Условно-патогенные микробы: системный подход к проблемам лекарственной устойчивости и роли при воспалительных процессах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Условно-патогенные микробы: системный подход к проблемам лекарственной устойчивости и роли при воспалительных процессах

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

бактерия гриб воспаление резистентность

Актуальность проблемы

Со второй половины ХХ века в экономически развитых странах мира наблюдается устойчивый рост уровня заболеваемости патологией, вызываемой условно-патогенными бактериями и грибами. Антропогенное воздействие, как мощный фактор эволюции живой материи, привело в последние годы к стиранию грани между ними и облигатно-патогенными микроорганизмами, т.е. возбудителями «классических» инфекций [Яковлев В.П. и др., 2003; Rolston K.V.I., 2005].

В настоящее время доказана этиологическая роль целого ряда условно-патогенных бактерий и грибов в возникновении инфекционного процесса различной локализации [Анкирская А.С. и др., 2006; Веселов А.В., Козлов Р.С., 2006; Muratani T., 2004]. Однако в отношении некоторых из них данный вопрос не в полной мере изучен, хотя отрицательное влияние избыточной микробной колонизации слизистых оболочек различных органов на структуру, метаболическую и ферментативную активность эпителиальных клеток показано целым рядом ученых [Ардатская М.Д. и др., 1996, 2001; Шендеров Б.А., 1998; Коршунов В.М. и др., 1999].

Другой важнейшей проблемой современной медицины стало массовое распространение лекарственной устойчивости в популяциях условно-патогенных бактерий и грибов [Манграм А.Дж. и др., 2003; Шагинян И.А., Чернуха Ю.М., 2005; Rex J.H. et al., 1995]. В последнее десятилетие сформировалось устойчивое мнение, что одним из важнейших признаков микробной патологии в XXI веке станет появление новых полирезистентных штаммов возбудителей, против которых лечащий врач будет бессилен подобрать необходимый антимикробный препарат [Mazuda N. et al., 1995; Davies J.E., 1997; Jones A.M. et al., 2001]. Разработка универсальных рекомендаций по эмпирической антимикробной терапии невозможна вследствие выраженных колебаний в уровнях и частоте распространения резистентных штаммов бактерий и грибов в разных географических регионах и даже разных биотопах тела человека [Страчунский Л.С.и др., 2003; Тец В.В., 2003; Янов Ю.К., 2003; Бухарин О.В. и др., 2005].

Эпидемиологический надзор за микробным пейзажем заболеваний и резистентностью их возбудителей к антимикробным препаратам в каждом конкретном регионе является в настоящее время единственно приемлемым инструментом обоснования адекватной эмпирической антимикробной химиотерапии [Cuevas О. et al., 2004; Sader H.S., Jones R.N., 2005]. Другое важнейшее направление в повышении ее эффективности - разработка фармакологических способов преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, актуальным является изучение связи условно-патогенных бактерий и грибов с патологией человека, их резистентности к антибиотикам, а также разработка методических подходов к ее преодолению.

Цель исследования

Разработка и обоснование способа преодоления лекарственной резистентности условно-патогенных микроорганизмов на основе системного анализа закономерностей ее распространения при патологических процессах, возникающих за пределами госпитальной среды.

Задачи исследования

1 Выявить особенности циркуляции условно-патогенных бактерий и грибов при воспалительных процессах различной локализации, а также роль некоторых из них в возникновении и развитии патологии у больных амбулаторного профиля.

2 Определить спектр резистентности условно-патогенных микробов к антимикробным препаратам, а также характер и причины распространенности множественной лекарственной устойчивости в их популяциях за пределами госпитальной среды.

3 Сравнить распространенность лекарственной устойчивости у гомологичных видов бактерий и грибов, выделенных из различных локализаций в макроорганизме.

4 Провести эпидемиологический анализ условий и факторов риска колонизации различных биотопов тела человека полирезистентными штаммами условно-патогенных микробов, а также особенностей клинических проявлений вызываемой ими патологии.

5 Разработать способ преодоления лекарственной устойчивости условно-патогенных бактерий и грибов, оценить его эффективность in vitro и in vivo, а также безвредность в экспериментах на лабораторных животных.

Научная новизна исследования

Доказана этиологическая роль коагулазонегативных стафилококков, отдельных видов коринебактерий и факультативных эшерихий в развитии воспалительных процессов различной локализации у больных.

Получены новые данные о региональных особенностях распространения лекарственной устойчивости в популяциях наиболее актуальных видов условно-патогенных бактерий и грибов у амбулаторных больных. Установлено, что отличия в резистентности к антимикробным препаратам эпидермального стафилококка и факультативных эшерихий определяются их локализацией в организме человека.

Впервые показано, что полирезистентные и панрезистентные штаммы условно-патогенных бактерий и грибов получили широкое распространение среди населения вне госпитальной среды. Ведущую роль в их формировании играет не вынос госпитальных штаммов за пределы лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), а массовое потребление антимикробных препаратов, приобретаемых в аптеках.

На основании данных эпидемиологического анализа впервые определены факторы риска и условия колонизации микробиотопов тела человека антибиотикорезистентными штаммами условно-патогенных микробов; выявлены особенности клинических проявлений вызываемой ими патологии; установлена передача детерминант резистентности к ряду антимикробных препаратов в ассоциациях грамположительных бактерий.

Впервые разработан способ преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанный на эффекте синергизма в комбинированном действии антимикробных препаратов и анилиновых красителей,применяемых в субингибирующих дозах. Показана его эффективность и безвредность в доклинических испытаниях. Установлено, что разработанный фармакологический способ преодоления лекарственной устойчивости является универсальным не только в отношении различных микроорганизмов (бактерий, грибов), но и широкого спектра антимикробных препаратов (антибиотиков разных групп, фторхинолонов, нитрофуранов и антимикотиков).

Разработаны новые лекарственные средства для реализации способа преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, определены их оптимальные технологические параметры приготовления и допустимые сроки хранения.

Разработан универсальный способ постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза эритроцитов для подтверждения этиологической роли выделенного клинического штамма микроорганизма в патологии данного пациента.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретический вклад в клиническую микробиологию заключается в установлении закономерностей циркуляции лекарственной устойчивости в популяциях условно-патогенных микробов, выявлении самостоятельной роли некоторых бактерий как возбудителей неспецифических воспалительных заболеваний различной локализации, доказательстве факта распространения полирезистентных бактерий и грибов за пределами госпитальной среды, определении факторов риска и условий колонизации ими слизистых оболочек человека.

Теоретический вклад в фармакологию заключается в обосновании нового подхода к преодолению лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанного на повреждении различных структур микробной клетки, отвечающих за признак резистентности, субингибирующими дозами анилиновых красителей. Данный подход быть использован в качестве основы для решения проблемы преодоления лекарственной устойчивости в вирусологии, паразитологии и онкологии.

Для практического здравоохранения предложены схемы эмпирический антимикробной химиотерапии ряда гастроэнтерологических и акушерско-гинекологических видов патологии в амбулаторно-поликлинической практике, а также патологических процессов других локализаций, вызванных условно-патогенными бактериями и грибами. Кроме того, рекомендованы для использования в практике работы ЛПУ разработанные блок-программы организации мероприятий по инфекционному контролю за циркуляцией лекарственной резистентности условно-патогенных микроорганизмов в госпитальной среде и за ее пределами и составления схем эмпирической антимикробной химиотерапии.

Успешно проведенные доклинические испытания лабораторных образцов новых антимикробных лекарственных средств обосновывают целесообразность доведения их до фармакопейных лекарственных форм, что позволит повысить эффективность лечения патологии, обусловленной полирезистентными микроорганизмами.

Положения, выносимые на защиту

1 У амбулаторных больных г. Самара доминирующая роль в этиологии воспалительных заболеваний различной локализации принадлежит условно-патогенным микроорганизмам: стафилококкам (золотистому и эпидермальному), энтеробактериям (клебсиеллам, энтеробактерам, лактозонегативным эшерихиям) и различным видам грибов рода Candida.

2 Множественная лекарственная устойчивость условно-патогенных микроорганизмов получила широкое распространение за пределами госпитальной среды. Ее характер определяется структурой продаж антимикробных препаратов через аптечную сеть в конкретном географическом регионе, а также локализацией возбудителя заболевания в организме больного.

3 Воспалительные заболевания, обусловленные полирезистентными микроорганизмами, характеризуются более тяжелыми клиническими и дисбиотическими проявлениями. Факторами риска колонизации ими слизистых оболочек являются длительность заболевания и кратность предшествующей антимикробной химиотерапии.

4 Разработанный фармакологический способ преодоления лекарственной устойчивости обладает универсальностью не только в отношении различных микроорганизмов (бактерий, грибов) и способов введения в макроорганизм, но также широкого спектра антимикробных препаратов (антибиотики разных групп, фторхинолоны, нитрофураны и антимикотики). Новые лекарственные средства для его реализации эффективны in vivo, безвредны, сохраняют стабильность свойств в процессе длительного хранения, а технология их приготовления проста и доступна для предприятий фармацевтической промышленности.

Реализация

Результаты проведенных исследований реализованы изобретениями: «Способ преодоления лекарственной устойчивости бактерий и грибов» (патент РФ № 2363470 от 10 августа 2009 г. - переуступлен заводу по производству медицинских препаратов ООО «ОЗОН» из г. Жигулевска - регистрация 26.06.2010 договор № РД0066300), «Способ постановки реакции задержки цитотоксического гемолиза» (патент РФ № 2352945 от 20 апреля 2009 г.), изданием Методических рекомендаций для врачей Министерства здравоохранения и социального развития Самарской области «Эмпирическая антимикробная химиотерапия воспалительных заболеваний, ассоциированных с условно-патогенными бактериями в амбулаторной практике» (2007), составлением отчета о НИР по проблеме № 3 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский военно-медицинский институт» МО РФ на тему: «Микробная экология и ее нарушения при различных видах патологии человека» (2007). Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры медико-биологических дисциплин НОУ ВПО СМИ «РЕАВИЗ», в клиническую практику гинекологического отделения ММУ «Городская клиническая больница №2 имени Н.А.Семашко», терапевтического отделения лечебно-диагностического комплекса «МЕДГАРД», поликлиники НОУ ВПО СМИ «РЕАВИЗ», стоматологической клиники ООО «К-Дент» г. Самары, Госпиталя МСЧ ГУВД по Самарской области.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», XI, XII и XIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», 40-й и 41-й научно-практической конференции научно-педагогического состава Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский военно-медицинский институт» МО РФ «Актуальные вопросы военной медицины», VII научной Международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Египет, г. Хургада), V, VI Международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Таиланд, г. Бангкок, Паттайа), IV общероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования», X Международном конгрессе МАКМАХ/ESMID по антимикробной терапии, III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням.

Публикации

По результатам проведенных исследований опубликовано 28 работ, в том числе 15 - в изданиях, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук» ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации и одна монография.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста, иллюстрирована 66 таблицами, 24 рисунками и двумя клиническими примерами. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», шести глав собственных исследований, обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы содержит 526 наименований, из которых 222 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин и в подразделениях Негосударственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» Министерства образования и науки Российской Федерации, Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский военно-медицинский институт» Министерства обороны Российской Федерации, в Самарской областной клинической больнице № 1 им. М.И. Калинина, Поликлинике ГУВД Самарской области, Женской консультации МСЧ № 17, Пульмонологическом центре г. Самара (ММУ МСЧ № 12), МУЗ «Городская клиническая больница № 3», 1321-м Центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства обороны РФ, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Самарской области».

Под нашим наблюдением находилось 1063 человека, среди которых было 415 больных с хронической патологией органов пищеварения (гастрит, панкреатит, холецистит, энтероколит, синдром раздраженной толстой кишки), 291 пациентка с хроническими акушерско-гинекологическими заболеваниями (бактериальный и кандидозный вульвовагиниты, бактериальный вагиноз). Кроме этого в исследование были включены 44 человека с острыми бронхолегочными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый бронхит), 82 - с ангиной и обострением хронического тонзиллита, 151 - с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей (абсцедирующий фурункул, карбункул, флегмона, абсцесс, инфицированная рана мягких тканей, панариций). Основное количество больных составляли лица в возрасте 16 - 59 лет (88,6 - 100,0 %). В качестве группы сравнения служили 80 практически здоровых лиц.

Все пациенты подвергались тщательному клиническому обследованию, согласно общепринятой схеме исследования больного в терапевтической и хирургической клинике. Диагноз подтверждался физикальными, лабораторными данными, результатами инструментальных исследований. Жалобы больных, анамнез жизни и заболевания опрашивались согласно общепринятым методикам [Лобзин Ю.В., 2000].

Общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи проводили в лабораторных отделениях ЛПУ по стандартным методикам [Карпищенко А.И., 1999]. У больных с пневмонией и бронхитом проводилась рентгенография органов грудной клетки, а при патологии органов брюшной полости - по показаниям фиброгастродуоденоскопии и ультразвукового исследования.

Все женщины с акушерско-гинекологической патологией подвергались осмотру гинекологом. Оценке подлежали состояние слизистой оболочки влагалища, шейки матки (с обязательным использованием кольпоскопии). Особое внимание уделялось характеру (цвет, запах, консистенция) и количеству выделений из влагалища. Размер матки и ее расположение, размеры, болезненность и подвижность придатков определяли путем бимануального влагалищного исследования.

Состав вагинального секрета изучали путем микроскопии мазков, окрашенных по Романовскому - Гимзе, Граму и метиленовым синим. Параллельно производилось измерение pH вагинального секрета с помощью полосок универсальной индикаторной бумаги фирмы "Lachema" (Чехия). Постановку аминного теста и определение "ключевых клеток" осуществляли согласно методикам, приведенным А.С.Анкирской (1995): к выделениям из влагалища, помещенным на предметное стекло, добавляли 10 % раствор гидроокиси калия; «ключевые клетки» идентифицировали под увеличением микроскопа х90.

Количественный и качественный состав микрофлоры кишечника изучали, согласно требованиям «Руководства по военной микробиологии» (2003), а также следуя методическим рекомендациям «Бактериологическая диагностика дисбактериоза» (1989), методикам С.Д.Митрохина с соавт. (1997), В.М.Коршунова с соавт. (1999). Оценку полученных результатов выполняли в соответствии с ОСТ 915000.11.0004 - 2003 «Протокол ведения больного. Дисбактериоз кишечника». Исследование микробиоценоза влагалища выполняли в соответствии с рекомендациями О.П. Даниловой, Н.А. Никифоровой (1997). При проведении большинства микробиологических анализов использовали отечественные реактивы и питательные среды (их качество контролировали с помощью тест-штаммов золотистого стафилококка АТСС 29213 и кишечной палочки АТСС 25922).

Выделение и идентификацию культур бактерий и грибов выполняли в соответствии с требованиями приказа МЗ СССР № 535 от 24.04. 1985 г.; Руководства по военной микробиологии (2003), а также рекомендаций В.И. Кочеровца, В.С. Михайловой (1995). Дополнительно для идентификации энтеробактерий, стрептококков, стафилококков, грамотрицательных неферментирующих бактерий применяли диагностические тест-системы «Streptotest», «Nefermtest», «Staphylotest», «Enterotest» (Чехия) и системы индикаторные бумажные (Россия). Идентификацию грибов рода Candida проводили с учетом рекомендаций В.М. Лещенко (1977), В.Г. Кубась с соавт. (1997), А.Н. Родионова (1998), А.Ю. Сергеева, Ю.В. Сергеева (2000).

При оценке чувствительности бактерий и грибов к антимикробным препаратам in vitro и in vivo руководствовались «Методическими указаниями по изучению противомикробной активности фармакологических веществ» (1999) и МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», инструкциями производителей бумажных дисков. При оценке чувствительности грибов к антимикотикам учитывали требования стандарта M27-A National Committee for Clinical Laboratory Standards (1997).

При проведении эпидемиологических исследований использовали классический эпидемиологический метод, разработанный В.Д. Беляковым с соавт. (1976, 1989, 2001), Б.Л. Черкасским (1990), Н.Н. Филатовым с соавт. (2001), С.Ф. Усиком с соавт. (2007). По типу организации проведенные исследования отнесены к когортным. Для выявления отдельных факторов риска тех или иных клинических проявлений заболеваний, вызываемых полирезистентными микробами, применяли метод продольных ретроспективных исследований. Продольные проспективные эпидемиологические исследования проводили при оценке эффективности разрабатываемых антимикробных препаратов (по данным опытов in vitro и химиотерапевтических экспериментов на лабораторных животных). Поперечные эпидемиологические исследования (типа «поперечного среза») включали анализ распространенности (частоты встречаемости) изучаемых признаков и их сравнение для определения достоверности различий в выборках больных и популяциях микробов.

Химиотерапевтические эксперименты проведены на 120 беспородных белых мышах массой тела 18-20 г, 40 взрослых беспородных белых крысах массой 250-280 г и 9 беспородных кроликах массой 2,5-3,0 кг. До начала эксперимента все животные проходили двухнедельный карантин.

При моделировании острой генерализованной инфекции (экспериментальный сепсис белых мышей) микроорганизмы (золотистый стафилококк, грибы Candida albicans) вводились однократно внутрибрюшинно в дозе 10⁸ живых клеток. При моделировании локализованной гнойной инфекции кожи 10⁹ живых клеток золотистого стафилококка вносили белым крысам на раневую поверхность лопаточной области. При моделировании кандидозного вульвовагинита у самок белых крыс использовалась заражающая доза 10⁸ живых клеток, введенная однократно интравагинально. Заражающие дозы микроорганизмов, а также методические приемы введения их суспензий были выбраны, исходя из данных С.В. Райковой, Г.М. Шуб (2005), Т.Н. Лебедевой (2004), методических рекомендаций «Методы экспериментального изучения биологически активных веществ на моделях вульвовагинита» (2003). Экспериментальные исследования проводились при соблюдении правил, сформулированных в приказах МЗ СССР № 1 от 10.10.1989 г., № 1045-73 от 6.04.1973г.

На фоне развившейся инфекции у животных оценивали действие испытуемых лабораторных образцов лекарственных препаратов (при сепсисе вводили растворы ежедневно однократно внутрибрюшинно, при локализованной гнойной инфекции наносили мази однократно накожно, при экспериментальном вульвовагините вводили растворы однократно интравагинально и внутрибрюшинно). При оценке их эффективности руководствовались «Методическими указаниями по изучению противомикробной активности фармакологических веществ» (1999). В экспериментах использовали один вид контроля - с лечением препаратом, к которому микробы были резистентны in vitro, и который входил в состав разрабатываемого нами лекарственного средства (комбинированная антимикробная рецептура).

Для оценки острой, хронической токсичности, сенсибилизирующего и раздражающего действия разработанных комбинированных антимикробных рецептур применяли методики, изложенные А.И. Карпищенко с соавт. (1999), Л.Н. Серновым, В.В. Гацура (2000).

Лекарственные формы разрабатываемых антимикробных препаратов готовили в асептических условиях путем смешивания в фарфоровой ступке пестиком мазей с антибиотиками (на основе ланолина или медицинского вазелина) с водными или спиртовыми (на этаноле) растворами метиленового синего, бриллиантового зеленого, фуксина. В стеклянных колбах смешивали вышеуказанные красители с водорастворимыми формами антимикробных препаратов. Полученные комбинированные антимикробные рецептуры после фасовки закладывали на хранение в защищенном от света месте при комнатной температуре (от +22 до + 25^оС). Через 12 месяцев растворы оценивались по физическим (визуальным) признакам на предмет сохранения гомогенной структуры. У растворов комбинированных антимикробных рецептур коэффициент светопропускания измеряли на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (светофильтр № 5, кювета толщиной 10 мм). У мазей оценивали цвет визуально по цветовой шкале монитора персонального компьютера в единицах с помощью программы “Power point” (опция - “спектр заливки”). Кроме того, проводилась оценка антимикробной активности приготовленных комбинированных рецептур на выбранных полирезистентных клинических изолятах бактерий и грибов.

На диссертационное исследование получено разрешение Комитета по биоэтики при Самарском государственном медицинском университете (протокол № 73 от 13.01.2009 г.)

Статистическая обработка результатов исследований проводилась на компьютере «Partner E418L» с использованием прикладной программы "Statgraрhics Plus for Windous" по методикам С.Г. Григорьева с соавт. (1990), В.Дюк (1997), комплекта статистических программ "Statistica 6,0" по методике В.И. Юнкерова, С.Г. Григорьева (2002). Полученные данные интерпретировали по рекомендациям Г.Ф. Лакина (1990), В.И. Юнкерова, С.Г. Григорьева (2002).

Общая характеристика проведенных исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Объем и методики проведенных исследований

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Девять лет наблюдений были посвящены оценке особенностей циркуляции условно-патогенных микроорганизмов за пределами госпитальной среды среди населения крупного административно-промышленного центра Среднего Поволжья (г.Самара). Для объективизации эпидемической ситуации нами включены в исследования формы патологии, связанные с нарушениями микробной экологии в самых заселенных бактериями и грибами микробиотопах тела человека: кишечнике, влагалище, ротоглотке, кожных покровах.

Анализ микробного пейзажа кишечника у больных (455 чел.) с хроническими заболеваниями органов пищеварения показал, что ассоциированный с условно-патогенными бактериями и грибами дисбиоз является широко распространенным клинико-лабораторным синдромом. При переходе болезни из фазы ремиссии в фазу обострения, он встречался у 67-86 % пациентов, что согласуется с данными, выявленными ранее А.Е. Билёвым (2003) у пациентов с бронхолегочной патологией. В противоположность этому гипотеза В.А. Боброва, Л.Ф. Карпова (1993), Е.В. Будановой с соавт. (1996), Т.К. Корневой (1999) о специфичности изменений кишечной микрофлоры при отдельных видах патологии не нашла своего подтверждения в отношении рассмотренных нами хронических заболеваний (гастрит, холецистит, панкреатит, энтероколит): достоверных отличий в количественном составе микрофлоры у больных не наблюдалось. В структуре дисбиоза у этих пациентов преобладали II и III степень микробиологических нарушений, обусловленные в 55-59 % случаев колонизацией кишечника факультативными энтеробактериями: эшерихиями (лактозонегативными и с гемолитическими свойствами), клебсиеллами, энтеробактерами, реже цитробактерами и протеями. Важное значение в формировании дисбиоза имели также золотистый стафилококк и грибы рода Candida (5 - 11 и 3 - 14 % случаев соответственно). Другие условно-патогенные аэробные бактерии (цитобактеры, гафнии, протеи) были выделены только у 2,2 % обследованных нами пациентов.

Дальнейшие исследования циркуляции условно-патогенных микроорганизмов были проведены среди женского населения (423 чел.) г. Самара на примере акушерско-гинекологической патологии. Было установлено, что в большинстве случаев (от 61 до 92 %) заболевания были обусловлены ассоциациями аэробных, анаэробных бактерий и грибов рода Candida, что согласуется со сведениями, опубликованными Е.А. Крешневой (2000), В.И. Петровой с соавт. (2003), А.А. Халдиным (2004) относительно других регионов России. Доля пациенток, у которых патологический процесс ассоциировался только с одним видом факультативных микробов, варьировала от 8 - 12 % (при кандидозном вульвовагините и бактериальном вагинозе) до 39 % (при бактериальном вульвовагините).

Ведущими в дисбалансе микробной экологии влагалища были эпидермальный стафилококк и коринебактерии. Частота их встречаемости при изученных видах акушерско-гинекологической патологии варьировала в разных группах больных соответственно от 40 до 66 % и от 4 до 38 % при средней концентрации в вагинальном секрете от (9Ч10⁵) до (8Ч10⁶) КОЕ/мл. Это побудило нас более подробно рассмотреть роль данных бактерий в этиологии бактериального вульвовагинита.

В результате проведенных клинических исследований женщин нами были получены данные о способности эпидермального стафилококка и коринебактерий самостоятельно (или в ассоциации друг с другом) вызывать воспалительный процесс во влагалище. Доля таких больных среди обследованных женщин с бактериальным вульвовагинитом составила 42 %.

Золотистый стафилококк выявлялся в вагинальном секрете у 9 - 19 % обследованных лиц в концентрации от (2Ч10⁵) до (8Ч10⁷) КОЕ/мл (часто в составе ассоциаций с другими бактериями, а также грибами). Важную роль в колонизации влагалища играли и представители микробиотопа кишечника. Из аэробных и микроаэрофильных бактерий чаще всего встречались энтерококки и факультативные энтеробактерии (лактозонегативные эшерихии, энтеробактеры и клебсиеллы): соответственно в 4 - 26 % и 5 - 17 % случаев. Их концентрация в вагинальном секрете была в пределах от (6Ч10⁵ ) до (2Ч10⁶) КОЕ/мл.

Облигатные анаэробы кишечника (пептострептококки, бактероиды, фузобактерии, мобилункусы и другие) также выделялись из влагалища (либо изолированно, либо в ассоциациях): при бактериальном вульвовагините у 18 %, кандидозном - у 40 %, при бактериальном вагинозе - у 69 % пациенток, что согласуется с данными И.А. Кондулуковой (2000).

В качестве вспомогательного метода дифференциальной диагностики бактериального вагиноза и бактериального вульвовагинита нами была разработана экспертная система оценки результатов микробиологического анализа вагинального секрета, основанная на искусственном интеллекте -комбинированном применении методов линейной алгебры и интерактивной графики. Учитывая всего три параметра: абсолютное число видов выделенных анаэробных бактерий, абсолютное число видов выделенных микроаэрофильных и аэробных бактерий, содержание анаэробных бактерий и аэробных бактерий в 1 мл вагинального секрета (lg), она позволяла с вероятностью 52 - 81 % уточнять предварительный диагноз.

Особенностью микробного пейзажа при кандидозном вульвовагините у женщин явилась редкая встречаемость мононоинфекции, вызванной основным возбудителем (всего у 8 % больных). В большинстве случаев наблюдалась ассоциация грибов с аэробными или анаэробными бактериями (соответственно 47 и 19 %), либо с теми и другими одновременно (26 %). Это указывало на необходимость комплексной этиотропной терапии кандидозного вульвовагинита, направленной на эрадикацию как грибов, так и входящих в ассоциацию с ними бактерий. По нашему мнению, отсутствие надлежащего клинического эффекта, обусловливающего необходимость длительного применения антимикотиков у таких больных, связано в значительной степени с наличием сопутствующих условно-патогенных бактерий.

Таким образом, микробиологическими особенностями кандидозного, бактериального вульвовагинита и бактериального вагиноза являются специфичность изменений микробного пейзажа и обусловленность патологического процесса ассоциациями условно-патогенных бактерий и грибов. Наряду с этим особенностью кандидозного вульвовагинита явилось и то, что соотношение случаев, вызванных Candida albicans и прочими видами Candida, составляло у обследованных больных 2 : 1. Это подтверждает сведения Л.И. Дятловой (2002) о постепенном изменении этиологической структуры кандидоза в пользу последних. Учитывая природную устойчивость некоторых из них к антимикотическим препаратам, на что указывали А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев (2004), Н.Н. Климко, А.В. Веселов (2007), без идентификации видов грибов выбор средств этиотропного лечения не может считаться достаточно обоснованным.

В отличие от дисбиозов кишечника и женской половой сферы микробный пейзаж ротоглотки при ангине и гнойно-воспалительных процессов в мягких тканях (панариций, флегмоны, абсцессы, инфицированные раны наружных покровов) (277 чел.), возникших до госпитализации больных, не отличался большим разнообразием (рисунок 1): в его этиологической структуре доминировали стафилококки (золотистый или эпидермальный), а также пиогенный стрептококк. Из области хирургического вмешательства при абсцедирующем фурункуле, карбункуле, флегмоне, абсцессе, инфицированной ране мягких тканей, панариции они выделялись, как правило, в монокультуре (99 %).

Таким образом, у больных амбулаторного профиля в микробном пейзаже гастроэнтерологической, акушерско-гинекологической и хирургической патологии, ассоциированной с условно-патогенными микроорганизмами, доминируют стафилококки (золотистый и эпидермальный), факультативные энтеробактерии (лактозонегативные эшерихии, клебсиеллы, энтеробактеры) и грибы рода Candida.

Рисунок 1 - Этиологическая структура некоторых видов патологии, возникшей за пределами госпитальной среды

Далее, учитывая наибольшую актуальность для медицинской практики в г. Самара указанных микроорганизмов, они были выбраны в качестве объектов изучения при анализе закономерностей распространения лекарственной устойчивости.

Результаты проведенных исследований антибиотикорезистентности у штаммов, выделенных у 963 лиц, позволили установить высокую частоту встречаемости резистентности к антимикробным препаратам в популяциях факультативных бактерий, циркулирующих среди больных амбулаторного профиля с различными видами патологии (таблица 2).

Таблица 2 - Распространенность лекарственной устойчивости среди условно-патогенных бактерий, ассоциированных с патологией, сформировавшейся за пределами госпитальной среды

Так, у 10 - 25 % штаммов золотистого стафилококка и факультативных энтеробактерий, выделенных из кишечника, была установлена резистентность даже к цефалоспоринам (2 и 3 поколения). Кроме того, от 13 до 15 % исследованных клинических изолятов энтеробактерий и 13 % штаммов стафилококков утратили чувствительность к фторхинолонам.

Ситуация, аналогичная вышеизложенной, наблюдалась и в структуре резистентности к антимикробным препаратам у возбудителей некоторых акушерско-гинекологических заболеваний: к цефалоспоринам были устойчивы от 16 до 22 % клинических изолятов, фторхинолонам - от 20 до 41 %, аминогликозидам - от 19 до 46 %. Эти данные согласуются с публикациями J.F. Acar, F.W. Goldstein (1997), T. Muratani, T. Matsumoto (2004), отмечавших утрату чувствительности к данным препаратам среди возбудителей внебольничных инфекций.

Таким образом, нами было установлено, что среди штаммов микроорганизмов, выделенных у амбулаторных больных с различной патологией, наиболее распространенной является резистентность к макролидам, аминопенициллинам, левомицетину, препаратам тетрациклинового ряда, нитрофуранам, наименее - аминогликозидам, цефалоспоринам и фторхинолонам.

Сравнительный анализ распространенности лекарственной резистентности среди отдельных популяций бактерий, обусловивших патологические процессы в различных органах у обследованных больных, показал, что для выделенных штаммов золотистого стафилококка отмечались статистически достоверные различия в отношении чувствительности к фторхинолонам, аминопенициллинам и препаратам тетрациклинового ряда. Доминирующей экологической нишей по частоте встречаемости резистентных штаммов S.aureus было влагалище, затем следовал кишечник, область хирургического вмешательства, бронхолегочная система и небные миндалины. Эти данные согласуются с данными О.В. Бухарина с соавт. (2005) и Л.М.Хуснутдиновой (2006) об отличиях в резистентности популяций микробов, выделенных из различных микробиотопов тела человека.

Аналогичные исследования были проведены и в отношении эпидермального стафилококка. Они представляли особый интерес, так как подробному изучению лекарственной устойчивости этого микроба ранее не уделялось должного внимания за исключением единичных публикаций [Карпушкина Н.Б. и др., 2007]. Нами показано, что отсутствие отличий по частоте циркуляции резистентных штаммов S.epdermidis в различных экологических нишах тела человека касалось только ципрофлоксацина и эритромицина. По всем остальным изученным антимикробным препаратам установлено достоверное превышение доли устойчивых клинических изолятов, выделенных из влагалища и небных миндалин в сравнении с таковыми из области хирургического вмешательства. Ранее подобные сравнительные исследования касались только микробиотопов кожи и глаз [Бухарин О.В. и др., 2005].

У лактозонегативных эшерихий, выделенных из разных органов, таких существенных отличий в резистентности к антимикробным препаратам, как у стафилококков, не выявлено. Тем не менее, доля штаммов кишечной микрофлоры, полностью утративших чувствительность к доксициклину, превышала таковую у ассоциированных с акушерско-гинекологической патологией в 1,6 раза (р < 0,05). В противоположность этому, у штаммов микробов, выделенных из влагалища, в 3,6 раза чаще, чем у обусловивших дисбиоз кишечника, встречалась резистентность к левомицетину (р < 0,05).

Выявленный нами факт отличий в распространенности лекарственной устойчивости в популяциях бактерий, изолированных из различных органов и участков тела человека, имел принципиальное значение, так как являлся важным аргументом в пользу обоснования утверждения о том, что при решении проблемы эмпирической антимикробной химиотерапии следует учитывать локализацию инфекционного процесса в организме больного.

Сравнительный анализ распространенности резистентности к различным антимикробным препаратам в популяциях условно-патогенных бактерий, выделенных у больных, проживающих в г. Самара, показал, что по распространенности резистентности энтеробактерий к гентамицину и ципрофлоксацину г. Самара занимал промежуточное положение между г. Оренбург, где большинство выделенных штаммов были чувствительны к этим препаратам, и г. Москва и г.Санкт-Петербург, в которых отмечалась низкая чувствительность к антимикробным препаратам. Аналогичные данные получены в отношении S.aureus и коагулазонегативных стафилококков, что подтверждает сведения Л.С. Страчунского с соавт. (2003), В.В. Тец (2003), Ю.К. Янова (2003) о неравномерности частоты встречаемости устойчивости бактерий к антимикробным препаратам в различных географических регионах.

В дальнейшем нами была исследована распространенность множественной лекарственной устойчивости условно-патогенных бактерий, ассоциированных с различными видами патологии, сформировавшейся за пределами госпитальной среды (789 штаммов). Оказалось, что от 35 до 53 % штаммов золотистого стафилококка и факультативных энтеробактерий, выделенных из кишечника больных, обладали этим свойством. О тенденции к увеличению доли эшерихий, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, также указывали E.P. Hyle et al. (2005).

Особенностью акушерско-гинекологических заболеваний (вагинитов и бактериального вагиноза) явилось то, что от 62 до 76 % штаммов стафилококков, энтерококков, лактозонегативных эшерихий и коринебактерий, выделенных у 423 женщин, обладали множественной лекарственной устойчивостью. Кроме того, были выявлены панрезистентные штаммы условно-патогенных бактерий, утративших чувствительность одновременно к восьми группам исследованных антимикробных препаратов: фторхинолонам, аминогликозидам, левомицетину, цефалоспоринам, макролидам, тетрациклинам, нитрофуранам, аминопенициллинам. Их доля в общей структуре клинических изолятов, выделенных от больных амбулаторного профиля, составила от 3 до 12 %.

Существенно отличалась и распространенность множественной лекарственной устойчивости в популяциях золотистого стафилококка, выделенных из разных органов и участков тела больных: частота встречаемости данного признака была достоверно выше среди штаммов, колонизирующих микробиотопы влагалища и кишечника, в сравнении с микробами, выделенных из зева и бронхолегочной системы (р < 0,05). Клинические изоляты из области хирургического вмешательства занимали промежуточное положение. Доли полирезистентных штаммов, полностью утративших чувствительность к трем и более антимикробным препаратам разных химических классов из 7 исследованных, составили: для микроорганизмов, выделенных из влагалища - 59 %, кишечника - 47%, области хирургического вмешательства - 40 %, бронхолегочной системы - 27 %, небных миндалин - 22 %.

Нами установлена высокая частота встречаемости метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) среди амбулаторных акушерско-гинекологических больных и пациентов другого профиля, у которых инфекционная патология возникла до госпитализации. Доля таких клинических изолятов среди микроорганизмов, выделенных из влагалища, составила 16,2 %, кишечника - 15,8 %, бронхолегочной системы - 15,9 %, небных миндалин - 8,7 %, области хирургического вмешательства - 11,9 %. Это свидетельствовало о том, что MRSA вышли за пределы госпитальной среды (или сформировались вне ЛПУ) и распространяются среди «неорганизованного» населения.

Частота встречаемости множественной лекарственной устойчивости в популяциях эпидермального стафилококка, выделенных из разных органов и участков тела больных, до настоящего времени не была изучена. В связи с этим нами были проведены исследования чувствительности к антибактериальным препаратам у 789 штаммов. Было установлено, что доля полирезистентных штаммов, полностью утративших чувствительность к трем и более препаратам разных химических классов из 7 исследованных нами, составила для микробов, выделенных из влагалища, - 73 %, области хирургического вмешательства и небных миндалин - по 61 %. Это подтверждает приведенные выше данные о значимости S.epidermidis как этиологического фактора в развитии воспалительных процессов в различных органах и участках тела.

При анализе распространенности метициллинрезистентных штаммов эпидермального стафилококка (MRSE) было установлено, что среди клинических изолятов из влагалища их доля составила 16,4 %, из небных миндалин и области хирургического вмешательства - соответственно 52,8 % и 35,3 %.

Необходимо отметить, что нами впервые была выявлена циркуляция вне госпитальной среды панрезистентных MRSE, т.е. устойчивых ко всем семи испытанным антимикробным препаратам, о чем ранее сведения не были опубликованы. Доля таких штаммов в популяциях MRSE, выделенных из влагалища, составила 35,3 %, небных миндалин - 50,0 %, области хирургического вмешательства - 10,3 %. Установленная нами высокая частота встречаемости MRSA, MRSE и панрезистентных штаммов лактозонегативных эшерихий за пределами госпитальной среды свидетельствует о необходимости принятия неотложных мер по сдерживанию распространения лекарственной устойчивости среди условно-патогенных микроорганизмов.

Важное внимание придавалось нами изучению распространенности резистентности к антимикотикам в популяциях грибов рода Сandida, выделенных от больных амбулаторного профиля (423 чел.). Было установлено, что у выделенных штаммов грибов наиболее часто встречалась лекарственная устойчивость к современным противогрибковым препаратам, которые стали широко применяться в акушерско-гинекологической практике всего 5-7 лет назад: итраконазолу и флуконазолу. Если в отношении итраконазола доли устойчивых к этим препаратам Сandida albicans и других видов Сandida были близки (38 и 32 %), то у последних, как наиболее вирулентных, частота встречаемости резистентности к флуконазолу была достоверно выше в 2,2 раза (р < 0,05), что согласуется с данными литературы об устойчивости видов Сandida glabrata и Сandida krusei к этому антимикотику [Страчунский Л.С. и др., 2002; Moran J.P. et al., 1998]. Аналогичная картина наблюдалась при сравнительной оценке устойчивости грибов рода Сandida к клотримазолу. Следует отметить, что циркуляция полирезистентных штаммов грибов рода Candida, ассоциированных с кандидозным вульвовагинитом, не имеет такого широкого распространения: их доли среди Сandida albicans и других видов Сandida были равными и составили по 9 %.

Результаты наших исследований, указывающие на широкую распространенность устойчивости изучаемых грибов к итраконазолу и флуконазолу, согласуются со сведениями, опубликованными А.С. Анкирской с соавт. (2006), J.R. Wingard (1991), J.H. Rex et al. (1995), Д. Саттон с соавт. (2001). Однако, В.С. Митрофанова (2001), О.В. Грищенко с соавт. (2003), О.В.Тихонова, Н.В. Наймушина (2004) утверждают о невысокой ее распространенности. Эти данные можно объяснить реально существующими отличиями в распространенности лекарственной устойчивости микроорганизмов в различных географических регионах, на что указывали ранее Р.С. Козлов с соавт. (2006), H.S. Sader et al. (2005). Согласно K.V.I.Rolston (2005), все отличия в резистентности возбудителей заболеваний определяются местными особенностями эмпирической антимикробной химиотерапии.

При изучении чувствительности грибов рода Candida к противогрибковым препаратам нами получены данные о наличии «инокулят-зависимого» эффекта: зона подавления роста уменьшалась при увеличении величины инокулята. Частота его встречаемости в отношении разных химических классов антимикотиков варьировала, но была достаточно высокой (47 - 76 %), чтобы высказать предположение о возможной связи низкой эффективности терапии кандидозного вульвовагинита средними терапевтическими дозами препаратов у пациенток с высокой концентрацией возбудителя заболевания во влагалище.

Еще одним важным результатом проведенных исследований было выявление феномена неоднородности популяций грибов по чувствительности к противогрибковым препаратам (42 % у Сandida albicans и 53 % у других видов Сandida). Это дает некоторое объяснение описанному в литературе (правда, только в отношении бактерий) явлению несоответствия эффективности антимикробных препаратов in vitro и in vivo.

В последующем нами были вскрыты и количественно охарактеризованы эпидемиологические особенности циркуляции лекарственной устойчивости в популяциях наиболее актуальных условно-патогенных микроорганизмов к восьми группам антимикробных препаратов. Они состоят, во-первых, в высокой частоте встречаемости за пределами госпитальной среды полирезистентных штаммов бактерий, а также грибов рода Candida, утративших чувствительность к ряду современных антимикотиков; во-вторых, в существенных отличиях распространенности лекарственной устойчивости среди условно-патогенных микроорганизмов в г. Самара от других регионов России.

На основании вышеизложенного, нами предложена гипотетическая схема условий формирования и распространения полирезистентных микроорганизмов за пределами ЛПУ (рисунок 2). Она показывает, что полирезистентные штаммы условно-патогенных микроорганизмов могут оказаться вне госпитальной среды в результате двух причин: выноса микроорганизмов из ЛПУ с помощью медицинского персонала и реконвалесцентов или наличия условий для их формирования среди «неорганизованного» населения при дефектах оказания амбулаторно-поликлинической помощи больным с инфекционной патологией и массового распространения явления самолечения в России.

Рисунок 2 - Гипотетическая схема формирования и распространения полирезистентных штаммов микробов за пределами госпитальной среды

Для проверки этой гипотезы нами были исследованы причины широкого распространения полирезистентных штаммов бактерий вне госпитальной среды с помощью одного из методов эпидемиологического анализа - эпидемиологического наблюдения - аналитического исследования с использованием статистического приема измерения связи устойчивости микробов со структурой потребления лекарственных химиопрепаратов [В.Д. Беляковым и др. (1976, 1989, 2001), Б.Л. Черкасским (1990), Н.Н. Филатовым и др. (2001), С.Ф. Усиком и др. (2007)]. В качестве сопоставляемых параметров были выбраны распространенность резистентности в популяциях микроорганизмов и структура потребления антимикробных препаратов через различные источники их получения: аптечную сеть, ЛПУ, систему льготного обеспечения населения лекарствами.

В результате проведенного анализа была выявлена прямая сильная статистически достоверная корреляционная связь долей резистентных штаммов только со структурой продаж лекарств в аптеках (коэффициент корреляции от +0.71 до +0.84). Кроме того, именно на долю аптек приходилось 86 % потребляемых в г. Самара антимикробных препаратов. Эти данные свидетельствуют в пользу факта формирования полирезистентных штаммов условно-патогенных микроорганизмов за пределами госпитальной среды. Доля «выноса» госпитальных штаммов полирезистентных микробных из медицинских стационаров во внебольничную среду (к населению), по-видимому, незначительна.

Основываясь на данных проведенных исследований, нами предложен алгоритм составления схем эмпирической антимикробной химиотерапии в амбулаторных условиях для конкретного населенного пункта (рисунок 3). Он был реализован при обосновании перечня препаратов для адаптированных к условиям г. Самара схем эмпирической антимикробной химиотерапии заболеваний, вызываемых условно-патогенными бактериями. Анализ изменений резистентности штаммов микробов, выделенных у больных, к цефалоспоринам, аминогликозидам и фторхинолонам показал, что в прогнозируемом периоде (ближайшие 2 года) эти лекарственные препараты останутся еще достаточно эффективными.