Роль NO- та NF-кВ–залежних процесів у патогенезі експериментального метаболічного синдрому

На відміну від вищеназваних ізоформ, iNOS (NOS II) вважається, головним чином, епізодично функціонуючим ізоферментом. iNOS вперше була виявлена у макрофагах, однак, зустрічається в багатьох інших клітинах, включаючи гладеньком'язові, фібробласти, гепатоцити, епітеліоцити. Експресія цієї ізоформи індукується більшістю чинників, здатних викликати ІР, зокрема, прозапальними цитокінами [148], ендотоксинами [260,282], АФК [171], ВЖК [251], глюкозою (за умов гіперглікемії) [132,250]. Для її активації не потрібні йони Са²⁺ [112,156,221]. У той же час, встановлено, що iNOS може експресуватися у клітинах і конститутивно, без впливу будь-яких ушкоджуючих агентів [164]. Повідомляють також про протективну дію iNOS на серце та судини [137].

Вважають, що індукція iNOS у інсулін-чутливих тканинах відіграє ключову роль у розвитку ІР [131,158,222,258]. При цьому, погіршується дія інсуліну на рівень глюкози через дисфункцію інсулін-залежної сигналізації в IRв, IRS-1/-2 та протеїнкінази B (PKB або Akt) та виявляються порушення сигнального шляху IRв/IRS/PI-3-K/Akt [131, 234].

В останні роки з'явилися повідомлення про роль nNOS у патогенезі МС. Було виявлено, що відтворення ІР супроводжується зменшення каталітичної активності nNOS у інсулін-залежних органах. За цих умов порушується здатність інсуліну призводити до фосфорилювання nNOS у скелетних м'язах [175].

У експерименті на опасистих щурах лінії Zucker fa/fa показано, що зниження активності nNOS у інсулінорезистентних скелетних м'язах пов'язано з реалізацією убіквітин-протеасомного шляху деградації ферменту через його взаємодію з шапероном Hsp-70 та кошапероном CHIP (Carboxyl Terminus of Hsc70-Interacting Protein) [208]. Блокада протеасомного протеолізу та гіперекспресія nNOS, за даними авторів, поліпшує базальний та інсулін-стимульований транспорт глюкози та транслокацію GLUT-4 у культурі міоцитів за умов ІР, що доводить роль протеолізу nNOS у механізмі порушення інсулін-індукованого транспорту глюкози.

NO має унікальні властивості, поєднуючи функції первинного та вторинного посередника з високою дифузійною здатністю, що забезпечує можливість передачі сигналу на досить значні дистанції від джерела його синтезу [71]. Як первинний месенджер, NO регулює продукцію ендотелієм таких біологічно активних сполук, як простациклін, ендотеліальний фактор гіперполяризації (EDHF) та ендотелін-1 [13]. Прямі ефекти NO, як вторинного посередника, пов'язані з його взаємодією з білками, що містять у своїй структурі гем, і, у першу чергу, з розчинною гуанілатциклазою, яка каталізує синтез цГМФ у клітинах, і з цитохромом Р450 [83,221]. Поряд з цим, NO здатний реагувати з білками, що містять негемовий ферум, купрум і цинк, з ненасиченими жирними кислотами та тіоловими групами білків з утворенням нітрозотіолів, що представляють собою внутрішньоклітинні «депо» NO [22].

Вважається, що головним чинником, який обумовлює біологічний ефект NO, є його концентрація. При низькому вмісті NO (<1 мкМ), головним чином, переважають його прямі ефекти, спрямовані на підтримання гомеостазу клітин. При високих концентраціях (>1 мкМ) переважають непрямі ефекти, обумовлені утворенням і подальшою дією високореакційної сполуки - пероксинітриту (ONOO^-) [32,226,261]. Останній, утворюється при взаємодії NO з супероксидним аніон-радикалом (^.О):

NO + ^.О > ONOO^- (2)

У свою чергу, пероксинітрит розкладається з утворенням ще більш активного гідроксильного радикала (^.ОH) [226,261].

Утворення пероксинітриту опосередковує непрямі ефекти NO, які найчастіше мають патологічний характер. Ці ефекти призводять до модифікації різних макромолекул, включаючи білки, ліпіди та нуклеїнові кислоти [32, 226,261].

При надлишку NO також відбуваються інактивація Fe-вмісних ферментів мітохондрій, що призводить до дистрофічних змін, пригнічення росту та розмноження клітин, індукції апоптозу. У серцево-судинній системі надлишок NO викликає дисфункцію ендотелію судин, патологічне ремоделювання судинної стінки, збільшує проникність судин, що викликає набряки тканин та призводить до стійкої генералізованої вазодилатації і вираженого падіння артеріального тиску [204].

Таким чином, в клітинах, де експресуються конститутивні ізоформи NOS, NO утворюється у відносно невеликих кількостях, протягом короткого періоду часу і справляє позитивну біологічну дію, в той час, як iNOS виявляє активність через 2-8 годин після зовнішнього впливу на клітини, продукуючи величезні (у 100-1000 разів більше, ніж конститутивні ізоформи ферменту) кількості NO. При цьому, продукція NO утримується на високому рівні більш тривалий час - від годин до декількох діб. Іншими словами, здатність NO виступати в ролі фізіологічного регулятора або токсичної сполуки обумовлена експресією й активністю різних ізоформ NOS [51,71].

Повідомляється про наявність тісних взаємовідносин між системою NO та NF-кB. Звертає на себе увагу той факт, що гени iNOS експресуються за участю NF-кB. У промоторі iNOS виявлено сайти для зв'язування як NF-кB [274], так і інших факторів транскрипції - активатора транскрипції 1, фактора транскрипції jun/fos [112]. Завдяки активації NF-кB опосередковується продукція TNF-б та IL-1в, які є індукторами іNOS. Пригнічення ж активності NF-кB знижує активність цієї ізоформи NOS [152,237].

У той же час, літературні джерела свідчать про існування негативного зворотного зв'язку між вмістом оксиду азоту та NF-кB, що дозволяє контролювати експресію гена iNOS та протидіяти надмірній генерації NO та його активних метаболітів. Так, NO пригнічує експресію свого гена через зниження експресії NF-кB in vivo (у гепатоцитах щурів) та in vitro (в культурі первинних гепатоцитів людини) [255]. Процес активації NF-кB також пригнічується пероксинітритом [199].

В останні роки показано негативний зворотний зв'язок між активністю nNOS і NF-кB. Так, у дослідах на культурі астроцитів та при дослідженні тканин тонкої кишки in vivo продемонстровано гальмівний вплив nNOS на опосередковану NF-кB експресію iNOS [236,269]. Введення інгібіторів nNOS призводить до активації NF-кB, зменшення вмісту IкBб з подальшим підвищенням мРНК iNOS та активності цієї ізоформи NOS [236].

При відтворенні МС в експерименті на білих щурах Л.І. Ляшенко [62] виявила NF-кB-опосередкований характер негативного впливу nNOS на продукцію АФК, ПОЛ, колагеноліз та деполімерізацію протеогліканів у тканинах пародонта. Збільшення, за умов введення селективного інгібітора nNOS 7-NI, продукції супероксидного аніон-радикала мікросомальним і мітохондріальним електронно-транспортними ланцюгами, утворення ТБК-активних сполук, концентрації вільного оксипроліну та глікозаміногліканів у тканинах пародонта усувається призначенням інгібітора активації NF-кB - JSH-23, який порушує процес ядерної транслокації NF-кB.

Таким чином, дані сучасної літератури висвітлюють здатність NO впливати на широкий спектр фізіологічних і патологічних процесів у організмі людини та ссавців за умов серцево-судинної та ендокринної патології. Показана неоднозначна дія NO у механізмах розвитку інсулінорезистентності, його властивість утворювати високоактивний пероксинітрит при взаємодії з супероксидним аніон-радикалом. Звертає на себе увагу суперечлива інформація щодо взаємовідносин між системою оксиду азоту та функціональною активністю NF-кB, а також ролі NO-синтаз, пероксинітриту та факторів транскрипції у механізмах локальних і системних метаболічних розладів. До цього часу відсутні науково обґрунтовані підходи до визначення методів патогенетичної терапії з урахуванням корекції NO- та NF-кB-залежних процесів у організмі за умов метаболічного синдрому, що обґрунтовує доцільність цієї роботи.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Загальна характеристика матеріалів та методів дослідження

Експерименти виконані на 85 білих щурах-самцях лінії Вістар масою 180 - 230 г.

Тварин утримували в умовах акредитованого віварію згідно зі “Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню та утриманню експериментальних біологічних клінік (віваріїв)”.

При роботі з тваринами дотримувалися вимог «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються в експерименті та інших наукових цілях» (Страсбург, 18.03.1986 р.), основних правил належної лабораторної практики GLP (1981), закону України № 3447-IV від 21.02.2006 р. «Про захист тварин від жорстокого поводження».

Проведені дослідження відповідають етичним та морально-правовим вимогам згідно з наказом МОЗ України № 281 від 01.11.2000 р. Комісією з питань біоетики Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія» (протокол №126 від 12.10.2015 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.

Проведено 8 серій дослідів:

- у першій серії необхідні показники вивчали в інтактних тварин (контрольна серія);

- у другій - після моделювання МС;

- у третій, четвертій і п'ятій серіях - протягом відтворення МС тваринам вводили відповідно селективний інгібітор нейрональної NO-синтази (nNOS) 7-нітроіндазол (7-NI), селективний інгібітор iNOS - аміногуанідин і субстрат NO-синтазної реакції - L-аргінін;

- у шостій - протягом відтворення МС тваринам вводили скевенджер пероксинітриту - L-селенометіонін;

- у сьомій і восьмій - протягом відтворення МС тваринам вводили відповідно інгібітор активації NF-кB - JSH-23 (4-метил-N-(3-фенілпропіл)бензол-1,2-діамін) та метформіну гідрохлорид.

Для проведення оцінки системної чутливості до інсуліну здійснювали забір крові із хвостової вени щурів, до- і через 60 хв після введення інсуліну («Актрапід НМ» виробництва фірми «Novo Nordisk», Данія).

Евтаназію проводили методом дислокації шийних хребців під ефірним наркозом.

З ділянки грудної аорти вилучали дослідний зразок.

2.2 Методика відтворення МС

МС моделювали згідно із описом патенту України на корисну модель №93517 “Спосіб моделювання метаболічного синдрому”, запропонованого з нашою участю.

Для відтворення МС гризунам протягом двох місяців призначали 20% водний розчин фруктози для пиття та «дієту західного типу», що містить такі складові: рафіноване пшеничне борошно - 45%, сухе знежирене коров'яче молоко - 20%, крохмаль - 10%, столовий маргарин (зі складом жирів 82%) - 20%, переокиснена соняшникова олія - 4%, натрію хлорид - 1%.

Переокиснену соняшникову олії отримують шляхом її нагрівання у присутності 2% сульфату міді протягом 6-10 годин.

2.3 Методика зміни режимів функціонування NO-синтаз та активності NF-кB

Для модифікації функціональної активності NOS та NF-кB тваринам вводили сполуки, наведені у таблиці 2.1.

Таблиця 2.1Сполуки, що застосовувалися для модифікації функціональної активності NOS та NF-кB

Назва сполуки	Призначення	Виробник	Шлях введення	Доза
1	2	3	4	5
7-нітроіндазол (7-NI, 7-nitroindazole)	Селективний інгібітор nNOS	“Sigma Chemical Co”, США	в/о	30 мг/кг [197]
Аміногуанідин (Aminoguanidine)	Селективний інгібітор іNOS	“Sigma Chemical Co”, США	в/о	20 мг/кг [262]
L-аргінін	Субстрат NO-синтазної реакції	“Kyowa Hakko Kogyo Co LTD”, Японія	в/о	500 мг/кг [33]
L-селенометіонін	Скевенджер пероксинітриту	“Sigma-Aldrich, Inc.”, США	в/о	3 мг/кг [197]
JSH-23 (4-метил- N-(3-фенілпропіл) бензол-1,2-діамін)	Інгібітор активації NF-кB	“Santa Cruz Biotechnology”, ФРН	в/о	1 мг/кг [194]
Метформіну гідрохлорид	Інгібітор активації NF-кB	“Wanbury LTD”, Індія	в/о	200 мг/кг [193]

Примітка: в/о - внутрішньоочеревинно.

Метформіну гідрохлорид вводили через день, інші - 2 рази на тиждень протягом періоду відтворення МС.

2.4 Біохімічні методи дослідження

Перелік біохімічних методів дослідження наведено в таблиці 2.2.

Таблиця 2.2Біохімічні методи дослідження

№	Параметр, що вивчається	Об'єкт	Літературні джерела
1	ТБК-реактанти	Кров	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
2	СОД	Кров	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
3	Каталаза	Кров	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
4	Церулоплазмін	Сироватка крові	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
5	Супероксидний аніон-радикал	Гомогенат аорти	Цебржинский О.І. (2002)
6	Глюкоза	Сироватка крові	Набір реактивів фірми «Філісіт-Діагностика»
7	Холестерол	Сироватка крові	Набір реактивів фірми «Філісіт-Діагностика»
8	Ліпопротеїни низької та дуже низької щільності	Сироватка крові	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
9	Триацилгліцероли	Сироватка крові	Набір реактивів фірми «Філісіт-Діагностика»

Визначення концентрації ТБК-реактантів [72]. Принцип методу базується на здатності 2-тіобарбітурової кислоти (ТБК) утворювати стійкий забарвлений комплекс із малоновим діальдегідом та іншими проміжними оксопродуктами ПОЛ. Приріст концентрації ТБК-реактантів при 1,5-годинній інкубації тканин у прооксидантному фероаскорбатному буферному розчині дає інформацію про стан антиоксидантної системи.

Визначення активності супероксиддисмутази. Визначення активності супероксиддисмутази (СОД) проводили за методом О.С. Брусова і співавт. [72]. Принцип методу полягає в тому, що СОД інгібує автоокиснення адреналіну. За різницею швидкості реакції без додавання біологічного матеріалу та з його додаванням обчислюють активність ферменту.

Визначення активності каталази. В основі методу знаходиться здатність каталази, що міститься в біоматеріалі, розкладати пероксид водню [72]. Кількість пероксиду водню, що залишився в пробі, визначають титруванням 0.1 н розчином калію перманганату.

Визначення концентрації церулоплазміну у сироватці крові. Принцип методу оснований на окисненні п-фенілендіаміну, яке відбувається за участю церулоплазміну [72]. Ферментативна реакція зупиняється додаванням фториду натрію. За оптичною густиною продуктів, що утворюються, визначають концентрацію церулоплазміну у дослідній пробі.

Визначення продукції супероксидного аніон-радикалу. Утворення супероксидного аніон-радикала оцінювали при проведенні тесту з нітросинім тетразолієм (НСТ) у модифікації О.І. Цебржинського [98]. Оцінювали продукцію супероксиду в гомогенаті тканин аорти з такими індукторами: НАДH - для оцінки продукції супероксидного аніон-радикала мітохондріальним електронно-транспортним ланцюгом (ЕТЛ) та НАДФH - для оцінки його генерації мікросомальним ЕТЛ та NOS.

Визначення концентрації глюкози. Вміст глюкози у сироватці крові визначали глюкозооксидазним методом за допомогою набору реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна, м. Дніпропетровськ). Глюкоза в присутності ферменту глюкооксидази, окиснюється до глюконової кислоти та перекису водню. Останній, під дією пероксидази, реагує з фенолом і амінофеназоном з утворенням забарвленого хіноніміну, який визначають фотометрично.

Визначення загального холестеролу. Вміст холестеролу у сироватці крові визначали ферментативним методом за допомогою набору реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна, м. Дніпропетровськ). Етерифікований холестерол, під впливом холестеролестерази, розкладається до вільного холестеролу та жирних кислот. Холестерол, під впливом холестеролоксидази, в присутності кисню, окиснюється в Д-4-холестенон з утворенням молекул пероксиду водню. Останній, вступає в реакцію з 4-амінофеназоном та фенолом з утворенням забарвленого хіноніміну. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації загального холестеролу.

Визначення концентрації ліпопротеїнів низької та дуже низької щільності за Клімовим [72]. Атерогенні ліпопротеїни при взаємодії з гепарином та хлоридом кальцію у розчині, утворюють нерозчинні комплекси, що розсіюють світло пропорційно кількості утворених комплексів. Вимірюючи ступінь розсіювання світла можна визначити концентрацію ліпопротеїнів.

Визначення концентрації триацилгліцеролів. Вміст ТАГ у сироватці крові визначали ензиматичним колориметричним методом за допомогою набору реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна, м. Дніпропетровськ) за концентрацією хіноніміну.

2.5 Методика оцінки системної чутливості до інсуліну

Системну чутливість до інсуліну оцінювали за змінами вмісту глюкози в крові через 60 хв після підшкірного введення інсуліну («Актрапід НМ» виробництва фірми «Novo Nordisk», Данія), в дозі 0,2 МО на 1 кг маси тварини (підшкірний інсуліновий тест, ПІТ) [48].

2.6 Методи проведення досліджень гемостазу

Забір та стабілізацію крові для коагулогічних досліджень проводили за стандартною методикою [72]. Досліджували показники коагуляційного гемостазу - протромбіновий час, активований парціальний тромбопластиновий час, тромбіновий час та фібринолітичну активність плазми крові (табл. 2.5).

Таблиця 2.3 Методи дослідження гемостазу

№	Параметр, що вивчається	Об'єкт	Літературні джерела
1	Протромбіновий час	Плазма крові	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
2	Активований парціальний тромбопластиновий час	Плазма крові	Баркаган З.С., Момот А.П. (2008)
3	Тромбіновий час	Плазма крові	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)
4	Фібринолітична активність плазми методом лізису еуглобулінів плазми	Плазма крові	Кайдашев І.П. та співавт. (2003)

Визначення протромбінового часу [72]. Плазма рекальцифікується в присутності тромбопластину. Швидкість утворення фібринового згустку визначається в основному рівнем протромбіну, при цьому максимально активується зовнішній шлях коагуляції. Результати цього тесту залежать від активності факторів протромбінового комплексу V, VII. ІХ, X і характеризують функціонування зовнішнього механізму гемокоагуляції.

Визначення активованого парціального тромбопластинового часу (АПТЧ) [6]. Визначається час згортання плазми крові в умовах стандартизированої контактної активації процесу коагуляції елаговою кислотою та фосфоліпідами (кефаліном), в присутності йонів кальцію. АПТЧ - високостандартизована коагуляційна проба, чутлива тільки до плазмових дефектів згортання, особливо до дефіциту в плазмі ХІІ, ХІ, ІХ і VIII факторів, а та надлишку антикоагулянтів. Характеризує внутрішній шлях згортання.

Визначення тромбінового часу [72]. Внесення в досліджувану плазму розчину тромбіну супроводжується переходом фібриногену в фібрин з утворенням згустку. Характеризує кінцевий етап гемокоагуляції - утворення фібрину. Визначення фібринолітичної активності методом лізису еуглобулінів плазми крові [72]. Час розчинення згустку, встановлений по лізису еуглобулінової фракції, відображає фібринолітичну активність плазми, звільненої від інгібіторів.

2.7 Статистична обробка результатів експерименту

Отримані дані піддавали статистичній обробці [20,84]. Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано розрахунок критерію Шапіро-Вілка. Якщо дані відповідали нормальному розподілу, то для їх порівняння використовували t-критерій Ст'юдента, для незалежних вибірок. У випадку, коли ряди даних не підлягали нормальному розподілу, статистичну обробку здійснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-Вітні.

Для множинного порівняння застосовували поправку Бонфероні, а при розподілі, який відрізняється від нормального, - критерій Краскела-Уоліса.

Статистичні розрахунки проводили з використанням програм "Microsoft Excel 2007" та "StatisticSoft 6.0".

РОЗДІЛ 3. ЗМІНИ ОКИСНЮВАЛЬНИХ ПРОЦЕСІВ, ЛІПІДНОГО ТА ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ, ГЕМОКОАГУЛЯЦІЇ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ЗА УМОВ ВІДТВОРЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛІЧНОГО СИНДРОМУ

3.1 Зміни вільнорадикальних процесів та антиоксидантного захисту за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому

Дослідження останніх років показали, що одним з найважливіших патогенетичних факторів ЦД 2-го типу та МС є окиснювальний стрес [36,272]. У наш час накопичилася значна кількість даних, які вказують на те, що ВРО посилюється в міру розвитку стану ІР як в експериментальних умовах у тварин, так і у хворих з ознаками МС. Збільшення вмісту вторинних продуктів ПОЛ, у крові при експериментальній ІР було показано в роботах [15,36]. Підвищення рівня пероксидів ліпідів і МДА в плазмі крові хворих з ознаками ІР також наведено у великій кількості досліджень [16,34,56,57,76]. Виявлена лінійна кореляція між вмістом МДА та загальною кількістю ліпідів в плазмі, МДА і ТАГ [2]. При цьому, наголошується лінійна залежність між концентрацією МДА в стінці артерій і зростанням його вмісту в плазмі крові.

Повідомляється, що найбільша кількість МДА міститься в ЛПНЩ і, що із зростанням кількості МДА у ЛПНЩ і ЛПДНЩ збільшується ступінь атеросклеротичного ураження артерій. Окрім збільшення рівня продуктів ПОЛ у крові, виявлено збільшення концентрації цих сполук у стінці судин як у тварин, так і у людей. Активація ПОЛ за умов МС спостерігається також в тканинах печінки, пародонта та слинних залоз [36,60]. Так, в печінці сирійських хом'ячків-самців, при вживанні висококалорійної дієти, зростає рівень первинних та вторинних продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів та ТБК-активних продуктів [2].

Посилення ПОЛ може бути наслідком, з одного боку, активації систем, що призводять до пероксидації, а з іншого - пригнічення АО систем. У зв'язку з цим, потрібно відмітити, що за умов ліпотоксичності у кроликів, щурів, міні-свиней збільшується активність НАДФН-залежної ферментної системи ПОЛ в мікросомах печінки [2].

З іншого боку, показано, що розвиток ліпотоксичності і ІР супроводжується зменшенням активності ферментів, що захищають від активації і розвитку процесу ПОЛ, а також від шкідливої дії продуктів ПОЛ в крові, печінці та стінці судин тварин і людей. Проте дані щодо змін активності ряду АО ферментів (СОД, каталази, глутатіонпероксидази) є досить суперечливими [36].

За нашими даними, концентрація вторинних продуктів ПОЛ - ТБК-активних сполук - у крові інтактних щурів до та після 1.5-годинної інкубації у прооксидантному фероаскорбатному буферному розчині (таблиця 3.1) складає відповідно - 11.54±0.90 та 27.41±2.10 мкмоль/л. Приріст концентрації ТБК-активних сполук за час інкубації - 15.87±1.23 мкмоль/л.

Таблиця 3.1Зміни концентрації ТБК-реактантів у крові білих щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому(M+m, n=10)

Концентрація ТБК-реактантів, мкмоль/л	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
1	2	3
До інкубації	11.54±0.90	18.27±0.59 *
Після інкубації	27.41±2.10	43.27±2.01 *
Приріст	15.87±1.23	25.00±1.44 *

Примітка (у табл. 3.1-3.7): * - р<0,05 у порівнянні з даними інтактних щурів.

Відтворення МС супроводжується суттєвими змінами показників ПОЛ. Так, концентрація ТБК-активних сполук у крові зростає до інкубації - до 18.27±0.59 мкмоль/л, після інкубації - до 43.27±2.01 мкмоль/л, що перевищує дані інтактної групи відповідно на 58.3% (p<0.001) та 57.9% (p<0.001). Активація процесу пероксидації може бути пов'язана як зі збільшенням утворення АФК, так і з розладами АО системи.

Так, за нашими даними, приріст концентрації ТБК-активних сполук за час 1.5-годинної інкубації крові у фероаскорбатному буферному розчині також збільшується - до 25.00±1.44 мкмоль/л, тобто на 57.5% (p<0.01) у порівнянні з результатом першої серії, що вказує на суттєве зменшення АО потенціалу.

Порушення АО захисту в організмі щурів за умов експериментального МС підтверджується також змінами активності АО ферментів у сироватці крові (таблиця 3.2).

Таблиця 3.2Показники антиоксидантного захисту в крові щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=10)

Показники	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
1	2	3
Активність СОД, од. акт.	1.97±0.09	1.36±0.15 *
Каталазне число	1.77±0.12	1.16±0.16 *
Церулоплазмін, мг/л	253.8±30.3	353.5±23.9 *

Так, активність СОД зменшується з 1.97±0.09 од. акт. до 1.36±0.15 од. акт., тобто на 31.0% (p<0.01) у порівнянні з даними першої серії. Каталазне число знижується з 1.77±0.12 до 1.16±0.16, тобто на 34.5% (p<0.02).

У той же час, концентрація церулоплазміну в сироватці крові при моделюванні МС суттєво збільшується - з 253.8±30.3 мг/л до 353.5±23.9 мг/л, тобто на 39.3% (p<0.05) у порівнянні з результатом інтактної групи.

Відомо, що церулоплазмін (блакитна ферооксидаза, КФ 1.16.3.1) каталізує окиснення двовалентного заліза у трьохвалентне: Fe⁺² + 4H⁺ + 2O₂ = Fe⁺³ + 2H₂O, окиснює поліаміни, поліфеноли, аскорбінову кислоту та транспортує мідь [17,58]. Фермент містить 6-8 йонів міді трьох типів, які відрізняються лігандним оточенням.

АО властивості церулоплазміну пов'язані з супероксиддисмутазною активністю та зі здатністю окиснення прооксидантних чинників (йона двовалентного заліза, що гальмує реакцію Фентона). В свою чергу трьохвалентне залізо зв'язується з трансферином и транспортується в клітини. Крім того, церулоплазмін конкурує з киснем за електрон, зв'язуючи його залишком гістидину.

Церулоплазмін продукується печінкою в плазму крові як реактант гострої фази запалення. Збільшення концентрації церулоплазміну сприяє посиленому утворенню жирової тканини і розглядається як ознака системної запальної відповіді та компонент МС [58,188,245].

Примітно, що за умов експериментального МС значно підвищується продукція супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів (таблиця 3.3).

Таблиця 3.3Зміни продукції супероксидного аніон-радикала у гомогенаті аорти білих щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=10)

Продукція супероксидного аніон-радикала, нмоль/г·с	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
1	2	3
Загальний фон	0.69±0.04	1.11±0.04 *
НАДФН-залежні ЕТЛ (мікросомальний і NOS)	8.93±0.54	11.87±0.33 *
НАДН-залежний ЕТЛ (мітохондріальний)	11.73±0.81	17.73±0.45 *

За результатами контрольної серії, у клітинах аорти інтактних тварин загальний фон продукції супероксидного аніон-радикала складає 0.69±0.04 нмоль/г·с. У виробленні цієї АФК беруть участь НАДФН-залежні ЕТЛ (мікросомальні і NOS), які генерують 8.93±0.54 нмоль/г·с, а також НАДН-залежний (мітохондріальний) ЕТЛ, який продукує 11.73±0.81 нмоль/г·с супероксидного аніон-радикала.

За умов моделювання МС продукція супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти значно збільшується. Так, загальний фон його продукції підвищується - до 1.11±0.04 нмоль/г·с, тобто на 60.9% (p<0.001) у порівнянні з результатом першої серії. Генерація супероксидного аніон-радикала НАДФН-залежними ЕТЛ (мікросомальним і NOS) зростає - до 11.87±0.33 нмоль/г·с, тобто на 32.9% (p<0.01), а мітохондріальним ЕТЛ - до 17.73±0.45 нмоль/г·с, тобто на 51.2% (p<0.001) у порівнянні з даними інтактної групи.

Ці зміни узгоджуються з наведеними раніше даними про активацію процесів ПОЛ у крові. Спрямованість зрушень у крові і аорті співпадає, що свідчить про системний характер змін вільнорадикальних реакцій в організмі тварин за умов експериментального МС.

Таким чином,

1) відтворення МС супроводжується істотною активацією пероксидного окиснення ліпідів, що носить декомпенсований характер, із значним зниженням активності в сироватці крові АО ферментів (супероксиддисмутази, каталази);

2) призначення білим щурам фруктози з питною водою (20% розчину) та їхнє знаходження на вуглеводно-жировій дієті протягом двох місяців супроводжується суттєвим збільшення вмісту в сироватці крові реактанту гострої фази запалення - церулоплазміну, що свідчить про розвиток системної запальної відповіді як компонента МС;

3) відтворення МС супроводжується істотною активацією продукції супероксидного аніон-радикала НАДФН-залежними (мікросомальним і NOS) і мітохондріальним ЕТЛ у клітинах аорти щурів.

3.2 Зміни показників вуглеводного та ліпідного обміну за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому

В останні роки показано, що розвиток МС пов'язаний з проатерогенними змінами метаболізму - гіперліпідемією, зокрема, гіпертриацилгліцеролемією, змінами показників метаболізму ліпопротеїнів у крові, зокрема, активацією переносу естерів холестеролу та печінкової ліпази, а також характерними змінами гормонального тла: наростанням вмісту інсуліну та резистентності до нього, прогресуючою гіперкортикостероїдемією [36]. Повідомляється, що гіперінсулінемія, здатна стимулювати синтез ЛПДНЩ у печінці, викликати суттєві кількісні та якісні зміни ліпопротеїнових молекул [44]. В той же час, метаболіти ТАГ і НЕЖК порушують механізми передачі інсулінового сигналу, інгібують окиснення, транспорт, фосфорилювання глюкози, синтез глікогену [44].

Отримані нами результати доводять адекватність експериментальної моделі МС, яку ми використовували.

Так, призначення лабораторним тваринам фруктози з питною водою у кількості 200 г/л та вуглеводно-жирової дієти протягом двох місяців супроводжується збільшенням концентрації глюкози у сироватці крові (таблиця 3.4) з 5.13±0.18 ммоль/л до 6.92±0.24 ммоль/л, тобто на 34.9% (p<0.001) у порівнянні з результатом першої серії.

Таблиця 3.4Показники підшкірного інсулінового тесту за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=10)

Концентрація глюкози у сироватці крові, ммоль/л	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
1	2	3
До введення інсуліну	5.13±0.18	6.92±0.24 *
Через 60 хв після введення інсуліну	2.62±0.15	5.44±0.22 *
Зниження	2.51±0.05 (49.1±1.2%)	1.49±0.05 * (21.5±0.7%)

За даними підшкірного інсулінового тесту, вміст глюкози у сироватці крові інтактних щурів через 60 хв після введення інсуліну, в дозі 0.2 МО/кг маси тварини, зменшується до 2.62±0.15 ммоль/л, тобто, на 2.51±0.05 ммоль/л, що складає 49.1±1.2%.

При проведенні підшкірного інсулінового тесту у щурів, які отримували фруктозу з питною водою (20% розчину) та перебували на вуглеводно-жировому раціоні протягом двох місяців, вміст глюкози у сироватці крові через 60 хв після введення інсуліну, в дозі 0,2 МО/кг, зменшується до 5.44±0.22 ммоль/л, тобто на 1.49±0.05 ммоль/л, що складає 21.5±0.7%.

Таким чином, зниження концентрації глюкози у сироватці крові за умов МС поступається такому у інтактних тварин на 40.6% (p<0.001), що свідчить про розвиток ІР.

При проведенні оцінки показників ліпідного спектру сироватки крові у щурів з експериментальним МС (таблиця 3.5) звертає на себе увагу відсутність істотних змін концентрації холестеролу. Проте вміст ЛПНЩ і ЛПДНЩ значно підвищується - з 2.48±0.15 г/л до 3.27±0.14 г/л, тобто на 31.9% (p<0.01) у порівнянні з результатом контрольної серії.

Таблиця 3.5Показники ліпідного спектру крові щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=10)

Показники	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
1	2	3
Холестерол, ммоль/л	1.88±0.24	2.36±0.22
ЛПНЩ і ЛПДНЩ, г/л	2.48±0.15	3.27±0.14 *
ТАГ, ммоль/л	0.67±0.06	1.77±0.15 *

Концентрація ТАГ також суттєво зростає - з 0.67±0.06 ммоль/л до 1.77±0.15 ммоль/л, тобто у 2.6 рази (p<0.001) у порівнянні з даними першої серії.

Використання запропонованої нами моделі МС супроводжується також збільшенням маси абдомінального жиру - в 2.3 рази (p<0.001) - з 1.27±0.08 г у інтактних тварин до 2.86±0.09 г (таблиця 3.6).

Таблиця 3.6Маса абдомінального жиру у щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому(M+m, n=10)

Показник	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
Маса абдомінального жиру, г	1.27±0.08	2.86±0.09 *

Таким чином, призначення білим щурам фруктози з питною водою (20% розчину) та їхнє знаходження на вуглеводно-жировій дієті протягом двох місяців супроводжується суттєвими розладами ліпідного та вуглеводного метаболізму, що виявляються розвитком гіперглікемії, ІР, дисліпопротеїнемії, гіпертриацилгліцеролемії, підвищенням маси абдомінального жиру, що є ознаками МС.

3.3 Зміни показників гемокоагуляції за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому

Дослідження останніх років підтверджують наявність певного патогенетичного зв'язку як між традиційними компонентами МС (артеріальною гіпертензією, ІР, ожирінням, дисліпідемією, окиснювальним стресом та хронічним субклінічним запаленням), так із порушеннями системи гемостазу [2,9,39,74,129].

Найбільш виражений взаємозв'язок встановлений між агрегаційною активністю тромбоцитів і вмістом загального холестеролу, холестеролу ЛПНЩ, рівнем інсуліну натще та С-пептиду [39,77].

Показано, що при хронічній гіперглікемії зростає швидкість неферментативного глікозилювання рецепторів на поверхні тромбоцитів, що сприяє інтенсифікації процесів згортання крові та пригніченні механізмів фібринолізу [74,210].

У хворих з МС виявляється підвищений вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів у крові, підвищення індукованої та спонтанної агрегації тромбоцитів, вмісту фібриногену, активності фактора Віллебранда, PAI-1, що призводить до порушення рівноваги між протромботичною і фібринолітичною властивостями крові [76] та веде до посилення тромбогенного потенціалу плазми, обумовлюючи високу частоту судинних катастроф різної локалізації. Збільшення тромбогенної загрози у хворих з МС пов'язують з гіперагрегацією тромбоцитів у результаті впливу комплексу обмінних порушень і гемодинамічних чинників, гіперкоагуляції - внаслідок підвищення рівня фібриногену та активності факторів згортання крові, а також з гіпофібринолізом [21, 64,69].

Нами досліджено за умов відтворення МС показники коагуляційного гемостазу - протромбіновий час (характеризує зовнішній шлях згортання крові), активований парціальний тромбопластиновий час (характеризує внутрішній шлях коагуляції), тромбіновий час (характеризує кінцевий етап гемокоагуляції - утворення фібрину) та фібринолітичну активність плазми крові (таблиця 3.7). Відтворення МС супроводжується суттєвим зменшенням протромбінового часу - з 19.2±0.5 с до 14.0±0.5 с, тобто на 27.1% (p<0.001) у порівнянні з результатом контрольної серії. Активований парціальний тромбопластиновий час за цих умов також знижується - з 48.2±1.7 с до 35.7±1.4 с, тобто на, тобто на 25.9% (p<0.001) у порівнянні з даними першої серії. Тромбіновий час скорочується - з 52.8±2.2 с до 37.9±2.0 с - на 28.2% (p<0.01) у порівнянні з результатом контрольної серії.

Таблиця 3.7Зміни показників гемокоагуляції за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=10)

Показники	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
Протромбіновий час, с	19.2±0.5	14.0±0.5 *
Активований парціальний тромбопластиновий час, с	48.2±1.7	35.7±1.4 *
Тромбіновий час, с	52.8±2.2	37.9±2.0 *
Фібринолітична активність плазми методом лізису еуглобулінів плазми, хв	162.8±5.7	187.2±4.5 *

Час розчинення згустку, встановлений за лізисом еуглобулінової фракції, змінюється з 162.8±5.7 хв до 187.2±4.5 хв, тобто, подовжується на 15.0% (р<0.01).

Таким чином, відтворення МС призводить до істотних порушень процесу згортання крові: розвитку гіперкоагуляції за зовнішнім і внутрішнім шляхами, прискорення кінцевого етапу гемокоагуляції (утворення фібрину) та пригнічення фібринолізу.

Матеріали цього розділу оприлюдненні в статтях, тезах та опису до патенту на корисну модель:

1. Талаш В.В. Стан вільнорадикальних процесів та гемокоагуляції в організмі щурів за умов відтворення метаболічного синдрому / В.В. Талаш, В.О. Костенко // Світ медицини та біології. - 2015. - № 2. - С. 184-187.

2. Роль NO-синтаз у механізмах порушень вільнорадикальних процесів у тканинах пародонта і слинних залоз щурів за умов експериментального метаболічного синдрому / Л.І. Ляшенко, А.М. Єлінська, В.В. Талаш, В.О. Костенко // Світ медицини та біології. - 2014. - № 2. - С. 139-142.

3. NO-зависимые механизмы расстройств окислительного обмена при экспериментальном метаболическом синдроме / А.Н. Елинская, Л.И. Ляшенко, Н.В. Соловьева, В.В. Талаш // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: XVII Всерос. мед.-биол. конф. молодых исследователей (с международным участием) : мат. (Санкт-Петербург, 19 апреля 2014 г.) [Фундаментальная наука и клиническая медицина. - 2014. - Т. XVII. - С. 149-150].

4. Пат. 93517 Україна, МПК G09B 23/28. Спосіб моделювання метаболічного синдрому / Кайдашев І.П., Костенко В.О., Талаш В.В., Єлінська А.М., Ляшенко Л.І., Соловйова Н.В.; u 2014 02769; заявл. 19.03.2014, опубл. 10.10.2014, Бюл. № 19.

РОЗДІЛ 4. РОЛЬ ІЗОФОРМ NO-СИНТАЗ У ПАТОГЕНЕЗІ ПОРУШЕНЬ ОКИСНЮВАЛЬНИХ ПРОЦЕСІВ, ЛІПІДНОГО ТА ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ, ГЕМОКОАГУЛЯЦІЇ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ЗА УМОВ ВІДТВОРЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛІЧНОГО СИНДРОМУ

4.1 Вплив інгібіторів NO-синтаз на стан вільнорадикальних процесів та антиоксидантного захисту за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому

АФК, у тому числі і вільні радикали, відіграють важливу роль у багатьох фізіологічних реакціях, що відбуваються в клітині - від регуляції кров'яного тиску, за що відповідальний NO, до участі в лізисі мікроорганізмів фагоцитами (супероксидний аніон-радикал, гіпохлорид, синглетний кисень) та забезпеченні внутрішньо- та міжклітинних комунікацій [18,28-30]. Негативний ефект АФК може бути реалізований ними як безпосередньо, так і проміжними або кінцевими продуктами радикальних реакцій, ініційованих вільними радикалами [82]. Продукти ПОЛ здатні викликати порушення синтезу білків, зміну судинної проникності і характеру запальної реакції. Особливо небезпечні пошкодження ДНК, що виникають у ході радикальних процесів, оскільки вони нерідко викликають невідновлювальні дефекти геному. Агресія вільних радикалів по відношенню до білків призводить до зміни фізико-хімічних властивостей останніх. Патогенна дія АФК була б набагато більш значною, якби в організмі не існувало своєрідної противаги ВРО у вигляді АО системи.

Стаціонарні концентрації NO в межах 10-100 нмоль, що продукуються in vivo NOS, вважаються безпечними. При таких показниках СОД здатна ефективно регулювати рівень NO у клітинах. У випадках активації iNOS у макрофагах концентрація NO може досягати 10 мкмоль [83]. Гіперпродукція NO, зазвичай, обумовлена експресією iNOS (рідше сNOS) під дією ендо- та екзотоксинів, медіаторів запалення і активаторів ВРО, що активують NF-кB, який, в свою чергу, знову індукує синтез iNOS.

Проте NOS здатна контролювати біосинтез IL-4, -11, -13, які належать до інгібіторів запальної реакції. Тому, NO вважається «справжнім» регулятором запалення та окиснювального стресу. При цьому, NO може виявляти і АО властивості (завдяки зв'язуванню вільних йонів заліза з утворенням нітрозильних комплексів [22,106], взаємодії з алкілпероксильними й аллоксильними радикалами, нітрозилювання гему та відновлення оксоферилформ гемопротеїдів [27]).

Проте з надлишком NO пов'язують пригнічення низки залізовмісних білків, до яких належать дихальні ферменти мітохондрій, пригнічення проліферації клітин. У реакції з супероксидним аніон-радикалом NO утворює токсичний пероксинітрит, що вважається потужною прооксидантною сполукою [226,261].

Обмеження гіперпродукції NO в організмі здійснюється за принципом зворотного негативного зв'язку. NO може прямо пригнічувати експресію гена iNOS, за рахунок попередження активації NF-кB та пригнічення його зв'язування з ДНК.

В останні роки показано негативний зворотний зв'язок між активністю nNOS і NF-кB [236].

Нами досліджено вплив інгібіторів NOS на зміни концентрації вторинних продуктів ПОЛ - ТБК-реактантів - у крові білих щурів за умов відтворення МС (таблиця 4.1).

Призначення селективного інгібітора nNOS 7-NI за умов моделювання МС підвищує концентрацію ТБК-активних сполук - до 20.67±0.59 мкмоль/л (на 13.1%, p<0.05) у порівнянні з результатом другої серії.

У той же час, приріст концентрації ТБК-активних сполук протягом інкубації крові у прооксидантному фероаскорбатному буферному розчині достовірно не відрізняється від результату другої серії.

Одержані результати свідчать, що за умов експерименту функціональна активність nNOS спрямована на обмеження реакцій ПОЛ в організмі, що, вочевидь, може бути пов'язано з сигнальними властивостями низьких (піко- та наномолярних) концентрацій NO, які виробляються за участю nNOS.

Таблиця 4.1Вплив інгібіторів NO-синтаз на зміни концентрації ТБК-активних сполук у крові білих щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=20)

Концентрація ТБК-активних сполук, мкмоль/л	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
		Контроль	7-NI	+ аміногуанідин
До інкубації	11.54±0.90	18.27±0.59 *	20.67±0.59 */**	13.94±1.18 **
Після інкубації	27.41±2.10	43.27±2.01 *	47.60±1.77 *	31.73±2.78 **
Приріст	15.87±1.23	25.00±1.44 *	26.92±1.18 *	17.79±1.63 **

Примітка (у табл. 4.1-4.7): * - р<0,05 у порівнянні з даними інтактних щурів, ** - р<0,05 у порівнянні з даними другої серії.

Введення селективного інгібітора іNOS аміногуанідину за умов експериментального МС суттєво зменшує концентрацію ТБК-активних сполук до інкубації крові - до 13.94±1.18 мкмоль/л (на 23.7%, p<0.02), після інкубації - до 31.73±2.78 мкмоль/л (на 26.7%, p<0.01) у порівнянні з результатом другої серії.

Приріст концентрації ТБК-активних продуктів за час інкубації у прооксидантному фероаскорбатному буферному розчині за цих умов також значно зменшується - до 17.79±1.63 мкмоль/л, тобто на 28.8% (p<0.02) у порівнянні з даними другої серії. Такі зміни цього показника свідчать про певне підвищення АО потенціалу.

У таблиці 4.2 наведено дані щодо впливу інгібіторів NOS на показники антиоксидантного захисту в крові щурів за умов відтворення МС.

Введення 7-NI за умов експерименту достовірно не позначається на активності СОД, проте збільшує каталазне число -до 1.67±0.14, тобто на 44.0% (p<0.05) у порівнянні з даними другої серії.

Таблиця 4.2 Вплив інгібіторів NO-синтаз на показники антиоксидантного захисту в крові щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=20)

Показники	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
		Контроль	7-NI	+ аміногуанідин
СОД, од. акт.	1.97±0.09	1.36±0.15 *	1.72±0.13	1.81±0.07 **
Каталазне число	1.77±0.12	1.16±0.16 *	1.67±0.14 **	1.70±0.14 **
Церулоплазмін, мг/л	253.8±30.3	353.5±23.9 *	213.5±22.9 **	206.5±18.9 **

За цих умов відмічається значне зменшення концентрації церулоплазміну в сироватці крові - до 213.5±22.9 мг/л, тобто на 39.6% (p<0.01) у порівнянні з результатом другої серії.

Призначення аміногуанідину за умов відтворення МС істотно підвищує активність СОД та каталазне число - відповідно до 1.81±0.07 од. акт. та 1.70±0.14, що на 33.1% (p<0.05) та 46.6% (p<0.05) перевищує величини другої серії. У ході експерименту, при застосуванні аміногуанідину, також виявляється зниження концентрації церулоплазміну в сироватці крові - до 206.5±18.9 мг/л, тобто на 41.6% (p<0.01) у порівнянні з результатом другої серії.

Звертає на себе увагу, що інгібітори NOS за умов експериментального МС суттєво впливають на вироблення супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів (таблиця 4.3).

Таблиця 4.3Вплив інгібіторів NO-синтаз на зміни продукції супероксидного аніон-радикала у гомогенаті аорти білих щурів за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому (M+m, n=20)

Продукція супероксидного аніон-радикала, нмоль/г·с	Серії дослідів
	Інтактні тварини	Відтворення МС
		Контроль	7-NI	+аміногуанідин
1	2	3	4	5
Загальний фон	0.69±0.04	1.11±0.04 *	1.24±0.02*/**	0.91±0.04 */**
НАДФН-залежні ЕТЛ (мікросомальний і NOS)	8.93±0.54	11.87±0.33 *	15.47±0.33 */**	11.07±0.45 *
НАДН-залежний ЕТЛ (мітохондріальний)	11.73±0.81	17.73±0.45 *	22.00±0.52 */**	14.93±0.45 */**

Призначення 7-NI за цих умов істотно підвищує загальний фон продукції супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів - до 1.24±0.02 нмоль/г·с (на 11.7%, p<0.02), його генерацію НАДФН і НАДН-залежними ЕТЛ - відповідно до 15.47±0.33 нмоль/г·с (на 30.3%, p<0.001) та 22.00±0.52 нмоль/г·с (на 24.1%, p<0.001) у порівнянні з даними другої серії.

Застосування аміногуанідину за цих умов, навпаки, значно зменшує загальний фон продукції супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів - до 0.91±0.04 нмоль/г·с (на 18.0%, p<0.01) та його вироблення НАДН-залежним (мітохондріальним) ЕТЛ - до 14.93±0.45 нмоль/г·с (на 15.8%, p<0.01) у порівнянні з результатами другої серії. Проте введення цього селективного інгібітора іNOS достовірно не позначається на продукції супероксидного аніон-радикала НАДФН-залежними ЕТЛ.

Таким чином,

1) функціональна активність nNOS за умов експериментального МС обмежує в організмі щурів активацію ПОЛ та різноспрямовано впливає на показники антиоксидантної системи крові, зменшує утворення супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів. Введення селективного інгібітора nNOS 7-NI за умов відтворення МС підвищує в крові концентрацію вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ТБК-активних сполук), збільшує активність каталази, знижує вміст церулоплазміну, підвищує загальний фон продукції супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів та його генерацію НАДФН і НАДН-залежними ЕТЛ у порівнянні з даними другої серії;

2) функціональна активність іNOS за умов моделювання МС призводить до активації у крові білих щурів декомпенсованого ПОЛ, що супроводжується виснаженням АО потенціалу, зменшенням активності АО ферментів (СОД, каталази), сприяє підвищенню вмісту церулоплазміну, збільшує утворення супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів. Введення селективного інгібітора iNOS аміногуанідину за умов відтворення МС зменшує в крові концентрацію вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів (ТБК-активних сполук) та їх приріст за час інкубації у прооксидантному буферному розчині, збільшує активність СОД і каталази, знижує вміст церулоплазміну, зменшує загальний фон продукції супероксидного аніон-радикала у клітинах аорти щурів та його генерацію НАДН-залежним (мітохондріальним) ЕТЛ у порівнянні з даними другої серії.

4.2 Вплив інгібіторів NO-синтаз на показники вуглеводного та ліпідного обміну за умов відтворення експериментального метаболічного синдрому

Найбільш дослідженою на сьогодні є роль eNOS у забезпеченні вуглеводного та ліпідного обміну в нормі та за умов ЕД [38,66,108]. Значення дефіциту eNOS у патогенезі метаболічних розладів при атеросклерозі та ЦД 2 типу підтверджено клінічно [11,63,102] та експериментально - на гризунах з нокаутом гена eNOS [177].

У той же час, показано, що дисліпідемія також здатна порушувати функціонування eNOS [125,177]. Так, гіперхолестеролемія призводить до зменшення продукції NO, що опосередковуються дією ендогенного інгібітора NOS асиметричного диметиларгініну [124,207,287]. Окиснені ЛПНЩ знижують рівень експресії гена еNОS, стимулюють підвищення активності аргінази, яка реципрокно регулює рівень NO в ендотеліоцитах шляхом конкуренції з еNOS за спільний субстрат (L-aргінін) [9,100,121,177,184,243]. Наслідком дисліпідемії є розлад сполучення L-аргініну та eNOS [113,281], що супроводжується перемиканням еNОS на продукцію поряд з NО супероксидного аніон-радикала [225,273].

Дефіцит у клітинах L-аргініну поряд з BH₄ провокує, так зване, «роз'єднане» утворення супероксидного аніон-радикала як конститутивними, так і індуцибельною NOS [113,115,155, 225,273,281].

Значно у меншій мірі з'ясованою є роль nNOS у механізмах розладів вуглеводного та ліпідного обміну за умов атерогенезу, ЦД 2 типу та МС. Лише в останні роки з'явилися повідомлення про причетність дефектів nNOS до порушення інсулін-індукованого транспорту глюкози. Блокада убіквітин-протеасомної деградації цього ізоферменту або гіперекспресія nNOS поліпшує надходження глюкози і транслокацію GLUT-4 у культурах інсулінорезистентних міоцитів [208].

Виявлено, що за умов фізичної активності скелетні м'язи здорових осіб виявляють збільшення активності nNOS, у той час, як у хворих з ознаками ІР цей параметр не зазнає змін [192]. В останні роки з'явилися повідомлення, що відтворення ІР супроводжується зменшення каталітичної активності nNOS у інсулін-залежних органах. За цих умов порушується здатність інсуліну призводити до фосфорилювання nNOS у скелетних м'язах [175].

Показано, що у скелетних м'язах nNOS знаходиться у фосфорильованому стані та реагує підвищенням продукції NO у відповідь на надходження інсуліну [175]. Низькі концентрації NO у м'язах важливі для підтримки адекватного redox стану клітин [147].

Все ще залишається далеким від свого розв'язання питання про те, в якій мірі функціонування iNOS за умов МС має протективну дію, а в якій сприяє ураженню органів-мішеней, тому, що NO у залежності від концентрації, походження і характеру стимулів, що викликають його продукцію, може мати зовсім різний спектр дії [258].

Відомо, що експресія iNOS активується низкою чинників, здатних індукувати ІР, у тому числі глюкозою, за умов гіперглікемії [132,250] та вільними жирними кислотами [251], що опосередковуються, головним чином, через активацію NF-кB [258].

Таким чином, викликає інтерес дослідження впливу селективних інгібіторів nNOS та iNOS на показники вуглеводного та ліпідного обміну в організмі щурів за умов відтворення МС.

Призначення 7-NI та аміногуанідину за цих умов істотно не позначається на величині концентрації глюкози у сироватці крові щурів у порівнянні з даними другої серії (таблиця 4.4).

Проте за даними підшкірного інсулінового тесту, вміст глюкози у сироватці крові у щурів, яким відтворювали МС та вводили селективний інгібітор nNOS 7-NI, через 60 хв після введення інсуліну, в дозі 0.2 МО/кг маси тварини, концентрації глюкози зменшується до 5.54±0.26 ммоль/л, тобто на 0.97±0.19 ммоль/л, що складає 14.7±2.4%. Це на 31.6% (p<0.05) поступається даним другої серії, що вказує на погіршення чутливості тканин до інсуліну.

Концентрація глюкози у сироватці крові у щурів, яким відтворювали МС та вводили селективний інгібітор iNOS аміногуанідин, через 60 хв після введення інсуліну, в дозі 0.2 МО/кг маси тварини, зменшується до 3.95±0.33 ммоль/л, тобто на 2.67±0.10 ммоль/л, що складає 40.6±1.6%. Це на 88.8% (p<0.001) перевищує результат другої серії, що свідчить про істотне покращення чутливості тканин ...