Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни

03.02.07. - Генетика

Ушачев Дмитрий Владимирович

Белгород - 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Полоников Алексей Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович

доктор медицинских наук, профессор Прощаев Кирилл Иванович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 22 декабря 2011 г. в 15.00 на заседании диссертационного совета Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Белгородского государственного университета по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85.

Автореферат разослан «_____» _____________ 2011 г.

Ученый секретарь

совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

доктор биологических наук В.И. Кочкаров

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Гипертоническая болезнь (ГБ) в настоящее время признана пандемией, определяющей большую часть заболеваемости в большинстве стран мира [Гогин Е. Е., 2003]. По данным обследования, проведенного в рамках целевой Федеральной программы «Профилактика и лечение АГ в Российской Федерации», распространённость АГ среди населения нашей страны составляет 39,5%. По данным обследования репрезентативной выборки, стандартизированной по возрасту, распространённость АГ в России составляет среди мужчин 37,2%, а среди женщин - 40,4% [Шальнова С.А. и др., 2006]. Общеизвестно, что артериальная гипертензия (АГ) является важнейшим фактором риска распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - острого инфаркта миокарда (ОИМ) и мозгового инсульта (МИ) [Гринштейн А. В., 2002], которые определяют высокую смертность населения во всем мире. Существует прямая связь между уровнем артериального давления (АД) и риском развития инсульта [В.И.Скворцова, 2006]. Кроме того, ГБ способствует развитию атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС), лежит в основе развития хронической сердечной недостаточности [Ланг Г.Ф., 1950; Мясников А. Л., 1965; Чазов Е. И., 1997]. У больных ГБ часто прослеживается отягощенный семейный анамнез по ССЗ, в том числе и АГ, тем самым, демонстрируя важную роль наследственных факторов в её развитии [Гинтер Е.К., 2003]. Значительную роль генетических факторов в развитии ГБ продемонстрирован и близнецовыми исследованиями [Шарандак А.П. и др., 2002].

Согласно современным представлениям, ГБ имеет многофакторную или мультифакториальную природу и относится к полигенным заболеваниям. К настоящему времени установлены уже сотни генов-кандидатов предрасположенности к ГБ, установлены многочисленные средовые факторы риска заболевания и описаны ранее неизвестные стороны его патогенеза [Бойцов, С. А. и др., 2003; Гуревич, М. А., 2009; Денисова Т.П., 2005; Елисеев А.О., 1987; Казеннов, А.М., 1990; Логинов В.А., 1990; Casari G. et al., 1995; Chowdhary S. et al., 2001; Corvol P., 2001; Siffert W. et al., 1998]. Однако, несмотря на прогресс молекулярной генетики, по-прежнему, в мировом научно-медицинском сообществе отсутствует единое мнение о ведущих патогенетических механизмах, лежащих в основе стойкого хронического повышения уровня артериального давления.

Одной из подробно изученных и обоснованных является “мембранная концепция” этиопатогенеза ГБ, в основе которого лежат структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток, приводящие к нарушению трансмембранного транспорта катионов, контролирующих сосудистый тонус. “Мембранная концепция” этиопатогенеза ГБ, основные положения которой были исследованы учеными Ю.В. Постновым и С.Н. Орловым и обобщены в известной монографии [Постнов Ю.В.; Орлов С.Н., 1987], оказалась способной объяснить многие противоречия различных точек зрения на молекулярные механизмы развития заболевания. За период с середины 70-х годов прошлого века до конца первого десятилетия 21 века проведено значительное количество исследований по изучению природы ионтранспортных нарушений при ГБ. В частности, была установлена взаимосвязь количественного содержания белков мембран эритроцитов с подверженностью гипертонической болезни [Емельянова О.Г., 1999]. Кроме того, был установлен значительный вклад генетических факторов в вариабельность белков клеточных мембран эритроцитов при ГБ [Емельянова О.Г., 1999; Ivanov V.P. et al., 2004]. Однако геномный источник “мембранных нарушений”, по-прежнему, не установлен. Считается маловероятным, что при ГБ нарушения в геноме относятся к участкам, кодирующим структуру таких различных белковых молекул, как Na⁺/Na⁺- и Na⁺/K⁺-переносчики, переносчики Са^2+-АТФаза, а также мембранных белков, вовлеченных в регуляцию катион-транспортных процессов через плазматические мембраны [Котелевцев Ю.В., Постнов Ю.В., 1986].

Учитывая вышеизложенное, наиболее целесообразной является интегрированная оценка молекулярно-генетических и биохимических исследований, направленных на поиск и установление взаимосвязей между ДНК-полиморфизмом конкретных генов предрасположенности к ГБ и изменчивостью содержания белков мембран эритроцитов. Однако до настоящего времени исследований, направленных на оценку вклада известных генов-кандидатов ССЗ в вариабельность количественного содержания основных белков мембран эритроцитов, не проводилось.

Цель исследования

Изучение вклада полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний AGT, AGTR1, ACE, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 в фенотипическую изменчивость количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Задачи исследования

1) Исследовать количественное содержание и характер взаимного варьирования основных мембранных белков эритроцитов в норме и при гипертонической болезни и установить факторы, определяющие совместное варьирование данного комплекса количественных признаков.

2) Проанализировать особенности количественного содержания белков мембран эритроцитов в зависимости от пола и наличия наследственной отягощенности по ГБ.

3) Изучить популяционные частоты полиморфизмов T174M и M235T гена AGT, 1166A/C гена AGTR1, I/D гена ACE, A4582C гена MLR, E298D и -786T/C гена NOS3, G272S и C825T гена GNB3, G460W гена ADD1 и R25P гена TGFB1 и исследовать их ассоциации с гипертонической болезнью.

4) Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, ACE, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 и их парных сочетаний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

5) Оценить влияние полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, ACE, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на вариабельность содержания основных мембранных белков эритроцитов и установить вклад исследуемых полиморфных генов в общую фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию количественных показателей.

6) Оценить совместное влияние основных мембранных белков эритроцитов и ДНК-полиморфизмов на риск возникновения ГБ и исследовать предиктивный потенциал исследуемых биохимических и молекулярно-генетических маркеров в отношении прогнозирования риска развития болезни.

Научная новизна исследования

В рамках исследования впервые проведен комплексный анализ влияния полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний AGT, AGTR1, ACE, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на фенотипическую вариабельность количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Оценена степень вклада аллелей генов-кандидатов ССЗ в фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию мембранных белков эритроцитов при ГБ. Установлено, что исследованные гены объясняют значительную часть фенотипической изменчивости мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Впервые показано, что существенная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, отражающих фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов. Впервые выявлен половой диморфизм, проявляющийся не только в особенностях количественного содержания мембранных белков у мужчин и женщин, страдающих ГБ, но и значительные различия в характере генетической детерминации фенотипической изменчивости исследуемых показателей у представителей разного пола. Полученные в ходе настоящей работы результаты позволили глубже взглянуть на молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе мембранных нарушений при ГБ, и расширяют возможности доклинической оценки риска развития заболевания.

Научно-практическая значимость исследования

В связи с тем, что исследованные белки мембран эритроцитов и полиморфные гены оказались ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин, их совместная оценка с помощью разработанных статистических моделей может использоваться для прогнозирования вероятности развития болезни, как во врачебной, так и в эпидемиологической практике при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ. В этой связи результаты исследования могут быть востребованы при организации мероприятий по раннему выявлению и профилактике гипертонической болезни в популяции. Практическое использование статистических моделей дает возможность врачам-генетикам, терапевтам и кардиологам формировать группу повышенного риска ГБ, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, что может способствовать снижению риска формирования ГБ в популяции. Результаты, полученные в ходе исследования, не только формируют представления о роли полиморфизма генов ССЗ в детерминации изменений количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ, но и создают теоретическую основу для их внедрения в образовательный процесс. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Значительная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, которые могут отражать фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов, один из которых определяет почти 20% основного вектора количественных изменений белков эритроцитарных мембран при заболевании - снижение уровня и в спектринов и повышение содержания глюкозного транспортера.

2. Фенотипические эффекты аллелей исследованных полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в отношении изменчивости уровня основных мембранных белков эритроцитов модифицируются вследствие возможных аддитивных и эпистатических взаимодействий между исследованными локусами, а также различий в величинах их пенетрантности, и характеризуются неодинаковыми проявлениями у представителей разного пола.

3. Исследованные полиморфные варианты генов в совокупности вносили существенный вклад в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ: величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков достигала 64% (для глюкозного транспортера) у мужчин и 50% (для -спектрина) у женщин, свидетельствуя о значимой роли известных кандидатных генов ССЗ в детерминации количественного дисбаланса мембранных белков эритроцитов, обнаруженных при заболевании.

4. Исследованные полиморфные гены и белки мембран эритроцитов являются ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин и могут использоваться в качестве генетических и биохимических маркеров прогнозирования вероятности развития болезни при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационного исследования доложены на итоговых научных сессиях КГМУ и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2006, 2007, 2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (2008), 2-ом съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007), международной (российско-японо-американской) научно-практической конференции «Современные технологии и общая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Хабаровск, 2007), 1-й и 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием ”Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии” (Курск, 2006, 2011), VI съезде "Российского общества медицинских генетиков" (Ростов, 2010) и ежегодной научной конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011).

По материалы диссертации опубликовано 11 печатных работ, в т. ч. 5 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 рисунками, содержит 9 приложений. Список литературы включает 253 источников: 88 отечественных и 165 зарубежных.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужила популяционная выборка неродственных индивидов русской национальности, жителей Курской области, общей численностью 751 человек (371 мужчина и 380 женщин), из которых 235 пациентам с ГБ и 207 человек контрольной группы проводились молекулярно-генетические исследования. Биохимические исследования белков мембран эритроцитов проводились у всех пациентов. Диагноз ГБ подтверждался по критериям ВОЗ согласно рекомендациям ВНОК после исключения вторичных артериальных гипертензий (АГ) [Оганов Р.Г., Мамедов М.Н., 2008]. Критерием включения индивидов в контрольную группу были: систолическое АД 130 мм.рт.ст., диастолическое АД 85 мм.рт.ст. при двух повторных измерениях, отсутствие стойких хронических заболеваний по данным субъективного обследования. Средний возраст больных ГБ (67 мужчин, 168 женщин) составил 47,8±9,6 лет, здоровых индивидов (75 мужчин, 132 женщин) - 45,9±11,2 лет. Группы больных ГБ и контроля были сопоставимы, как по полу, так и по возрасту (р0.05).

Программа обследования включала в себя анкетирование по специально разработанным анкетам, включающим данные семейного анамнеза, общеклинического, лабораторно-инструментального обследований. Для проведения молекулярно-генетических и биохимических исследований у всех обследуемых проводился забор венозной крови.

Выделение и отмывка мембран эритроцитов из цельной венозной крови получали традиционным методом Beutler [Beutler, E., 1985] и Dodge [Dodge, G.T. 1963]. Фракционирование мембранных белков эритроцитов проводилось с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli [Laemmli U.K, 1970] с незначительной модификацией.

Выделение геномной ДНК осуществляли из венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции [Маниатис Т. с соавт., 1984]. Пациентам проводилось генотипирование полиморфизмов генов-кандидатов CCЗ: G460W гена ADD1, G272S и C825T гена GNB3, E298D и -786T гена NOS3, T174M и M235T гена AGT, 1166AC гена AGTR1, I/D гена ACE, A4582C гена MLR и R25P гена TGF1) методами полимеpазной цепной pеакции (ПЦР) и рестрикционного анализа по методикам, опубликованным в литературе.

Для оценки характера взаимного варьирования количественного содержания белков мембран эритроцитов использовались методы многомерной статистики: корреляционный и кластерный анализ. Для выделения интегральных факторов, обусловливающих общую изменчивость мембранных белков эритроцитов, использовали метод главных компонент [Ким Дж.О. и др., 1989]. Генетический анализ количественных признаков включал изучение их ассоциаций с аллельными вариантами генов-кандидатов CCЗ, оценку средних эффектов аллелей в детерминации показателей, а также доли общей фенотипической и полигенной дисперсии, объясненной вариацией по исследованным локусам [Sing C., Davignon J., 1985]. Взаимосвязь между мембранными белками эритроцитов и молекулярно-генетическими маркерами изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа, в рамках которого сравнивали средние значения количественных показателей в группах с разными генотипами и их парными сочетаниями. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных ГБ и контрольной группе использовали критерий ² Пирсона [Вейр Б., 1995].

Для сравнения частот аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий ² с поправкой Йетса [Реброва О.Ю., 2003]. Метод бинарной логистической регрессии использовался для разработки прогностических статистических моделей для предсказания риска развития ГБ [Hosmer D.W. et al, 2000].

Проверку распределений количественных признаков на нормальность проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Значения уровня значимости p?0,05 рассматривались как статистически значимые. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 8.0 (StatSoft) и MS Excel 2007.

Результаты собственных исследований

Общая характеристика и вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у человека в норме и при гипертонической болезни

В таблице 1 представлен сравнительный анализ количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных ГБ и контроля. Установлены статистически значимые различия между группами в количественном содержании 6 мембранных белков. Так, у больных ГБ, в сравнении с контрольной группой, установлено сниженный уровень -спектрина (t=4,32 p=0,00002), -спектрина (t=3,87 p=0,0001) и белка 6 (t=1,92 p=0,05), а также повышенный уровень белка 4.1 (t=1,98 p=0,05), белка 4.5 (t=3,44 p=0,001) и актина (t=2,47 p=0,01). Кроме того, между группами больных ГБ и контроля имели место различия в дисперсиях по анкирину 2.1, белку 3, паллидину, белку 4.5 и белку 6. Результаты сравнительного анализа количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля в зависимости от пола представлены в таблице 2 (представлены только статистически значимые различия между группами).

Таблица 1

Сравнительный анализ количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля

Таблица 2

Статистически значимые различия в количественном содержании мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля в зависимости от пола

Было установлено, что у мужчин, страдающих ГБ, уровень -спектрина (t=3,88, p=0,0002) был ниже, а белка полосы 4.5 (t=2,47 p=0,01) был выше, в сравнении с группой здоровых мужчин. У женщин, страдающих ГБ, уровни -спектрина (t=2,39 p=0,02), -спектрина (t=3,40 p=0,001), дематина (t=2,00 p=0,05) и белка полосы 6 (t=2,10 p=0,04), были ниже, а белка 4.5 (t=2,42 p=0,02) и актина (t=2,46 p=0,01) было выше, чем у женщин контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о значительной роли полового диморфизма в детерминации количественных изменений в содержании отдельных белков мембран эритроцитов при гипертонической болезни и обосновывает необходимость проведения дальнейших этапов статистического анализа раздельно у мужчин и женщин.

В рамках настоящей работы представлялось важным исследовать влияние наследственной отягощенности (НО) по гипертонической болезни на количественную представительность мембранных белков эритроцитов. Результаты сравнительного анализа количественного содержания мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля в связи с наследственной отягощенностью по ГБ представлены в таблице 3. Сравнительный анализ у лиц без наследственной отягощенности по ГБ позволил выявить статистически значимые различия между группами по 3 мембранным белкам эритроцитов: у гипертоников уровень -спектрина (t=2,80 p=0,01) был снижен в сравнении с контрольной группой, а количественное содержание белка полосы 4,5 (t=2,01 p=0,05) и тропомиозина (t=2,14 p=0,03) было повышено. У лиц с отягощенным семейным анамнезом по ГБ наблюдались различия по 6 мембранным белкам. Так, у больных ГБ количественное содержание -спектрина (t=2,46 p=0,01), -спектрина (t=2,85 p=0,005) и белка полосы 6 (t=2,88 p=0,005) было снижено, в то же время, количественное содержание белков анкирина 2.2 (t=2,31 p=0,02), анкирина 2.3 (t=2,39 p=0,02) и белка полосы 4,5 (t=1,94 p=0,05) было повышено у больных ГБ в сравнении с контрольной группой. Таким образом, наследственная отягощенность по ГБ характеризуется более глубокими изменениями количественного содержания белков мембран эритроцитов у больных ГБ.

Таблица 3

Статистически значимые различия в количественном содержании мембранных белков эритроцитов в группах больных гипертонической болезнью и контроля с отягощенностью семейного анамнеза по ГБ

С помощью факторного анализа, выполненного методом главных компонент, было установлено, что значительная доля совместного варьирования количественных характеристик мембранных белков эритроцитов (72,4% у мужчин и 71,0% у женщин) обусловлена взаимодействием пяти факторов (таблица 4). При этом структура главных компонент существенно отличалась у мужчин и женщин. В первый из 5 факторов у мужчин вошло 10 мембранных белков: 3 фракции анкиринов, аниотранспортный белок полосы 3, белок 4,1 и паллидин с большими отрицательными нагрузками, а также цитоскелетные белки актин и тропомиозин и ферменты ГАФД (белок 6) и GST (белок 8) с положительными нагрузками. Первый фактор у мужчин определял 27% изменчивости комплекса указанных выше мембранных белков эритроцитов. В первый из 5 факторов у женщин вошло 6 мембранных белков: 3 фракции анкиринов с большими отрицательными нагрузками, тропомиозин и ферменты ГАФД и GST с положительными нагрузками, аналогично обнаруженным у мужчин. Первый фактор у женщин определял около 24% изменчивости комплекса указанных выше мембранных белков эритроцитов. Структура второй главной компоненты практически не отличалась у мужчин и женщин. В данную компоненту у мужчин и женщин вошли с высокими отрицательными весами спектрины, а также с положительными нагрузками - белки 4,1 и 4,5. Примечательно, что данные мембранные белки характеризовались наибольшими отклонениями в их количественном содержании при ГБ. Второй фактор определял около 18% изменчивости комплекса указанных мембранных белков эритроцитов. Структура третьей ГК была представлена исключительно белками цитоскелета эритроцитов и принципиально отличалась у мужчин и женщин. Так, у мужчин третья компонента была обусловлена -спектрином и актином с отрицательными нагрузками, а также анкирин 2.3, дематином и тропомиозином с положительными весами. У женщин основной вклад в третью ГК с отрицательным знаком внесли тропомиозин и белок полосы 8, а также с высокой положительной нагрузкой - белок актин. В четвертую ГК у мужчин вошли с положительными весами паллидин, актин и белок полосы 6, у женщин - паллидин и дематин, но с отрицательными нагрузками. В структуру пятой ГК у мужчин вошли с отрицательными весами белок п. 4.1 и дематин, с положительной нагрузкой - 2.2 анкирин. У женщин в пятую ГК с высокой положительной нагрузкой вносил анионтранспортный белок (белок полосы 3).

Таблица 4

Факторные нагрузки количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ и характеристика главных компонент

Серые ячейки - выделены значения нагрузок более 0,400 - принятый в исследовании критерий для включения признака в интерпретацию ГК

Анализ взаимосвязи полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни

Частоты аллелей полиморфизмов изученных генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний представлены в таблице 5.

Таблица 5

Частоты аллелей полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в исследованных группах

При сравнении общих групп нами были выявлены статистически значимые различия между группами больных ГБ и контроля по двум полиморфизмам генов-кандидатов. Сравнительный анализ частот генотипов между контрольной группой и группой больных ГБ мужчин позволил установить, что генотип 235TT гена AGT ассоциируется с повышенным риском развития ГБ у мужчин (OR=2,33; 95%CI 1,06-5,12; p=0,03). Кроме того, носительство вариантных генотипов 460GW+460WW ассоциировалось с повышенным риском развития ГБ у мужчин (OR=1,99; 95%CI 0,97-4,06; p=0,057). Генотип 1166AC гена AGTR1 ассоциировался с повышенным риском возникновения ГБ у женщин (OR=1,66; 95%CI 1,02-2,69; p=0,04). Таким образом, наблюдался отчетливый половой диморфизм в ассоциациях генов-кандидатов CCЗ c риском развития ГБ: у мужчин специфичность ассоциаций с предрасположенностью к ГБ проявлялась в отношении полиморфизмов G460W гена ADD1 и M235T гена AGT, тогда как у женщин половой диморфизм характеризовался ассоциациями генотипа 1166A/C гена AGTR1.

Расчет эффектов аллелей генов-кандидатов ССЗ на количественные характеристики мембранных белков эритроцитов показал, что практически все исследованные нами гены в той или иной степени влияют на варьирование данных биохимических показателей. Однако в большинстве случаев эффекты аллелей анализируемых генов для количественных показателей мембранных белков эритроцитов были относительно невысокими, о чем свидетельствовала степень отклонения величин признаков в группах носителей определенного аллеля от среднего в популяции значения. Практически во всех случаях имели место различающиеся влияния аллелей на вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у мужчин и женщин. В качестве примера можно привести расчеты средних эффектов аллелей полиморфизмов генов ADD1 и NOS3 на вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ (рисунок 1). Наиболее выраженные эффекты вариантного аллеля 460W гена ADD1 установлены в отношении изменчивости количественного содержания спектринов, анкирина 2.1, белка п. 4.5, дематина и белка п. 8 у мужчин и спектринов, анкирина 2.2, белка п. 3, белка п. 4.5, актина, дематина и белка п. 8 у женщин. Обнаружены также различия в направленности эффектов аллеля 460W гена ADD1 в отношении отдельных мембранных белков эритроцитов между мужчинами и женщинами: аллель 460G у мужчин повышала, а аллель 460W понижала количественное содержание спектринов от среднепопуляционного значения, в то время как у женщин аллель 460W усиливала фенотипическое выражение признака, а аллель 460G ослабляла. Разнонаправленность влияния аллельных вариантов полиморфизма G460W гена ADD1 обнаружена также в отношении вариабельности белка п. 4.5 (глюкозный транспортер). Так, аллель 460W у мужчин повышала, а аллель 460G понижала количественное содержание белка п. 4.5 от среднепопуляционного значения, в то время как у женщин аллель 460W ослабляла фенотипическое выражение признака, а аллель 460G усиливала. Наиболее выраженные эффекты аллелей полиморфизма E298D гена NOS3 установлены в отношении изменчивости количественного содержания в-спектрина, анкирина 2.1, белка п. 3, белка п. 4.5, актина, белков полос 6 (ГАФД) и 7 (тропомиозин) у мужчин, спектринов и белка п. 4.5 у женщин. У мужчин аллель 298E повышала количественное содержание -спектрина относительно его среднепопуляционного значения, в то время как аллель 298D практически нейтрален в отношении фенотипического эффекта на выражение данного показателя. У женщин аллель 298E снижала, а аллель 298D повышала количественное содержание обеих субъединиц спектринов. Кроме того, у мужчин оба аллельных варианта 298E и 298D гена NOS3 снижали количественное содержание глюкозного транспортера; у женщин аллель 298E усиливала, аллель 298D ослабляла фенотипическое выражение данного признака. У мужчин аллели 298E и 298D повышали количественное содержание анионтранспортного белка п. 3, а у женщин такие эффекты отмечены не были. Разнонаправленные эффекты аллелей 298E и 298D наблюдались у мужчин в отношении вариабельности актина, глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы и тропомиозина. У женщин, за исключением спектринов и белка п. 4.5, аллельные варианты 298E и 298D гена NOS3 не оказывали ощутимого влияния на количественное содержание белков мембран эритроцитов у больных ГБ.

мембранный эритроцит гипертонический болезнь

Таким образом, было установлено, что полиморфные варианты генов-кандидатов ССЗ оказывали плейотропное влияние на количественное содержание мембранных белков эритроцитов у больных ГБ. Причем степень и направленность фенотипических аллелей генов ССЗ в отношении вариабельности количественного содержания мембранных белков эритроцитов у больных ГБ была неодинаковой у мужчин и женщин.

Анализ ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с мембранными белками эритроцитов c помощью дисперсионного анализа

C помощью одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (таблицы 6 и 7) выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний практически со всеми мембранными белками эритроцитов у представителей различного пола. Для оценки степени полученных взаимосвязей полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их сочетаний с количественной вариабельностью мембранных белков эритроцитов использовали коэффициент детерминации R², величина которого варьировала от 9,7% до 26,1% у мужчин и от 5,8% до 10,7% у женщин. В ряде случаев полученные ассоциации можно интерпретировать исходя из эффекта ”доминирования” одного из аллелей полиморфизма. Интересным является тот факт, что в парных сочетаниях полиморфизмы влияли на количественное содержание мембранных белков эритроцитов, с которыми они не были связаны по отдельности. В то же время, в некоторых случаях эффект одного полиморфизма в сочетании с другим локусом нивелировался (феномен эпистаза). По всей видимости, эти особенности можно объяснить суммацией эффектов отдельных полиморфных генов: совпадение направлений действия аллельных вариантов усиливала их влияние на признак, разнонаправленность - нивелировала. Другими словами, фенотипические эффекты аллелей различных полиморфных генов в отношении вариабельности изучаемых количественных признаков могут варьировать по причине эпистатических взаимодействий между локусами и/или различий в величинах их пенетрантности.

Вклад каждого из исследованных парных сочетаний полиморфных вариантов генов-кандидатов ССЗ в вариабельность количественного содержания белков мембран эритроцитов был неодинаков: для одних полиморфизмов установлено наибольшее число ассоциация с изучаемыми количественными признаками, для других - специфические ассоциации с определенными мембранными белками. Как видно из представленных в таблицах 6 и 7 данных, вклад парных сочетаний полиморфных генов-кандидатов ССЗ в вариабельность мембранных белков эритроцитов у мужчин превышал таковой у женщин, как по числу, так и по выраженности. Полученные данные свидетельствовали о достоверном, но сравнительно небольшом вкладе отдельных полиморфных вариантов генов-кандидатов

Таблица 6

Ассоциации полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с количественными характеристиками белков мембран эритроцитов у мужчин больных гипертонической болезнью (p?0.05)

Таблица 7

Ассоциации полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ и их парных сочетаний с количественными характеристиками белков мембран эритроцитов у женщин больных гипертонич...