Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Специальность - Физиология

на тему: Базальный уровень ионов кальция и его регуляция в волокнах постуральной мышцы крысы и монгольской песчанки в условиях гравитационной разгрузки

Выполнила:

Алтаева Эржена Григорьевна

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Шенкман Борис Стивович, кандидат физико-математических наук Огнева Ирина Владимировна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович, доктор биологических наук, профессор Рубцов Александр Михайлович

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита диссертации состоится « 24 » февраля 2011 г. в 10⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской Академии Наук.

Автореферат разослан « 20 » января 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из основных медицинских проблем, препятствующих длительным космическим полетам, является снижение работоспособности, в том числе в силу атрофических изменений скелетных мышц. Скелетная мышца - один из наиболее пластичных органов, способный адаптироваться к изменению условий функционирования, воздействующих как на мышцу, так и на организм в целом. Длительное снижение функциональной активности постуральных мышц, особенно, камбаловидной мышцы, в условиях снижения гравитационного стимула (пребывание в условиях невесомости, устранение опоры на все или только задние конечности, переход в горизонтальное положение), так называемой гравитационной разгрузки, приводит к глубокой структурной и функциональной перестройке мышечной ткани. Снижение функциональных характеристик скелетных мышц - одно из важнейших проявлений гипогравитационного синдрома (Oganov et al., 1976; Козловская и др., 1984; Edgerton et al., 1998; Adams et al., 2003; Shenkman, Nemirovskaya, 2008). В литературе имеются данные о снижении сократительных характеристик мышечных волокон млекопитающих (силы и работоспособности), жесткости мышцы и ее волокон (Mounier et al., 1989; 2000; Stevens et al., 1993; Widrick et al., 1999; Ogneva et al., 2009, 2010). Изменение сократительных свойств мышц связывают с уменьшением площади поперечного сечения мышечных волокон (атрофия) (Оганов и др., 1982; Riley et al., 2002) и соответствующим изменением объема миофибриллярного аппарата (Stevens et al., 1993; Kozlovskaya et al., 1996; Desplanches et al., 1997; Mounier et al., 2000; Fitts et al., 2000). Также невесомость приводит к разрастанию соединительнотканных структур (Karpakka et al., 1991; Miller et al., 2001), трансформации миозинового фенотипа волокон в сторону увеличения экспрессии быстрых изоформ тяжелых цепей миозина (Caiozzo et al., 1994; 1998; 2000; Edgerton et al., 1995; 1998), деградации ряда цитоскелетных белков (Chopard et al., 2001; Гасникова и др., 2006). В основе мышечных перестроек лежит направленное изменение экспрессии большого числа генов, формирование нового целостного, так называемого, «атрофического» паттерна экспрессии (Kandarian, Stevenson, 2002).

Эти данные позволяют предположить, что реализация «атрофической» программы осуществляется, прежде всего, на клеточном уровне - на уровне мышечных волокон. Причем, ее запуск осуществляется путем последовательной активации протеолитических систем, и в первую очередь системы кальций-зависимых протеаз - кальпаинов (Kandarian, Stevenson, 2002; Shenkman, Nemirovskaya, 2008). Активность кальпаинов отмечается уже после первых суток функциональной разгрузки (Enns, Belcastro, 2007), по всей видимости, эти изменения в условиях снижения гравитационного стимула связаны с увеличением базального уровня ионов кальция внутри мышечных волокон (Ingalls et al., 1999, 2001).

Ионы кальция имеют большое значение для скелетных мышц, так как выполняют регуляторную и сигнальную функции в клетке. Они играют важную роль в электромеханическом сопряжении, обеспечивая передачу сигнала о мышечном сокращении на миофибриллы. Однако до сих пор динамика накопления кальция в условиях разгрузки остается практически неизученной.

Помимо этого, остаются неясными механизмы поступления избыточного кальция в миоплазму мышечных волокон и его удаления в условиях разгрузки. Существуют предположения, что ионы кальция могут поступать внутрь клетки через сарколемму из межклеточного пространства посредством медленных кальциевых каналов L-типа, которые специфически блокируются нифедипином. Кроме того, показано, что их экспрессия в условиях разгрузки увеличивается (Kandarian et al., 1992). С другой стороны, большое значение имеет и механизм элиминации ионов кальция из миоплазмы мышечных волокон. Ответственной за этот процесс является кальциевая АТФаза саркоэндоплазматического ретикулума - SERCA, функционирование которой в условиях гипогравитации также мало изученно. Однако слаженная работа кальциевых каналов и Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает поддержание кальциевого гомеостаза в клетке, который очень важен, так как в настоящее время увеличение внутриклеточного содержания кальция рассматривается как один из основных пусковых факторов в реакции мышечных волокон на изменение гравитационного стимула (Kandarian, Stevenson, 2002). Таким образом, исследование физиологической роли базального содержания ионов кальция в миоплазме мышечных волокон и биофизических механизмов его поступления и элиминации представляет собой актуальную задачу современной гравитационной биологии.

Цель работы

Изучить динамику накопления ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы грызунов и роль базального уровня ионов кальция в активации протеолитических процессов при моделируемой гравитационной разгрузке.

Задачи исследования:

1. Проследить динамику изменения уровня кальция в камбаловидной мышце на разных сроках вывешивания.

2. Проверить гипотезу о ключевой роли медленных кальциевых каналов L-типа в накоплении ионов кальция в миоплазме мышечных волокон.

3. Исследовать изоформный состав кальциевой АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума - SERCA в волокнах камбаловидной мышцы в условиях функциональной разгрузки.

4. Изучить влияние накопления базального кальция в миоплазме волокон на активацию кальпаиновой протеолитической системы на начальных этапах функциональной разгрузки.

5. Сравнить динамику накопления и элиминации ионов кальция в миоплазме постуральных мышц при гравитационной разгрузке у крысы породы Wistar и монгольской песчанки.

Научная новизна работы:

- увеличение базального содержания ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы крысы и монгольской песчанки происходит уже после первых суток гравитационной разгрузки;

- применение нифедипина, селективного блокатора медленных кальциевых каналов L-типа, приводит к снижению интенсивности накопления внутриклеточного содержания ионов кальция в волокнах камбаловидной мышцы крысы в условиях разгрузки;

- моделируемая разгрузка приводит к увеличению доли мышечных волокон, экспрессирующих быструю изоформу кальциевой АТФазы саркоплазматического ретикулума, на ранних сроках: у крысы после 3-х суток, у монгольской песчанки уже после первых.

- в условиях кратковременной функциональной разгрузки увеличение базального внутриклеточного содержания ионов кальция непосредственно влияет на содержание как мембранной, так и цитоплазматической фракций кальпаинов в миоплазме волокон камбаловидной мышцы крысы;

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование расширяет представления о физиологической роли ионов кальция, о механизмах, влияющих на изменение кальциевого гомеостаза в камбаловидной мышце млекопитающих, а именно крысы и монгольской песчанки, в условиях гравитационной разгрузки. Подобное исследование в условиях снижения гравитационного стимула имеет большое значение в решении вопроса поддержания функциональной активности скелетных мышц в условиях длительных космических полетов. Применение в данной работе селективного блокатора дигидропиридиновых кальциевых каналов позволило достоверно снизить базальное содержание ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы на ранних сроках моделируемой разгрузки. Возможно, развитие этого подхода в дальнейшем позволит найти способ для, по крайней мере, частичного предотвращения негативных последствий невесомости на функциональное состояние постуральных мышц.

Положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение базального содержания ионов кальция в миоплазме мышечных волокон камбаловидной мышцы - один из наиболее ранних эффектов гравитационной разгрузки. Показано участие медленных кальциевые каналов L-типа в этом процессе.

2. Изменение паттерна экспрессии изоформ Са²⁺-АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума вносит вклад в механизм элиминации ионов кальция из мышечного волокна в условиях разгрузки.

3. Показано влияние увеличения базального уровня ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы на активацию цистеиновых кальций-зависимых протеаз - кальпаинов in vivo на ранних сроках гравитационной разгрузки.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждались на 12-м Европейском симпозиуме студентов биологов (Коимбра - Авейро, Португалия, 2008); 9-ой Конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010); 31-м Международном симпозиуме по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 2010).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 02.11.2010 г).

По теме диссертации опубликовано 26 печатные работы. В том числе 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН, программ Отделения биологических наук РАН, грантов РФФИ 10-04-00106-а, 04-04-49044-а, 07-04-00763-а.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 139 страницах, иллюстрирован 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 336 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила камбаловидная мышца крысы породы Wistar (100 половозрелых самцов) и монгольской песчанки (Meriones unguiculatus) (73 половозрелых самца). Все эксперименты на животных были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Методы исследования

1. Определение изменения содержания ионов кальция в одиночных мышечных волокнах проводили в день взятия биоматериала. Выделенную камбаловидную мышцу помещали в раствор Рингера на 40 минут, затем препараты фиксировали, инкубируя целую мышцу в растворе R (Stevеns et al., 1993) смешанном в соотношении 1:1 с 4%-ным раствором формалина. После отмывки от формалина выделяли единичные мышечные волокна, которые окрашивали флуоресцентным кальциевым зондом Fluo-4AM (Molecular Probes, США). Уровень содержания кальция оценивали по интенсивности флуоресценции, которую фиксировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica (Германия).

2. Определение доли мышечных волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA). Поперечные криостатные срезы толщиной 10 мкм окрашивали моноклональными антителами против быстрой и медленной изоформ SERCA I и II (Sigma и Novocastra Laboratories, США) по стандартной методике. Для проявления использовали вторичные поликлональные антитела конъюгированные с флуоресцина изотиоцинатом (FITC) (Sigma, США). Подсчитывали количество волокон, окрашенных SERCA I или SERCA II, к общему количеству волокон на срезе, таким образом подсчитывали процентную долю волокон, экспрессирующих быструю или медленную изоформу Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума.

3. Определение доли волокон, экспрессирующих медленную и быструю изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ). Поперечные криостатные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм окрашивали первичными моноклональными антителами против медленной и быстрой изоформ тяжелых цепей миозина (Novocastra Laboratories, США) по стандартной методике. Для проявления использовали вторичные поликлональные антитела конъюгированные с FITC (Sigma, США). Подсчитывали отношение окрашенных волокон к общему количеству волокон на срезе, тем самым, определяя процентную долю волокон, экспрессирующих медленную или быструю изоформу ТЦМ.

4. Оценку площади поперечного сечения (ППС) мышечных волокон проводили на поперечных криостаных срезах, окрашенных антителами против медленных и быстрых миозинов. Чтобы определить ППС медленных мышечных волокон измеряли площадь неокрашенных волокон на срезах, окрашенных антителами против быстрой изоформы ТЦМ, и, наоборот, для определения ППС быстрых мышечных волокон. В среднем анализировали 100 волокон с каждого среза.

5. Определение активности кальпаинов в камбаловидной мышце проводили в соответствии с методом Enns, Belcastro (2006). Образцы скелетных мышц гомогенизировали, выделяли цитоплазматическую и мембраносвязанную фракции белка. Активность кальпаинов определяли спектрофотометрически на приборе СФ 2000 (ЗАО «ОКБ-Спектр», Россия), используя в качестве субстрата щелочно-денатурированный казеин. Из каждой пробы отбирали аликвоты, в которых определяли остаточное содержание белка по методу Брэдфорд (1976). Активность кальпаинов измеряли при длине волны 595 нм. Для растворимой и мембраносвязанной фракций активность кальпаинов выражали как относительный прирост по сравнению с контрольным значением для каждой фракции.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета математического анализа MS Excel. Оценку значимости различия средних значений показателя в независимых выборках проводили по t-критерию Стьюдента. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали достоверным при уровне значимости p0.05. Результаты представлены в виде Мm, где М - среднее значение, m - ошибка среднего значения.

Организация экспериментов.

1. Антиортостатическое вывешивание животных проводили согласно стандартной модели Ильина-Новикова (1981) в модификации Morey-Holton (2002).

2. Динамика накопления ионов кальция в камбаловидной мышце крысы и монгольской песчанки на разных этапах гравитационной разгрузки. В первой серии эксперимента участвовали 40 половозрелых самцов крысы породы Wistar массой 180-220 г. Животные были разделены на 5 групп: группа №1 - «Контроль» (К), группа №2 - «Вывешивание 1 сутки» (1HS), группа №3 - «Вывешивание 3 суток» (3HS), группа №4 - «Вывешивание 7 суток» (7HS), группа №5 - «Вывешивание 12 суток» (12HS). Во второй серии участвовали 40 половозрелых самцов монгольской песчанки массой 40-50 г, которые аналогично были поделены на 5 групп. Животные групп «Контроль» находились в течение всего эксперимента в обычных виварных условиях. Взятие биоматериала осуществляли под нембуталовым наркозом (10 мг/кг веса животного), усыпление животных - с помощью внутрибрюшинного введения летальной дозы нембутала (120 мг/кг веса животного). В этом эксперименте оценивали динамику изменения базального содержания кальция в миоплазме m. soleus вывешенных животных, изменение соотношения изоформ кальциевой помпы, трансформацию миозинового фенотипа и изменение площади поперечного сечения мышечных волокон.

3. Организация космического эксперимента на борту биоспутника «ФОТОН- М №3». В 2007 году на борту биоспутника «ФОТОН-М №3» 12 самцов монгольской песчанки на протяжении 12 суток находились в условиях воздействия реальной гравитационной разгрузки. Животные содержались в специализированном модуле малого объема «Контур» с автономной системой жизнеобеспечения. Параллельно с этим в виварных условиях находилась контрольная группа животных. Взятие биологического материала проводили через сутки после приземления биоспутника. В камбаловидной мышце анализировали уровень накопления ионов кальция, трансформацию фенотипов SERCA и ТЦМ, также оценивали степень атрофии мышечных волокон.

4. Динамика накопления ионов кальция в камбаловидной мышце крысы на фоне системного введения нифедипина. Исследование мышечной ткани в рамках данного эксперимента проводилось у 32 половозрелых самцов крысы, произвольным образом разделенных на 4 группы: «Контроль» (К); «Контроль + нифедипин» (KN); «Вывешивание 1 сутки + нифедипин» (1HSN); «Вывешивание 3 суток +нифедипин» (3HSN). Нифедипин животным вводили перорально из расчета 10 мг/кг веса животного (Feng, Yu, 2005). Введение препарата начали за 7 дней до вывешивания и продолжали вводить в течение всего срока разгрузки ежедневно.

5. Локальная доставка кальций-связывающего агента BAPTA-AM и нифедипина. В соответствии с методикой Vrbova (1995) были изготовлены из силиконового геля (3140RTV, Dow Corning, США) имплантаты, которые затем в стерильных условиях были введены под камбаловидную мышцу. В этом исследовании использовали 28 самцов крысы породы Wistar, которых случайным образом разделили на 4 группы: «Контроль (К)»; «Вывешивание 3 суток» (HS); «Вывешивание 3 суток с нифедипином» (HSN); «Вывешивание 3 суток с BAPTA-AM» (HSB). В пробах мышечной ткани анализировали уровень ионов кальция и активность кальпаинов цитоплазматической и мембрансвязанной фракций по методу Enns, Belcastro (2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика базального содержания ионов кальция в миоплазме камбаловидной мышцы на разных сроках гравитационной разгрузки. На изолированных единичных волокнах камбаловидной мышцы крысы и песчанок с помощью флуоресцентного зонда Fluo-4AM (Molecular Probes, США) нами было показано увеличение базального содержания кальция.

Согласно полученным результатам увеличение уровня ионов кальция в миоплазме камбаловидной мышцы крысы происходило уже после суток антиортостатического вывешивания в 2.8 раза по сравнению с контрольным значением. Высокое содержание кальция сохранялось на протяжении трех суток, после чего начинало постепенно снижаться, но уровня контроля к 12-м суткам не достигало (рис.1).

Рис.1. Динамика изменения уровня ионов кальция в камбаловидной мышце крысы на разных сроках гравитационной разгрузки

* - достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

& - достоверные отличия от группы «Вывешивание 1 сутки» (р?0.05)

Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными Ingalls и соавторов (1999, 2001), которые в аналогичных экспериментах показали увеличение концентрации кальция у мышей после двух суток вывешивания.

В 2007 году после миссии аппарата «ФОТОН-М №3» новым объектом гравитационной физиологии стала монгольская песчанка. На борту биоспутника был проведен уникальный космический эксперимент с 12-суточным экспонированием этих животных.

В результате этого эксперимента не было обнаружено достоверных отличий в содержании ионов кальция в волокнах m. soleus животных, подвергавшихся воздействию микрогравитации, относительно животных контрольной группы (рис.2).

Рис.2. Базальный уровень кальция в миоплазме камбаловидной мышцы монгольской песчанки после 12-ти суточного космического полета.

В литературных источниках нет информации о том, что происходит с базальным уровнем ионов кальция в волокнах скелетных мышц песчанки в условиях гипогравитации. Поэтому сделать однозначные выводы, касаемые изменения этого показателя у песчанки, весьма проблематично: с одной стороны, возможно, что к этому моменту еще ничего не изменилось в системе, но с другой - возможен вариант более ранних изменений, которые к моменту взятия биоматериала были уже незначимы. Чтобы решить этот вопрос нами был проведен эксперимент в лабораторных условиях, в котором песчанки подвергались антиортостатическому вывешиванию. В результате проведенного эксперимента нами было установлено, что увеличение базального уровня ионов кальция в 4.5 раза относительно контроля у песчанки, так же как и у крысы, произошло уже после первых суток инактивации (рис.3).

Рис.3. Динамика изменения уровня ионов кальция в камбаловидной мышце монгольской песчанки на разных сроках гравитационной разгрузки

* - достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

& - достоверные отличия от группы «Вывешивание 1 сутки», (р?0.05)

Высокий уровень ионов кальция в миоплазме m. soleus сохранялся в течение трех суток, после чего он снижался, но не достигал значений контрольной группы. Некоторые расхождения наземного эксперимента с результатами полетного эксперимента могут быть обусловлены тем, что забор материала происходил только через сутки после приземления. Кроме того, условия содержания песчанок на борту «ФОТОН-М №3» были более стесненными, нежели при стандартном антиортостатическом вывешивании. Тем не менее, учитывая тенденцию к существенному снижению содержания ионов кальция в волокнах камбаловидной мышцы песчанок после 12-суточного вывешивания и отсутствие достоверных отличий после космического полета можно полагать, что восстановление этого параметра у песчанки происходит быстрее, чем у крысы. Последнее может быть связано с особенностями водно-солевого обмена, характерными для монгольской песчанки, в частности, практически полной реабсорбцией воды в почках и, как следствие, повышенной осмолярностью внутренних сред.

Опираясь на полученные данные, можно сделать заключение о том, что динамика изменения уровня ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы сходна для крысы и песчанки, но у песчанки этот процесс имеет более интенсивный характер.

Механизм накопления и элиминации ионов кальция остается малоизученным. Существуют предположения, что увеличение базального уровня кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы в условиях отсутствия гравитации возможно за счет его поступления через наружные кальциевые каналы L-типа (Kandarian et al., 1992). Последующее снижение концентрации ионов кальция в миоплазме мышечных волокон во время разгрузки может быть обусловлено изменением скорости работы систем электромеханического сопряжения, в частности, системы элиминации кальция - кальциевой АТФазы саркоплазматического ретикулума.

Роль медленных кальциевых каналов L-типа в накоплении ионов кальция в миоплазме постуральных мышц в условиях гипогравитации. Одним из возможных путей поступления ионов кальция в миоплазму m. soleus может быть их поступление из внеклеточного пространства через медленные кальциевые каналы L-типа (дигидропиридиновые рецепторы). Проведенный нами трехсуточный эксперимент с использованием крыс в качестве объекта исследования с введением нифедипина, блокатора дигидропиридиновых каналов, показал, что его применение снижало уровень ионов кальция в миоплазме камбаловидной мышцы в условиях антиортостатического вывешивания. Так, после суток вывешивания на фоне нифедипина не происходило увеличения содержания базального уровня кальция, по сравнению с вывешиванием без нифедипина, где имело место увеличение в 2.8 раз относительно контроля. Достоверное увеличение уровня ионов кальция отмечалось после трех суток и всего в 1.5 раза (рис.4).

Рис.4. Динамика изменения уровня ионов кальция в камбаловидной мышце крысы на ранних сроках гравитационной разгрузки на фоне перорального применения нифедипина

* - достоверные отличия от группы контроль (р?0.05)

& - достоверные отличия от группы «Контроль с нифедипином», (р?0.05)

Таким образом, можно сделать предположение о том, что дигидропиридиновые каналы вносят существенный вклад в поступление ионов кальция из внеклеточного пространства в миоплазму волокон при разгрузке. ион кальций миоплазма гравитация

Тем не менее, механизм, обеспечивающий поступление ионов кальция в волокно в условиях отсутствия гравитационной нагрузки, до сих пор остается неясным, хотя некоторую роль дигидропиридиновых каналов можно считать доказанной. Возможно, результаты исследования процессов, протекающих в мембране мышечного волокна при разгрузке, могут внести значительный вклад в понимание механизмов работы кальциевых каналов. Ранее было показано, что после трех суток вывешивания отмечается деполяризация мембраны мышечных волокон (Кривой и др., 2008), снижение потенциала происходит за счет уменьшения электрогенного вклада Na-K-АТФазы. Снижение мембранного потенциала покоя на ранних сроках гравитационной разгрузки позволяет предположить, что проницаемость сарколеммы для ионов кальция увеличивается. Известно, что медленные кальциевые каналы L-типа потенциал-зависимые (Hofmann et al., 1999), поэтому снижение МПП при разгрузке может привести к активации хотя бы части из них (Catterall W., 1995; Кривой И. и др., 2008), а также к увеличению проницаемости сарколеммы для ионов кальция. С другой стороны было показано увеличение экспрессии дигидропиридиновых каналов в условиях функциональной разгрузки (Kandarian et al., 1992).

Однако при подобном способе введения препарата сложно отделить влияние системного эффекта на результаты эксперимента. Для выявления местного эффекта был поставлен эксперимент, в котором доставка нифедипина осуществлялась локально, непосредственно к камбаловидной мышце. Полученные данные свидетельствовали о том, что у животных групп «Вывешивание + нифедипин» и «Вывешивание + BAPTA-AM» уровень ионов кальция внутри волокон камбаловидной мышцы снизился примерно в 1.4 раза по сравнению с группой «Вывешивание» (рис.5). Раньше было показано, что внутрибрюшинное введение таких хелаторов кальция как ЭГТА и ЭДТА также снижало увеличение ионов кальция в миоплазме m. soleus при 14-суточной разгрузке (Shenkman et al., 2002; Литвинова, 2005).



Рис.5. Динамика изменения уровня ионов кальция в условиях кратковременной разгрузки

*- достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

&-достоверные отличия от группы «Вывешивание», (р?0.05)

Таким образом, наши данные свидетельствуют, что медленные кальциевые каналы L-типа играют немаловажную роль в процессах накопления базального уровня ионов кальция в миоплазме камбаловидной мышцы.

Механизм элиминации избыточного количества ионов кальция из миоплазмы в саркоплазматический ретикулум с помощью работы кальциевой АТФазы саркоплазматического ретикулума - SERCA в условиях гравитационной разгрузки.

В условиях функциональной инактивации наряду со значимостью механизма поступления ионов кальция, не менее важным является механизм его элиминации. В связи с этим в микрогравитационной среде существенное значение имеет работа кальциевой АТФазы саркоплазматического ретикулума.

В нашей работе показано, что в условиях разгрузки происходила трансформация изоформ кальциевой АТФазы в быструю сторону. Так, у крысы уже после трех суток вывешивания относительно контрольного уровня происходило достоверное увеличение на 10% доли волокон, экспрессирующих быструю изоформу SERCA (рис.6).

Рис.6.Процентное соотношение волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы кальциевой АТФазы СР в m.soleus крысы

*-достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

Ранее в условиях антиортостатического вывешивания у крысы было показано увеличение экспрессии мРНК быстрой изоформы кальциевого насоса СР (Peters et al., 1999, Mitchell-Felton et al., 2000). Ранее было показано увеличение доли волокон, экспрессирующих быструю SERCA I в образцах мышечной ткани двух космонавтов, пребывавших в условиях невесомости 180 суток (Литвинова, 2005). В нашем эксперименте количество волокон, содержащих медленную изоформу SERCA, снизилось на 7% после трех суток вывешивания. При этом увеличилась доля волокон, содержащих одновременно и быструю и медленную изоформы кальциевой помпы СР. По данным Литвиновой (2005) в мышечных образцах, взятых у космонавтов, после пребывания в условиях длительного космического полета, также происходило уменьшение доли волокон, экспрессирующих медленную изоформу кальциевого насоса СР.

У монгольской песчанки изменение паттерна экспрессии изоформ Са²⁺-АТФазы происходило уже через сутки антиортостатического вывешивания (рис.7).



Рис.7.Процентное соотношение волокон, экспрессирующих «быструю» и «медленную» изоформы кальциевой АТФазы СР в m.soleus песчанки

*-достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

После первых суток доля волокон, содержащих быструю изоформу увеличивалась на 10%, максимальное увеличение на 17% отмечалось после третьих суток. Далее, в течение более длительного срока вывешивания количество волокон, экспрессирующих быструю SERCA, оставалось высоким. Параллельно с этим происходило уменьшение количества волокон, экспрессирующих медленную изоформу кальциевой помпы на 8%, после первых суток и на 16% после третьих суток. Однако к 12-суткам разгрузки происходит возвращение к уровню контроля. Также во время вывешивания происходило увеличение доли волокон, которые экспрессируют и быструю и медленную изоформы.

В эксперименте, проводимом на борту биоспутника «ФОТОН-М №3», где песчанки экспонировались в условиях реальной невесомости на протяжении 12 суток, нами были получены достоверные изменения в процентном соотношении волокон, содержащих быструю изоформу кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума (рис.8).



Рис.8.Процентное соотношение волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы SERCA у песчанок в условиях космического полета

* - достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

В эксперименте с участием крыс, которым перорально вводили нифедипин, также отмечалось увеличение количества волокон, экспрессирующих SERCA I, после трех суток разгрузки, несмотря на то, что накопление ионов кальция в миоплазме m. soleus было менее интенсивно, чем в эксперименте с чистым вывешиванием (рис.9). Возможно, что экспрессия SERCA чувствительна к снижению сократительной активности мышцы и снижение гравитационной нагрузки приводит к перераспределению экспрессии изоформ кальциевой помпы уже на ранних этапах микрогравитации.



Рис.9. Процентное соотношение волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформу SERCA, у крысы при разгрузке на фоне нифедипина

* - достоверные отличия от нруппы «Контроль», р?0.05

Влияние кальций-связывающего агента BAPTA-AM на активации кальпаиновой протеолитической системы на раннем этапе функциональной разгрузки. В условиях разгрузки наблюдается активация различных протеолитических систем, одной из первых активируется кальпаиновая протеолитическая система (Enns, Belcastro, 2006). Согласно нашим результатам, активация кальпаинов отмечалась после трех суток вывешивания. Отмечалось увеличение активности цитоплазматической фракции в 2 раза и в 4 раза - мембраносвязанной фракции у вывешенных крыс по сравнению с контрольными (рис.10).



Рис.10. Содержание кальпаинов в цитоплазматической и мембраносвязанной фракциях в камбаловидной мышце при краткосрочной разгрузке

* - достоверные отличия от группы «Контроль», р?0.05

# - достоверные отличия от группы «Вывешивание», (р?0.05)

Существуют предположения, что при разгрузке запуск кальпаинов (кальций-зависимых ферментов) непосредственно связан с увеличением концентрации ионов кальция в миоплазме мышечных волокон, однако данных, напрямую подтверждающих это, нет. Целью эксперимента с хелатором кальция BAPTA-AM была проверка гипотезы о том, что увеличение концентрации ионов кальция в условиях снижения гравитационной нагрузки непосредственно влияет на активность кальпаинов. Нами были получены данные, свидетельствующие о том, что действительно количество ионов кальция в миоплазме мышечных волокон является триггерным механизмом для активации кальпаинов. У животных группы «Вывешивание + BAPTA-AM» происходило не только снижение уровня ионов кальция в миоплазме мышечных волокон, но и уменьшение активности мембраносвязанной фракции кальпаинов в 2 раза, а цитоплазматической фракции до контрольного уровня, по сравнению с животными группы «Вывешивание». Таким образом, in vivo было показано, что увеличение содержания кальция напрямую влияет на активацию кальпаиновой протеолитической системы.

Изменение миозинового профиля в условиях гравитационной разгрузки. Согласно результатам экспериментов, у крысы достоверные изменения трансформации миозинового фенотипа в сторону увеличения доли волокон, экспрессирующих быструю изоформу, происходили после 12 суток вывешивания (рис.11), что согласуется с более ранними экспериментальными данными (Booth, Kelso, 1973; Desplanches et al., 1990; Caiozzo et al., 1996).

Рис.11.Процентное соотношение волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы тяжелых цепей миозина в m. soleus крысы

* - достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

Однако у монгольской песчанки после 12-ти суток реального космического полета достоверных изменений сдвига миозинового профиля в быструю сторону не было обнаружено (рис.12). Объяснение этого явления было найдено в эксперименте с вывешиванием песчанки: изменение экспрессии изоформ тяжелых цепей миозина у этих животных происходило значительно раньше, чем у крысы (рис.13). Уже после трех суток вывешивания у песчанки наблюдалось уменьшение количества волокон, содержащих медленную изоформу миозина, на 12 % по сравнению с контрольным значением, в то же время происходило увеличение доли волокон с быстрой изоформой миозина на 14%. Однако процентное отношение медленных волокон уже к седьмым суткам возвращалось к контрольному значению.

Рис.12.Процентное соотношение волокон, содержащих быструю и медленную изоформы тяжелых цепей миозина в m. soleus песчанки

Рис.13.Процентное соотношение волокон, экспрессирующих быструю и медленную изоформы тяжелых цепей миозина в m. soleus песчанки

*-достоверные отличия от группы «Контроль», (р?0.05)

В настоящее время достоверное неизвестно, активация какого сигнального пути приводит к изменению экспрессии изоформ ТЦМ при снижении двигательной активности. Вероятно, что одним из стимулов активации сигнального механизма служит изменение концентрации кальция в миоплазме мышечного волокна, это подтверждается в эксперименте с вывешиванием крыс на фоне нифедипина в течение 14 суток. Было показано предотвращение трансформации мышечных волокон m. soleus в быструю сторону и снижение экспрессии мРНК тяжелых цепей миозина быстрого типа (Мухина и др, 2006; Feng et al., 2005).

В условиях функциональной разгрузки наряду с трансформацией миозинового фенотипа мышечных волокон в быструю сторону происходила атрофия скелетных мышц. Уменьшение площади поперечного сечения (ППС) наблюдалось и в медленных и в быстрых мышечных волокнах (табл.1). У крысы достоверное снижение площади поперечного сечения волокон медленного (I) типа отмечалось после трех суток вывешивания. Уменьшение ППС мышечных волокон быстрого (II) типа происходило после седьмых суток. У монгольской песчанки изменение ППС волокон I типа происходило к третьим суткам вывешивания, что интересно у песчанок происходило увеличение площади поперечного сечения к седьмым суткам разгрузки по сравнению с контролем и возвращение этого показателя к контрольному уровню после 12 суток. ППС быстрых волокон на протяжении всего эксперимента не менялась, однако на седьмые сутки также наблюдалось некоторое ее увеличение по сравнению с площадью поперечного сечения у контрольных животных.

Таблица № 1 Площадь поперечного сечения (ППС) мышечных волокон медленного и быстрого типов

	контроль	1 HS	3 HS	7 HS	12 HS
КРЫСА
ППС МВ медленного типа (мкм2)	1611±62	1529±71	1347±26*	1237±47*	977±54*
ППС МВ быстрого типа (мкм2)	1274±65	1193±49	1162±43	1053±39*	866±73*
МОНГОЛЬСКАЯ ПЕСЧАНКА
ППС МВ медленного типа (мкм2)	1090±61	996±25	923±42*	1283±39*	1073±37
ППС МВ быстрого типа (мкм2)	864±52	863±36	828±54	971±49	892±33

* - достоверные отличия от группы «Контроль», р?0.05

Таким образом, данные, полученные при исследовании камбаловидной мышцы песчанки, свидетельствуют о том, что гипогравитационные эффекты у этих животных проявляются интенсивнее, чем у крысы. При этом изменение уровня электромиографической активности в условиях гравитационной разгрузки было одинаковым для крысы и песчанки, что обеспечивала стандартизация условий антиортостатического вывешивания задних конечностей и одинаковый выбор исследуемой мышцы - камбаловидная. Тем не менее, накопление избыточного кальция у монгольской песчанки протекает более интенсивно, нежели у крысы. Также у песчанки по сравнению с крысой отмечается более ранняя трансформация изоформного состава мышечных волокон в быструю сторону. Возможно, это связано с большим градиентом изменения концентрации ионов кальция в волокнах m. soleus монгольской песчанки относительно крысы, в связи с измененным водно-солевым балансом, что приводит к более ранней активации факторов, обусловливающих экспрессию быстрой изоформы кальциевого насоса и ТЦМ. Постепенное снижение концентрации кальция в миоплазме мышечных волокон приводит к уменьшению градиента и динамике в сторону контрольного уровня. Тем не менее, полной элиминации ионов кальция из миоплазмы камбаловидной мышцы не происходит. Это может быть связано с уменьшением уровня экспрессии SERCA, с недостатком АТФ, возможно вызванным уменьшением числа митохондрий или снижением их АТФ-синтезирующей функции. Также возможно постоянное поступление ионов кальция в мышечное волокно на протяжении всего периода разгрузки. Остается неясным ответ на вопрос, достаточно ли имеющегося уровня кальция в миоплазме волокон через 12 суток разгрузки для постоянной активации протеолитических систем или же атрофические изменения достигли своего предела и образовавшийся ионный состав адаптирован к разгрузке.

ВЫВОДЫ

1. При моделируемой гравитационной разгрузке происходит увеличение базального содержания ионов кальция в миоплазме мышечных волокон камбаловидной мышцы крысы и песчанки уже в первые сутки. При этом тенденция к снижению базального содержания ионов кальция у крысы наблюдается к 12-м суткам моделируемой разгрузки, а у монгольской песчанки ? к 7-м суткам.

2. Применение селективного блокатора медленных кальциевых каналов L-типа - нифедипина на фоне функциональной разгрузки приводит к достоверному снижению интенсивности накопления внутриволоконного кальция в камбаловидной мышце крысы, как при пероральном, так и при локальном введении.

3. Антиортостатическое вывешивание задних конечностей крысы и песчанки приводит к изменению изоформного состава Са²⁺-АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума в сторону увеличения доли волокон, экспрессирующих быструю изоформу.

4. Локальное применение внутриклеточного кальций-связывающего агента BAPTA-AM приводит к достоверному снижению базального содержания ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы крыс при краткосрочной разгрузке и достоверно снижает содержание кальпаинов, как мембраносвязанной, так и цитоплазматической фракций.

5. Динамика накопления и элиминации ионов кальция в миоплазме волокон камбаловидной мышцы в целом у крысы и монгольской песчанки схожи, однако, у песчанки эти явления имеют более выраженный характер.

Благодарности. Автор искренне признателен всем сотрудникам лаборатории миологии, способствовавших выполнению данной диссертационной работы, особенно Е.В. Пономаревой, В.А. Курушину; коллективу Института медико-биологических наук РАН и предприятия «Прогресс», обеспечивших проведение космического эксперимента на борту биоспутника «ФОТОН-М №3»; сотрудникам, Л.А. Лысенко и Н.П. Канцеровой, и заведующему, Н.Н. Немовой, лаборатории экологической биохимии Института биологии КАР НЦ. Особую благодарность автор выражает руководителям - д.б.н., проф. Шенкману Б.С. и к.ф._м.н. Огневой И.В.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах рекомендованных ВАК РФ

1. Роль кальциевых каналов L-типа в накоплении Са²⁺ в волокнах m. soleus крысы и изменении соотношения изоформ миозина и SERCA при гравитационной разгрузке / Мухина А.М., Алтаева Э.Г., Немировская Т.Л., Шенкман Б.С. // Росс. Физиол. журнал. - 2006. - Т. 92. - № 11. - С.1285-1295.

2. Сократительные свойства изолированной musculus soleus и ее скинированных волокон на ранних этапах гравитационной разгрузки: факты и гипотезы / Пономарева Е.В., Кравцова В.В., Качаева Е.В., Алтаева Э.Г., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Кривой И.И., Шенкман Б.С. // Биофизика. - 2008. - Т.53.-№ 6. - С.1087-1094.

3. Снижение электрогенного вклада Na-K-АТФ-азы и мембранного потенциала покоя как возможный механизм накопления ионов кальция в волокнах m.soleus крысы при кратковременной гравитационной разгрузке / Кривой И.И., Кравцова В.В., Алтаева Э.Г., Кубасов И.В., Прокофьев А.В., Драбкина Т.М., Никольский Е.Е., Шенкман Б.С. // Биофизика. - 2008. - Т. 53. -№ 6. - С.1051-1057.

4. Effect of short-time gravitational unloading on rat and Mongolian gerbil muscles / Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Ponomareva E.V., Shenkman B.S. // J. Muscle Res. Cell Mot. - 2009. - V. 30. - P.261-265.

5. Электрогенная активность Na-K-АТФазы и содержание ионов кальция в волокнах m. soleus крысы и монгольской песчанки при моделировании гравитационной разгрузки / Кравцова В.В., Огнева И.В., Алтаева Э.Г., Разговорова И.А., Тяпкина О.В., Никольский Е.Е., Шенкман Б.С., Кривой И.И. // Авикосм. и экол. медицина. - 2010. - Т.44. - № 2. - С.35-44.

6. Базальный уровень кальция в волокнах камбаловидной мышцы крысы при гравитационной разгрузке. Механизмы его увеличения и роль в активации кальпаинов / Алтаева Э.Г., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н., Шенкман Б.С. // Доклады академии наук. - 2010. - Т. 433. - №1. - С.138-141.

7. Динамика накопления ионов кальция и изменения изоформ Ca-АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума (SERCA) в волокнах камбаловидной мышцы крысы и монгольской песчанки в ходе моделирования гравитационной разгрузки различной длительности / Алтаева Э.Г., Огнева И.В., Шенкман Б.С. // Цитология. - 2010. - Т. 59. - № 9. - С.770-775.

8. Влияние нифедипина на механические свойства сарколеммы и модуляция динамики накопления ионов кальция в волокнах камбаловидной мышцы крысы в условиях кратковременной гравитационной разгрузки / Огнева И.В., Алтаева Э.Г. // Биофизика. - 2010. - Т. 55. - № 5. - С.918-925.

9. Сравнительный анализ структурно-функциональных характеристик камбаловидной мышцы крысы и монгольской песчанки в условиях гравитационной разгрузки различной длительности / Огнева И.В., Курушин В.А., Глашев М.М., Михайлова М.М., Пономарева Е.В., Алтаева Э.Г., Кривой И.И., Шенкман Б.С. // Биофизика. - 2010. - Т. 55. - №6. - С.1117-1123.

Публикации в материалах конференций

1. Effects of intracellular calcium decrease by nifedipine administration on myosine heavy chain and serca transformation in m.soleus under hindlimb unloading in rats / Mukhina A.M., Altaeva E.G., Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S. // International symposium «Biological motility». Pushchino, 2006. - P.129.

2. Resting intracellular calcium level as a triggering signal for soleus fiber alterations during unloading / B.S. Shenkman B.S., Mukhina A.M., Litvinova K.S., Altaeva E.G., Nemirovskaya T.L. // J. Gravit. Physiol. - 2006. - V.13. - № 1 - P.73-74.

3. Dystrophin in unloaded and strained slow muscle. Does it affect fiber atrophy and membrane permeability / Shenkman B.S., Gasnikova N.M., Tarakina M.V., Altaeva E.G., Turtikova O.V., Litvinova K.S. // Biochemistry of Exercise, 13^th International Conference - Seul, 2006 - P. 38-39.

4. Functional alterations of single muscle fibers of m. soleus at the early stage of unloading / E. Kachaeva, E. Ponomareva, E. Altaeva, B. Shenkman // J. Muscle Res. Cell Motil. - 2007. - V.28. - P.105

5. Cellular mechanisms involved in the soleus fiber alterations during gravitational unloading / Turtikova O., Shenkman B., Altaeva E., E. Kachaeva B., Tarakina M., Nikolsky E., Nemirovskaya T. // J. Muscle Res. Cell Motil. - 2007. - V.28. - P.472.

6. Alterations in basal myoplasmic calcium level in rat soleus muscle, effects of short-term gravitational unloading / Altaeva E.G. // The 12^th annual symposium for biology students of Europe. - Coimbra-Aveiro. - 2008. - P.5

7. Early adaptations in rat soleus under simulated gravitational unloading (contractility and cytoskeletal proteins) / Ponomareva E.V., Kachaeva E.V., Altaeva E.G., Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A., Shenkman B.S. // Journal of gravitational physiology - 2008. - V. 15. - P.1

8. The fiber contractility and cytoskeleton losses after 3-day hindlimb unloading / Ponomareva Е., Vikhlyantsev I., Podlubnaya Z., Altaeva E., Kachaeva E. // J. Muscle Res. Cell Motil. - 2008. -P.132.

9. Changes of transverse stiffness, contractile properties and resting calcium level in myofibres of postural muscles in Mongolian gerbils after 12-day simulated gravitational unloading / Ogneva I.V., Kurushin V.A., Ponomareva E.V., Altaeva E.G., Shenkman B.S. // 30^th Annual International Gravitational Meeting. - Xian, China. - 2009. - P. 105.

10. Regulation of calpain activities and ubiquitin-ligase expression in rat soleus during hindlimb unloading / Shenkman B.S., Kachaeva E.V., Altaeva E.G., Lysenko L.A., Kantserova N.P., Nemova N.N. // 14^th International Conference Biochemistry of Exercise. - Guelph. - 2009. - P.74.

11. Electrophysiological and contractile characteristics of rat and mongolian gerbil soleus muscle after hindlimb unloading / Krivoi I.I., Kravtsova V.V., Razgovorova I.A., Mikhailova E.V., Glashev M.M., Altaeva E.G., Ogneva I.V., Shenkman B.S. // 17^th IAA Humans in space Symposium. Book of abstracts. - 2009. - Moscow. - P. 73.

12. Signaling mechanisms, involved in the regulation of proteolysis in rat soleus during gravitational unloading / Shenkman B.S., Kachaeva E.V., Altaeva E.G., Bondareva L.A., Kantserova N.P., Nemova N.N. // 17^th IAA Humans in space Symposium. Book of abstracts. - 2009. - Moscow. P.118.

13. The state of two main proteolytic systems in the model of postural muscle disuse / Kachaeva E.V., Lysenko L.A., Altaeva E.G., Shenkman B.S. // J. Muscle Res. Cell Motil. 38^th Eur. Muscle Conf. - Lille. - 2009. - P.53.

14. Effect of short-time gravitational unloading on rat and Mongolian gerbil muscles / Ogneva I.V., Kurushin V.A., Altaeva E.G., Ponomareva E.V., Shenkman B.S. // J. Muscle Res. Cell Motil. 38^th European Muscle Conference. - Lille. - 2009. - P. 58.

15. Изменение базального уровня кальция в миоплазме камбаловидной мышцы крысы и эффекты кратковременной гравитационной разгрузки / Алтаева Э.Г., Канцерова Н.П. // IX Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики. - М. - 2010. - С.14-15.

16. Alteration of myosin phenotype in rat and Mongolian gerbil soleus under gravitational unloading / Altaeva E.G., Ogneva I.V. // Biological motility. From fundamental achievements to nanotechnologies. - Pushchino. - 2010. - P.14-15.

17. Dynamics of changes in resting calcium level and SERCA isoforms in myoplasm of soleus muscle in rat and Mongolian gerbil under gravitational unloading / Altaeva E.G., Ogneva I.V. // 31 Annual ISGP Meeting. - Trieste. - 2010. - P.83.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МПП - мембранный потенциал покоя

ППС - площадь поперечного сечения

ТЦМ - тяжелые цепи миозина

SERCA - Са²⁺-АТФаза саркоэндоплазматического ретикулума

Размещено на Allbest.ru

...