Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние синтетического регуляторного пептида DNSP-5 на экспрессию генов нейтротрофинов и их рецепторов в мозге крыс с 6-гидроксидофамин индуцированным паркинсонизмом



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ARTN (artemin) - артемин

BDNF (brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор мозга CNTF (ciliary neurotrophic factor) - цилиарный нейротрофический фактор DOPAC (3,4-Dihydroxyphenylacetic acid) - 3, 4-диоксифенилуксусная кислота GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор глиальных клеток

GFRa (GDNF family receptor a) - рецептор семейства GDNF HVA (homovanillic acid) - гомованилиновая кислота

NGF (nerve growth factor) - фактор роста нервов NRTN (neurturin) - нейтурин

TGF-в (transforming growth factor в) - трансформирующий ростовой фактор в 6-ГДА - 6-гидроксидофамин

БП - болезнь Паркинсона ГП - голубое пятно

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДА - дофамин

ДНК - дизоксирибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин НТФ - нейротрофические факторы

ОБ-Л - обонятельная луковица (левая часть) ОБ-П - обонятельная луковица (правая часть) ЖКТ -желудочно-кишечный тракт

ПЦР - полимеразная цепная реакция С-Л - стриатум (левая часть)

С-П - стриатум (правая часть) ХЯ - хвостатое ядро

ЦНС - центральная нервная система ЦЯ - центральное ядро

ЧС - чёрная субстанция

ЧСкч - чёрная субстанция (компактная часть) ЧС-Л - чёрная субстанция (левая часть)

ЧС-П - чёрная субстанция (правая часть)



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Заболевания центральной нервной системы являются одними из наиболее социально значимых. Среди этих болезней отдельную большую группу составляют нейродегенеративные заболевания, которые характеризуются избирательной дегенерацией отдельных типов нейронов и структур мозга. Одним из таких заболеваний является Болезнь Паркинсона (БП) - это медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, которое характеризуется гибелью дофаминергических нейронов чёрной субстанции (ЧС) головного мозга. БП относят к числу самых распространённых нейродегенеративных заболеваний человека. По последним данным, БП по всему миру болеет около 6 млн. человек. Считается, что БП наблюдается у не менее 1-2% населения в возрасте старше 65 лет и не менее 4-5% в возрасте старше 85 лет. Было высказано предположение, что с увеличением среднего возраста населения в ближайшие годы распространенность БП в мире будет увеличиваться.

Многолетние исследования позволили достаточно полно описать БП с клинической точки зрения. Однако до сих пор БП остаётся неизлечимой. В связи с этим, в настоящее время ведутся поиски лекарственных средств и методик, способных оказать влияние на причины заболевания и привести к частичному или полному восстановлению повреждённых клеток. Наиболее часто изучение новых лекарственных средств проводят с помощью моделей БП на животных. Одним из многообещающих направлений таких исследований является изучение свойств регуляторных пептидов - соединений, входящих в состав сложной сети взаимодействий специализированных сигнальных молекул, основная функция которой состоит в объединении нервной, эндокринной и иммунной систем в единый цикл.

Нейротрофические факторы - группа регуляторных полипептидов, регулирующих выживание, развитие и дифференцировку нейронов. Они участвуют в комплексе биохимических и физиологических процессов, которые оказывают воздействие на нейропластичность, нейропротекцию и нейрогенез. С момента открытия нейротрофических факторов возникли предположения о возможном применении этих веществ в лечении нейродегенеративных заболеваний. В настоящее время можно найти большое количество работ, посвящённых оценке влияния нейротрофических факторов на БП.

Однако, хотя в работах выявлено профилактическое и терапевтическое воздействие нейротрофических факторов, использование регуляторных пептидов в качестве терапевтических агентов осложняется их мультифункциональной природой и высокой нестабильностью, которая обусловлена наличием в организме множества пептидаз. Одним из возможных решений этих проблем является создание коротких синтетических пептидов, основанных на аминокислотной последовательности нейротрофических факторов.

Среди таких пептидов особое внимание привлекает небольшой синтетический пептид, основанных на последовательности глиального нейротрофического фактора (GDNF). DNSP-5 выделяется среди прочих синтетических пептидов малым размером, стабильностью in vitro, а также слабым связыванием с гепарином, все эти факторы делают его перспективным терапевтических средством для лечения БП.

Цели и задачи

Целью настоящего исследования является оценка возможных нейропротекторных свойств синтетического регуляторного пептида DNSP-5 у крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделение тотальной РНК из черной субстанции и стриатума у крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом при введении синтетического регуляторного пептида DNSP-5 и без.

2. Получение библиотеки кДНК на основе тотальной РНК, выделенной из черной субстанции, стриатума и обонятельных луковиц у крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом.

3. Анализ изменения относительных уровней транскрипции генов Artn, Gdnf и их рецепторов Gfra1, Gfra2, Gfra3, Gfra4 в черной субстанции, стриатуме и обонятельных луковицах у крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом на фоне курсового введения синтетического регуляторного пептида DNSP-5.

4. Оценка возможных нейропротекторных свойств синтетического регуляторного пептида DNSP-5.

Научная новизна работы

В настоящее время активно ведутся поиски лекарственных препаратов и методик, способных повлиять на причины заболевания и привести к частичному или полному восстановлению повреждённых отделов нервной системы. Наиболее часто изучение новых лекарственных средств проводят с помощью моделей БП на животных. Одним из перспективных направлений таких исследований является изучение свойств регуляторных пептидов - соединений, основная функция которой состоит в объединении нервной, эндокринной и иммунной систем в единый цикл.

Нейротрофические факторы - регуляторные полипептиды, влияющие на выживание, развитие и дифференцировку нейронов. С момента открытия нейротрофических факторов появились ожидания относительно их применения в лечении нейродегенеративных заболеваний. В настоящее время можно найти большое количество работ, посвящённых оценке влияния нейротрофинов на болезнь Паркинсона.

Но применение регуляторных пептидов в качестве медицинских препаратов осложняется, главным образом, их крупным размером и высокой нестабильностью, которая обусловлена наличием в организме множества пептидаз. Вследствие этих особенностей возникла необходимость повышения эффективности и продолжительности жизни природных регуляторных пептидов. Многообещающим решением этого вопроса стало создание небольших синтетических пептидов, основанных на аминокислотных последовательностях природных нейротрофинов. Так был создан ряд синтетический регуляторный пептид DNSP-5. Предполагается, что он может быть использован для профилактики и лечения.

В данной работе впервые было проведено исследование влияния синтетического регуляторного пептида DNSP-5 на экспрессию уровня мРНК генов нейротрофических факторов Artn, Gdnf и их рецепторов Gfra1, Gfra2, Gfra3 и Gfra4 в черной субстанции, стриатуме и обонятельных луковицах у крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом. Это позволило рассмотреть потенциальную возможность использования DNSP-5 в качестве терапевтического агента для профилактики и лечения БП.



Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона - хроническое прогрессирующее заболевание головного мозга, связанное с нарушением работы базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции. (Левин О.С., Федорова Н.В., 2012)

1.1.1 Симптомы БП

БП характеризуется, в первую очередь, нарушениями двигательных функций, такими как гипокинезия, ригидность, тремор покоя и постуральная неустойчивость, а также широким спектром недвигательных нарушений (психических, вегетативных, сенсорных и др.)

Моторные симптомы.

Гипокинезия может проявляться в виде брадикинезии (замедленности движений) или олигокинезии (скованности движений). Ригидность - повышение мышечного тонуса с явным сопротивлением пассивным движениям, которое может быть:

• монотонным, нарастающим при повторных движениях (феномен «восковой куклы»)

• толчкообразно меняющимся (феномен «зубчатого колеса»).

Ригидность наиболее выражена в дистальных отделах рук. Важное диагностическое значение имеет усиление ригидности в одной из конечностей при движении другими конечностями. Относительно рано при БП развивается ригидность и аксиальной мускулатуры. (Раздорская В.В., Юдина Г.К., 2014) Тремор покоя - ритмичные, с частотой 4-6 Гц, колебательные движения в покоящейся конечности (дистальном отделе руки или ноги). Как правило, тремор уменьшается при активном движении и усиливается при движении контрлатеральной конечностью (Левин О. С., Датиева В. К., 2014).

Постуральная неустойчивость обычно возникает на поздних стадиях заболевания и характеризуется нарушением способности удерживать равновесие в той или иной позе, а также при изменении позы.

Немоторные симптомы БП

Согласно современной концепции, нейродегенеративный процесс выходит за рамки компактной части черной субстанции: распространяется от каудальных отделов ствола мозга к коре большого мозга. После поражения дофаминергических нейронов ЧС дегенерации последовательно подвергаются нейроны дорсального ядра блуждающего нерва, нейроны обонятельной луковицы, норадренергические нейроны голубого пятна, серотонинергические нейроны ядер шва, холинергические нейроны ядра Мейнерта, нейроны коры больших полушарий и некоторые вегетативные сплетения (Braak H., Del Tredici K., Bratzke H. et al., 2002.). Так как моторные нарушения становятся заметны на той стадии БП, когда потеряно более половины нейронов ЧС, есть предположения, что немоторные проявления могут выступать как клинические маркеры диагностики БП, поскольку проявляются задолго до моторных нарушений. В связи с этим, говорят о «премоторной стадии», которая может характеризоваться появлением таких симптомов, как: аносмия, дисфункция ЖКТ, болевые проявления, нарушения сна (Левин О.С., 2008.)

Нервно-психические нарушения при БП

Из-за мультисистемности патологического процесса при БП с дисфункцией не только дофаминергической, но и других медиаторных систем, у большинства пациентов вышеперечисленные нарушения сочетаются с теми или иными нервно-психическими нарушениями, представленными эмоциональными, когнитивными и психотическими расстройствами. Одним из наиболее частых и клинически значимых нервно-психических нарушений при БП является депрессия. (Нодель М.Р., Яхно Н.Н., 2009.). Также специфическими для БП являются усталость, повышенная дневная сонливость. Кроме того, при БП отмечается снижение слуха вследствие поражения периферического отдела анализатора (Vitale C., Marcelli V., Allocca R. et al.,2012). Присутствует ряд характерных зрительных симптомов БП: трудности при чтении, двоение в глазах, зрительные иллюзии, сложные зрительные галлюцинации (Urwyler P., Nef T., Killen A. et al. 2014.,). На поздних стадиях пациентов начинают чаще беспокоить трудности при глотании, неполное опорожнение кишечника, снижение сексуального влечения, головокружение, обмороки, синдром беспокойных ног, отёчность конечностей, гипергидроз. (Bostantjopoulou S., Katsarou Z., Karakasis C. et al., 2013).

паркинсон ген этиопатогенез мозг

1.2 Классификация БП

Наиболее часто в настоящее время применяют классификацию стадий паркинсонизма по Хён и Яру. (Hoehn M. M., Yahr M. D. 1967). Изначально она описывала 5 стадий прогрессирования болезни Паркинсона (1-5). Впоследствии шкалу модифицировали, дополнив её стадиями 0, 1,5 и 2,5. (Goetz CG, Poewe W. 2004).

· Стадия 0 -- нет признаков заболевания.

· Стадия 1 -- симптомы проявляются на одной из конечностей.

o Стадия 1,5 -- симптоматика проявляется на одной из конечностей и туловище.

· Стадия 2 -- двусторонние проявления без постуральной неустойчивости.

o Стадия 2,5 -- двусторонние проявления с постуральной неустойчивостью. Больной способен преодолевать инерцию движения, вызванную толчком.

· Стадия 3 -- двусторонние проявления. Постуральная неустойчивость. Больной способен к самообслуживанию.

· Стадия 4 -- обездвиженность, потребность в посторонней помощи. При этом больной способен ходить и/или стоять без поддержки.

· Стадия 5 -- больной прикован к креслу или кровати.

Тяжёлая инвалидизация.

Существует альтернативная классификация стадий БП по Брааку, которая описывает нейрофизиологические изменения, происходящие при БП. (Рисунок 1.)

Она была предложена в 2003 году (Braak H, Del Tredici K, et al.,2003).

Эта классификация уделяет больше внимания ранним, бессимптомным стадиям БП.

Рисунок 1. Стадии БП по Брааку (Hawkes C.H. et al., 2010). Х ЧМН - моторный компонент 10-го черепно-мозгового нерва, ГП - голубое пятно, ХЯ - хвостатое ядро, РФ - ретикулярная формация, ЧС - чёрная субстанция, ЦЯ - центральное ядро



1.3 Этиопатогенез

При БП выделяют семейную и спорадическую формы. Считается, что семейная форма заболевания наблюдается у 10-15% больных (Orr и др., 2002), в то время, как у большинства больных развитие заболевания носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды. При этом сочетание сходного генетического фона и образа жизни повышает риск развития заболевания у родственников больных спорадическим паркинсонизмом в 2-7 раз (Elbaz и др., 1999).

В настоящее время считается, что нейродегенеративные изменения при БП связаны с избирательной гибелью дофаминергических нейронов. В первую очередь разрушаются ДА нейроны в компактной части черной субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга [Nussbaum, Polymeropoulos, 1997]. Гибель нейронов в ЧС приводит к снижению уровня дофамина в полосатом теле, что вызывает двигательные нарушения: тремор, ригидность и брадикинезию [Fowler, 2007]. Характерные для БП клинические признаки проявляются при гибели приблизительно 50-60% дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции и 70-80%-ном снижении уровня дофамина в полосатом теле [Bernheimer et al., 1973; Cookson et al., 2008]. При этом нейродегенерация затрагивает не только дофаминергические нейроны, но и клетки других медиаторных систем. Патологические процессы наблюдаются в голубоватом пятне (норадренергическая система), ядрах шва (серотонинергическая система), базальном ядре Мейнерта и дорсальном моторном ядре блуждающего нерва (холинергическая система), коре поясной извилины, энторинальной области коры, обонятельной луковице, симпатических ганглиях и парасимпатических нейронах пищеварительного тракта. Дегенерация некоторых из перечисленных не дофаминергических зон коррелирует с вторичными симптомами БП, например, с деменцией. Развитие деменции главным образом может быть связано с дегенерацией структур гиппокампа [Lee, Liu, 2008]. Таким образом, при БП говорят не столько о поражении какой-либо конкретной медиаторной системы, сколько о дисбалансе медиаторов базальных ганглиев. Подобный дисбаланс приводит к дезорганизации деятельности мозга, и, прежде всего, экстрапирамидной системы [Горбунова и др., 2000].

Генетические факторы.

На данный момент в геноме человека картировано 17 локусов семейной формы БП, но только несколько из них ответственны за развитие заболевание в достаточно большом количестве семей (более 10).

Роль генетических факторов в патогенезе БП подтверждается близнецовыми исследованиями и анализом семей с БП. Анализ семей с БП показал, что сочетание сходного генетического фона и образа жизни повышает риск развития заболевания у родственников больных идиопатическим (спорадическим) паркинсонизмом в 3-14 раз по сравнению с контролем [Pankratz, Foroud, 2004]. Анализ семейных форм выявил целый ряд различных локусов, так или иначе вовлеченных в патогенез БП. При этом только для 7 локусов точно идентифицированы гены, связанные с заболеванием, определен характер наследования и выявлены мутации, приводящих к развитию моногенных форм БП. (Показаны в Таблице 1.)

Таблица 1. Локусы и гены, связанные с БП

Локус	Ген/белок	Возможная функция
PARK1/ PARK4	SNCA/-синуклеин	Пресинаптический белок, компонент телец Леви, хранение и компарментализация дофамина
PARK2	PARK2/ Паркин	Убиквитин Е3 лигаза, Нейропротектор
PARK5	UCHL1/ C-концевая убиквитин гидролаза 1	Убиквитин карбоксигидролаза
PARK6	PINK1/ Серин/треонин- протеин киназа PINK1	Митохондриальная протеин киназа, нейропротектор
PARK7	PARK7/ Белок DJ-1	Шаперон, антиоксидант
PARK8	LRRK2/ Киназа 2 с лейцин богатыми повторами, дардарин	Протеин киназа, защищает клетки от вызываемой стрессом митохондриальной дисфункции
PARK9	ATP13A2/ ATФаза 13A2	Лизосомная ATФаза

Анализ всех выявленных на данный момент локусов позволяет предположить несколько механизмов, объясняющих причины селективной и прогрессирующей гибели дофаминергических нейронов. К ним в первую очередь относятся процессы, связанные с убиквитин-зависимой протеасомной деградацией белков, митохондриальной дисфункцией, дифференцировкой дофаминергических нейронов, функционированием синапсов и лизосом, обменом дофамина и другими процессами.

У больных БП в нейронах центральной нервной системы и тромбоцитах крови наблюдается недостаточная активность митохондриального комплекса I и снижено содержание отдельных субъединиц этого комплекса [Swerdlow et al., 1996]. Связанные с развитием семейных форм БП гены кодируют белки, которые играют важную роль в функционировании митохондрий.

В последнее десятилетие появились данные о том, что ?-синуклеин может непосредственно локализоваться на внутренней мембране митохондрий за счет криптического сигнала транспорта в митохондрии, обнаруженного на N- конце белка [Biskup et al., 2005; Klivenyi et al., 2006]. Это говорит о том, что, по всей видимости, ?-синуклеин способен модулировать функции митохондрий и может влиять на их устойчивость к митохондриальным токсинам.

Механизмы, при помощи которых паркин может регулировать функции митохондрий, до конца не изучены. Потеря функциональных способностей паркина как Е3 убиквитин лигазы, связанная с мутациями в гене PARK2, может привести накоплению поврежденных оксидантным стрессом белков, таких как CDCrel-1/Sept5, CDCrel-2/Sept4, Pael-R, циклин E, синфилин-1, p38/JTV1 и FBP1. Однако ни один из этих субстратов не локализован в митохондриях и, следовательно, их накопление может только косвенно влиять на функционирование митоходрий [Moore et al., 2005]. Было обнаружено, что паркин способен влиять на митоходриальный морфогенез при сперматогенезе, а также усиливать митохондриальный биогенез при пролиферации клеток через транскрипцию и репликацию митохондриальной ДНК [Kuroda et al., 2006]. В недавних экспериментах было показано, что митохондриальная дисфункция, индуцированная ?-синуклеином, может быть значительно усилена при недостаточной активности паркина in vivo, что указывает на важную роль паркина в модулирование функций митохондрий при БП, вызванной мутациями или нарушением метаболизма синуклеина [Stichel et al., 2007]. Паркин также способен взаимодействовать с белками, кодируемыми генами LRRK2, PINK1 и DJ-1, усиливая или снижая митохондриальную дисфункцию. Помимо паркина и б-синуклеина, важную роль в функционировании митохондрий играют белки, которые непосредственно локализованы в этой органелле и кодируются генами моногенных форм БП - LRRK2, PINK1, DJ-1.

Таким образом, можно предположить, что нормальное функционирование митохондрий крайне важно для выживаемости и полноценного функционирования нейронов. Кроме того, митохондриальная дисфункция приводит к развитию окислительного стресса, который может быть как её следствием, так и усиливать или непосредственно вызывать дисфункцию митохондрий.

В настоящее время есть данные том, что окислительный стресс реализуется через блокирование двух сигнальных путей, связанных с нормальным функционированием дофаминергических нейронов ??Nrf2/ARE и PI3kinase-Akt.

Внешние факторы.

Как уже было сказано выше, генетически обусловленными являются лишь 10-15% случаев БП. В большинстве же случаев данного заболевания причина болезни неизвестна, однако, считают, что спорадическая форма БП может быть обусловлена сложным взаимодействием генетической предрасположенности и факторов окружающей среды.

К факторам окружающей среды относят воздействие пестицидов, полихлорированных бифенилов, растворителей (трихлорэтилена, тетрахлорэтилена), тяжёлых металлов, а также загрязнение воздуха. Влияние возраста на развитие БП может быть связано с накоплением у лиц пожилого возраста соматических мутаций в митохондриальной ДНК, которые вызывают функциональную недостаточность дыхательной цепи нейрона [Ekstrand M.I. et al, 2007]. А это в свою очередь приводит к возрастной потери мозговых нейронов. Было показано, что каждые 10 лет жизни человек теряет около 8% нейронов, в том числе и дофаминергических. Но, тем не менее, компенсаторные возможности мозга настолько велики, что симптомы паркинсонизма появляются только в пожилом возрасте, при потере более 60% дофаминергических нейронов.

1.4 Лечение и перспективы терапии БП

Несмотря на то, что в настоящее время болезнь Паркинсона неизлечима, современные достижения в области изучения патогенеза заболевания позволили значительно продвинуться в симптоматическом лечении БП: снизить выраженность симптомов и замедлить процесс нейродегенерации.

В лечении БП можно выделить три основных направления:

• симптоматическую терапию, позволяющую уменьшить основные симптомы заболевания за счет коррекции возникающего в мозге нейрохимического и нейрофизиологического дисбаланса

• нейропротективную/нейрорепаративную терапию, целью которой является замедлить или приостановить дегенерацию нейронов головного мозга, а с другой стороны, восстановить функционирование поврежденных отделов мозга

• физическую и социально-психологическую реабилитацию.

К нейропротективной/нейрорепаративной терапии относятся 3 группы мер:

• меры, предупреждающие развитие нейродегенеративных изменений в клетках,

• меры, обеспечивающие функциональное восстановление частично поврежденных, но жизнеспособных клеток,

• меры, обеспечивающие увеличение числа нейронов, например, путем имплантации новых клеток или стимулирования деления существующих клеток. (Левин О.С., Артемьев Д.В., Бриль Е.В., Кулуа Т.К., 2017)

Несмотря на то, что вышеперечисленные методы лечения БП постоянно развиваются и совершенствуются, они остаются только симптоматическими и не могут остановить процесс дегенерации ДА клеток. По-прежнему существует необходимость разработки альтернативных методов лечения, которые позволят остановить гибель нейронов и защитить их от дальнейшей дегенерации. В последние годы экспериментальные и клинические испытания прошли несколько десятков средств, потенциально способных влиять на различные стадии нейродегенеративного каскада, в конечном итоге ведущего к гибели клеток (окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, токсическое действие глутамата, нарушения гомеостаза кальция, воспаление, агрегация белков, апоптоз). В частности, исследуются препараты, которые могут оказывать действие на нейротрофические факторы.

1.5 Нейротрофические факторы

Белковые молекулы, регулирующие деление и выживание клеток, называют факторами роста. (Goustin A.S. ea, 1986). Некоторые из таких белков способны индуцировать дифференцировку и подавлять пролиферацию клеток, а так же модулировать их подвижность. (Stoker M. and Gherardi E., 1987). К этой группе относятся в том числе и нейротрофические факторы.

Нейротрофические факторы (НТФ) - регуляторные белки нервной ткани, которые синтезируются в нейронах и глии и влияют на все основные процессы жизнедеятельности нейронов, обусловливают пластичность нейрональной ткани и участвуют в восстановлении нарушенных функций. В дальнейшем был открыт ещё ряд НТФ.

Нейротрофические факторы:

· фактор роста нервов (NGF)

· нейротрофический фактор мозга (BDNF)

· нейротрофины -3 и 4/5 (NT-3, -4/5)

· глиальный нейротрофический фактор (GDNF)

· цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)

Эти факторы контролируют дифференцировку, рост, и сохранение клеток преимущественно центральной и периферической нервной систем. Для них характерен ретро- или антеградный транспорт зрелых молекул по аксону или локальный синтез в прилегающих клетках. (Гомазков О.А., 2004).

В настоящее время ведутся активные исследования эффективности терапевтического воздействия нейротрофических факторов при нейродегенеративных заболеваниях. Одним из наиболее перспективных считают семейство GDNF (Airaksinen M.S., Saarma M., 2002).

Семейство GDNF/

Вместе с тремя другими структурно родственными факторами - нейротурином (NRTN), артемином (ARTN) и персефином (PSPN) - GDNF образует семейство нейротрофических факторов, входящее в суперсемейство трансформирующего ростового фактора в (TGF-в) (Airaksinen, M.S., and Saarma, M., 2002).

Члены семейства GDNF передают сигнал через экстраклеточные рецепторы (GFRб1-4), каждый из которых селективен для соответствующего члена семейства. GDNF проявляет наиболее высокую аффинность к GFRб1.

Рецепторный комплекс GDNF-GFRб1 связывается с экстраклеточным доменом рецепторной тирозинкиназы, модулируя различные внутриклеточные сигнальные каскады (Sariola, H., and Saarma, M., 2003).

GFRб1 - преимущественно с ним связывается GDNF, GFRб2 - связывает нейртурин, GFRб3 - для артемина и GFRб4 - для персефина. Однако возможно и перекрёстное связывание: GFRб1 с меньшим аффинитетом способен активироваться нейртурином и артемином, а GFRб2 - GDNF.

Рецепторы GDNF, как и его транскрипты и белок, обнаружены во многих структурах мозга, что указывает на разнообразие функций GDNF. Среди них

- участие в синаптогенезе в гиппокампе, в поддержании клеточных элементов ГЭБ.

Основные сигнальные пути семейства GDNF:

• MEK/ERK (связан с клеточным делением, дифференциацией и ростом аксонов)

• PI3K/Akt(PKB) (связан с блокировкой про-апоптотических белков)

• PLC/PKC (связан с синаптической пластичностью).

Хотя нейротрофические факторы разных семейств обладают общими свойствами, но особое внимание привлекают те, которые влияют на работу нейромедиаторных систем мозга. GDNF оказывает выраженное защитное действие на нигростриарную и мезолимбическую дофаминовую систему мозга и считается дофаминергическим (Попова Н.К., и др., 2017)

GDNF.

Глиальный нейротрофический фактор впервые выделили из глиальных клеток в 1993 г. Поначалу он был охарактеризован как фактор выживания эмбриональных дофаминергических нейронов мозга в культуре. Позже было выяснено, что он содержится преимущественно в астроцитах, являясь основным продуктом этих клеток. Так же было показано трофическое действие GDNF на культуру ДА нейронов (Lin, L.F., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S., and Collins, F., 1993). В настоящее время GDNF считается фактором, необходимым для развития, поддержания и защиты ДА нейронов чёрной субстанции и стриатума, и обладающим способностями защищать и восстанавливать ДА нейроны, пораженные при болезни Паркинсона (Ibanez, C.F., and Andressoo, J.O.,2016) и имеет потенциал в качестве терапевтического агента.

Особенности строения GDNF.

GDNF - белковая молекула, которая содержит цистеиновый «узел» и характеризуется двумя длинными сигнальными последовательностями, образованными парами антипараллельных в-нитей (Eigenbrot C., Gerber N.,1997). Формируя димер, мономеры связываются в положении «головка- хвост». В связи с антипараллельным расположением структура GDNF имеет лево-правую симметрию. Согласно структурно-функциональному анализу первые 39 аминокислот на N-конце GDNF не требуются для его биологической активности. 3D-структуры на N-конце отсутствуют. С-конец имеет решающее значение для стабильности и биологической активности GDNF, поскольку на С-конце расположены в-спираль и сигнальные последовательности, участвующие в связывании GDNF с GFRб1-рецептором (Chen Z.Y., He Z.Y., He C., Lu C.L., Wu X.F., 2000). Незрелая молекула GDNF состоит из 211 аминокислот, участков расщепления сигнальной последовательности и продомена. Зрелые молекулы имеют молекулярную массу 35 кДа и состоят из 134 аминокислот. В процессе созревания происходит гликозилирование белка и образование гомодимера за счет ковалентных дисульфидных связей. В этой форме нейротрофин реализует свои биологические функции. (Lin L.F., Doherty D.H., Lile J.D., Bektesh S., Collins F.,1993), (Шишкина Т.В., Ведунова М.В., Мищенко Т.А., Мухина И.В., 2015). Ген GDNF локализуется на хромосоме 5p12-P13.1. Он содержит два экзона, один из которых кодирует зрелый белок GDNF, а также сайт расщепления, используемый при обработке белка-предшественника pro-GDNF. (Schindelhauer D., Schuffenhauer S., Gasser T.,Steinkasserer A., Meitinger T., 1995).

Функции GDNF.

Нейротрофический фактор глиальных клеток GDNF играет важную роль в нормальном функционировании дофаминергических нейронов нигростриарной системы - синтезируемый в стриатуме GDNF необходим у крыс для нормального формирования связи между нейронами чёрной субстанции и стриатума (Oppenheim, 1991). GDNF также способен играть роль протекторного фактора при различных токсических повреждениях дофаминергических нейронов - таких как оксидантный стресс, действие 6- гидроксидофамина и МРТР (Hou, 1996, Zeng, 2006, Kearns, 1997) - и повышает уровень синтеза и секреции дофамина в культивируемых дофаминергических нейронах (Cass, 1999).

Терапевтическое применение GDNF/

За последнее время, кроме множества исследований на животных моделях, было проведено несколько исследований терапевтического влияния GDNF на пациентов с БП, в части из которых было показано значительное улучшение состояния больных (Gill et al., 2003; Love et al., 2005; Patel et al., 2005; Slevin et al., 2005), в то время как в других исследованиях таких улучшений не наблюдалось (Lang et al., 2006). В этих исследованиях GDNF доставлялся в ткани стриатума напрямую с помощью катетера. Однако в этих же работах отмечается возможность появления у больных иммунного ответа на применяемый рекомбинантный человеческий GDNF (Slevin J.T. et al., 2005; Tatarewicz S.M. et al., 2007).

Полученный при введении GDNF пациентам с болезнью Паркинсона отрицательный результат лечения может быть связан с относительно большим размером препро-GDNF (211 аминокислотных остатков) и зрелого GDNF. Анализ структуры препро-GDNF позволил предположить, что в результате протеолитического процессинга могут образовываться короткие пептиды и эти пептиды могут также обладать биологической активностью. На основании in silico анализа была предсказана возможность образования трёх таких пептидов размером 5, 11 и 17 аминокислотных остатков (Immonen, 2008), названных DNSP-5, DNSP-11 и DNSP-17 (от Dopamine Neuron Stimulation Peptide).

DNSPs/

Ряд исследований, в которых применялась терапия, основанная на нейротрофических факторах, говорят о том, что эти синтетические пептиды демонстрируют нейротрофические и нейропротекторные свойства как in vitro, так и in vivo, кроме того, DNSP-5, DNSP-11 обладают низкой связываемостью с гепарином, что облегчает их доставку в ткани мозга. Исследователи отмечают, что эффект терапевтического воздействия GDNF и DNSP-пептидов отличаются. Так, повышение уровня внеклеточного ДА наблюдается после терапии с использованием DNSP-5, в отличие от использования GDNF, который не приводит к подобному увеличению (Hebert, et al., 1996). Более того, применение GDNF повышает уровень метаболитов (DOPAC и HVA) и вызывает высвобождение дофамина. Причину функциональной разницы между DNSP-5 и GDNF видят в клеточных механизмах. И DNSP-5 и DNSP-11 способствуют сохранению митохондриального потенциала и повышает уровень активации каспазы-3 в дофаминергических клеточных линиях (Bradley, et al., 2010). Хотя DNSP-11 демонстрирует протективный эффект относительно стауросфорина и 3-нитропропионовой кислоты (исследования проводились на не-нервных клетках HEK-293) (Kelps, et al., 2011), DNSP-5 не проявляет таких свойств, что, предположительно, указывает на большую избирательность протективного эффекта DNSP-5, направленного исключительно на нейроны.

DNSP-5 особенно интересен в связи с его небольшим размером (всего 5 аминокислотных остатков, FPLPA), что обеспечивает высокую эффективность его доставки в головной мозг при интраназальном введении - через обонятельную область и гломеруло-назальный орган он будет поступать непосредственно в область базальных ядер, минуя гематоэнцефалический барьер.

Кроме этого, данный пептид высоко консервативен у человека, приматов и грызунов, тогда как пептид DNSP-11 отличается по своей структуре у разных видов позвоночных. Малый размер пептида также облегчает создание вариантов этого пептида, модификации с целью повышения его устойчивости к действию протеаз.

Таким образом, простая структура, небольшой размер, стабильность in vitro, слабое связывание с гепарином - отличают его от крупных нейротрофических факторов, таких, как GDNF, и делают DNSP-5 перспективным терапевтических средством (Kelps, et al., 2011; Lang, et al., 2005; Salvatore, et al., 2006)

1.6 Моделирование БП

В настоящее время болезнь Паркинсона - неизлечимое заболевание, и для разработки и тестирования новых лекарственных препаратов требуется проведение доклинических исследований, в том числе с использованием подходящих моделей на животных. Для создания моделей БП используются различные виды животных, к которым в первую очередь относятся: мышь, крыса, дрозофила, нематода, рыба и др. [Fox, Brotchie et al., 2010; Pienaar et al., 2010]. Кроме того, в последнее время все более активно для моделирования БП используются различные типы клеточных линий [Schьle et al., 2009].

Все модели БП принято делить на два типа: генетические (эндогенные) и не генетические (экзогенные) модели. Генетические модели основаны на изменении экспрессии различных генов, вовлечённых в патогенез БП, или изменении активности белковых продуктов, кодируемых этими генами. Идентификация генетических мутаций, ведущих к возникновению БП, позволила создать ряд генетических моделей БП. Важно помнить, что лишь около 10 % случаев БП объясняются генетическими причинами, в то время как большая часть относится к спорадическим. Тем не менее генетические модели БП важны, поскольку именно они могут помочь в изучении молекулярных процессов, ведущих к гибели дофаминергических нейронов. Не генетические модели основаны на введение модельным организмам различных индукторов (нейротоксинов, лекарственных препаратов и др.), вызывающих патологическое состояние или хирургических операций, которые приводят к развитию паркинсонического синдрома. Для моделирования используются вещества, вызывающие как обратимые (резерпин), так и необратимые изменения в тканях мозга (МФТП, 6-ГДА, паракват, ротенон), последние - чаще. Общее преимущество токсических моделей заключается в их способности вызывать окислительный стресс и вызывать гибель дофаминергических нейронов.

6-ГДА модель.

6-гидроксидофамин - селективный катехоламинергический нейротоксин (гидроксилированный аналог дофамина). Используется для повреждения дофаминергических нейронов чёрной субстанции у крыс. Поскольку 6-ГДА не может проникнуть через гемато-энцефалический барьер, эта модель требует инъекций 6-ГДА в ткани мозга (чаще всего практикуется унилатеральное введение - другое полушарие остаётся контрольным), обычно в ткани чёрной субстанции, медиальный пучок переднего мозга и стриатум. Также используется внутрижелудочковое введение. Билатерального введения стараются избегать из-за частой афагии и адипсии, которые без тщательного наблюдения за животными приводят к их гибели.

После инъекции в течение 2-3 дней происходит значительная гибель дофаминергических нейронов стриатума, сопровождаемая истощением дофамина. Как и при БП, происходит гибель дофаминергических нейронов с сохранением других нервных клеток.

Нейрональные повреждения от 6-ГДА проявляются по большей части в сильном окислительном стрессе, вызываемом токсином. Из-за схожести с дофамином, 6-ГДА проявляет высокую аффинность к транспортёрам дофамина, которые переносят токсин в дофаминергические нейроны. Находясь в нейроне, 6-ГДА аккумулируется в цитозоле и претерпевает сильное самоокисление, способствую накоплению свободных радикалов (в основном - пероксида водорода). Также 6-ГДА может накапливаться в митохондриях, где он препятствует транспорту электронов, блокируя комплекс I.

Несмотря на доступность инновационных моделей БП, 6-ГДА модель остаётся одной из наиболее используемых инструментов индуцирования гибели нейронов чёрной субстанции по ряду причин:

1. Относительная простота технологии и её низкая стоимость

2. Эксперименты с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом имеют высокую степень воспроизводимости

3. Возможность варьировать количество погибающих нейронов и скорость их гибели (Blandini F, Armentero MT, Martignoni E., 2008)/



Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Использованные реактивы, материалы и приборы

В работе применяли: набор для выделения РНК RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия); колонки для выделения РНК QIAshredder, (QIAGEN, Германия); набор для ПЦР обратной транскрипции RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США); пробирки для ПЦР

MicroAmp® Optical 8-Tube Strip, 0,2 мл, (Applied Biosystems, США); крышки для ПЦР MicroAmp® Optical 8-Cap Strip, (Applied Biosystems, США); планшеты для ПЦР MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0,1 мл, (Applied Biosystems, США); набор для определения концентрации РНК Quant-iT™ RNA Assay Kit (Invitrogen, США). Реактивы для проведения ПЦР были изготовлены компанией «Синтол» (Россия).

В работе использовали следующие приборы: амплификатор для проведения ПЦР в реальном времени StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США); амплификатор для проведения ПЦР и обратной транскрипции; центрифуги Centrifuge 5430 R и 5424 R (Eppendorf, Германия); весы Explorer Pro (OHAUS, США); флуориметр для определения концентрации РНК Quibit 3.0 (Invitrogen, США).

В работе были использован DNSP-5 (синтетический аналог фрагмента нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеток (GDNF). Пептид был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН и любезно предоставлен Андреевой Л.А.

2.2 Характеристика животных, использованных в эксперименте

В эксперименте использовали 10 самцов крыс линии Wistar с весом 250 ± 30 г. Крысы содержались в виварии с температурой окружающей среды 22оС, 12-часовым световым циклом и свободным доступом к воде и пище.

2.3 Выделение тотальной РНК из тканей мозга крыс

Выделение тотальной РНК из тканей мозга проводилось с использованием набора RNeasy® Mini Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с протоколом, разработанным производителем.

Выполнялись следующие операции:

· Поместить в пробирку объемом 2 мл около 10 мг ткани;

· Добавить 350 мкл лизирующего буфера RLT, предварительно смешав его с в-меркаптоэтанолом в соотношении 1мкл в-меркаптоэтанола на 100 мкл RLT;

· Разрушить и гомогенизировать ткань при помощи пипетки в течение 15- 30 сек;

· Нанести смесь на колонку и центрифугировать 2 минуты на скорости более 10 000 об/мин;

· Отобрать супернатант (без осадка), перенести в новую пробирку объемом 2 мл, добавить к нему 70%-й этиловый спирт в объеме, равном объему лизирующего буфера RLT, и смешать пипетированием;

· Нанести по 700 мкл смеси на колонку и центрифугировать 15 секунд на 10 000 об/мин, осадок слить;

· Добавить 700 мкл промывочного буфера RW1 и центрифугировать 30 секунд на 10000 об/мин, осадок слить;

· Добавить 500 мкл промывочного буфера RPE и центрифугировать 30 секунд на 10 000 об/мин, осадок слить; повторить процедуру.

· Поместить колонку в пробирку объемом 1,5 мл. Добавить 30 мкл воды (вода без РНКаз), центрифугировать 1 мин на скорости более 10 000 об/мин;

· Добавить 20 мкл воды (вода без РНКаз), центрифугировать 1 мин на скорости более 10 000 об/мин;

· Содержание РНК определить методом флуорометрической детекции с использованием высокочувствительного набора Quant-iT™ RNA Assay Kit на приборе Quibit 3.0 (Invitrogen, США);

· Образцы полученной тотальной РНК хранить в аликвотах по 10 мкл при температуре -70 °С.

2.4 Полимеразная цепная реакция обратной транскрипции

Реакция обратной транскрипции проводилась с использованием набора RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США).

В работе использовали следующие праймеры и зонды. Artn:

Artn-f 5'-GAACTGGGACTTGGAGAGCCTAC Artn-r 5'-CAGGGAAGCTTCTGTGACGC

Artn-p 5'-GGTGGCAACCAGCCTTGTGGCC

Gdnf:

G-f 5'-CCTTCGCGCTGACCAGTG

G-r 5'-CTTTTGATGGTGGCTTGAATAAAATCC Gdnf-p 5'-CGTCATCAAACTGGTCAGGATAATCTT

Gfra1:

G1-f TCCTAGCCACTCTGTACTTCGCG G1-r GCAGCTCTGTTCCTTCAGGCAC

G1-P 5'-FAM-ACAGTCCAGACGGTCTCCAC-BHQ1-3'

Gfra2:

G2-f CTCCTACCGGACAATCACCAGC

G2-r GTTGGAGTCCACATAGTTGGGTGTC

G2-P 5'-FAM-CAATCATGCCAGCATAGGAGCC-BHQ1-3'

Gfra3:

G3-f CCTGTCTGGACATTTATTGGACC G3-r AGGTCACTGTGTCTTCATAGGGTG

G3-P 5'-FAM-CCGAAGCCTTGGTGACTACGA-BHQ1-3'

Gfra4:

G4-f 5' CACCTTCCTGCCTGAAGCC

G4-r 5' TCCTCCGGACAGCCGTC

G4-p 5' GCCGGTGCCGGCCCCGTC

Tfrc:

Tfrc-F 5'-GGCAGACCTCAAAACACTGTTG

Tfrc-R 5'-CAGCCTCACGAGGAGTATATGTATTC

Tfrc-P 5'-VIC-TTCACTGACATCATCAAGCAGCTGAGCC-BHQ2

Tspo:

Tspo-f 5'-AGGCTGTGGATCTTTCCAGAAC Tspo-r 5'-GGCTGGGCACCAGAGTGA

Tspo-r 5'-ROX-CAATCACTATGTCTCAATCCTGGGTACCCG-BHQ2

Праймеры и зонды подбирались с помощью программы Beacon designer и нуклеотидных последовательностей генов Artn, Gdnf, Gfra1, Gfra2, Gfra3, Gfra4, Tfrc, Tspo (идентификационные номера в базе данных GenBank (ID): (NC_000001.11, NC_005101.4, NC_005100.4, NC_005114.4, NC_005117.4, NC_005102.4, NC_005110.4, NC_005106.4 соответственно).

FAM, VIC, ROX - флуоресцентные красители, BHQ1, BHQ2 - тушители флуоресценции.

Праймеры были синтезированы компанией «Евроген» (Россия), зонды компанией «ДНК-Синтез» (Россия).

В качестве генов сравнения были использованы гены Tfrc и Tspo, так как их относят к генам «домашнего хозяйства». Первый кодирует рецептор трансферрина, второй - внутриклеточный транспортный белок. Для них характерен стабильный уровень экспрессии во многих тканях организма, поэтому они могут быть использованы в качестве генов сравнения (Batarseh, Papadopoulos, 2010).

Протокол действий:

· Собрать смесь следующего состава (в расчете на одну реакцию): РНК - ?1 мкг

Обратный праймер Artn, Gdnf , Gfra1, Gfra2, Gfra3, Gfra4 - 20 пмоль, тРНК E.coli - 100 нг

Бидеионизированная вода - до 10 мкл

· Инкубировать смесь 5 минут при 65°С, затем охладить при 0°С в течение 2 минут.

· Добавить в смесь следующие компоненты: Буферный раствор - 4 мкл (x5)

дНТФ (по 25 нмоль/мкл) - 2 мкл

Ингибитор РНКаз - 1 мкл (20 е.а.)

Ревартаза RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase - 1 мкл (200 е.а.)

· Инкубировать конечную смесь объёмом 20 мкл 1 час при 42°С.

· Инактивировать ревертазу в течение 10 мин при 70°С. Полученные образцы кДНК хранить при температуре -20°С.

2.5 Полимеразная цепная реакция в реальном времени

ПЦР в реальном времени проводилась с помощью прибора Состав смеси на одну реакцию:

· Буферный раствор - 3 мкл (x10)

· Смесь дНТФ - 3 мкл (по 25 нмоль/мкл)

· MgCl2 - 1,5 мкл (25 нмоль/мкл)

· Праймер прямой - 1 мкл (10 пмоль/мкл)

· Праймер обратный - 1 мкл (10 пмоль/мкл)

· Зонд - 1 мкл (25 пмоль/мкл)

· Taq-полимераза - 0,2 мкл (5 е.а./мкл)

· тРНК E.coli - 1 мкл (100 нг/мкл)

· кДНК - 5 мкл

· Бидеионизованная вода - 14,3 мкл

Условия реакции: 1) 50°С - 60 с;

2) 95°С - 600 с;

3) 95°С - 20 с; 45

4) 60° С - 50 с. циклов

2.6 Статистическая обработка данных

Последовательности праймеров и зондов были подобраны с использованием программы Beacon designer 7.0 «Premier Biosoft International» (Palo Alto, США). Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы “Statistica for Windows 8.0” (StatSoft, Inc., США) и программного обеспечения MS Excel 2010 (Microsoft, США). Статистическую значимость данных анализировали с применением непараметрического теста (U-тест Манна-Уитни).

Для оценки относительных уровней экспрессии генов использовали метод сравнения пороговых уровней амплификации, или 2-??Ct метод (Livak K.J., Schmittgen T.D., 2001), согласно которому изменение экспрессии гена определяется с помощью формулы

2-??Ct, где -??Ct = - (?Ct, опыт - ?Ct, контроль);

?Ct = Ct, х - Ct, 0;

Ct, х - пороговый цикл исследуемого гена;

Ct, 0 - пороговый цикл гена сравнения.

Необходимое условие для применения 2-??Ct метода состоит в том, что эффективности реакций для исследуемых генов и генов сравнения должны быть одинаковыми.



Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Схема эксперимента

В эксперименте использовали самцов крыс линии Wistar. Инъекция 3 мкл 6- ГДА гидробромида вводилась стереотаксически в чёрную субстанцию (координаты: AP=4,2; V=1,9; L=7,0) (Paxinos G., 2007). Для анестезии применялись кетамин (50мг/50кг) и бензодиазепин (5мг/50кг), введенные внутрибрюшинно (Shadrina, Filatova, 2013). Следует отметить, что у крыс при введении 6-ГДА фенотип БП развивается дольше, чем у мышей при введении МФТП, что лучше подходит для изучения процессов, протекающих как при нейродегенерации, так и при нейропротекции. Эта экспериментальная модель с использованием моделирования in vivo (токсическая модель с введением крысам 6-ГДА) воспроизводит патогенез болезни Паркинсона и позволяет проводить скрининг веществ на нейропротекторную активность. Необходимо также отметить, что полноценный паркинсонизм-подобный фенотип у крыс развивается через четыре недели после введения токсина (Shadrina, 2013), в связи с этим все последующие операции с животными проводились через четыре недели после введения 6-ГДА.

Все эксперименты с лабораторными животными проводились в соответствии «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» и согласия этического комитета ИМГ РАН. Крысы содержались в виварии со свободным доступом к пище и воде и естественной сменой освещения.

Затем крыс разделили на две группы - контрольную (5 особей) и опытную (5 особей). В течение четырёх недель крысам из опытной группы вводили DNSP- 5 (400 нмоль/кг). Крысам из контрольной группы вводили препарат сравнения, воду. Все препараты вводились интраназально. Вода использовалась в качестве инертного контроля. Развитие симптомов паркинсонизма оценивали в течение 4 недель после проведения повреждения дофаминергических (ДА) нейронов чёрной субстанции. Спустя четыре недели после введения 6-ГДА все животные были декапитированы, и были созданы коллекции тканей мозга (обонятельные луковицы, чёрная субстанция, стриатум). Выделенные области головного мозга поместили в пробирки, заморозили в жидком азоте и поместили на хранение при температуре -70 оС.

3.2 Выделение тотальной РНК

Выделение тотальной РНК проводилось с помощью набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) и колонок QIAshredder (QIAGEN, Германия). РНК была выделена из трёх парных областей головного мозга: стриатума (левой и правой частей), обонятельной луковицы (левой и правой частей) и чёрной субстанции (левой и правой частей). Всего было выделено 60 образцов тканей. (Таблица 2).

Таблица 2. Средняя концентрация РНК в выделенных тканях

Тип ткани	Средняя концентрация РНК в контроле, нг/мкл	Средняя концентрация РНК в опыте, нг/мкл
Стриатум (лев.)	69,1	66,9
Стриатум (прав.)	126,9	134,1
Обонятельная луковица (лев.)	135,5	136,8
Обонятельная луковица (прав.)	141,5	123,2
Чёрная субстанция (лев.)	111,3	109
Чёрная субстанция (прав.)	72,7	70,4

3.3 Получение библиотеки к ДНК

На основе тотальной РНК, выделенной из мозга крыс с 6-ГДА- индуцированным паркинсонизмом, с помощью реакции обратной транскрипции была получена библиотека кДНК.

Получено 60 образцов кДНК на основе РНК, выделенных из 3 типов тканей:

· Стриатум (прав.)

· Стриатум (лев.)

· Обонятельная луковица (прав.)

· Обонятельная луковица (лев.)

· Чёрная субстанция (прав.)

· Чёрная субстанция (лев.)

Для проведения реакции применяли набор RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, США) и прибор Biometra T3 Thermocycler (Biometra, Германия).

3.4 Анализ изменения относительных уровней транскрипции генов Artn, Gdnf, Gfra1, Gfra2, Gfra3, Gfra4

В ходе работы был проведён анализ относительных уровней транскриптов генов нейротрофинов и их рецепторов в различных отделах мозга крыс с 6- ГДА индуцированным паркинсонизмом, получавших DNSP-5. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Относительные уровни транскриптов генов нейротрофинов и их рецепторов в различных отделах мозга крыс с 6-ГДА индуцированным паркинсонизмом, получавших DNSP-5

ткань	Artn	Gdnf	Gfra1	Gfra2	Gfra3	Gfra4
ЧСп	0,63*	0,35*	2,21*	1,89*	1,37	2,01
ЧСл	1,36	0,88	1,38	0,44*	1,07	1,83
СтрП	0,49*	1,88	1,10	1,03	1,26	1,12
СтрЛ	0,73	1,14	2,74	2,98*	-	1,10
ОЛп	0,70	0,34*	0,88	0,82	0,73	0,68
ОЛл	0,38*	0,59*	1,06	1,29	0,93	1,12

Данные представлены в виде медиан. * - данные в экспериментальной группе статистически значимо отличаются от контрольной группы (p<0.05). ОЛп - правая обонятельная луковица, ОЛл - левая обонятельная луковица, ЧСп - правая чёрная субстанция, ЧСл - левая чёрная субстанция, СтрП - правый стриатум, СтрЛ - левый стриатум. Относительные уровни транскрипции в тканях контрольных животных были приняты за единицу

Из представленной таблицы видно, что часть генов статистически значимо изменили свою экспрессию под влиянием DNSP-5.

3.5 Анализ изменения экспрессии гена Artn

Результаты исследования относительной экспрессии гена Artn в мозге крыс с 6-гидроксидофамин индуцированным паркинсонизмом на фоне введения синтетического регуляторного пептида DNSP-5 представлены на рис. 2.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Относительные уровни экспрессии гена Artn в мозге крыс с 6-гидроксидофамин индуцированным паркинсонизмом на фоне введения синтетического регуляторного пептида DNSP-5 по сравнению с контрольной группой. Уровень экспрессии гена Artn в контрольной группе принят за единицу. SNr - чёрная субстанция (правая часть), SNl - чёрная субстанция (левая часть), StrR - стриатум (правая часть), StrL - стриатум (левая часть), OlfbR - обонятельная луковица (правая часть), OlfbL - обонятельная луковица (левая часть). * - p<0,05

По приведённым выше данным видно, что введение DNSP-5 приводит к увеличению экспрессии гена Artn в левой части чёрной субстанции и снижению его экспрессии на стороне, противоположной той, куда вводили токсин, в обонятельной луковице и на стороне с повреждённой чёрной субстанцией в самой чёрной субстанции и стриатуме.

...