Молекулярно-генетические механизмы ретинобластомы

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ТАШКЕНТСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ

на получение академической степени магистра

УДК: 616 - 006.576.36.044

Молекулярно-генетические механизмы ретинобластомы

5А510113-Медицинская генетика

Кушалиев Олим Акрамович

Научный руководитель:

д.б.н ГильдиеваМ.С.

Научный консультант:

д.м.н Исламов З.С.

Ташкент-2014



АННОТАЦИЯ

Рост заболеваемости злокачественными опухолями, а также своеобразие и особенности опухолевого процесса у детей привели к развитию новой науки детской онкологии. Ретинобластома (retinoblastoma) - это злокачественное новообразование, развивающееся в сетчатке глаза. Ретинобластома поражает в основном детей в возрасте от 0 до 5 лет жизни [4]. Несмотря на то, что в последние годы появились сообщения о развитии РБ у детей старше 5 лет, особенности течения опухоли у них описаны недостаточно четко . В настоящее время известно, что развитие ретинобластомы обусловлено мутацией онкосупрессорного гена -Rbl, локализованного в проксимальном отделе длинного плеча хромосомы 13 - (13q14.2)[6]. Еще в 1971г. Кнудсон предложил модель канцерогенеза ретинобластомы, согласно которой для возникновения опухоли необходимо повреждение (мутация) обоих аллелей гена- Rbl [1].Вероятность возникновения опухоли у носителей мутации гена ретинобластомы (пенетрантность) высокая и составляет 90% [2].

Полученные данные позволили установить, что при ретиноблатоме дискриминационный уровень хромосомных аберраций у пациентов составил 11,2% .Частота специфических аберраций хромосом (13q-) у больных РБ составила 16,7% (5/30), у сибсов 5,1% (4/78).Остальная часть выявленных аберраций как у больных РБ, так и у сибсов носила неспецифический характер, чтобы расцениватся как хромосомная нестабильность.



THE SUMMARY

Disease growth by malignant tumours, and also originality and features of tumoral process at children have led to development of a new science of children's oncology. Retinoblastoma (retinoblastoma) is the malignant new growth developing in a retina of an eye. Retinoblastoma amazes basically children at the age from 0 till 5 years of a life [4]. In spite of the fact that last years there were messages on development retinoblastoma at children is more senior 5 years, features of a current of a tumor at them are described insufficiently accurately. Now it is known, that development retinoblastoma is caused by a mutation oncosupressor a gene-Rb1, localized in procsimal department of a long shoulder of a chromosome 13 - (13q14.2) [6]. Still in 1971y. Knudson has offered model canserogenez retinoblastoma according to which for occurrence damage (mutation) both allel gene - Rb l [1]. The probability of occurrence of a tumor at carriers of a mutation of a gene retinoblastoma (penetrates) high also makes 90 %. [2].

The obtained data have allowed to establish, that at retinoblastoma discrimination level of chromosomal aberrations at patients has made 11,2 %. Rate specific aberrations of chromosomes (13q-) at patients Rb has made 16,7 % (5/30), at sibs 5,1 % (4/78). Other part of the revealed aberrations both at patients Rb, and at sibs had nonspecific character, that as chromosomal instability.



ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль мутаций в канцерогенезе

1.2 Этиология и патогенез развития ретинобластомы

1.3 Формы и стадии ретинобластомы

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика экспериментального материала

2.2 Методы исследования

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Определение уровня специфических хромосомных и общих дискриминационных аберраций у больных с ретинобластомой и у сибсов

3.2 Проведение генеологического анализа и определить соотношения спородических и семейных форм ретинобластомы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ



СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РБ -ретинобластома

ДРБ - двусторонняя ретинобластома

ОРБ - односторонняя ретинобластома

ДЗН - диск зрительного нерва

ЦНС - центральная нервная система

ВЗО - вторая злокачественная опухоль

КТ - компъютерная томография

МРТ - магнитно-резонансная томография

РИИ - радиоизотопное исследование

УЗИ - ультразвуковое исследование

RE - Reese-Ellsworth

НХТ - неоадъювантная химиотерапия

ИХТ - интенсивная химиотерапия

ВХТ - высокодозная химиотерапия

ПСК - периферические стволовые клетки

CEV - карбоплатин, этопозид, винкристин

ДЛТ - дистанционная лучевая терапия

СОД - суммарная очаговая доза

ДНК -дузоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК- матричная рибонуклеиновая кислота

М - отдалённые метастазы.

Мх - недостаточно данных для оценки отдалённых метастазов.

Мо - метастазов нет.

М1 - имеются отдалённые метастазы.

АТФ - аденозинтрифосфат



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Рост заболеваемости злокачественными опухолями, а также своеобразие и особенности опухолевого процесса у детей привели к развитию новой науки детской онкологии. В офтальмологии выделилась офтальмоонкология, в том числе и детская. Организация офтальмоонкологической службы и специальных центров связана со специфичностью течения опухолевых процессов у детей, первичным обращением больных к офтальмологам, применением специальных диагностических методик для выявления этой сложной патологии органа зрения.

Важность изучения проблемы ретинобластомы подтверждена и созданием в 1989-1991 г.г. специальной международной группы по изучению ретинобластомы RISC с центром в Филадельфии (США).

Ретинобластома (РБ) - единственная злокачественная опухоль сетчатки, встречающаяся в детском возрасте. В последние десятилетия частота РБ увеличилась 1:34 000 до 1:15 000-1:20 000 новорожденных [44]. В Узбекистане 1:20000[5].В последние 10 лет наблюдается не только рост заболеваемости, но и увеличение частоты билатеральных форм с мультицентричным ростом опухоли[17]. Отмечена тенденция к "повзрослению" РБ: увеличивается число детей старше 5 лет, страдающих РБ [13]. Примерно в 30 % случаев процесс бывает двусторонним, нередко носит семейно-наследственный характер. [22] Ретинобластома составляет 2,5--4,5% всех злокачественных опухолей у детей до 15 лет. [41,52,66]

Несмотря на множество публикаций, посвященных РБ, многие вопросы остаются дискутабельными и неразрешенными [50]. Нет единого мнения о факторах, влияющих на развитие, клиническое течение и эффективность лечения РБ. Данные о росте заболеваемости в регионах с повышенной радиоактивностью и индустриально развитых зонах разноречивы. По данным разных авторов, РБ одинаково часто поражает как мальчиков, так и девочек [71] с небольшим преобладанием мальчиков при спорадических формах опухоли. Зарубежные авторы не отмечают особых различий в расовой принадлежности больных, эндемичности по различным регионам и населенным пунктам [54,59,67].

Ретинобластома поражает в основном детей в возрасте от 0 до 5 лет жизни. [25,34,11]. Несмотря на то, что в последние годы появились сообщения о развитии РБ у детей старше 5 лет, особенности течения опухоли у них описаны недостаточно четко. Оказалось, что увеличивается как число заболевших в старшем возрасте, так и частота врожденных и далекозашедших форм болезни [48]. А между тем, все еще отсутствуют методы ранней диагностики опухоли.

К сожалению, в последние годы утрачены те навыки и организационные достижения, которые использовались ранее при обследовании новорожденных в роддомах и поликлиниках. Офтальмопедиатры не осматривают новорожденных в роддомах, а в поликлиниках часто пренебрегают жалобами родителей на косоглазие и даже свечение зрачка у ребенка. В результате потери времени дети попадают в специализированные клиники на далеко зашедших стадиях заболевания, что ограничивает выбор методов лечения и делает невозможными органосохранные операции. Отсутствуют программа обследования детей и критерии, позволяющие выявить группы риска по ретинобластоме, методы ее профилактики и ранней диагностики.

В последние годы появились новые цитостатики, позволяющие разрушить первичный очаг внутри глаза, но сведения о применяемых дозах и протоколах разноречивы, не выработана схема органосохраняющего лечения при больших и мультицентричных опухолях [54]. Нет должного внимания к социальной реабилитации детей, выживших после лечения. Стольпротиворечивые и неполные данные объясняются отсутствием достаточного клинического материала и комплексныхмногоцентровых исследований, необходимых для выработки обоснованной тактики обследования, лечения и реабилитации больных РБ.Все вышеперечисленное подчеркивает актуальность и целесообразность исследований по данной проблеме.

Цель исследования: Ранняя диагностика больных с ретинобластомой и прогнозирование высокого риска развития ретинобластомы среди здоровых родственников первой степени родства.

Задачи исследования:

1. На основании цитогенетического обследования больных РБ и их родственников выявить специфические и дискриминационные нарушения структуры хромосом при ретинобластомы.

2. Провести генеологический анализ родословных.

3.Определенее группы высокого риска по наследственной патологии.

Практическая значимость.

Проведенные генетические анализы дадут возможность предсказывать рождения ребенка с этой патологией. Эту возможность можно будеть преминят в генетической консультации и предупреждать рождения ребенка с данным заболеванием

Научная новизна. Полученные данные в ходе экспериментов расширят представления о возникновении и развитии ретинобластомы. Уточнит роль генетических факторов в возникновении данной патологии среди узбекской популяции.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 70 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель включает - 7 источников, из которых - 41 русскоязычных и 38 - дальнего зарубежья.



ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль мутаций в канцерогенезе

Повреждения гена р53 играют центральную роль в канцерогенезе человека. Точечные мутации и делеции гена р53 наблюдаются примерно в 50% случаев злокачественных заболеваний, хотя частоты повреждений варьируют в зависимости от типа опухоли [56,76,].

В отличии от дикого р53, мутанты обладают свойствами онкогенов : точечные мутанты могут иммортализовать первичные фибробласты [34,45,66] и кооперировать с онкогенами в экспериментах по трансформации клеток [12,32,54]. Мутантный р53 может вносить вклад в развитие канцерогенеза либо посредством инактивирования дикого р53, либо вследствии преобретения им новых онкогенных свойств (так называемые "gain of function" мутации ).

Иследования последних лет показали, что мутации гена р53 - наиболее распространенная черта различных опухолей человека. В карциномах большинство мутаций (75-80%) являются миссенс- мутациями , продукт которых - дефектный белок; второй аллель в этих клетках, как правило, делетирован ( Shields C.L. 2004)

В саркомах наряду с миссенс-мутациями встречаются делеции , инсерции и перестройки гена р53[57,64,67].

В саркомах часто сохраняется немутированный р53, что сопровождается амплификациями онкогенов, продукты которых инактивируют р53 [19]

Природа мутаций, наблюдаемых в локусе р53, по-видимому, зависит от тканевой специфики опухоли. Этот факт может быть следствием селекции определенных типов мутантных белков в карциномах, или отражать механизм мутагенеза, который, по- видимому, различен в клетках различных типов тканей. Миссенс- мутации р53 часто встречаются при карциномах мозга [73,75], карциномах молочной железы [65,68,74]

, карциномах пищевода[34,45.65]

, карциномах желудка [65,74], карциномах печени [45,61], карциномах легких [54], карциномах лимфоидной системы [38], карциномах яичников, карциномах простаты . Большинство из этих мутаций находятся в высококонсервативных областях гена. Чаще других встречаются мутации в 175, 248, 249, 273, и 282 кодонах (так называемых "горячих точках" мутаций р53).

Различные клетки (или типы тканей) характеризуются своими характерными горячими точками мутаций р53. Например, в опухолях печени у пациентов из южного Китая или южной Африки мутация р53 в 249 кодоне наблюдается наиболее часто (53% из всех рассмотренных примеров) [44,56,75]. Однако не ясно, является ли предпочтительность замен аминокислот по определенным кодонам в р53 результатом селекции специфичного мутантного аллеля в клетках печени, или же это последствие воздействия определенного класса мутагенов. В пользу второй гипотезы говорит тот факт, что в случае рака легких примерно с равной частотой встречаются как транслокации , так и трансверсии в р53 локусе, в то же время опухолям толстой кишкисвойственны только транслокации р53. Природа воздействующих на эпителий легких и толстой кишки мутагенов различна. ретинобластома онкологический хромосомный мутация

Кроме соматических мутаций в гене р53, которые обнаружены в 50-60% известных злокачественных опухолях человека, р53 мутации встречаются и в клетках эмбриональных линий от пациентов с синдромом Ли-Фраумени [42]. Синдром Ли- Фраумени является наследственной предрасположенностью к возникновению и развитию различных злокачественных новообразований, что, по-видимому, связано с передаваемым врожденным дефектом одного из аллелей р53. Для этих пациентов характерны как миссенс- так и нонсенс-мутации р53[32,65,70]. Интересно, что у пациентов с синдромом Ли-Фраумени чаще возникают остеосаркомы , а также аденокортикоидные карциномы , рак молочной железы илирак мозга . Рак толстой кишки , который характеризуется высоким уровнем соматических мутаций р53, встречается, напротив, очень редко [50].

Развитие технологии трансгенных животных позволило смоделировать процесс влияния наследуемой мутации р53 в одном из аллелей на возникновение опухолей. В отличие от контрольных, у 20% трансгенных мышей, несущих дополнительный мутантный аллель р53, возникали злокачественные опухоли в 6-9 месячном возрасте[53] .

1.2 Этиология и патогенез развития ретинобластомы

Ретинобластома является врожденной опухолью, хотя редко диагностируется к моменту рождения ребенка.Ретинобластома может возникать спорадически (случайно), но может быть и наследственной. Ретинобластома имеет в большом проценте случаев четкие генетические поломки, выявляемые в одной из 13-ой пары хромосом (ген RB1)

Идентифицированы гены, врожденные мутации которых приводят к развитию наследственных и семейных форм злокачественных опухолей. К таким генам относится ген ретинобластомы (Rb), при терминальных мутациях которого развивается врожденная форма ретинобластомы .

Ген Rb картирован. Цитогенетические методы показали, что многие случаи наследственных и спорадических форм сопровождаются делецией в участке 13q14 хромосомы человека[14,45,64]. Использование тесно сцепленного с геном Rb гена, кодирующего фермент эстеразу D , а также синтенных полиморфных рестрикционных фрагментов (RFLP ), подтвердило локализацию гена Rb в локусе 13q14 .

Белковый продукт гена Rb контролирует продвижение клетки по циклу деления. Регуляция функции pRb (белка, кодируемого геном Rb ) осуществляется путем его фосфорилирования-дефосфорилирования [60]. В неделящихся клетках (G0) pRb дефосфорилирован. В G1 он постепенно фосфорилируется и в гиперфосфорилированном состоянии пересекает "точку рестрикции", отделяющую G1 от S-фазы - фазы синтеза ДНК. Затем pRb дефосфорилируется - до начала нового митотического цикла. Активность фосфорилирования определяется циклином D , взаимодействующим с митогенными сигналами. Мутации pRb делают этот белок независимым от митогенных сигналов, создающим непрерывное (и потому нерегулируемое) прохождение клеток сетчатки по циклу, что лежит в основе возникновения ретинобластомы .

Развитие ретинобластомы связано с потерей или инактивацией обоих аллелей гена. Так, если в нормальных клетках больной с гетерозиготной делецией по участку 13q14 уровень активности эстеразы D составлял 50% нормальной активности фермента, то в клетках ретинобластомы той же больной фермент не выявлялся. При этом произошла потеря гомологичной хромосомы 13, не содержащей делеции [54,58,66]. Использование RFLB, синтенных с геном Rb, показало потерю гетерозиготности по участку 13q14 во всех исследованных опухолях []32,65,73].

Ген Rb был клонирован и секвенирован [43,51,63,73].

Анализ гена Rb человека показал, что этот ген имеет очень большие размеры (200 кб). Он содержит 27 экзонов и кодирует ядерный белок RB [14,63,75].

Отнюдь не только делеции приводят к потере гетерозиготности при ретинобластоме. Были выявлены самые разные изменения в локусе 13q14. Помимо потери целой хромосомы 13, встречались делеции разных размеров, различные структурные перестройки и точечные мутации [43,44,65].

Ген Rb экспрессируется во всех тканях, кодируя мРНК размером 4,7 кб. При различных мутационных изменениях транскрипты Rb либо вовсе не выявлялись, либо присутствовали аномальные (укороченные, truncated ) мРНК, в то время как в нормальных тканях тех же больных и в клетках других типов опухолей (нейробластомы, миеломы и др.), присутствовал нормальный транскрипт[34,51,58]. Это явление наблюдалось как при наследственной, так и при спорадической формах. Потеря гетерозиготности может возникать также в результате таких событий, как нерасхождение, митотическая рекомбинация, генная конверсия, а также импринтинг (imprinting).

Примерно у 50% гетерозиготных носителей герминальной мутации возникает ретинобластома, т.е. эта частота на много порядков превышает темп спонтанного мутирования гена Rb . По-видимому, частота второго события, приводящего к гомозиготности ( или гемизиготности) является результатом суммарных частот всех перечисленных механизмов.

Совокупность полученных данных полностью подтвердила гипотезу Кnudson об едином механизме возникновения наследственной и спорадическолй форм ретинобластомы, связанном с утратой или инактивацией гена Rb, т.е. во всех случаях с потерей генетической информации. Таким образом, если на уровне организма предрасположенность к ретинобластоме наследуется как доминантный признак, то на клеточном уровне мутации Rb рецессивны. Отсюда следует, что опухолеобразованию препятствует доминантный нормальный аллель, который обладает супрессорным действием.

Ген ретинобластомы ( Rb ген ) был открыт первым из антионкогенов и является наиболее известным из них. Тем не менее, механизм подавления роста клеток геном Rb остается неясен. Существование Rb гена было впервые предположено А. Кнудсоном. Впоследствии было показано, что развитие ретинобластомы вызывается мутацией в гене, имеющем хромосомную локализацию 13q14 [11,43,54] Мутации гена Rb, приводящие к его инактивации, связаны с развитием ряда опухолей. У пациентов с ретинобластомой мутации гена Rb были найдены в 100% случаев [66,71]

Следует отметить, что в отличии от онкогенов , где для развития опухоли может быть достаточно мутации в одном аллеле, для развития ретинобластомы должны быть инактивированы оба аллеля Rb гена.

Мутационная инактивация гена Rb обнаружена также в таких опухолях, как мелкоклеточная карцинома легких, остеосаркома,карцинома мочевого пузыря и карцинома простаты .

Введение активного Rb гена в трансформированные клетки с дефектным Rb во многих случаях ведет к подавлению злокачественных свойств, включая способность вызывать опухоли у мышей с ослабленным иммунитетом [69].

Помимо человека, Rb ген был выделен у некоторых других видов позвоночных, включая мышь, цыпленка и лягушку [54,62,66,71].

Мышиный Rb ген гомологичен человеческому на 88%, причем по идентичным аминокислотным остаткам гомология составляет 91% [51,65,76]. У мышей, гетерозиготных по мутантному Rb гену, с высокой частотой развиваются опухоли гипофиза , для которых характерна инактивация обоих аллелей Rb гена [39,63]

Было показано, что Rb ген экспрессируется во всех нормальных тканях [56]. Однако, только в некоторых тканях инактивация обоих аллелей приводит к неконтолируемому росту.

Предполагают, что Rb является ключевым элементом из нескольких систем регуляции роста. По-видимому, в различных тканях различные системы действуют с различной эффективностью, поэтому только в некоторых типах клеток система Rb не дублируется другими системами контроля роста. Кроме того, предполагают, что инактивация системы Rb может способствовать промотированию канцерогенеза в клетках, которые обычно резистентны к трансформации за счет инактивации Rb, если уже произошло повреждение одного или нескольких других регулирующих механизмов[31].

Показано, что повышенная экспрессия Rb гена подавляет рост фибробластов человека, а также клеток эпителия молочной железы .

Введение дополнительных копий Rb гена в трансгенную мышь, повышающее экспрессию Rb в 2-3 раза, приводит к уменьшению размеров животных [19,32,49]

Исследования гена Rb и его белка привели [13] к построению модели роли Rb в регуляции клеточного цикла .

Локус RB1 расположен на хромосоме 13 и занимает около 200000 п.н. Он содержит 27 экзонов, длина интронов варьирует от 80 п.н. (интрон 15) до 60000 (интрон 17) [66,69,74,77]

1.3 Формы и стадии ретинобластомы

Различают пять стадий развития опухоли:

1) латентную;

2) начальную;

3) развитую;

4) далеко зашедшую;

5) терминальную.

Для латентной стадии ретинобластомы характерны такие ранние косвенные признаки, как одностороннее расширение зрачка, замедление или отсутствие его реакции на свет. Более выражен бывает не прямой, а содружественный зрачковый рефлекс. Может быть уменьшена глубина передней камеры. Эти признаки могут сочетаться с небольшими изменениями на глазном дне.

Начальная стадия характеризуется тем, что при офтальмоскопии на глазном дне обнаруживается желтовато-белый очаг с нечеткими контурами, часто покрытый сосудами сетчатки. Вокруг очага наблюдаются мелкие очажки-сателлиты. Рост опухоли приводит к амаврозу (слепоте). Опухоль может распространяться в стекловидное тело в виде серовато-белых, иногда желтоватых или зеленоватых масс с нерезкими границами, на поверхности которых видны геморрагии. Ретинобластома обнаруживается при боковом освещении и невооруженным глазом по желтому свечению области зрачка. Именно последний симптом обычно заставляет родителей показать ребенка окулисту. Процесс может распространяться по сетчатке (экзофитный рост) и в сторону стекловидного тела (эндофитный рост). Появление отслойки сетчатки затрудняет диагностику.

Развитая стадия (стадия глаукомы) характеризуется ростом опухоли и увеличением объема содержимого глаза, что нередко приводит к повышению внутриглазного давления. При этом возможны боли в глазу, застойная инъекция, отек роговицы, уменьшение глубины и помутнение влаги передней камеры (псевдогипо-пион) в связи с тем, что отдельные частицы опухоли отрываются и рассеиваются внутри глаза. Зрачок расширен и не реагирует на свет. В отдельных случаях в радужке обнаруживают импланта-ционные узелки, напоминающие туберкулезные.

Далеко зашедшая стадия (стадия прорастания). Этой стадии ретинобластомы присуще прорастание опухоли за пределы глазного яблока, чаще сквозь склеру, вдоль сосудов, через оболочки зрительного нерва и т. д. Прорастание опухоли кзади проявляется экзофтальмом с ограничением подвижности глаза, распространение процесса в полость черепа вызывает расширение канала зрительного нерва, выявляемое на рентгенограмме.

В терминальной стадии (стадии метастазов) определяются увеличенные шейные, подчелюстные лимфатические узлы, со стороны глаза наблюдаются дальнейшие грубые изменения вплоть до распада оболочки и резчайшего экзофтальма (глаз вывихнут). Выявляются опухолевидные образования в костях черепа, бывают увеличены и бугристы печень, селезенка, почки и другие органы. Процесс сопровождается болевым синдромом, началом кахексии, изменениями картины крови.

Клиническая картина. Ретинобластома может быть односторонней и двусторонней. Двусторонние опухоли часто сочетаются с микроцефалией, незаращением неба и другими пороками эмбрионального развития. Начало заболевания обычно проходит незаметно. Первым клиническим симптомом может быть понижение остроты зрения. Иногда ранним клиническим признаком одностороннего поражения может быть косоглазие. Затем присоединится изменение цвета глаза (желтоватый рефлекс), наблюдаемое в глубине глазного яблока и видимое через зрачок (так называемый амавротический кошачий глаз). Такое явление возникает из-за наличия глиоматозных узлов на сетчатке и заставляет родителей ребенка обратиться к врачу. Опухоль отличается медленным ростом.

В клинике ретинобластомы при объективном исследовании глазного дна различают четыре стадии.

На первой стадии видны ретинальные беловато-розовые очаги с гладким или неровным рельефом, новообразованными сосудами и серыми участками кальцификатов. Размеры их не превышают одного квадранта глазного дна, окружающие ткани не изменены.

На второй стадии происходит интраокулярная диссеминация. Беловатые включения различных размеров уже наблюдаются в стекловидном теле, отмечаются преципитатоподобные отложения в углу передней камеры глазного яблока и на задней поверхности роговицы. Появляются вторичная глаукома, буфтальм (гидрофтальм). При прорастании опухолью сетчатки скопление под ней экссудата приводит к отслойке сетчатки. Зрение снижается до полной слепоты.

Третья стадия характеризуется экстраокулярным распространением опухоли. Сопровождающееся экзофтальмом прорастание опухоли в полость черепа, чаще всего по зрительному нерву, дает симптомы поражения головного мозга (головную боль, тошноту, рвоту). Прорастание ретинобластомы в сосудистую оболочку глаза приводит к гематогенному диссеменированию и неблагоприятному исходу. В результате некроза опухоли может развиться токсический увеит.

На четвертой стадии к глазной симптоматике присоединяются симптомы, обусловленные метастазированием. Метастазирова-ние происходит в лимфатические узлы, кости, мозг, печень и другие органы.

Осложнения и диагностика. Осложнением ретинобластомы при благоприятном исходе может быть потеря зрения на одном или обоих глазах. Возможным осложнением является развитие ретино-бластомы в саркому (рабдомиосаркому), лейкоза. Диагностическим критерием ретинобластомы на первой стадии заболевания служит обнаружение амавротического кошачьего глаза. Для объективного подтверждения диагноза прибегают к офтальмоскопии, рентгенографии, ультразвуковому исследованию глазного яблока и черепа. Ретинобластому следует дифференцировать от псевдоглиомы, которая возникает в результате воспалительного процесса, а также ее нужно различать с организовавшимся кровоизлиянием, пролиферирующим ретинитом, отслойкой сетчатки, болезнью Коут-са, цистицеркозом, туберкулезом и т. д. Для постановки диагноза важны анамнез (перенесенные инфекционные заболевания), наличие в некоторых случаях на рентгенограммах орбиты очагов обызвествления. Помогают в диагностике диафаноскопия и эхографи-ческие исследования.

Лечение и профилактика. На первой и второй стадиях болезни возможно проведение органосохранной криоаппликации. На более поздних стадиях лечение заключается в своевременном проведении хирургического удаления опухоли (энуклеации пораженного глаза при одностороннем процессе или обоих глаз при двустороннем). Энуклеация глазного яблока проводится с резекцией зрительного нерва на расстоянии 10-15 см от заднего полюса глазного яблока. В дальнейшем проводится лучевая терапия в сочетании с химиотерапией или самостоятельно. Может проводиться и фотокоагуляция. В качестве противоопухолевых препаратов применяют циклофосфан, проспедин, метотрексат-эбеве.

Профилактика ретинобластомы заключается в своевременном генетическом обследовании тех семей, чьи родственники проходили лечение по поводу ретинобластом в прошлом.

TNM - клиническая классификация ретинобластомы у детей

Степень вовлечения сетчатки выражают в процентах

Т - первичная опухоль.

Тх - недостаточно данных для оценки первичной опухоли.

То - нет признаков первичной опухоли.

Т1 - опухоль занимает 25% или меньше глазного дна.

Т2 - опухоль занимает >25% сетчатки, но не более 50%.

Т3 - опухоль занимает >50% сетчатки, и/или выходит за пределы сетчатки, но располагается внутри глаза.

Т3а - опухоль занимает >50% сетчатки и имеются злокачественные клетки в стекловидном теле.

Т3в - вовлечение в процесс зрительного нерва.

З3с - вовлечена передняя камера, наличие или отсутствие распространения на увеальный тракт.

Т4 - опухоль с экстраокулярным ростом.

Т4а - прорастание в ретробульбарный зрительный нерв.

Т4в - другое экстраокулярное распространение.

No - метастазов в лимфоузлах нет.

N1 - метастазы в региональных лимфоузлах.

М - отдалённые метастазы.

Мх - недостаточно данных для оценки отдалённых метастазов.

Мо - метастазов нет.

М1 - имеются отдалённые метастазы.

m - множественные опухоли

f - для обозначения случаев с семейным анамнезом.

d - для обозначения диффузного вовлечение сетчатки.

Морфологическое строение опухоли.

Последние исследования показали, что ретинобластома является опухолью нейроэпителиального происхождения, которую можно рассматривать как одну из примитивных нейроэктодермальных бластом детского возраста. Вероятно, она происходит из ретино-предшествующих клеток, и поэтому клетки опухоли имеют некоторое структурное подобие ретинофоторецепторных и амакринных клеток. Строма в опухоли отсутствует. В зависимости от степени дифференциации опухолевых клеток различают ретинобластому, встречающуюся чаще, и ретиноцитому. Более злокачественной из них является первая, недифференцированная форма. При ней клетки опухоли группируются вокруг сосудов, образуя так называемые псевдорозетки. Ретиноцитома, дифференцированная форма опухоли, состоит из более дифференцированных клеток, из которых образуются истинные розетки Флекснера-Винтерштейнера. Возможно смешанное строение опухоли.

Ретинобластома характеризуется быстрым ростом и, вследствие недостаточного кровоснабжения, некротизируется. В очагах некроза откладываются соли кальция, образуя характерные для больших опухолей кальцификаты. Классически различают два вида макроскопического роста опухоли -- эндофитный, при котором опухоль растет в направлении центра глаза, разрушая внутренние слои сетчатки и стекловидное тело, и экзофитный, или стелящийся, при котором опухоль инфильтрирует преимущественно наружные слои сетчатки, распространяясь в сторону субретинального пространства. Большие опухоли с экзофитным ростом могут вызвать отслоение сетчатки с последующим накоплением субретинального транссудата. Оба вида роста опухоли не имеют значимого прогностического значения.

Редко, в 1--2% случаев, у детей старшего возраста может наблюдаться инфильтрата вная форма ретинобластомы, характеризующаяся диффузным утончением сетчатки, скоплением эксудата в передних отделах стекловидного тела, ранним проявлением псевдогипопиона и передних спаек.

Проявление заболевания разнообразно и зависит от размера опухоли, места ее локализации и типа роста. Вначале опухоль располагается в пределах сетчатки. Затем, по мере роста, нарушает стекловидную пластинку, распространяется на сосудистую оболочку и стекловидное тело. По мере эндофитного роста бластомы формируется проминирующий в стекловидное тело узел серовато-беловатого цвета круглой или овальной формы. Узлы ретинобластомы могут быть единичными или множественными. Острота зрения при локализации опухоли в центральных отделах глазного дна рано и резко снижается, и появляется косоглазие.

В случаях расположения опухоли на периферии зрение резко снижается по мере ее распространения в центральную зону глазного дна.

Опухоль, увеличиваясь в размерах, может заполнить всю полость глазного яблока, прорастает сосудистую оболочку. В результате разрушения и прорастания трабекулярного аппарата глаза нарушается отток внутриглазной жидкости и повышается внутриглазное давление. Появляются боли в глазу, застойная инфекция, отек роговицы, наблюдается расширение зрачка и отсутствие его реакции на свет. У детей младшего возраста под влиянием повышенного офтальмотонуса глазное яблоко, как правило, увеличивается. При обширных дистрофических изменениях и некрозе ткани опухоли нередко развивается воспалительный процесс (иридоциклит, увеит). Вследствие отека орбитальной клетчатки может возникнуть экзофтальм. При росте опухоли за пределы глазного яблока, в глазницу, этот симптом появляется раньше и быстро нарастает. Возможно разрушение костных стенок глазницы и проникновение опухоли в околоносовые пазухи.

При распространении ретинобластомы по зрительному нерву в полость черепа (в субарахноидальное пространство) наблюдаются мозговые симптомы (головная боль, тошнота, рвота). Прорастание опухоли через стенку глазного яблока приводит к формированию экстрабульбарного узла. При распространении опухоли кпереди возможно появление очагов некроза роговицы.

Ретинобластома характеризуется лимфогенным и гематогенным метастазированием. В первом случае метастазы появляются в околоушных, подчелюстных и шейных лимфатических узлах, а во втором -- в костях черепа, трубчатых костях нижних конечностей и печени. В редких случаях можно наблюдать спонтанную регрессию ретинобластомы, что связывают с иммунологическими факторами и нарушением кровообращения.

Ретиноблсатома это злокачественная опухоль сетчатки глаза, которая встречается от 0 до 5 лет. Опухоль имеет семейные и спорадические формы. Делеция 13 пары хромосом является одним из этиологических факторов данной патологии. Проявление заболевания очень разнообразно и зависит от размера опухоли, от места ее локализации , типа роста. По началу опухоль располагается в пределах сетчатки. После чего, по мере роста, нарушает стекловидную пластинку, распространяется на сосудистую оболочку и стекловидное тело. По мере эндофитного роста бластомы формируется проминирующий в стекловидное тело узел серовато-беловатого цвета круглой или овальной формы. Узлы ретинобластомы могут быть единичными или множественными. Ретиобластома может быть как с одной стороне, так и с двух сторон. Осложнением ретинобластомы может быть потерия зрения, возможно проявления саркомы.



ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика экспериментального материала

Материалом для цитогенетических исследований была использована периферическая кровь больных ретинобластомой, их пробандов, и здоровых людей. Для определения хромосомных аберраций из форменных элементов крови брали лимфоциты которые, служат объектом цитогенетического анализа у человека.

Цитогенетический анализ проводился 30 пациентам ретинобластомой, 30 здоровым людям, 78 робандам и 1 пациенту с псевдоретинобластомой.

Все операции при работе с ростовыми средами и репаратами проводили в стерильных условиях с использованием ламинарного бокса. Буферы были приготовлены на бидистиллированной воде, отфильтрованы через мембранные фильтры(0,22 мкм «Millipor», Германия ) и автоклавированы при 1,2 атм 30 мин.

Стеклянная посуда перед использованием была предворительна стерилизована при 1600С в течении 120 мин. Приспособления, посуда из полимерных материалов подвергались облучению ультрафиолетовым светом в течении 30 мин.

2.2 Методы исследований

Характеристика цитогенетического метода.

В 1956г. было доказано, что в соматических клетках человека содержится 46 хромосом (в половых 23 хромосомы) - носителей генетической информации. В конце 60-х - начале 70-х годов были разработаны методы, позволяющие различить каждую хромосому и исследовать ее структуру. Благодаря этому было установлено, что множество тяжелых врожденных заболеваний определяется нарушениями структуры хромосом или их количества в клетке.

Первое условие цитогенетической диагностики - наличие делящихся клеток в материале для цитологического исследования.

Костный мозг, ткани семенника и хорион имеют достаточный митотический индекс для использования в цитогенетике. Однако, как показал опыт, несравненно информативнее исследование на культурах клеток: клетки освобождены от элементов соединительной ткани и хорошо суспендируются. Митотический индекс в культуре клеток много выше, чем в тканях организма.

Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови (рис. 1.).

Рис. 1. Приготовление цитогенетических препаратов путем культивирования лимфоцитов периферической крови



Для ее получения достаточно взять 1-2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Он вызывает иммунную трансформацию и деление лимфоцитов. Продолжительность культивирования составляет 48-72 ч.

Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы.Колцемид добавляют в культуры клеток за 2-3 ч до окончания культивирования: митотический индекс в культуре клеток за 2-3 ч повышается в 2-3 раза. Даже без культивирования экспозиция с колцемидом увеличивает число метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются в результате продолжающейся конденсации, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой.

Если необходим детальный анализ определенного района хромосомы, сильно конденсированные хромосомы на стадии метафазы (метод называется метафазным) непригодны для анализа. Клетку нужно зафиксировать на стадии, предшествующей метафазе, когда хромосома редуплицировалась, но еще не полностью конденсировалась. Это стадия прометафазы. Хотя хромосомы на стадии прометафазы плохо разъединены (они еще очень длинные), и в препарате много наложений одной хромосомы на другую, что, безусловно, затрудняет анализ, все же в отдельных клетках можно найти нужный участок, пригодный для анализа. Этот метод (или подход), в отличие от метафазного метода, называют прометафазным, или методом высокоразрешающей цитогенетики. Суть модификации метода состоит в прекращении процесса спирализации и конденсации хромосом в профазе с помощью препаратов, например метатрексата, которые вводят в культуру клеток за несколько часов до фиксации.

Следующее условие для получения хороших метафазных пластинок - гипотонизация клеток (гипотонический шок). Обычно для этого используют гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся, и хромосомы свободно плавают в цитоплазме.

Культивирование клеток, применение колцемида и гипотонизация стали условиями, на основе которых сформировались современные цитогенетические методы.

Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), затем суспензию центрифугируют и меняют фиксатор.

Смесь клеток с фиксатором может сохраняться при температуре +4 °С в течение нескольких недель. При нанесении такой суспензии на чистое предметное стекло метафазная клетка расправляется и в ее пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. При высыхании фиксатора хромосомы прикрепляются к стеклу.

Выше описана методика получения препаратов из культуры лимфоцитов, которая используется наиболее часто. Для диагностических целей можно готовить препараты из хориона, костного мозга, семенников, культуры фибробластов, культуры амниоцитов. Процедуры для каждого объекта отличаются от описанной выше, но общий принцип сохраняется: накопление метафаз, гипотонизация, фиксация, капанье на предметное стекло, окраска, кариотипирование.

Окраска препаратов

Следующая стадия цитогенетических методов - окраска препаратов. Методы окраски бывают простыми, дифференциальными, флюоресцентными.

Наиболее распространен метод окраски по Гимзе, или простая окраска (в русскоязычной литературе распространен также термин «рутинная окраска»). Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине (рис. 2.) При этом контурируются центромера, спутники (иногда со спутничными нитями) и вторичные перетяжки. Механизм связывания красителя

Гимзы хромосомами неясен. Он не является специфичным для какого-либо азотистого основания ДНК.

Рис. 2. Метафазная пластинка при простой окраске

При простой окраске возможна только групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Структурные хромосомные аномалии (делеции, транслокации, инверсии), выявляемые при простой окраске, должны быть идентифицированы с помощью дифференциальной окраски.



Рис. 3. Метафазная пластинка с радиационно-индуцированными хромосомными аберрациями

Рис. 4. Метафазная пластинка (неполная) с химически-индуцированными аберрациями



Простая окраска широко применяется для изучения хромосомного мутагенеза (учет хромосомных аберраций) при проверке факторов окружающей среды на мутагенность. На рис. 4. хорошо видны аберрации, возникшие под влиянием радиации и химических мутагенов.

Метод простой окраски хромосом как единственный метод изучения кариотипа человека применялся до начала 70-х годов XX в. С его помощью за 10 лет были открыты основные хромосомные болезни, показана роль хромосомных аномалий в спонтанных абортах, врожденных пороках развития и канцерогенезе, разработаны принципы биологической дозиметрии.

Морфологическая однородность хромосомы по длине на стандартно приготовленных и окрашенных по Гимзе препаратах обманчива. Прогресс цитогенетики человека позволил выявить глубокую линейную дифференцированность не только функции, но и структуры хромосом. В 70-х годах в практику вошли методыдифференциального окрашивания.

Под дифференциальной окрашиваемостью хромосом понимают их способность к избирательному окрашиванию по длине без прижизненной модификации какими-либо воздействиями. Дифференциальное окрашивание хромосом обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в чередовании эу- и гетерохроматиновых районов (темные и светлые полосы). Протяженность этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Как видно на рисунках 5 и 6, при дифференциальной окраске идентифицируются все хромосомы, плечи и даже определенные районы. Каждая хромосома имеет свой рисунок исчерченности. При дифференциальной окраске метафазных хромосом в кариотипе можно оценить около 200-400 участков (разрешающая способность метода), на стадии прометафазы - до 2000.



Рис. 5. Метафазная пластинка после дифференциальной окраски

Первоначально при специальном окрашивании хромосом использовали флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом, он требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

Рис.6. Кариотипы при простой (а) и дифференциальной (б) окраске



В дальнейшем была разработана методика дифференциальной окраски без флюоресцентных красителей. Наиболее широко используется G-окраска (по Гимзе). Хромосомы нужно предварительно обрабатывать (инкубация в солевом растворе либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, в некоторых участках она восстанавливается при окраске, что и придает хромосоме индивидуальную исчерченность. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты - это гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные - это эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.

Для идентификации хромосом, помимо методов выявления линейной структурной дифференцированности, можно воспользоваться одной из важных характеристик хромосом человека - асинхронностью их репликации по длине. Этот метод разработал талантливый отечественный цитогенетик А.Ф. Захаров о его роли в цитогенетике можно прочитать на компакт-диске. «Рисунки» последовательности репликации (рано или поздно реплицирующиеся участки) специфичны для каждой хромосомы. Для выявления последовательности репликации применяется аналог тимидина - 5-бромдезоксиуридин.

Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо. Используя этот метод, можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку.

5-бромдезоксиуридин вводят в культуру на 24 ч и более для дифференциальной окраски сестринских хроматид. Если 5-бромдезоксиуридин ввести на полный клеточный цикл, то вновь образуемая хроматида включит аналог тимидина и будет окрашиваться слабо. Другая хроматида (старая) окрашивается, как обычно, интенсивно (рис.7). Этот метод позволяет легко выявлять обмены между сестринскими хроматидами, число которых увеличивается при наследственных болезнях с хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, пигментная ксеродерма и др.) (рис. 8).

Рис. 7. Метафазная пластинка с дифференциальной окраской сестринских хроматид

Число обменов сестринских хроматид увеличивается также при мутагенных воздействиях, поэтому метод учета обменов сестринских хроматид широко используется при изучении мутационного процесса у человека.

Рис. 8. Хроматидные аберрации (а) и сестринские хроматидные обмены (б) при заболеваниях с хромосомной нестабильностью



Ряд нарушений структуры или количества хромосом не проявляется никакими симптомами. Единственной причиной для обращения к врачу у таких пациентов может быть бесплодие. Поэтому клиника репродукции является нередко единственным учреждением, где такое нарушение может быть выявлено и приняты меры для его преодоления.

Кариотипирование при бесплодии показано в следующих случаях:

Необструктивная азооспермия

Тяжелая олигозооспермия (<5 млн/мл).

Задержка полового развития

Первичная аменорея

Вторичная аменорея (преждевременная менопауза)

Привичное невынашивание раннего срока беременности (наличие 2 и более самопроизвольных абортов в первом триместре беременности) - обследуются оба родителя. В семьях с отягощенным акушерским анамнезом (привычное невынашивание, особенно ранних сроков, мертворождение, рождение ребенка с множественными врожденными пороками развития (МВПР) - хромосомныенарушения встречаются от 5 до 15% случаев

Обследование доноров спермы и яйцеклеток.

В некоторых случаях цитогенетического исследования бывает недостаточно для выдачи заключения о кариотипе, в этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Метод - FISH позволяет выявлять более тонкое строение отдельных районов определенных хромосом, быстро исследовать какой либохромосомный участок в различных тканях (органах). Он актуален в тех случаях, когда исследуемый материал имеется в малом количестве.

Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников или плода при подозрении на хромосомный синдром либо другое хромосомное нарушение.

Объектом исследования служат культуры лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, клеток других тканей.

С помощью метода определяется наличие Х и У полового хроматина, определяющего истинную половую принадлежность. Половой хроматин (тельце Барра) - в виде компактной глыбки в ядрах соматических клеток имеется только у женщин. Он определяется в эпителиальных клетках ротовой полости, вагинальном эпителии и клетках волосяной луковицы.

Генеалогический метод, или метод анализа родословных .

В основе этого метода лежит составление и анализ родословных. Этот метод широко применяют с древних времен и до наших дней. Родословные человека составлялись на протяжении многих столетий в отношении царствующих семейств в Европе и Азии.

Как метод изучения генетики человека генеалогический метод стали применять только с начала XX столетия, когда выяснилось, что анализ родословных, в которых прослеживается передача из поколения в поколение какого-то признака (заболевания), может заменить собой фактически неприменимый в отношении человека гибридологический метод.

При составлении родословных исходным является человек -- пробанд, родословную которого изучают. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить. При составлении родословных таблиц используют условные обозначения, предложенные Г. Юстом в 1931 г. (рис.9.) Поколения обозначают римскими цифрами, индивидов в данном поколении -- арабскими.



Рис. 9. Условные обозначения при составлении родословных (по Г. Юсту)

С помощью генеалогического метода может быть установлена наследственная обусловленность изучаемого признака, а также тип его наследования (аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, X-сцепленный доминантный или рецессивный, Y-сцепленный). При анализе родословных по нескольким признакам может быть выявлен сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Этот метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Он широко используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Однако необходимо отметить, что генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей. Генеалогический метод (метод составления родословных) позволяет проследить наследование признаков (нормальных или патологических) в ряду поколений с указанием родственных связей между членами родословной. Он включает в себя два этапа: * составление родословной на основании сведений, полученных от пробанда, с использованием специальных символов (обозначения Юста); * анализ родословной (определение типа наследования, генотипов всех членов родословной, прогнозирование проявления признака у потомков). Анализ основан на генетических закономерностях моногенного наследования менделирующих признаков. Менделирующий признак альтернативен, дискретен, детерминирован наличием своего аллеля, прослеживается по поколениям и подчиняется законам расщепления. Дискретность признака можно оценить по морфологическим, физиологическим, биохимическим, клиническим, иммунологическим критериям. Большую работу по систематизации изученных наследственных признаков проводит М. Кьюсик и публикует их в виде «Каталога менделирующих признаков у человека». Родословные имеют характерный вид, который определяется особенностями типа наследования: аутосомное и сцепленное с полом; доминантное и рецессивное ). Каждый тип наследования имеет свои специфические особенности. . Генеалогический метод является эквивалентом гибридологического, который модифицирован в соответствии с социальными и биологическими особенностями человека. Он используется в медико-генетическом консультировании, для определения сцепленного наследования, пенетрантности генов и др.

...