Роль клеток крови в связи между толерантностью к тромбину, содержанием в кровотоке продуктов взаимодействия тромбин-фибриноген и липидпероксидацией

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

РОЛЬ КЛЕТОК КРОВИ В СВЯЗИ МЕЖДУ ТОЛЕРАНТНОСТЬЮ К ТРОМБИНУ, СОДЕРЖАНИЕМ В КРОВОТОКЕ ПРОДУКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРОМБИН-ФИБРИНОГЕН И ЛИПИДПЕРОКСИДАЦИЕЙ

03.00.04 - Биохимия

Алборов Робинзон Григорьевич

Тюмень - 2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования "Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Научный консультант:

доктор медицинских наук профессор Бышевский Анатолий Шулимович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Соловьев Владимир Георгиевич;

доктор медицинских наук профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич;

доктор медицинских наук профессор Камилов Феликс Хусеинович.

Ведущее учреждение: Государственное учреждение Гематологический научный центр РАМН (г. Москва).

Защита состоится 23 июня 2006 г. В 9 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 при Тюменском государственном университете по адресу: 625003, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Тюменского государственного университета.

Автореферат разослан "____"______________2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор Е.А. Чирятьев.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность выбранного направления исследований определяется, участием клеток крови в функционировании системы гемостаза, хотя и до настоящего времени один из его компонентов чаще называют тромбоцитарным, а не клеточным [Кудряшов, 1975; Э.С. Габриелян, С.Э. Акопов, 1985; В.П. Балуда и др., 1995; А.Л. Папаян, 2003; В.Ф. Киричук и др., 2005; Gaertner, 1960; Ratnoff, 1991; McKenzie, 1999]. Это связано с преимущественным (в сравнении с другими клетками) вкладом тромбоцитов в сохранение жидкого состояния крови и в её свертывание [Баркаган, 1998; Д.М. Зубаиров, 1978; 2000; А.С. Шитикова, 2000; А.Д. Макацария, 2000; Sims, Wiedmer, 1991; Gawaz, 2001]. В действительности же, все виды клеток крови и эндотелиоциты, соприкасающиеся с ней, участвуют в процессах сохранения жидкого состояния крови, в тромбиногенезе, следовательно, и в фибринообразовании, и в ликвидации его последствий.

Несколько десятилетий назад известные на тот период данные о роли клеток крови в гемостазе подверглись анализу в ряде фундаментальных работ [Германов, О.Н. Пиксанов, 1964; Б.И. Кузник, В.П. Скипетров, 1974; И.Н. Ашкинази, 1977; А.А. Маркосян, 1970; Н.Н. Петрищев, 1994: А.С. Шитикова, 2000; Perlick E., 1959; Gaertner, 1960; Gawaz, 2001]. Однако и до настоящего времени представления о взаимодействии клеток крови в процессах гемостаза окончательно не сформированы, хотя посвященных этой проблеме работ в периодике немало. Есть данные, свидетельствующие о кооперации между тромбоцитами и другими клетками крови. Показано, что эритроциты и разные формы лейкоцитов могут опосредованно, а не только путем высвобождения прокоагулянтов, антикоагулянтов и фибринолитических агентов, участвовать в регуляции гемостаза:

- при некоторых заболеваниях одновременно увеличивается агрегационная активность эритроцитов и тромбоцитов [Иванов и др., 1984; Г.Я. Левин, С.Б. Кораблев, 1984; З.С. Баркаган, 1978; 2000];

- все виды клеток крови служат источником коагулоактивных фрагментов клеточных мембран [Зубаиров и др., 1984; О.А. Терсенов 1984; А.Ш. Бышевский и др., 1987, 1993, 2004, 2006];

- АДФ, высвобождаемая эритроцитами при высоких скоростях сдвига, влияет на агрегацию тромбоцитов в кровотоке [Preston, 1988; Gawaz, 2001];

- выделяемая нейтрофилами сериновая протеаза усиливает агрегацию тромбоцитов [Selac e. a. 1988];

- лейкоциты концентрационнозависимо изменяют интенсивность высвобождения -тромбоглобулина тромбоцитами [Pietersz e. a., 1988; Gawaz, 2001];

- протеазы лейкоцитов влияют на мембранные рецепторы тромбоцитов, изменяя их активность [Meyer e. a., 1993].

- тромбоцитарный простагландин Е ₁ влияет на продукцию супероксида нейтрофилами [Umeki, 1994];

- фосфолипаза А ₂ мембран клеток крови ускоряет образование эндоперекисей в тромбоцитах, являясь инициатором "кислородного взрыва" в нейтрофилах [Кучник и др., 1994];

- клетки крови вовлекаются во взаимную адгезию, в частности, интегрины тромбоцитов обеспечивают их адгезию к нейтрофилам [Spangenberg e. a., 1992];

- взаимодействие нейтрофилов и моноцитов, эритроцитов и нейтрофилов выявляется и в культурах [Адаменко, 1993; В.Ф. Кузнецов, Т.П. Обернебесова, 1994];

- стимулированные лейкоциты интенсивно синтезируют фактор активации тромбоцитов [Naraba e. a., 1993];

- эластаза из нейтрофилов после обработки колониестимулирующим фактором, разрушает гликопротеид Ib тромбоцитов [Aziz e. a., 1993].

Это лишь частные примеры кооперативных отношений между клетками крови.

Немногочисленные исследования, посвященные взаимосвязи между липидпероксидацией (ЛПО) в клетках крови и их прокоагулянтной активностью, появились лишь в последние годы. Их результаты позволяют полагать, что процессы ЛПО, тесно сопряженные с состоянием гемостаза [Филатова, 1996; А.Ш. Бышевский и др. 1998, 2005], реализуют свое влияние на тромбиногенез через воздействие на клетки крови, в частности, на тромбоциты [Селиванова, 1994; И.В. Ральченко, 1998; Н.Б. Баклаева, 2005]. Об этом же свидетельствует и то, что введение антиоксидантов ограничивает агрегацию тромбоцитов при разных патологических состояниях [Бышевский и др., 1994; Т.П. Шевлюкова, 1995; М.К. Умутбаева, 2004, 2005], а также данные о корреляции между ЛПО и гемостазом [Галян, 1993; В.А. Полякова, 1994; И.Е. Городничева, 2003; И.А. Карпова, 2003; М.К. Умутбаева, 2005,].

Отсутствуют сведения о зависимости между содержанием в кровотоке продуктов взаимодействия тромбин-фибриноген (ВТФ) и интенсивностью непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК). Вместе с тем, наличие маркеров ВТФ в плазме - следствие (и признак) НВСК, интенсивность которого отражает степень напряженности в системе гемостаза. Нет также сведений о зависимости между толерантностью к тромбину и интенсивностью ЛПО, о влиянии клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) на содержание продуктов ВТФ, следовательно, и о вкладе клеток крови в поддержании НВСК, протекающего непрерывно с малой интенсивностью. Не изучена зависимость НВСК от процессов ЛПО в клетках крови. В то же время связь между коагуляционной активностью клеток крови и интенсивностью ВТФ в кровотоке, контролируемую по содержанию маркеров этого взаимодействия, вполне реальна. Об этом косвенно свидетельствуют сообщения исследователей, которые отстаивают представление о непрерывном функционировании системы свертывания крови [Зубаиров, 1978, 2000; Д.М. Зубаиров и др., 1989; А.Ш. Бышевский, 1984; А.Ш. Бышевский и др., 1990; И.Н. Бокарев, 2000, 2002; Zwaal, 1982; Zwaal e.a., 1992].

Интерес к оценке интенсивности НВСК, протекающего в условиях физиологической нормы с малой интенсивностью [Зубаиров, 1978, 2000; А.Ш. Бышевский и др., 1990, 2003, 2006], обусловлен тем, что при экстремальных воздействиях сдвиги уровня маркеров НВСК указывают на наклонность к гипер- или гипокоагуляции [Момот, 1990; Т.А. Батрак, 1999; И.Н. Бокарев, 2000 а, б, в, 2002; М.К. Умутбаева, 2003, 2005]. Не известно, однако, как соотносятся уровень маркеров ВТФ и толерантность к гипертромбинемии и интенсивность ЛПО в клетках крови с их коагуляционной активностью.

Эти обстоятельства обратили внимание гемостазиологов на изучение роли клеток крови в обеспечении связи между взаимодействием тромбина с фибриногеном с одной стороны, и ЛПО - с другой. Можно надеяться, что факты, полученные при изучении проблемы, позволят углубить представления о механизмах взаимосвязи ЛПО-гемостаз, и, возможно, явятся основой для разработки методов направленного воздействия на интенсивность ВТФ, путем модификации ЛПО в клетках крови.

Цель исследования. Выявить, есть ли связь между содержанием маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген в кровотоке и толерантностью к тромбину, существует ли зависимость между интенсивностью липидпероксидации в тромбоцитах, эритроцитах, лейкоцитах и содержанием маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген, как показателя интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови.

Задачи исследования:

1. Разработать способ количественной оценки толерантности к тромбину;

2. Изучить экспериментально сдвиги толерантности к тромбину при воздействиях, повышающих или снижающих содержание в кровотоке маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген;

3. Изучить у экспериментальных животных изменения интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови в зависимости от коагуляционной активности тромбоцитов на фоне угнетения и активации липидпероксидации и антиоксидантного потенциала, вызываемых введением антиоксиданта или прооксиданта;

4. Изучить последовательность появления сдвигов ЛПО и АОП, активности тромбоцитов и уровня маркеров НВСК при первичной активации или угнетении свободнорадикальных процессов;

5. Изучить у экспериментальных животных динамику развития изменений ЛПО и АОП в эритроцитах, нейтрофилах и моноцитах, сопоставить её с динамикой изменений интенсивности НВСК;

6. Изучить влияние инфузии эритроцитов и лейкоцитов, полученных у животных, которым предварительно вводили про- или антиоксиданты, на интенсивность ЛПО, АОП и НВСК у крыс, не подвергавшимся таким воздействиям;

7. Изучить состояние ЛПО и АОП в клетках крови больных аденомой предстательной железы до и после операции, и у больных с инсулинзависимым сахарным диабетом - заболеваниями, отличающимися по патогенезу, но сходными в том, что им сопутствуют сдвиги ЛПО и АОП, а также гемостатические нарушения.

Научная новизна. Разработан и испытан в разных экспериментальных ситуациях способ определения толерантности к тромбину у лабораторных животных, который позволяет количественно оценивать эффект различных воздействий на этот интегральный показатель состояния гемостаза в небольших группах животных.

Впервые выявлена и статистически подтверждена зависимость между уровнем маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантностью к тромбину.

Количественно охарактеризована способность эритроцитов, нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов ускорять агрегацию тромбоцитов и реакцию высвобождения тромбоцитами фф. Р₃ и Р₄.

Подтверждено ранее не применявшимися приёмами, что по способности активировать липидпероксидацию, агрегацию и общую коагуляционную активность тромбоцитов клетки крови располагаются по убывающей: моноциты > эритроциты > нейтрофилы. Показано, что степень влияния этих клеток на тромбоциты зависит от интенсивности перекисного окисления липидов в них - она повышается после введения прооксиданта и снижается после введения витаминов-антиоксидантов или синтетического антиоксиданта димефосфона.

Впервые установлено, что в условиях экзогенной гипертромбинемии, наряду с развитием вторичной гипокоагулемии (гипокоагулемии потребления), увеличивается (пропорционально приросту содержания продуктов ЛПО) в эритроцитах и в лейкоцитах их способность активировать тромбоциты. При повышении антиоксидантного потенциала влияние гипертромбинемии на способность эритроцитов и лейкоцитов к агрегации и реакции высвобождения снижается.

Практическая ценность работы:

1. Разработан способ определения толерантности животных к тромбину (патент № 2219546, приоритет от 04.05.2000, регистрация в Госреестре изобретений РФ 20.12.2003), который позволяет на малой группе животных количественно оценить влияние какого-либо воздействия на "готовность" организма к ускоренному тромбинообразованию.

2. Полученные нами данные, наряду с данными Московской государственной академии физической культуры, НИИ онкологии (М.), научно-производственного объединения "Витамины" (М.), Читинской Госмедакадемии) использованы при составлении инструкции по клиническому испытанию Селмевита к "Заявке в Фармакологический Комитет МЗ РФ" (1999), при написании монографий "Биохимические сдвиги и их оценка в диагностике патологических состояний" (М.: Медицинская книга, 2002), "Связь гемостаза с перекисным окислением липидов". М.: Медицинская книга, 2003), "Антиоксиданты в коррекции гемокоагуляционных сдвигов" (М.: Медицинская книга. - 2004).

3. На основе полученных нами данных и с нашим участием подготовлены и изданы методические рекомендации для врачей-акушеров и гинекологов: "Профилактика тромбогеморрагических осложнений в родах и послеродовом периоде" (Минздравмедпром, ТГМА, Городская клиническая больница г. Тюмень № 3. - 1997), "Антиоксидантная терапия при гестозах" (Минздравмедпром, ТГМА, Городская клиническая больница г. Тюмень № 3. - 1997).

4. Результаты работы внедрены в работу ряда клинических учреждений г. Тюмени и Тюменского региона.

Положения, выносимые на защиту:

1. Определение степени снижения фибриногенемии при дозированном внутривенном введении тромбина позволяет в опытах с малым числом животных (крыс) количественно оценить толерантность к тромбину. Полученные при этом данные согласуются с результатами способа-аналога, основанного на учете частоты выживания животных после введения тромбина в кровоток, и способа-прототипа, основанного на определении десяти показателей состояния гемостаза. Недостаток способа-аналога - невысокая специфичность и необходимость в большом количестве животных (от 50 в группе), способа прототипа - значительный расход реагентов и препаратов, длительность определений и качественная форма выражения результатов - "толерантность выше" или "толерантность ниже", чем в контроле.

2. Величины толерантности к тромбину, установленные предложенным способом в разных экспериментальных ситуациях, находятся в обратной зависимости от плазменного содержания маркеров НВСК, и, следовательно, изменения их содержания отражают степень "готовности" организма к ответу на ускорение или замедление тромбообразования в кровотоке.

3. Ускорение ЛПО под влиянием разных по механизму действия прооксидантов увеличивает коагуляционную активность тромбоцитов, ускоряет НВСК и снижает толерантность к тромбину; торможение ЛПО антиоксидантами вызывает сдвиги противоположной направленности; последовательность изменений такова: сдвиги ЛПО и АОП в тромбоцитах предшествуют изменениям их коагуляционной активности, которые, в свою очередь, предшествуют изменениям интенсивности НВСК.

4. Изменения ЛПО и АОП в тромбоцитах при воздействии про- и антиоксидантов, выявляются одновременно в моноцитах, нейтрофилах и эритроцитах. Инфузия тромбоцитов, моноцитов, нейтрофилов или эритроцитов здоровым животным ускоряет НВСК и снижает толерантность к тромбину, особенно, если доноры клеток получали прооксидант, и в меньшей мере, если доноры получали антиоксидант. Инфузия моноцитов, нейтрофилов или эритроцитов, особенно от доноров, получавших прооксидант, усиливает сдвиги НВСК, вызываемые инфузией тромбоцитов.

5. У лиц с патогенетически разными заболеваниями, сопровождающимися гипероксидацией и гемостатическими сдвигами (в наших наблююдениях - аденома предстательной железы и инсулинзависимый сахарный диабет), повышено содержание липидпероксидов в тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и эритроцитах, ускорено НВСК. Эти изменения ослабляются при обычном лечении и, особенно при дополнении лечения комплексом витаминов-антиоксидантов.

Апробация и публикация. Результаты работы опубликованы:

1. В медико-биологических журналах - 33 статьи (из них 19 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций);

2. Монографии 2 - "Связь гемостаза с перекисным окислением липидов" (М.: Медицинская книга, 2003. - 68 с и "Антиоксиданты в коррекции гемокоагуляционных сдвигов" (М.: Медицинская книга, 2004. - 80 с);

3. Главы в монографиях - 12;

4. В материалах Всероссийских (3), Международных (5) и зарубежных (3) конференций.

Доложены: на конференции молодых ученых и студентов стран СНГ (Полтава, 1992); научн. конференциях Объединения биохимиков Урала и Западной Сибири (Тюмень, 1992, Оренбург, 2003, Самара, 2005); Международных симпозиумах "Физиология и патология гемостаза" (Симферополь-Полтава, 1994) и "Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях" (Тюмень, 1995); Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995); 9-й Европейской конференции "Вопросы гемореологии" (Сиена, 1995); 5-й Всероссийской конференции "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения" (М., 2000); 6-й национальной конференции "Атеротромбоз артериальная гипертензия" (М., 2001); Сессии Всероссийской ассоциации тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. Шмидта-Кудряшова с международным участием (М., 2003); конф. "Актуальные вопросы экспресс-диагностики в хирургии" (М., РНЦХ РАМН, 2003); конференциях РАЕ "Фундаментальные и прикладные исследования в медицине" (Афины, 2003) и конференции "Гомеостаз и эндоэкология" (Хургада, 2004); IX международном конгрессе по клинической биохимии (Бангкок, 2004); 14 Международном конгрессе Дунайской лиги по борьбе с тромбозами и нарушениями гемостаза (Санкт-Петербург, 2004); на ежегодных международных симпозиумах "Медицина и охрана здоровья населения" (Тюмень, 1997-2005), на заседании Тюменского отделения ВБО (Тюмень, 2005), заседании Тюменского регионального отделения РАЕ (Тюмень, 2006).

Подготовлены и тиражированы (совместно с сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии ТГМА и практическими врачами Областной клинической больницы) методические рекомендации: 1. Коррекция витаминами-антиоксидантами нарушений гемостаза при лапароскопических операциях на придатках матки - Тюмень, 2004 (соавт. В.А. Полякова, А.Ш. Бышевский, Е.А. Винокурова и др.; 2. Коррекция гемостазиологических показателей и нарушений липидного обмена у пациентов с ИЗСД и диабетической нефропатией антиоксидантом "Компливит" и пищевым маслом "Эйконол" - Тюмень, 2001. (соавт. И.В. Ральченко, Е.В. Платонов, А.В. Волков и др.); 3. Профилактика витаминами-антиоксидантами тромбогеморрагических осложнений при консервативной миомэктомии лапароскопическим доступом. - Тюмень. - 2004 (соавт. В.А. Полякова, А.Ш. Бышевский, Е.А. Винокурова и др.).

Зарегистрированы рационализаторские предложения:

1. Способ профилактики гемостазиологических сдвигов при лапароскопических операциях на матке селмевитом / Удостов. ТГМА на рацпредложение № 6 от 17.09. 2004 (соавт. В.А. Полякова, А.Ш. Бышевский, М..К. Умутбаева и др.

2. Способ профилактики гемостазиологических сдвигов при обширных операциях на матке селмевитом / Удостов. ТГМА на рацпредложение № 5 от 17.09. 2004 г (соавт. В.А. Полякова, А.Ш. Бышевский, М.К. Умутбаева и др.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах, содержит 37 таблиц и 20 рисунков, включает введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы, методы и результаты), обсуждение и заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы (474 публикации: 195 отечественных и 279 зарубежных).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная часть работы выполнена на нелинейных белых крысах (997 особей, 17517 г и 200±15 г). Выбор животных связан с тем, что 1) для крыс известна суточная потребность в витаминах, применявшихся нами в качестве природных антиоксидантов, 2) что эффекторы агрегации тромбоцитов часто испытывали на крысах и установили значения DI₅₀ для них, 3) что в прошлом работы по изучению гемостаза под влиянием разнообразных воздействий выполнены преимущественно на этих животных. Важно и то, что у крыс несложно брать пробы крови из v. jugularis (в шприц со стабилизатором) в количестве (40 мл/кг массы тела), достаточном для определения комплекса показателей без нарушения требований гемостазиологии [Балуда и др., 1980, 1995; З.С. Баркаган, 1998].

Принимая во внимание сезонные сдвиги гемостаза и его зависимость от метеофакторов [Бышевский, В.Н. Кожевников, 1986; В.П. Балуда и др., 1995], в эксперимент всегда включали контрольную группу, кроме серий с малыми интервалами между опытами. Кровь брали в шприц из обнаженной v. jugularis у наркотизированных (диэтиловый эфир) крыс. Стабилизатор - 3,8 % раствор цитрата натрия (1:9). Рану закрывали кожным швом.

Экзогенную гипертромбинемию вызывали внутривенным введением раствора тромбина (1 мл/кг), активность которого по времени свертывания 0,2 % раствора фибриногена составляла 25 с. Толерантность к тромбину оценивали по изменению уровня остаточного фибриногена плазмы, осаждаемого тромбином (метод разработан в процессе исследований и описан ниже).

Для выделения клеток крови объединяли кровь 4-х крыс обследуемой группы: у одной особи брали 4 мл крови, стабилизируя ее раствором гепарина (0,1 мл на 1 мл крови, концентрация гепарина - 5 000 ед./мл).

Для оценки состояния гемостаза определяли тесты и продукты, содержание которых в плазме позволяет судить об общей свертывающей активности крови, интенсивности НВСК и коагуляционной активности тромбоцитов:

1. Активированное время рекальцификации /АВР/ [Детинкина и др. 1984];

2. Активированное частичное тромбопластиновое время /АЧТВ/ [Детинкина и др. 1984]).

3. Содержание продуктов деградации фибрина /ПДФ/ - маркера коагуляционной активности (или компенсаторной активации фибринолиза, связанного с усиленной фибринацией) [Рудницкая, 2003; Kobayashi e.a,, 1987; Wada e.a., 1994]. Использовали модификацию А.Ш. Бышевского и др. [1991].

4. Содержание D-димеров (маркеров коагуляционной активности или компенсаторного фибринолиза [Н.К Зяблицкая, 2003; Е.Г. Соболева и др. 2003; de Moerloose, Boehlen, 2003]) определяли методом, основанным на латексной агглютинации с моноклональными (по отношению к D-димерам) антителами (набор "D-dimer test", Roche). Результат выражали в мкг/мл эквивалентов фибриногена.

5. Содержание РФМК, также являющееся показателем НВСК [Ветриле и др. 2003; Wada e.a., 1994, 1996, 2003], определяли с помощью количественного варианта фенантролинового теста [Момот и др., 1999].

6. Концентрацию в плазме осаждаемого тромбином фибриногена, снижение которой в присутствии других признаков активации свертывания, свидетельствует об ускорении НВСК [Wada e.a., 2003], определяли спектрофотометрически [Бышевский, В. Мохнатов, 1969].

7. Количество тромбоцитов определяли в периферической крови [Баркаган, А.П Момот 1998]- их ускоренное потребление позволяет судить об активации гемостаза [Баркаган, 1988; Wada e.a., 2003]).

8. Агрегацию тромбоцитов определяли на агрегометре "Биола", индуктор агрегации - АДФ, конечная концентрация 0,01 мг/мл [З.А Габбасов и др., 1989 а, б].

9. Спонтанную агрегацию определяли по Н.И. Тарасовой [Балуда и др., 1980]. Концентрацию тромбоцитов в плазме приводили к 250-500 тыс. клеток в мкл (диапазон, корректный для работы на агрегометре), разбавляя нормальную исследуемую плазму гомологичной (1:2), предварительно обедненной тромбоцитами плазмой.

10. Содержание ф. Р ₃ в плазме определяли по разнице показателей АВР плазмы до и после освобождения её от тромбоцитов (по Rabiner & Groder в описании [Балуда и др. 1980]).

11.Содержание ф. Р ₄ в плазме определяли по действию прогретой и обедненной тромбоцитами плазмы (источник термостабильного ф. Р ₄) на тромбин-гепариновое время свертывания плазмы (источник фибриногена и антитромбина III). Степень укорочения времени свертывания - мера активности ф. Р 4 [Балуда и др., 1980].

12 Общую коагулирующую активность тромбоцитов (ОКАТ) определяли по их способности изменять время свертывания при добавлении в плазму, используемую для теста АВР [Бышевский и др., 1996].

Для оценки ЛПО и АОП определяли: содержание первичных и вторичных липидпероксидов (ДК и ТБК-продуктов соответственно), период индукции (ПИ) и скорость окисления (СО). Липиды экстрагировали 100-кратным избытком смеси равных объемов гептана и изопропилового спирта. Содержание ДК устанавливали по оптической плотности ( = 232 нм) гептановой фазы. Содержание продуктов ЛПО, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), определяли в том же экстракте флуорометрически [Ушкалова и др., 1987, 1997]. Интенсивность флуоресценции возбуждения оценивали с помощью флуориметра "Биан 130".

В экстрактах определяли также кинетические величины прямого инициированного окисления липидов молекулярным О₂ в присутствии инициатора свободнорадикального окисления (динитрилазобисизомаслянная кислота). Величины ПИ выражали как время, затрачиваемое на поглощение исследуемой пробой 25 мм³ О₂, а СО - углом наклона линейного участка кинетической кривой [Ельдецова, 1990].

Выделяли и отмывали тромбоциты для опытов in vitro и для определения ЛПО согласно описанию [Самаль и др., 1990]. Цельные эритроциты для опытов in vitro и для исследования в них ЛПО выделяли и отмывали по И.Я. Ашкинази [1977].

Нейтрофилы и моноциты выделяли в градиенте плотности, создаваемом с помощью фиколла и верографина.

Из 9 % раствора фиколла и 50 % раствора верографина составляли ряд смесей:

А - 15,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность - 1,14 г/мл)

Б - 17,5 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,13 г/мл)

В - 20,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,12 г/мл)

Г - 24,0 мл фиколла + 10 мл гипака (плотность 1,06 г/мл).

Затем составляли градиент плотности в центрифужной пробирке, внося последовательно по 2 мл смесей Г, В, Б и А и помещая на верхний слой (смесь А) 2 мл гепаринизированной плазмы, разбавленной буферным раствором Михаэлиса, к которому заранее добавляли 0.14 М раствор NaCl в соотношении 1:2. Далее центрифугировали 40 мин с ускорением 1 000 g при 22С; после центрифугирования снимали плазму, оставляя слой примерно в 2 мм, который собирали отдельно и использовали (см. ниже) для выделения моноцитов (степень чистоты - 97-99 % при соотношении 1:2).

С помощью остроконечной пипетки отсасывали слой между столбиками Г и В - это нейтрофилы (чистота 94-99 %); отбрасывали содержащий эозинофилы слой (между столбиками, приготовленными из смесей А и Б). Отделенные фракции клеток осаждали центрифугированием, приливали к осадку 0,14 М раствор NaCl и повторно осаждали центрифугированием, повторяя отмывание дважды.

Фракцию лимфоциты+моноциты (?1:2) выделяли в градиенте фиколл/триомбраст (смесь А - 10 объемов 34 % раствора триомбраста плотностью 1,075 г/мл при 22С и 24 объема 9 % раствора фиколла; смесь В - 10 объемов 34 % раствора триомбраста плотностью 1,097 г/мл при 22С и 24 объема 14,6 % раствора фиколла).

Градиент в центрифужной пробирке составляли из 5 мл смеси В и 5 мл смеси А, наслаивали 10 мл гепаринизированной крови, разведенной 1:2, и фракцию лимфоциты/моноциты, полученную ранее. После центрифугирования (40 мин, 400 g, 22С) собирали легкую фракцию, соотношение лимфоциты/моноциты (66 % - лимфоциты и 32 % - моноциты). Примесь гранулоцитов составляла 1,2 %, т.е. примерно как и в других работах [Pandolfi e. a., 1981].

Разделяли лимфоциты и моноциты изокинетическим методом [Ross, 1979]: для формирования градиента плотности раствор перколла плотностью 1,060 г/мл в среде, освобожденной от ионов кальция и магния, центрифугировали при 26?000 g 1 ч; на градиент наслаивали 3,0 мл суспензии моноциты+лимфоциты, содержащую 15 тыс. клеток в мкл, центрифугировали 5 мин при 400 g, затем отсасывали легкую фракцию (степень чистоты моноцитов - 91 %).

При оценке АДФ-агрегации экспозиция клеток с плазмой длилась 30 мин. Для получения сопоставимых данных в пробу плазмы, объемом в 2 мл всегда вносили клетки, взятые из постоянного объема плазмы (0.2 мл). Следовательно, определяя значения ПИ или содержание ДК, ТБК-продуктов и других показателей, характеризующих состояние исследуемых клеток у контрольных и подопытных групп, мы получали сопоставимые величины.

Дозы и путь введения антиоксидантов и прооксидантов. Как активаторы ЛПО использовали ацетат свинца, этинилэстрадиол, тироксин, как ингибиторы - селмевит или димефосфон. Крысы получали суточную дозу одного из этих соединений или их комбинаций в составе рациона вязкой консистенции (каша из смеси овсяной и ячменной круп), в суточной порции которого равномерно распределяли вводимые вещества из расчета на 1 кг массы тела.

Ацетат свинца водили по 50 или 100 мг на 1 кг массы тела. В этих дозах ацетат свинца активирует ЛПО и снижает АОП к 10-15-му дням [Ельдецова, 1990; А.А. Мкртумян, 1994; В.Г. Соловьев, 1997]. Относительно малый эффект объясняется тем, что всасывается лишь около 5 % добавленного к рациону ацетата свинца [Данные ВОЗ: Свинец, 1980].

Этинилэстрадиол вводили в дозе 4.0 мкг/кг. По экспериментальным данным у крыс эта доза заметно влияет на ЛПО [Шабанов, 2000, П.Я. Шаповалов, 2000]. В пересчете на массу тела эта доза больше противозачаточной [Куземин, 1998; В.А. Полякова и др., 1999] в составе низкодозированных контрацептивов. Однако эффективные дозы биологически активных соединений в пересчете на массу тела всегда выше у животных с меньшей массой.

Тироксин усиливает ЛПО мембранных липидов [Wong, Hochstein, 1981], активирует фосфолипазу митохондрий, что ускоряет пероксидацию в мембранах [Marzoev e.a., 1983, 1985]. Растет скорость ЛПО и у лиц с гипертиреозом [Dumitriu e.a., 1988; Landriscina e.a., 1988].

В качестве антиоксидантов использовали:

Селмевит - комплекс витаминов с минеральными веществами (в одной таблетке содержатся: ретинола ацетат - 0,0005, токоферола ацетат - 0,0075, тиамина бромид - 0,00075, пиридоксина гидрохлорид - 0,0025, рибофлавин - 0,001, аскорбиновая к-та - 0,035, рутин - 0,0125, никотинамид - 0,004, пантотенат кальция - 0,0025, фолиевая кислота - 0,0005, липоевая кислота - 0,001 г; цианкобаламин - 3 мкг, железо двухвалентное - 0,0025, медь двухвалентная - 0,0004, кальций - 0,025, кобальт двухвалентный - 0,0005, марганец, цинк, магний и селен, двухвалентные соответственно 0,00125, 0,002, 0,025 и 0,025 г, фосфор пятивалентный - 0,03 и метионин - 0,1 г). Препарату свойственна высокая антиоксидантная активность, обусловленная присутствием "ловушек" свободных радикалов (витамины А, Е, Р и РР), протекторов HS-групп (липоевая кислота, витамин С) и компонента ферментов антиоксидантной защиты (селен) [Удалов и др., 1997, 2000; А.Ш. Бышевский и др., 2003-2005]. Антиоксидантные свойства селмевита подтверждены экспериментально [Галян, 1993; А.М. Мкртумян, 1994; А.Ш. Бышевский 1995, 1999; В.С. Соловьев, 1997] и клинически - в урологии [Шафер и др., 1989; Э.Н. Согрин, 2005], травматологии [Умутбаева, 2005], акушерстве и гинекологии [Полякова, 1994; А.В. Соловьева, 1999; Е.А. Винокурова, 1999; И.А. Карпова, 2003; Н.Б. Баклаева, 2005] и в эндокринологии [Попова, 1999; Г.А. Сулкарнаева, 2004 г].

Димефосфон (1,1-диметил-3-оксибутирилфосфоновая кислота) - антиоксидантные свойства обусловлены синергическим влиянием на эффекты присутствующих в организме антиоксидантов. Использовали препарат, чтобы исключить возможность эффектов, связанных со специфическими свойствами витаминов, и ещё потому, что димефосфон у здоровых не влияет на гемостаз [Галян, 1993; А.М. Мкртумян, 1994; В.Г. Соловьев, 1997;]. В дозе 1-3 г/кг димефосфон повышает у животных АОП [Ельдецова, 1990; М.К. Умутбаева, 2003, 2004].

В опытах на животных использовали димефосфон в дозе, однократное введение которой тормозит агрегацию примерно на 50 %. Такая степень сдвига оставляет место для выявления эффекта антиоксидантов на клетки крови, в том числе, и эффекта совместного действия антиоксидантов и антиагрегантов.

Каждому эксперименту сопутствовала контрольная группа (группа, не подвергавшаяся воздействиям или не получавшая добавок в составе рациона).

Данные, характеризующие обследованных нами больных, приведены в соответствующих разделах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка способа определения толерантности к тромбину. Определение толерантности животных к тромбину с помощью одного из известных способов [Кудряшов, 1960; Л.В. Михайлова, 1970] требует большого количества крыс (не менее 50 в контрольной и столько же в подопытной группе) для оценки влияния одного вида воздействий или одной дозы какого-либо соединения. Сущность этого способа-аналога в том, что после изучаемого воздействия животным инъецируют в яремную вену тромбин, устанавливая частоту гибели (или выживания) за 24 ч. Недостатки приёма: 1) необходимость использовать около 100 особей (по 50 в контроле и опыте) для оценки влияния одного вида воздействия на толерантность к тромбину, 2) длительность наблюдений (до 24 ч), 3) невысокая специфичность (часть животных гибнет в первый час после инъекции тромбина, часть же - в течение суток в связи с вторичными изменениями, вызываемыми тромбозами). Другой способ оценки толерантности к тромбину [Каптюх, 1970], рассматривавшийся нами как прототип, основан на том, что после изучаемого воздействия животным контрольной и подопытной групп вводят раствор тромбина, а через 0.5 ч в пробах крови определяют 10 показателей (время рекальцификации, толерантность к гепарину, его уровень, антитромбиновую активность, уровень антитромбина III, антифибринолитическую активность и активность фибринолиза и антиплазмина, протромбиновое время, потребление протромбина). Сопоставляя изменения величин в контроле и опыте, выявляют, отличаются ли при исследуемом воздействии сдвиги каждого из 10 перечисленных показателей, и на этом основании судят о толерантности к тромбину, выражая её изменения качественно - "толерантность выше или ниже, чем в контроле". Недостатками этого приёма мы сочли: 1) неспецифичность определявшихся показателей [Балуда и др., 1995; З.С. Баркаган, 1998]; 2) трудоёмкость, длительность определений и математической обработки (при оценке воздействия одного фактора на толерантность требуется 2 группы животных по 5-7 особей, т.е. не менее 24 ч на определение фибринолиза, и около 3-4 ч на статистический анализ результатов - всего около 28 ч); 3) неоднозначность ответа, так как одни из показателей могут уменьшаться, другие увеличиваться; 4) качественный характер ответа: "толерантность уменьшилась или возросла".

В основу разрабатывавшегося нами способа, который позволил бы сопоставлять влияние на толерантность к тромбину различных воздействий (при небольшом числе подопытных животных и малых сроках наблюдения), взята оценка изменения фибриногенемии после внутривенной инъекции тромбина интактным и подвергшихся изучаемым воздействиям животных. Схема эксперимента, проведенного нами для оценки возможностей предполагаемого способа, такова:

1. Раствор тромбина (1 мл/кг массы тела, активность 24 с по времени свертывания 0.2 % раствора фибриногена) вводили в яремную вену фиксированной на станке крысы после её пробуждения от наркоза. При введении более активного тромбина (17 с) в той же дозе обычно гибнет 40-50 % крыс [Михайлова, 1970; С.Л. Галян, 1993], поэтому для получения достоверных данных требуется около 50 особей в группе;

2. Пробы крови брали через 30 мин (0.9 мл в шприц, содержащий 0.1 мл 3.8 % раствора трехзамещенного цитрата натрия);

3. В плазме крови определяли содержание коагулируемого тромбином фибриногена, предполагая, что сдвиг фибриногенемии может служить мерой толерантности организма к тромбину.

При позитивном результате опытов разрабатываемый приём отличался бы от прототипа меньшим числом определений (1 вместо 10), меньшим числом реагентов и препаратов, сокращением длительности определения, большей специфичностью.

Специфичность результатов в варианте, разрабатываемом нами, обусловлена тем, что: 1) фибриноген - основной субстрат тромбина в процессах свертывания [Зубаиров, 1978, 2000; А.Ш. Бышевский и др., 1991; В.П. Балуда, 1995; З.С. Баркаган, 1998]; 2) изменения уровня реагирующего на тромбин фибриногена при экзогенной гипертромбинемии зависят от эффективности работы всех систем, обеспечивающих выживание организма при ускоренном тромбинообразовании [Кудряшов, 1975; З.С. Баркаган, 1988; В.П. Балуда и др., 1995; Д.М. Зубаиров, 1978, 2000].

Для расчета результата использовали формулу, учитывающую концентрацию фибриногена (%) в плазме крови крыс, которым тромбин не вводили (исходный уровень), и уровень фибриногена после введения тромбина (остаточная концентрация):

D = {1- [(Ск - Со): Ск]} х 100

где D - остаточная концентрация фибриногена, %; Ск - концентрация у крыс, которым тромбин не вводили и другим воздействиям не подвергали (исходный уровень); Со - концентрация фибриногена у крыс, которым ввели тромбин на фоне изучающегося воздействия или без него (остаточная концентрация).

Значение остаточной концентрации у крыс, которым тромбин ввели без предварительных воздействий, принимали за 100-процентную толерантность к тромбину, и устанавливали степень изменения (в %) толерантности при изучаемом воздействии по формуле:

Х % = (Do: Dк)х 100,

где X - толерантность к тромбину в %, Do - остаточная концентрация фибриногена (в %) у группы, подвергавшейся изучаемому воздействию, Dк - остаточная концентрация фибриногена (в %) у группы, не подвергавшейся изучаемому воздействию (контрольная группа).

Такой приём позволяет выяснить, влияет ли изучаемое воздействие на толерантность к тромбину (следовательно, и на предрасположенность к тромбообразованию) в эксперименте, используя в опытах с интактными, контрольными и подопытными группами 15-18 животных вместо 150 как это требуется при оценке частоты гибели (или частоты выживания).

Для проверки высказанных предположений провели эксперимент по схеме, приведенной ниже. Партию крыс (17015 г) разделили на 3 группы - контроль, опыт I, опыт II. Крысам контрольной группы (7 особей, не подвергавшихся воздействиям) вводили 0.14 М раствор NaСl, крысам опыта I (32 особи) вводили раствор тромбина (1 мл/кг, активность - 25 с по времени свертывания 0.2 % раствора фибриногена), крысам опыта II (32 особи) предварительно с рационом ввели ацетилсалициловую кислоту (50 мг/кг за 1 сут до тромбина), крысам опыта III вводили тироксин (25.0 мг/кг в течение трёх дней, предшествующих введению тромбина). Через 0.5 ч после инъекции тромбина у 7 крыс каждой группы брали пробы для определения фибриногена в плазме, а в подопытных группах, кроме того, в течение 24 ч учитывали число выживших. Группы с введением ацетилсалициловой кислоты или тироксина взяты в связи со следующим. Ацетилсалициловая кислота (ингибитор превращений арахидоновой кислоты в биомембранах), ослабляет выход тромбоксанов, следовательно, тормозит агрегацию тромбоцитов, что снижает "готовность" крови к свертыванию. Тироксин активирует гемостаз (повышение уровня маркеров НВСК), следовательно, обладает противоположным действием [Дементьева, 1998; А.И. Волков, 2001; М.К. Умутбаева, 2003, 2005].

Содержание фибриногена определяли, осаждая его тромбином (0.1 мл к 0.1 мл плазмы, экспозиция при 37^о С, 10 мин). Сгусток фибрина промывали 0.14 М раствором NaCl, осушивали фильтровальной бумагой, растворяли в 1 мл 0.5 М раствора NaOH при 60оС, охлаждали и определяли оптическую плотность раствора (л 280 нм). Содержание фибриногена находили по калибровочной кривой, построенной с растворами фибриногена заданных концентраций.

1. У крыс контрольной группы до введения тромбина концентрация фибриногена составила 2.20.04 г/л;

2.. У крыс, которым ввели тромбин без предварительного воздействия, - 0.930.03 г/л;

3. У крыс, получивших ацетилсалицилат, - 1.780.02 г/л;

4. У крыс, получавших тироксин, - 0.310.005 г/л.

Остаточная концентрация фибриногена

D = 1- { [(Ск - Со): Ск]х 100},

оказалась равной: у крыс контрольной группы - 43.0±1.2 %; у крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту, - 81.1±2.0 %; у крыс, получавших тироксин, - 14,0±0,9 %.

Толерантность к тромбину у интактных крыс в условиях опыта, приняли за 100 %, и нашли у подопытных крыс толерантность к тромбину по формуле: кровоток тромбин фибриноген липидпероксидация

Х % = (Do: Dк)х 100.

У крыс, получивших ацетилсалицилат, толерантность повысилась до 181 % против контроля, у получавших тироксин - упала до 32.5 % (сдвиги достоверны - Р < 0.05). При оценке частоты выживания животных (табл. 1) нашли следующее: введение тромбина интактным животным (т.е. на фоне физиологической нормы) вызывает гибель крыс с частотой, установленной ранее при введении такой же дозы тромбина [Каптюх, 1970; Л.В. Михайлова, 1970; Б.А. Кудряшов, 1975; В.Г. Соловьев, 1997].

Таблица 1. Частота выживания крыс в течение 24 ч после внутривенной инъекции тромбина (активность - 25 с, 1 мл/кг)

Подопытная группа	Общее число особей	Выжило (абсолютные значения)	Выжило, %
Контроль	25	13	52.01.6
Крысы получали ацетилсалицилат	25	16*	64.02.1*
Крысы получали тироксин	25	7*	28.01.2*

Знак * - достоверное отличие от значений у интактных крыс

Частота выживания равна 52,9 %; при введении тромбина на фоне ацетилсалициловой кислоты выживание животных выше на 38 % против контроля; при введении тромбина на фоне тироксина частота выживания ниже, чем в контроле - 28.0 %.В итоге, показатели толерантности к тромбину по снижению фибриногенемии и по частоте выживания у интактных крыс равны 52 и 64.0 % соответственно. На фоне ацетилсалицилата толерантность повысилась с 43.0 до 81.1 %, а по частоте выживания - с 52.0 до 64.0 %, на фоне тироксина толерантность упала с 57.7 до 14.0 % (по изменению фибриногенемии), а по выживанию - с 43 до 28 %. Различия в степени изменения толерантности к тромбину по результатам двух способов связаны с тем, что в предлагаемом нами способе реакция на тромбин оценивается у всех крыс точно через 0.5 ч после инъекции (на одном и том же этапе развития ответной реакции). При оценке частоты выживания, контролируемого в течение 24, ч на результате сказываются последствия внутрисосудистого тромбообразования, вызванного тромбином. Как показано в табл. 2, предложенный способ в сравнении с прототипом уменьшил в 10 раз число определяемых показателей и в 2 раза число используемых реагентов и препаратов, что позволило сократить в 10-12 раз время выполнения определений.

Таблица 2. Сравнительная характеристика разработанного нами способа оценки толерантности к тромбину и способа-прототипа, основанного на определении десяти показателей состояния гемостаза

Этапы реализации способа	Предлагаемый способ	Сопоставляемый способ
Воздействия, изменяющие толерантность к тромбину	Определяются характером воздействий (зависят от его продолжительности)	Определяются характером воздействий (зависят от его продолжительности)
Фиксация крысы и введение тромбина	3-5 мин на особь	3-5 мин на особь
Отбор проб и их обработка	Проба отбирается в один шприц (0.9 мл), 2 мин/особь	Проба отбирается в 2 шприца, до 4 мл, 5 мин/особь
Подготовка проб к анализу	Однократное центрифугирование, 10 мин	Центрифугирование при разных ускорениях, 25 мин
Проведение анализов	1 определение в 3-х повторностях - 5 мин	10 определений в 2-х повторностях - 24 ч
Обсчет результатов	- безмашинный - 10 мин на группу; машинный - 1 мин	- безмашинный - 6-7 ч на группу, машинный - 2 ч
Сопоставление результатов "контроль-опыт"	1-2 мин (расчет значений р)	1-2 ч (расчет значений р)
Объективность результатов	Количественное выражение уровня толерантности и её изменений при воздействиях (% к контролю)	Описательная характеристика: "толерантность ниже или выше контрольной"
Длительность определений	30-35 мин/особь или 3-4 ч на 2 группы (контроль-опыт, 10-12 крыс)	До 24 ч на особь или до 38 ч на 2 группы (контроль-опыт, 10-12 крыс)
Необходимые реагенты	1)NaCl, 2) NaOH, 3) лимоннокислый натрий	1) NaCl, 2)NaOH, 3) Буфер Михаэлиса, 4) Лимоннокислый натрий, 5) Щавеловокислый натрий, 6) Хлористый кальций
Необходимые препараты	1) тромбин, 2) фибриноген	1)тромбин, 2) фибриноген, 3) гепарин, 4) протамина сульфат, 5) тромбопластин, 6) фибрин-порошок, 7) фибринолизин

Главное: в отличие от аналога в предложенном способе показатель, на значении которого основана оценка толерантности к тромбину, определяется у всех животных в одно и то же время после введения тромбина, тогда как выживание животных оценивают в течение 24 ч, из-за чего причина гибели животных зависит не только от способности организма противостоять гипертромбинемии, но и от локализации образующихся внутрисосудистых тромбов. В связи с этим предложенный нами способ отличается бульшей специфичностью. Важна и возможность количественного выражения толерантности к тромбину, в то время как в способе-прототипе используются с этой целью качественные определения - "больше" или "меньше". Эти отличия позволили применить предложенный способ для оценки эффекта разнообразных воздействий на толерантность организма к тромбинемии. В частности, появилась возможность сравнивать толерантность к тромбину с содержанием маркеров НВСК, т.е. перейти к выполнению следующей задачи исследований.

Связяно ли содержания маркеров НВСК с толерантностью к тромбину, т.е. отражает ли уровень маркеров НВСК наклонность к тромбообразованию? Необходимость в исследования вызвана тем, что прямых подтверждений связи интенсивность НВСК-толерантность к тромбину (единичные косвенные данные о такой связи появились лишь в последнее время [Умутбаева, 2005; Э.А. Согрин, 2005]).

В первой серии экспериментов этой части работы мы нашли, что у крыс при экзогенной тромбинемии на фоне наркотического сна или после выхода из него, растет уровень маркеров НВСК (рост содержания продуктов ВТФ) одновременно со снижением толерантности к тромбину (рис. 1).

Рисунок 1. Изменения (в % к контрольным крысам) содержания маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ, D-димеров - столбцы слева направо) и толерантности к тромбину (Т к Тр.) бодрствующих крыс, у крыс в состоянии эфирного наркоза и после выхода из него

Варьируя дозой тромбина во время наркотического сна, количественно охарактеризовали связь между содержанием маркеров НВСК и толерантностью к тромбину.

Оказалось (рис. 2), что с увеличением дозы экзогенного тромбина (справа налево) содержание маркеров НВСК растет пропорционально и почти линейно (коэффициенты аппроксимации соответствующих трендов во всех случаях выше 0.9). Толерантность к тромбину (Т к ТР) с увеличением дозы снижается экспоненциально, однако, достоверность аппроксимации в этом случае ниже (0.84). Из сказанного следует, что при гипертромбинемии растет содержание маркеров НВСК (т.е. ускоряется ВТФ или внутрисосудистое свертывание крови) пропорционально степени тромбинемии. Способность же организма переносить последствия тромбинемии (толерантность к тромбину) уменьшается экспоненциально при увеличении степени экзогенной тромбинемии.

Рисунок 2. Степень изменения (в % от значений, найденных при введении цельного тромбина бодрствующим крысам) содержания маркеров НВСК и толерантности к тромбину при введении его в убывающих количествах наркотизированным крысам (1 - цельный раствор тромбина, 2, 3 и 4 - разбавленный в 2, 3 и 4 раза)

Сходны соотношения между степенью тромбинемии и содержанием маркеров НВСК и при ускорении эндогенного тромбиногенеза введением адреналина. Предварительно изучив эффект адреналина в дозе 30 мкг/кг, нашли, что рост содержания фф. Р ₃ и Р ₄, ПДФ, РКМФ и D-димеров проявляется как тенденция на 15-й и становится достоверным на 30-й мин после подкожной инъекции, что совпало с данными литературы [Бабич, 1973; М.К. Умутбаева, 2005].

Далее, приняв во внимание полученные данные, через 15 и 30 мин после инъекции адреналина крысам вводили внутривенно раствор тромбина (1 мл/кг, активность 25 с), определяя через 0.5 ч в пробах крови содержание маркеров НВСК и толерантность к тромбину. Анализ изменения содержания маркеров НВСК и толерантности к тромбину на рис. 3 показал, что с увеличением тромбинемии практически линейно растет содержание маркеров НВСК (все коэффициенты достоверности аппроксимации близки к единице). Толерантность к тромбину при этом снижается (как и при экзогенной гипертромбинемии) экспоненциально с довольно высоким коэффициентом аппроксимации (0.8511).

Рисунок 3. Изменения содержания маркеров НВСК и толерантность к тромбину при его введении на фоне инъекций адреналина (в % к результатам, полученным при введении тромбина крысам, которым адреналин не вводили)

Используя ещё одну модель эндогенной гипертромбинемии - кровопотерю [Галян, 1993; В.Г. Соловьев, 1997], - мы нашли, что через 1 ч после кровоизвлечения растет содержание РКМФ, ПДФ и D-димеров, а через 3 и особенно через 6 ч сдвиги усиливаются (табл. 3).

Таблица 3. Маркеры НВСК в разные сроки после кровопотери (n = 8 на каждом этапе)

	Отбор проб после кровопотери через:
Показатели	Контроль	1 ч	3 ч	6 ч	24 ч
Р 3, %	88.62.0	95.82.1*	99.92.1*	1022.2*	90.11.7
Р 4, с	3.30.02	3.60.03*	4.60.04*	4.90.06*	3.70.02
ФГ, г/л	2..10.07	1.90.06*	1.40.05*?	1.30.04*	2.00.08
ПДФ, мг %	14.41.2	16.91.1*	19.91.5*	24.71.6*	15.41.4
РКМФ, мкг/мл	25.40.8	29.40.6*	35.6?.5*	38.91.3*	27.00.9
D-Д, мкг/мл	0.210.090	0.290.007*	0.300.008*	0.360.011*	0.230.012

Обозначения: ФГ - фибриноген, D-Д - D-димеры, * - отличия от контроля достоверны.

Выбрав для исследования периоды с наиболее существенными сдвигами (1 и 6 ч после кровопотери), мы нашли, что толерантность к тромбину снижается в обратной зависимости от уровня маркеров НВСК (рис. 4).

Рисунок 4. Изменения (в % к значениям у интактных крыс) содержания маркеров НВСК и толерантность к тромбину, вводимому через 1 и 6 ч после кровопотери

Рост содержания маркеров НВСК здесь аппроксимирован в виде линейного тренда с малым коэффициентом достоверности. Снижение толерантности к тромбину при росте содержания маркеров НВСК происходит экспоненциально, а коэффициент аппроксимации близок к единице - 0.82.

В качестве ещё одной природной модели колебаний тромбиногенеза, мы использовали данные о сезонной вариабельности гемостатического потенциала [Кузник и др., 1976; В.П. Балуда и др., 1978; А.Ш. Бышевский, В.Н. Кожевников, 1986]: изучили зависимость между уровнем маркеров НВСК и толерантностью к тромбину в разные времена года.

...