защиты обеспечивают обработку патогена для взаимодействия с Т лимфоцитами с последующим развитием адаптивного иммунного ответа. (Barral D.C., Brenner M.B., 2007; Ярилин А.А., 2010, и др.). Данные литературы о количестве клеток Лангерганса при псориазе весьма противоречивы (Deguchi M., Alba S. еt. al., 2002; Lowes M.A., Chamian F. еt.al., 2005). Исследования по изучению роли толл-подобных рецепторов в патогенезе псориаза в Российской Федерации не проводились.

Интерлейкин 1 (ИЛ-1) экспрессируется в коже человека для выполнения ряда физиологических функций (регуляция синтеза и деградации коллагеновых волокон и гиалуроновой кислоты в дерме и др.) (Помыткин И., 2010). В то же время известно, что ИЛ-1, обладая плейотропным характером биологической активности, регулирует все стороны воспалительной реакции. Изучение роли и функции ИЛ-1 при псориазе привело к противоречивым результатам (Cooper K, Hammerberg C. et al.,1990; Debets R., Hegmans J.P. et al., 1995; Громов А.Ю., Чаплыгин А.В. и др., 2005). Поэтому интерес к изучению экспрессии ИЛ-1 непосредственно в пораженной коже больных псориазом возникает как с позиции получения нового иммуноморфологического параметра для оценки активированного состояния клеток кожи, так и для определения эффективности лечения.

Повышенное количество Т лимфоцитов, являющихся составляющей адаптивного иммунитета, обнаруживается в дермальных воспалительных инфильтратах (Охлопков В.А., 2004; Пинсон И.Я., 2006). Циркуляция лимфоцитов между структурами кожи и регионарными лимфатическими узлами строго регулируется молекулами межклеточной адгезии (Ярилин А.А., 2009). Поэтому характеристика таких адгезивных молекул, как ICАM-1 и Е-селектин, в коже больных псориазом, несомненно, имеет большое значение для понимания механизма формирования воспалительного инфильтрата.

Существующие методы системной терапии псориаза недостаточно эффективны, так как они направлены лишь на удлинение периодов ремиссии, снижение степени тяжести заболевания и не приводят к полному излечению больных (Nijsten T., 2005). Повышение эффективности лечения псориаза остается одной из важных проблем дерматологии, решение которой зависит от результатов исследований, направленных на углубление знаний о механизмах патогенеза этого заболевания.

Достижения в сфере молекулярных и клеточных биотехнологий позволили разработать новый класс лекарственных препаратов, являющихся рецепторными или химическими антагонистами различных медиаторов воспаления. Один из механизмов действия биологических препаратов заключается в нарушении связывания эндогенного лиганда с соответствующим рецептором, приводящем к модификации биологических реакций из-за блокирования системы внутриклеточной передачи сигнала (Jackson J.M., 2007; Козлов И.Г., 2009).

В последние годы в терапии псориаза стали использовать генно-инженерные биологические препараты (Sterry W., 2004; Purcell R.T., 2008; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). В России зарегистрированным и разрешенным к применению для лечения псориаза и псориатического артрита является препарат инфликсимаб (Ремикейд). По наблюдениям отечественных и зарубежных исследователей, терапия инфликсимабом у большинства больных более эффективна, чем при лечении другими системными методами терапии (Boehncke W.H., 2007; Menter A., 2007; Кубанов А.А., Матушевская Ю.И., 2008; Castelo-Soccio L., 2009; Курдина М.И., 2010). Однако инфликсимаб в терапии больных псориазом применятся сравнительно недавно, поэтому механизм реализации его терапевтической эффективности нельзя считать полностью изученным. Работы, посвященные изучению изменений морфологической картины в коже больных псориазом под влиянием терапии биологическими модификаторами иммунных реакций немногочисленны. Данные об иммуноморфологических показателях врожденного и адаптивного иммунитета в процессе биологической терапии приводятся в единичных работах.

Комплексный клинико-иммуноморфологический анализ структурной характеристики и особенностей функционирования врожденного и адаптивного иммунитета необходим для получения новых данных о механизмах развития воспалительного процесса при псориазе и достижения эффекта терапии биологическими модификаторами иммунного ответа, что определяет актуальность, своевременность и целесообразность проведения настоящего исследования.

Цель работы: изучить роль и особенности функционирования компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза и оценить динамику показателей иммунного воспаления в коже больных псориазом в процессе терапии биологическим модификатором иммунного ответа - инфликсимабом. псориаз иммунитет инфликсимаб кожа

Задачи:

1. Провести оценку содержания компонентов врожденного иммунитета морфометрическим методом по показателям экспрессии и распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом: толл-подобных рецепторов 2,4 и 9 типов, провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б, количества клеток Лангерганса.

2. Исследовать морфометрические параметры экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, а также содержания компонентов адаптивного иммунитета с учетом показателей распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD45RO+).

3. Изучить динамику клинической картины заболевания у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом, по результатам ближайших и отдаленных наблюдений (по истечении 2-х месяцев и 1-го года).

4. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета в коже больных псориазом в процессе терапии инфликсимабом.

5. Определить взаимосвязь между клиническими проявлениями на коже больных псориазом, патоморфологической картиной и показателями врожденного и адаптивного иммунитета в процессе отдаленных наблюдений.

6. Оценить прогностическую значимость показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом.

Научная новизна:

Впервые у больных псориазом проведено иммуноморфологическое исследование, включающее одновременное комплексное определение состояния структур врожденного и адаптивного иммунитета, что является новым перспективным направлением, позволяющим более эффективно изучать закономерности развития воспаления в коже больных и реализации эффективности терапии.

Результаты исследования, основанные на анализе распределения толл-подобных рецепторов разных типов, клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета, субпопуляций Т-лимфоцитов, относящихся к структурами адаптивного иммунитета, молекул, обеспечивающих рекруитмент клеток адаптивного иммунитета в очаг поражения (адгезивные молекулы) и определяющих активацию клеток кожи (провоспалительные цитокины), позволили расширить представления о роли врожденного иммунитета и показать, что такие его структуры, как толл-подобные рецепторы 2 и 4 типов и клетки Лангерганса не только участвуют в запуске иммунного воспаления, но и способны регулировать интенсивность иммунной реакции в коже больных, доказательством чего является наличие корреляционной связи между этими показателями. Изучение параметров содержания компонентов врожденного и адаптивного иммунитета позволило установить, что кератиноциты эпидермиса и эндотелиоциты сосудов непосредственно участвуют в иммунных реакциях при развитии воспалительного процесса в пораженной коже больных псориазом.

Установлено, что воспалительный процесс в коже развивается при значительном увеличении молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов, клетках воспалительного инфильтрата) и Е-селектина (на эндотелиоцитах сосудов), необходимых для обеспечения межклеточных взаимодействий. Показано, что в коже здоровых лиц не возникает необходимости в экспрессии молекулы ICAM-1.

Выявлены особенности экспрессии провоспалительных цитокинов в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления установлено увеличение экспрессии ИЛ-1б на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов и клетках воспалительного инфильтрата, в то время как, иммуногистохимическим методом признаков экспрессии ФНО-б обнаружено не было.

Вскрыты неизвестные ранее механизмы действия инфликсимаба, заключающиеся в уменьшении экспрессии распознающих рецепторов TLR2 и TLR4, провоспалительного цитокина ИЛ-1б, молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина.

Практическая значимость работы:

Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета, непосредственно в пораженном органе, в процессе антицитокиновой терапии, позволило установить, что этот метод лечения обладает стабильно нормализующим влиянием на патогенетические компоненты хронического воспаления, сопровождающимся разрешением высыпаний на коже больных. Данные, полученные в ходе исследования, позволили, в соответствии с правилами доказательной медицины, объективно оценить и обосновать эффективность терапии инфликсимабом.

Результаты исследования по определению в коже больных количества толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, клеток Лангерганса, молекул межклеточной адгезии, провоспалительного цитокина ИЛ-1б, основных субпопуляций Т лимфоцитов, в перспективе могут быть использованы для научно-обоснованной оптимизации существующих методов системной терапии и являются основой для разработки новых методов лечения псориаза, а также в исследованиях, ориентированных на поиск антигенов, вызывающих развитие иммунного воспаления у больных псориазом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Защитные функции кожи, находящейся в непрерывном взаимодействии с внешней средой, и развитие иммунного воспаления при псориазе осуществляются одними и теми же структурами врожденного иммунитета: толл - подобными рецепторами 2 и 4 типов и клетками Лангерганса. Разница между этими процессами заключается в количестве, различном распределении в компартментах кожи и степени активации структур. Патофизиологическая стадия при развитии воспалительного процесса у больных псориазом сопровождается увеличением числа активированных структур врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение экспрессии распознающих рецепторов TLR2 и TLR4 и количества антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (CD1a) в эпидермисе и дерме пораженной кожи.

2. Формирование воспалительных инфильтратов в пораженной коже больных псориазом происходит на фоне увеличения экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и Е-селектина, которые в коже у здоровых лиц продуцируются в незначительном количестве.

3. Связывание провоспалительного цитокина ФНО-б при введении инфликсимаба приводит к существенному уменьшению числа толл-подобных рецепторов, количества активированных клеток адаптивного иммунитета, адгезивных молекул в коже. В то же время, в разрешающихся высыпаниях количество активированных клеток Лангерганса остается повышенным, что является предрасполагающим фактором, способствующим обострению патологического процесса.

4. Появление в отдаленном периоде папулезных элементов у больных псориазом, получающих инфликсимаб сопровождается увеличением числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

5. Биологическая терапия является перспективным методом терапии псориаза. Предложенный алгоритм исследования является основой для разработки новых таргентных препаратов.

Апробация работы.

Основные положения работы представлены и обсуждены в ходе проведения:

-II Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2007 г.);

-III Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Казань, 5-9 ноября 2009 г.);

-научно-практических конференциях ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России (г. Москва, 25 сентября 2009 г. и 28 мая 2010 г.);

-пленарном заседании Московского общества дерматовенерологов им. А.И. Поспелова (г. Москва, 18 февраля 2010 г.);

-XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (г. Екатеринбург, 9-12 ноября 2010 г.);

-VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 11-12 ноября 2010 г.);

-22-м Мировом Конгрессе дерматологов (Корея, г. Сеул, 24-29 мая 2011 г.);

-II Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества/ IV Всероссийском конгрессе дерматологов (г. Санкт-Петербург, 5-9 июля 2011 г.).

Внедрение результатов исследования. Иммуноморфологические методы исследования внедрены в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России.

Полученные в ходе выполнения исследования результаты, используются в обучающих программах сертификационных курсов для дерматовенерологов, на занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами, на циклах общего и тематического усовершенствования.

Результаты исследования, касающиеся характеристики иммунопатологических реакций в коже при псориазе были использованы при составлении глав в руководствах для врачей: Клиническая дерматовенерология: 2 т./под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, 2009г. и Дерматовенерология. Национальное руководство/под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, О.Л. Иванова, 2011г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 25 научных работах, из которых 16 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме исследования, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимической реакции. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование патоморфологической картины. С применением компьютерной программы анализа изображения ImageJ проведен морфометрический анализ исследуемых показателей. С помощью прикладной программы осуществлена статистическая обработка полученных материалов. Проведена интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 47 рисунками (80 фотографий). Состоит из введения, 6 глав с описанием данных литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 55 источников на русском и 191 источник на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа выполнялась на базе ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России в период с марта 2007 по август 2011 года.

В исследование было включено 80 больных псориазом (34 - женского пола, 46 - мужского пола) в возрасте от 19 до 75 лет. Критериями включения больных в исследование являлись возраст старше 18 лет, наличие типичной картины заболевания, среднетяжелая и тяжелая степень кожных проявлений. В соответствии с «Основами законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» до начала проведения диагностических манипуляций и лечения все пациенты были ознакомлены и подписывали информированное добровольное согласие на медицинское вмешательство. Клиническое обследование больных проводилось в условиях отделения клинической дерматологии ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России и включало изучение жалоб, анамнеза жизни и заболевания, данных о полученном ранее лечении и сопутствующих заболеваниях, оценку общего и локального статуса. У каждого больного для оценки тяжести и распространенности кожных проявлений использовали индекс PASI (Psoriasis area and severity index).

До начала лечения и в течение курса терапии всем больным проводили обследование с применением лабораторных методов исследования (общий анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, проведение исследования для выявления сифилиса, гепатитов В и С, ВИЧ).

Для исключения сопутствующих заболеваний и противопоказаний к лечению больные были консультированы терапевтом, офтальмологом, эндокринологом, гинекологом, по показаниям - другими специалистами.

Оценку клинической эффективности лечения проводили через 2 месяца от начала лечения, используя динамику индекса PASI (табл. 1).

Таблица 1

Клинические показатели результатов лечения

Результаты лечения	Снижение индекса PASI
Клиническое выздоровление	90% и более
Значительное улучшение	75-89%
Улучшение	50-74%:
Незначительное улучшение	25-49%
Без эффекта	Менее 25%

Клинически значимым показателем высокой эффективности лечения считали снижение индекса PASI на 75% и более. Отдаленные клинические результаты изучали на протяжении периода от 1 до 3 лет, оценивая на момент осмотра жалобы больного, отсутствие прогрессирования заболевания либо распространенность, локализацию и характер кожных высыпаний.

Методы лечения. Основную группу составили 38 больных, у которых наблюдался псориаз среднетяжелой и тяжелой степени (индекс PASI >10) c короткими периодами ремиссии, отмечались неудовлетворительные результаты лечения при назначении ретиноидов, метотрексата, циклоспорина, фотохимиотерапии.

Больные основной группы получали препарат инфликсимаб (химерное соединение на основе гибридных и человеческих IgG1 моноклональных антител), являющийся селективным иммунодепрессантом, связывающим как растворимую, так и трансмембранную формы ФНО-б человека. До начала лечения больных основной группы тщательно обследовали для исключения новообразований, туберкулеза, тяжелых хронических инфекций, сердечно-сосудистой недостаточности. Женщины детородного возраста включались в исследование после получения отрицательного результата теста на беременность, при условии использования высокоэффективных методов контрацепции. Инфликсимаб вводили в дозе 5 мг/кг массы тела внутривенно капельно. Повторные введения препарата осуществляли через 2 и 6 недель после первого введения и далее каждые 8 недель. Непосредственно перед каждым введением препарата всем больным проводили общие анализы крови и мочи, биохимический анализ крови (исследование уровня трансаминаз, общего и связанного билирубина, продуктов азотистого обмена). После расчета дозы препарата содержимое каждого флакона растворяли в 10 миллилитрах воды для инъекций, после чего общий объем приготовленной дозы доводили 0,9% раствором натрия хлорида для инъекций до 250 миллилитров. Сразу после приготовления раствор вводили внутривенно капельно в течение не менее 2-х часов, со скоростью не более 2 мл/в минуту. Во время проведения инфузии каждые 30 минут больным измеряли частоту сердечных сокращений, частоту дыхательных движений, артериальное давление. По окончании проведения инфузии эти показатели измеряли каждые 30 минут в течение 2-х часов, затем больной оставался под наблюдением дежурного врача.

Группу сравнения составили 42 человека, которые получали фотохимиотерапию, ретиноиды, метотрексат, в различных комбинациях, в соответствии с клиническими рекомендациями Российского общества дерматовенерологов (РОДВ). Выбор метода терапии был обусловлен тяжестью кожного процесса, предыдущим использованием различных методов лечения и их эффективностью, наличием сопутствующей патологии. С учетом выбранного метода лечения всех больных группы сравнения до начала терапии тщательно обследовали для исключения противопоказаний к лечению: назначали общие анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, консультации специалистов.

Патоморфологические исследования. У всех больных (80 человек) проведено рутинное гистологическое исследование кожи (окраска гематоксилин-эозином). У 30 больных (15 человек из основной группы, 15 человек из группы сравнения), из них 12 женщин и 18 мужчин в возрасте от 19 до 68 лет, проведены иммуноморфологические исследования кожи.

Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев, не имевших клинических признаков кожных заболеваний, у которых биоптаты кожи были получены во время проведения хирургических операций.

До начала лечения биоптаты брали из центра очагов поражения под местной анестезией 2% раствором лидокаина. Через 2 месяца биоптаты брали из участков, расположенных в непосредственной близости от места первой биопсии. У 6 человек из 15 больных основной группы забор 3-й биопсии проводился через 1 год от начала терапии. В этом случае биопсийный материал брали из имеющихся на момент осмотра очагов поражения.

Биоптаты подвергали стандартной гистологической обработке. Фиксацию биопсийного материала осуществляли в 10% растворе забуференного формалина в течение 12-24 часов при комнатной температуре. После отмывания фиксатора в проточной воде проводилась стандартная гистологическая проводка биоптатов в автоматизированной вакуумной системе обработки тканей Leica ASP300 (Германия) путем обезвоживания в 96% этиловом спирте. Далее кусочки ткани пропитывали парафином, заливали в парафиновые блоки, из которых на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) изготавливали срезы толщиной 5 мкм, растягивали их на предметных стеклах. Для иммуноморфологических исследований использовали предметные стекла с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания). Окраску гематоксилин-эозином проводили в автоматическом устройстве для окрашивания срезов тканей Leica Autostainer XL ST5010 (Германия).

Изучение количества и распределения в структурах кожи основных субпопуляций Т-клеток - CD4+ (Т хелперов/индукторов), CD8+ (цитотоксических Т лимфоцитов) и CD45RO+ (Т-клеток памяти), антигенпрезентирующих клеток (CD1a+ клеток Лангерганса), толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 классов (TLR2, TLR4 и TLR9), молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б проводили непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Для иммунофенотипирования использовали мышиные моноклональные антитела против CD4 (клон 1F6), CD8 (клон 1A5), CD45RO (клон UCHL1), СD1a (клон MTB1), CD54 (клон 23G12) и CD62-Е (клон 16G4) человека производства фирмы Vision biosystems novocastra (Великобритания), кроличьи поликлональные антитела против TLR2 (регистрационный № О60603), TLR4 (регистрационный № О00206), TLR9 (регистрационный № ab53396), ИЛ-1б (регистрационный № Р01583) и ФНО-б (регистрационный № Р01375) человека производства фирмы Abbiotec (США), а также пероксидазную детекционную систему Novocastra Peroxidase Detection System, производства «Leica Microsystems» (Великобритания), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стрептавидин-пероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам.

Высокотемпературная антигенная демаскировка проводилась путем кипячения в цитратном буфере (рН - 6,0) в СВЧ - печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. Остывшие препараты промывали в растворе ТРИС - буфера (рН 7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут при комнатной температуре (23°С), с вторичными антителами - в течение 30 минут в термостате при температуре 37°С. Для завершения окрашивания осуществляли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные гистологические и иммуногистохимические препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа Leica DM4000В (Германия). Всего было изучено 940 препаратов (170 - гистологических и 770 - иммуногистохимических).

Морфометрический анализ проводили с применением компьютерной программы анализа изображения ImageJ. Для этого в каждом срезе цифровой фотокамерой с высоким разрешением Leica DFC320 (Германия) фотографировали по 5 полей зрения в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм, в дерме площадью 0,15 мм², в которых проводили подсчет клеток с положительной реакцией (рис. 1 А, Б), затем рассчитывали среднее значение показателя. Экспрессию толл-подобных рецепторов, молекул адгезии, провоспалительных цитокинов определяли измерением площади эпидермиса и сосудов дермы с положительной реакцией клеток в квадратных микрометрах (мкм²). Содержание толл-подобных рецепторов, молекул адгезии, провоспалительных цитокинов на стенках сосудов выражали в процентах по отношению к общей площади поля зрения (рис. 2 А, Б).

Статистическая обработка данных. Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ STATISTICA 8. Проверка на нормальность распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде медиан, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков (в формате Ме [Q₁чQ₃]). При сравнении показателей до и после лечения внутри групп (анализ признаков в динамике) использовали тест Вилкоксона. При сравнении групп друг с другом по количественным признакам использовали U-тест Манна-Уитни. Оценка корреляционных связей осуществлялась с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при значении уровня достоверности ниже 0,05 (Р < 0,05).



Рисунок 1 Подсчет содержания субпопуляций клеток в эпидермисе (А) и дерме (Б)



Рисунок 2 Измерение площади эпидермиса (А) и сосудов дермы (Б) с положительной экспрессией маркеров

Клиническая характеристика наблюдавшихся пациентов представлена в таблице 2. При анализе данных анамнеза было установлено, что дебют заболевания приходился на возраст от 4 до 65 лет (медиана 22). У 29 человек выявлен отягощенный наследственный анамнез. Начало заболевания у 31 больного было связано со стрессовой ситуацией, у 2 - со злоупотреблением алкоголем, у 1 больной - с наступлением беременности, у 5 - с переохлаждением и перенесенной вирусной респираторной инфекцией. 1 больной отметил, что заболевание у него возникло после пребывания на Чернобыльской АЭС, где он работал в качестве ликвидатора аварии. У 40 больных возможную причину заболевания выявить не удалось.

У 16 больных отмечалась сезонная зависимость: у 12 - обострение заболевания наблюдалось в осенне-зимний период, у 4 - в весенне-летний. У 64 человек наблюдалось внесезонное течение заболевания. Среди сопутствующей патологии следует отметить заболевания сердечно-сосудистой системы (22 человека), желудочно-кишечного тракта (34 человека), мочеполовой системы (4 человека), эндокринной системы (9 человека). У 11 больных наблюдалась железодефицитная анемия.

Вульгарный псориаз диагностирован у 56 (70%) больных, на коже которых имелись распространенные мономорфные папулезные высыпания розового или красного цвета, покрытые рыхлыми серебристо-белыми чешуйками четко отграниченные от здоровой кожи. В результате периферического роста папулы местами сливались в бляшки различных очертаний, диаметром от 5 до 20 см. У 24 (30%) больных была отмечена эритродермия,. При этом патологический процесс локализовался практически на всей поверхности кожного покрова. Кожные покровы были от розовато-красного до ярко-красного цвета, инфильтрированы, с умеренным крупно - и мелкопластинчатым шелушением. У части больных отмечалось увеличение периферических лимфатических узлов.

Величина индекса PASI колебалась от 10 до 65,4 баллов (медиана 35,1 балла). У 46 (57,5%) больных помимо кожного процесса диагностирован псориатический полиартрит с вовлечением в процесс лучезапястных, локтевых, коленных, голеностопных, плюсневых, плюснефаланговых и межфаланговых суставов. У 35 (43,7%) больных были патологические изменения ногтевых пластин в виде их утолщения и деформации, изменения цвета, появления подногтевого гиперкератоза, симптома «наперстка».

Большая часть пациентов ранее неоднократно получала лечение различными методами системной терапии, включая ретиноиды (неотигазон, тигазон), цитостатические препараты (метотрексат, циклоспорин, циклофосфан), фототерапию (общая фотохимиотерапия с пероральным приемом фотосенсибилизатора, локальная фотохимиотерапия, ПУВА-ванны, узкополосная фотохимиотерапия), глюкокортикостероидные препараты для парентерального введения и для наружного применения (дипроспан, преднизолон, кремы и мази, содержащие кортикостероиды).

При сравнении исходных значений клинических показателей в группах больных статистических различий по полу, возрасту, длительности заболевания, а также распространенности высыпаний обнаружено не было (Р>0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Клиническая характеристика больных основной группы и группы сравнения

Клинические показатели	Основная группа (n=38)	Группа сравнения (n=42)	Р
Возраст (лет)	39,5 [33,0ч47,0]	45,0 [37,0ч52,0]	0,184
Пол (муж/жен)	25/13	22/20	0,303
Длительность болезни (лет)	18,0 [11,0ч24,0]	18,0[12,0ч28,0]	0,862
Индекс PASI	35,6 [27,6ч47,6]	35,0 [27,2ч42,6]	0,410

Примечание: пол и возраст указаны в абсолютных частотах, остальные показатели в виде медиан и интерквартильных отрезков. Уровень статистической значимости при сравнении групп по клиническим показателям Р>0,05 (U-тест Манна-Уитни).

Результаты исследования

Результаты гистологического исследования показали характерные для заболевания патологические признаки: акантоз эпидермиса, нарушение дифференцировки кератиноцитов в виде паракератоза, наличие микроабсцессов Мунро внутри паракератотических чешуек, густая периваскулярная инфильтрация в дерме преимущественно из лимфоцитов и гистиоцитов, в биоптатах полученных из очагов пораженной кожи до начала лечения.

Изучение распределения и содержания толл - подобных рецепторов 2, 4 и 9 (TLR2, TLR4 и TLR9), антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (CD1a), распределения провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б, молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, субпопуляций Т-лимфоцитов проводилось до начала лечения у 30 больных псориазом (12 женщин и 18 мужчин) и у 10 здоровых добровольцев. Возраст больных варьировал от 19 до 68 лет, длительность заболевания от 3 до 35 лет. Величина индекса PASI колебалась от 10 до 65,4 баллов. Группы больных и здоровых не отличались по полу и возрасту (соответственно Р = 0,172 и Р = 0,249).

Результаты иммуноморфологического исследования выявили экспрессию толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR4 в базальном и шиповатом слоях эпидермиса в очагах поражения у больных псориазом до начала лечения. В роговом слое и в зонах паракератоза экспрессия толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR4 отсутствовала. В верхних рядах шиповатого слоя эпидермиса было отмечено усиление интенсивности иммуногистохимической окраски. Площадь экспрессии TLR2 и TLR 4 в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 990,2 мкмІ [817,7ч1099,2] и 968,5 мкмІ [750,5ч1093,6] соответственно. В дерме экспрессия TLR2 и TLR 4 наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда воспалительных инфильтратов, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища волосяных фолликулов. Площадь сосудов с положительной экспрессией TLR2 и TLR4 была повышена до 7,1% [5,3ч9,1] и 8,2% [5,7ч10,4] соответственно.

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия TLR2 и TLR4 обнаруживалась в базальном, шиповатом и зернистом слоях эпидермиса, в роговом слое - отсутствовала. Окраска была выражена равномерно, без тенденции к усилению интенсивности в каком-либо слое эпидермиса. Площадь экспрессии TLR2 в эпидермисе у здоровых лиц на отрезке 0,5 мм составляла 213,2 мкмІ [191,3ч223,0], TLR 4 - 217,3 мкмІ [191,5ч222,9]. В дерме у здоровых лиц экспрессия TLR2 и TLR4 отмечалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда, располагающихся вокруг сосудов сосочкового слоя дермы, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища волосяных фолликулов. Площадь сосудов с положительной экспрессией TLR2 и TLR4 у здоровых лиц составила 2,5% [1,9ч3,3] и 2,3% [1,9ч2,4] соответственно.

Реакция с моноклональными антителами к TLR9 была отрицательной в эпидермисе и дерме, как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Для подтверждения полученных результатов была проведена постановка иммуногистохимической реакции с поликлональными антителами к TLR9 в ткани небной миндалины, где положительная экспрессия изучаемого маркера наблюдалась на криптальном эпителии, на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда, инфильтрирующих ткань миндалины.

Другой компонент врожденного иммунитета - клетки Лангерганса (CD1a+) в очагах пораженной кожи больных псориазом обнаруживались в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, имели тело и несколько четко выраженных отростков, контактирующих с прилегающими кератиноцитами. В дерме клетки Лангерганса присутствовали в составе периваскулярных инфильтратов и не имели четко выраженной отросчатой формы. Количество клеток Лангерганса у больных псориазом было статистически достоверно выше по сравнению с показателями здоровых лиц, как в эпидермисе, так и в дерме, и составляло 30,2 [25,6ч37,0]/0,5 мм и 40,3[27,2ч47,6]/0,15 мм² соответственно. У здоровых лиц клетки Лангерганса локализовались в эпидермисе на уровне базального слоя, имели отросчатую форму. В дерме обнаруживались единичные клетки Лангерганса, располагающиеся вокруг сосудов сосочкового слоя, не имеющие отростков. Их количество в эпидермисе здоровых составило 12,5 [11,4ч14,0]/0,5 мм, в дерме 6,2 [4,6ч8,0]/0,15 мм².

Таким образом, в коже больных псориазом происходит повышение экспрессии толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR4 (табл. 3) и увеличение числа антигенпрезентирующих клеток - клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета.

Статистически значимое повышение содержания клеток Лангерганса (CD1a+) в эпидермисе и дерме больных псориазом наряду с повышенным количеством толл-подобных рецепторов 2 и 4 свидетельствует об их активации для процессинга и готовности к миграции в регионарные лимфатические узлы для презентации Т-лимфоцитам пока еще неустановленного антигена. В дальнейшем это приводит к развитию иммунного воспаления.

Полученные результаты позволяют полагать, что отсутствие экспрессии толл-подобного рецептора 9 (TLR9), ответственного за распознавание вирусных частиц, у здоровых лиц и больных псориазом свидетельствует о том, что данный рецептор, вероятно, имеет меньшую значимость для инициации иммунных реакций в коже, в отличие от других тканей.

Таблица 3

Содержание толл-подобных рецепторов и клеток Лангерганса в пораженной коже больных псориазом и у здоровых добровольцев

показатель	больные псориазом (n=30)	здоровые добровольцы (n=10)	Р1
TLR2 Э 3 (мкм2)	990,2 [817,7ч1099,2]2	213,2[191,3ч223,0]	< 0,001
TLR2 Д 4 (%)	7,1 [5,3ч9,1]	2,5 [1,9ч3,3]	< 0,001
TLR4 Э (мкм2)	968,5 [750,5ч1093,6]	217,3 [191,5ч222,9]	< 0,001
TLR4 Д (%)	8,2 [5,7ч10,4]	2,3 [1,9ч2,4]	< 0,001
CD1a+ Э (абс. к-во/0,5мм)	30,2 [25,6ч37,0]	12,5 [11,4ч14,0]	< 0,001
CD1a+ Д (абс. к-во/0,15мм2)	40,3 [27,2ч47,6]	6,2 [4,6ч8,0]	< 0,001

Примечание:

¹Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

² медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков

³Э - эпидермис, ⁴Д - дерма.

Экспрессия провоспалительного цитокина ИЛ-1б в пораженной коже больных псориазом выявлялась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, в шиповатом слое была выражена наиболее интенсивно, отсутствовала в паракератотическом и роговом слоях. Площадь экспрессии ИЛ-1б в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 957,5 мкмІ [821,6ч1084,5] (Р<0,001).

В дерме экспрессия ИЛ-1б наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания ИЛ-1б в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых обнаруживалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией ИЛ-1б до 8,5% [6,1ч10,7] (Р<0,001) (табл. 4).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ИЛ-1б в эпидермисе была выражена очень слабо, на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения.

Таблица 4

Содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б в пораженной коже больных псориазом и у здоровых лиц

показатель	больные псориазом (n=30)	здоровые добровольцы (n=10)	Р1
ИЛ-1б Э 3 (мкм2)	957,5 [821,6ч1084,5]	0	< 0,001
ИЛ-1б Д 4 (%)	8,5 [6,1ч10,7]	0	< 0,001
ФНО-б Э (мкм2)	0	0	-
ФНО-б Д (%)	0	0	-

Примечание:

¹Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

² медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков

³Э - эпидермис, ⁴Д - дерма

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1б и повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (TLR2 и TLR4) в эпидермисе и дерме (табл. 5).

Реакция с моноклональными антителами к ФНО-б была расценена нами как отрицательная в эпидермисе и дерме как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Для подтверждения полученных результатов была проведена постановка иммуногистохимической реакции с поликлональными антителами к ФНО-б в образцах ткани низкодифференцированного рака толстой кишки (аутопсийный материал), где положительная очаговая экспрессия исследуемого маркера наблюдалась в опухолевых клетках, а также в клетках инфильтрата соединительнотканной стромы.

Таблица 5

Уровни коэффициента ранговой корреляции Спирмена при проведении корреляционного анализа

показатели	ИЛ-1б Э	ИЛ-1б Д
TLR2 Э	r = 0,86	r = 0,66
TLR2 Д	r = 0,59	r = 0,78
TLR4 Э	r = 0,92	r = 0,62
TLR4 Д	r = 0,64	r = 0,78

Примечание: во всех случаях уровень статистической значимости Р0,05, ¹Э - эпидермис, ²Д - дерма

Полученные результаты выявили следующие особенности экспрессии провоспалительных цитокинов ИЛ-1б и ФНО-б в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления в очагах пораженной кожи установлено увеличение экспрессии ИЛ-1б, в то время как признаков экспрессии ФНО-б не было обнаружено. Полученные результаты можно объяснить возможностью депонирования ИЛ-1б в коже и локальным функционированием ФНО-б в низких концентрациях, не определяющихся иммуногистохимическим методом.

Таким образом, кератиноциты и клетки воспалительного инфильтрата, эндотелии кровеносных сосудов дермы у больных псориазом находятся в активированном состоянии, доказательством чего является значительное увеличение экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1б на этих участках.

Экспрессия молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в биоптатах, полученных из очагов поражения больных псориазом, наблюдалась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, отсутствовала в паракератотическом и роговом слоях. Площадь экспрессии молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 968,9 мкмІ [853,1ч1073,1] (Р<0,001).

В дерме экспрессия ICAM-1 была обнаружена на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания ICAM-1 в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых выявлялась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией ICAM-1 до 8,1% [6,1ч10,6] (Р<0,001) (табл. 6).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ICAM-1 в эпидермисе и на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись лишь единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения.

Экспрессия молекулы Е-селектина в эпидермисе у больных псориазом до начала лечения отсутствовала. В дерме экспрессия молекулы Е-селектин наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Для оценки содержания молекулы Е-селектин в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых наблюдалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией Е-селектина до 8,5 % [6,5ч10,2] (Р<0,001).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия Е-селектина в эпидермисе отсутствовала. В дерме у здоровых лиц экспрессия Е-селектина наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Содержание сосудов с положительной экспрессией Е-селектина у здоровых лиц составило в среднем 2,4 % [1,9ч3,2] (табл. 6).

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в эпидермисе и дерме больных псориазом (r = 0,66; Р< 0,05). Повышение площади экспрессии Е-селектина в дерме коррелировало с увеличением площади экспрессии ICAM-1 в эпидермисе (r = 0,65; Р< 0,05) и в дерме (r = 0,93; Р< 0,05). Кроме того, повышение экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина было связано с повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (TLR2 и TLR4) и провоспалительного цитокина ИЛ-1б в эпидермисе и дерме (табл. 7). Это свидетельствует о взаимосвязанности процессов, направленных на подготовку клеток кожи к приему лимфоцитов из циркуляции.

Таблица 6

Содержание молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина в пораженной коже больных псориазом и у здоровых лиц

показатель	больные псориазом (n=30)	здоровые добровольцы (n=10)	Р1
ICAM-1 Э 3 (мкм2)	968,9 [853,1ч1073,1]2	0	< 0,001
ICAM-1 Д 4 (%)	8,1 [6,1ч10,6]	0	< 0,001
E-селектин Э(мкм2)	0	0	-
E-селектин Д (%)	8,5 [6,5ч10,2]	2,4 [1,9ч 3,2]	< 0,001

Примечание:

¹Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

² медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков

³Э - эпидермис, ⁴Д - дерма

Таблица 7

Уровни коэффициента ранговой корреляции Спирмена при проведении корреляционного анализа

показатели	ICAM-1Э1	ICAM-1Д2	Е-селектин Д
TLR2 Э	r = 0,88	r = 0,68	r = 0,69
TLR2 Д	r = 0,55	r = 0,75	r = 0,74
TLR4 Э	r = 0,92	r = 0,63	r = 0,64
TLR4 Д	r = 0,72	r = 0,82	r = 0,82
ИЛ-1б Э	r = 0,93	r = 0,55	r = 0,58
ИЛ-1б Д	r = 0,61	r = 0,94	r = 0,88

Примечание: во всех случаях уровень статистической значимости Р0,05,

¹Э - эпидермис, ²Д - дерма

Участие молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина в миграции Т-лимфоцитов в очаг воспаления является известным фактом. Результаты иммуноморфологических исследований показали увеличение экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и Е-селектина в коже больных псориазом, что необходимо для осуществления контакта клеток иммунной системы, дермы и эпидермиса в условиях развития воспаления. Отсутствие молекулы ICAM-1 в коже у здоровых лиц свидетельствует о том, что необходимость её экспрессии возникает лишь при формировании воспалительного процесса. Наличие экспрессии Е-селектина на эндотелии у здоровых лиц показывает участие данной молекулы в физиологических функциях кожи.

...