Размещено на http://www.allbest.ru/

Матулевич Светлана Алексеевна

МАССОВЫЙ СКРИНИНГ НОВОРОЖДЕННЫХ НА НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ ОБМЕНА КАК ЧАСТЬ СИСТЕМЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ НАСЕЛЕНИЮ

03.00.15 - генетика

Автореферат

на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Медико-генетический научный центр РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Козлова Светлана Ивановна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович,

доктор медицинских наук, профессор Акуленко Лариса Вениаминовна,

доктор медицинских наук Демикова Наталья Сергеевна

Ведущая организация: ГУ НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН, г.Томск

Защита состоится «______»_______________ 2009 г. в _______часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01. при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения «Медико-генетический научный центр» РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук Р.А. Зинченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

новорожденный болезнь наследственный обследование

Актуальность исследования. Наследственные болезни обмена веществ (НБО) занимают заметное место в наследственной патологии человека, встречаются с разной частотой во всех популяциях. НБО, как правило, имеют тяжелые и во многих случаях фатальные проявления. Для ряда наследственных болезней обмена разработаны методы лечения, эффективные при их ранней диагностике.

Массовое обследование новорожденных (неонатальный скрининг) на НБО является основой профилактики наследственных болезней в популяциях, поскольку, позволяет выявлять заболевания на доклинической стадии, своевременно начинать лечение, формировать контингенты, требующие систематического медико-генетического консультирования, а также способствует обнаружению гетерозиготного носительства мутантного гена и проведению пренатальной диагностики.

История скрининга новорожденных в мире насчитывает несколько десятилетий. За это время накоплен достаточный опыт и сформулированы основные принципы скринирующих программ, касающиеся выбора нозологий для исследования, требований к лабораторной диагностике (методам тестирования, системе контроля качества и т.д.), соблюдению этических норм и т.д. Вместе с тем, следует подчеркнуть, что эти принципы по-разному реализуются в разных странах в зависимости от принятой системы организации медицинской помощи. Это требует разработки научных основ неонатального скрининга применительно к конкретным условиям с учетом основных принципов, принятых международным сообществом.

Программа неонатального скрининга обязательно включает в себя следующие этапы: 1) взятие биологического материала для исследования у всех новорожденных и доставка материала в диагностическую лабораторию; 2) лабораторная просеивающая диагностика; 3) уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами при просеивании; 4) лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения; 5) медико-генетическое консультирование семьи.

Программы массового обследования на наследственные болезни, поддающиеся профилактическому лечению, могут учреждаться только в рамках федерального или регионального здравоохранения. Они требуют организации специального звена в структуре здравоохранения и немалых экономических затрат, которые в общегосударственном масштабе компенсируются за счет уменьшения числа инвалидов с детства и снижения детской смертности. Многочисленные исследования, проведенные в разных странах (Долгов И.И. и соавт., 2002; Малиевский О.А. и соавт., 2006; Laberge J., 1983; Hannon H., Therrell B., 1991), показали, что по затратам на просеивающие программы и экономической эффективности от их применения (сохранение здоровья леченых индивидов) указанные программы дают государству 5-10-кратную экономическую выгоду.

Существуют трудности в оказании эффективной медико-генетической помощи населению в связи с тем, что в организации Скрининга остается много нерешенных вопросов как теоретического, так и прикладного характера. Прежде всего, недостаточно разработаны научные основы организации массового обследования новорожденных на НБО, принципы диспансерного наблюдения, вопросы преемственности в деятельности медико-генетических и других лечебно-профилактических учреждений. Требуют разрешения вопросы унификации обследования больных клиническими и лабораторными методами, создания региональных регистров НБО, организации лабораторий молекулярной диагностики, выявления факторов, влияющих на ложноположительные и ложноотрицательные результаты скрининга. Разработка подобных вопросов может стать основой для оптимизации подходов к осуществлению эффективной медико-генетической помощи населению.

Проблема ранней диагностики, превентивного лечения и профилактики галактоземии, адреногенитального синдрома и муковисцидоза, включенных в Программу скрининга только в 2006 году, в системе здравоохранения нашей страны осталась не до конца решенной, а популяционно-генетические аспекты данных заболеваний изучены лишь в отдельных регионах Российской Федерации, хотя разработка вопросов генетической эпидемиологии НБО принципиально важна как с практической, так и с теоретической точек зрения.

Цель исследования: разработка стратегических, организационных и методических принципов массового обследования новорожденных на наследственные болезни обмена, позволяющих осуществлять эффективную помощь населению (на примере крупного многонационального региона России - Краснодарского края).

Задачи исследования:

1. Разработать мероприятия и регламентирующую документацию для организации и проведения неонатального скрининга на НБО. Оценить вклад деятельности региональных органов здравоохранения в организацию скрининга на НБО.

2. Оценить результаты неонатального скрининга на ФКУ и врожденный гипотиреоз за 1987-2007гг.

3. Разработать мероприятия и оценить их эффективность по внедрению Программы неонатального скрининга на муковисцидоз, галактоземию, адреногенитальный синдром, выполняемой в рамках национального проекта «Здоровье».

4. Определить частоту муковисцидоза, галактоземии, АГС среди новорожденных Краснодарского края по данным неонатального скрининга.

5. Провести ДНК-диагностику и верифицировать генные мутации у больных фенилкетонурией и муковисцидозом, выявленных при проведении массового обследования новорожденных.

6. Разработать и оценить эффективность внедрения компьютерной программы для поддержки неонатального скрининга на НБО.

7. Создать краевой регистр наследственных болезней обмена.

Новизна результатов исследования

Впервые в Краснодарском крае на большой выборке (около 1 млн. новорожденных) определены частоты фенилкетонурии и врожденного гипотиреоза. Определены территориальная неравномерность гетерозиготного носительства и разнообразие мутаций в гене фенилаланингидроксилазы (ФАГ).

Впервые проведен сравнительный анализ клинической и биохимической диагностики врожденного гипотиреоза до и после внедрения неонатального скрининга, показавший, что лишь массовый биохимический скрининг позволяет поставить диагноз в первые дни жизни новорожденных. Установлена корреляция частоты врожденного гипотиреоза с уровнем неонатального ТТГ.

По данным неонатального скрининга определены ориентировочные частоты муковисцидоза, галактоземии и адреногенитального синдрома. Впервые в рамках неонатального скрининга проведено молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CFTR с использованием наборов «CF-9» и «CF-5», разработанных в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН. Выявлено 4 мутации из 14 изучаемых. Определена информативность молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза по изученному спектру мутаций и частота мажорной мутации delF508.

Впервые установлено влияние на повышение уровня ИРТ в крови новорожденных четырех факторов: анемии беременных, желтухи и гипоксии новорожденных, инфузионной терапии.

Разработан программный комплекс «Неоскрин», состоящий из двух отдельных программ. Программа «Регистрация новорожденных в родильном доме» предназначена для ввода информации о родившихся, передачи данных о них в МГК на электронном носителе, формирования территориального регистра новорожденных, ежедневной оценки качества проведения скрининга, формирования отчетов. Программа «Скрининг новорожденных», установленная в МГК, позволяет объединить и проанализировать всю информацию о новорожденных, поступающую из территорий края, откорректировать пороговые уровни исследуемых метаболитов для обследуемой популяции.

Создан краевой регистр наследственных заболеваний обмена веществ, позволяющий прогнозировать динамику генетического груза в популяции и разрабатывать необходимые медико-социальные мероприятия.

Практическая значимость

Впервые проведен анализ мероприятий по организации неонатального скрининга на НБО в крупном регионе России (Краснодарском крае). Показана эффективность функционирования лаборатории массового скрининга новорожденных в структуре медико-генетической консультации.

Доказана эффективность внедрения в практику здравоохранения компьютерных технологий, позволяющих ускорить и сделать более объективным процесс организации неонатального скрининга.

Разработан и внедрен программный комплекс «Неоскрин», позволяющий консолидировать данные, получаемые из регионов в единую систему данных лаборатории неонатального скрининга МГК, автоматизировать действия по заполнению и обновлению содержимого разделов программы; создать краевой и региональные регистры новорожденных, добиться 100% регистрации родившихся детей; оптимизировать работу лаборатории неонатального скрининга; использовать электронную почту для оперативной связи с ЛПУ края; получать достоверные статистические и отчетные данные о функционировании скрининга. Впервые программа по регистрации новорожденных была интегрирована во все родильные дома края. Принцип программного комплекса «Неоскрин», основанный на взаимодействии ЛПУ и лаборатории, осуществляющей неонатальный скрининг в крупном регионе страны, может быть использован для создания единой системы организации неонатального скрининга в федеральном округе, возможно и на уровне всей страны.

Создание краевого регистра наследственных заболеваний обмена веществ позволит определить объем медицинской помощи, формировать поток семей для медико-генетического консультирования и разрабатывать необходимые медико-социальные мероприятия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлены общие организационные закономерности, позволившие добиться стабильно высокого процента обследования новорожденных и благодаря раннему, своевременному началу лечения предотвратить или значительно снизить клинические проявления диагностируемых наследственных болезней обмена.

2. Успешная организация неонатального скрининга возможна только при соблюдении принципа централизации и единого алгоритма скрининга на всей территории страны, систематическом анализе качества проведения скрининга, директивной поддержке субъекта Российской Федерации.

3. Установлены частоты фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, муковисцидоза, адреногенитального синдрома и галактоземии среди новорожденных в Краснодарском крае.

4. Определена территориальная неравномерность гетерозиготного носительства мутаций гена ФАГ в популяции Краснодарского края.

5. Разработан компьютеризированный программный комплекс, предусматривающий решение задач накопления персонифицированных данных о каждом новорожденном, что позволяет осуществлять высокоэффективный контроль за качеством проведения Скрининга и проводить статистический анализ полученной информации.

6. Создан алгоритм неонатального скрининга на НБО на территории Краснодарского края.

7. Создание регионального регистра наследственных болезней обмена позволяет решать задачи сбора эпидемиологической информации о нозологической структуре болезней, генетического мониторирования населения, диспансеризации семей с наследственной патологией, прогнозирования и профилактики наследственной патологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Республиканском совещании «Принципы организации и методические основы профилактики инвалидизирующих наследственных болезней» (Москва, 1996), Региональной научно-практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003), Всероссийской научной конференции «Медико-генетическая оценка пищевых продуктов» (Москва, 2003), Региональной научно-практической конференции Южного федерального округа «Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты» (Ростов н/Д, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Скрининг врожденного гипотиреоза в РФ. Опыт, проблемы, пути оптимизации» (Москва, 2005), V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005), VIII научно-практической конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2008), Региональном интерактивном семинаре по избранным вопросам тиреоидологии (Сочи, 2008), VI региональной научно-практической конференции Южного федерального округа «Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты. Генетический скрининг» (Сочи, 2008), заседании межведомственной рабочей группы Совета при президенте Российской федерации по реализации приоритетных национальных проектов и демографической политике (Москва, 2008), научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики, наблюдения и нутритивной поддержки больных с врожденными метаболическими заболеваниями» (Римини, Италия, 2008), SSIEM ANNUAL SYMPOSIUM (Лиссабон, Португалия, 2008), на краевых научно-практических конференциях акушеров-гинекологов и педиатров (Краснодар, 2001-2008).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ГУ МГНЦ РАМН 3 декабря 2008 года.

Внедрение в практику здравоохранения

Материалы диссертации внедрены в работу Кубанской межрегиональной медико-генетической консультации, Адыгейского республиканского клинического перинатального центра, родовспомогательных и детских лечебных учреждений при проведении неонатального скрининга на наследственные болезни обмена, а также включены в учебный процесс Кубанского государственного медицинского университета при обучении студентов и слушателей факультетов последипломной подготовки по специальностям: педиатрия, неонатология, гастроэнтерология, эндокринология, неврология, генетика.

Результаты проведенных исследований легли в основу 7 приказов департамента здравоохранения Краснодарского края, направленных на оптимизацию неонатального скрининга. Проведены семинарские занятия и научно-практические конференции с врачами лечебно-профилактических учреждений края, выпущено 5 методических рекомендаций для врачей.

В КММГК и во всех родовспомогательных учреждениях Краснодарского края и Республики Адыгея внедрен разработанный алгоритм неонатального скрининга на НБО с использованием программного комплекса «Неоскрин».

Личное участие диссертанта. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 42 научные работы, из них 13 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, издано 5 методических рекомендации для врачей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 217 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследова-ния, заключения, выводов, библиографии (104 источников на русском и 137 на иностранном языках) и приложений. Работа содержит 30 рисунков и 28 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели было проведено многоплановое комплексное исследование, в котором были использованы клинические, биохимические, молекулярно-генетические, генеалогические, психологические, статистические методы.

Нами обобщенны данные о группах пациентов, которые послужили информационной базой исследования:

· 1061108 новорожденных, родившихся с 1.01.1987г. по 31.12.2007г., обследованных на ФКУ;

· 680786 новорожденных, родившихся с 1.01.1994г. по 31.12.2007г., обследованных на ВГ;

· 114253 новорожденных, родившихся с 1.07.2006г. по 30.06.2008г., обследованных на МВ, АГС;

· 116041 новорожденных, родившихся с 01.10.2006г. по 30.09.2008г., обследованных на галактоземию;

· выявленные при неонатальном скрининге дети с наследственными болезнями обмена (ФКУ -165, ВГ - 111, МВ -10, АГС-15, галактоземия -6);

· 20000 новорожденных, родившихся с 1.03.08 по 31.05.08, у которых при скрининге на НБО отмечались нормальные значения ФА, ТТГ, 17-ОНР, ИРТ и галактозы, послужили группой контроля. Сведения о новорожденных получены из программного комплекса «Неоскрин».

Программа неонатального скрининга обязательно включает в себя следующие этапы: 1) взятие биологического материала для исследования у всех новорожденных и доставка материала в диагностическую лабораторию; 2) лабораторная просеивающая диагностика; 3) уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами при просеивании; 4) лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения; 5) медико-генетическое консультирование семьи.

Материалом для исследования служила капиллярная кровь, взятая в родильном доме из пальца или пятки новорожденного на 4-5-й день жизни на бланки фильтровальной бумаги марки Schleicher & Schuell 2992. Высушенные образцы крови отсылались в лабораторию КММГК письмом или передавались с нарочным. Определение метаболитов проводилось в качественно взятых образцах крови. При повышенном уровне исследуемых метаболитов проводилось повторное исследование в дублях в образцах крови поступивших тест-бланков. Если среднее число 3-х результатов было выше порогового уровня, проводился забор крови для повторного исследования (ретест). При положительном ретесте дети срочно вызывались в МГК для проведения подтверждающей диагностики. Накопление и обработка данных проводилась с использованием разработанной в КММГК компьютерной программы «Скрининг новорожденных».

С целью диагностики фенилкетонурии определяли уровень фенилаланина (ФА). До 1992г. использовался полуколичественный микробиологический тест Гатри, с 1992г. - количественный флюориметрический метод. Пороговым значением считали уровень ФА более 2,0мг/дл. Если при проведении подтверждающей диагностики уровень ФА определялся более 7,9мг/дл, диагностировалась Фенилкетонурия и назначалась терапия. При ФА от 2,1 до 7,9мг/дл ставился диагноз «Доброкачественная гиперфенилаланинемия».

С целью диагностики врожденного гипотиреоза определяли уровень тиреотропного гормона (ТТГ) методом иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. Пороговым значением для выявления ВГ считали уровень ТТГ?20 мЕ/л у новорожденных 4-5 дней жизни, ТТГ?5 мЕ/л у новорожденных 7-14 дней жизни. Подтверждающая диагностика проводилась методом иммунофлюоресцентного анализа в сыворотке крови путем определения ТТГ, свободного тироксина (св.Т4).

С целью диагностики муковисцидоза определяли уровень иммунореактивного трипсина (ИРТ) иммунофлюоресцентным методом. При положительном результате скрининга (ИРТ >70 нг/мл) проводили повторное определение ИРТ в образцах крови, собранных на 21-28-й день жизни. При повторно высоком уровне ИРТ (>40 нг/мл) проводили потовую пробу с помощью системы для электрофореза и сбора пота Macroduct корпорации “Vescor”. Измерялась “эквивалентная” концентрация хлорида натрия в потовой жидкости. За норму принимались результаты 0-60 ммоль/л, показатели 60-80 ммоль/л расценивались как пограничные, 80 ммоль/л и выше считались позитивными для муковисцидоза. При пограничном и позитивном результате потовой пробы проводили ДНК-диагностику.

С целью диагностики адреногенитального синдрома определяли уровень 17б-оксигидропрогестерона (17-ОНР) методом твердофазного иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. За пороговый уровень у доношенных новорожденных (срок гестации больше 36 недель, вес больше 2,5кг) принимали значения 17-ОНР 30,0 nmol/l, у недоношенных при сроке гестации 33-36 недель (вес меньше 2,5кг) - 60,0 nmol/l, при сроке гестации 23-32 недели - 100,0 nmol/l.

Подтверждающая диагностика проводилась путем ультразвукового исследования надпочечников и определения в крови уровня электролитов (калий, натрий), кортизола, 17-ОНР.

С целью диагностики галактоземии определяли уровень общей галактозы (Гал) (галактоза + галактоза-1-фосфаты) флюоресцентным методом. Пороговым значением для выявления галактоземии считали уровень Гал >7,1 мг/дл.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах, с последующей амплификацией, анализом расщепления фрагментов ДНК ферментами рестрикции, детекцией на электрофорезе фрагментов ДНК в полиакриламидных гелях.

Для определения мутаций использовали наборы, разработанные в ГУ МГНЦ РАМН:

«PCU-8» - для определения 8 частых мутаций в гене ФАГ (I65T, IVS10nt546, IVS12nt1, R261Q, R252W, R408W, R158Q, P281L);

«CF-9» и «CF-5» - для диагностики 9 и 5 мутаций соответственно в гене CFTR (del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X; W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbc->T).

Полученные результаты документировали с помощью программного обеспечения «Gel Imager» (Россия).

Генетико-эпидемиологические исследования проводились с использованием данных неонатального скрининга за период 1987-2007 гг. В ходе работы созданы компьютерные базы данных семей: с ФКУ (230 случаев ФКУ из 205 семей), с ВГ (170 случаев ВГ из 168 семей), с АГС (15 семей), МВ (10 семей), ГАЛ (6 семей). Полученные данные сравнивали с официальными демографическими данными по Краснодарскому краю (Основные итоги Всероссийской переписи населения 2002г. по Краснодарскому краю, 2003г.).

Были проанализированы амбулаторные медико-генетические карты, разработанные нами анкеты на семьи с больными НБО.

Частоту гетерозиготных носителей фенилкетонурии в популяции рассчитывали на основании закона Харди-Вайнберга по формуле:

p²+2pq+q²=1,

где q - частота нормального гена,

p - частота мутантного аллеля.

Изучение интеллектуального уровня детей с ФКУ дошкольного возраста проводилось рисуночным тестом Гудиноф-Харриса, школьного возраста - с помощью компьютерной программы “Тест”, которая является адаптированным вариантом теста Д.Векслера. Определяли коэффициент интеллекта ОИП (общий интеллектуальный потенциал). За минимальное значение нормы принимали коэффициент ОИП =70. При подозрении на снижение интеллекта (ОИП=70 и ниже) ребенок консультировался детским психиатром.

Для диагностики психического развития детей с ФКУ применялись методы наблюдения и стандартные патопсихологические методики, адаптированные для каждого возрастного интервала.

Для оценки физического развития детей определяли массо-ростовой индекс (МРИ) по формуле:

МРИ =	М х 100 P

где М - отношение фактической массы тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста,

P - отношение фактической длины тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста.

За норму принимали МРИ от 90 до 99. При МРИ=89 и ниже диагностировали дефицит массы тела, при МРИ=100 и более - избыточную массу тела.

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990; Кайданов Л.З., 1996) с определением критерия Стьюдента, средней арифметической (М), стандартной ошибки (m) и показателя достоверности различий (р).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Организация неонатального скрининга на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае

Началом неонатального скрининга на НБО принято считать 1962г., когда в штате Массачусетс США было организовано тестирование новорожденных на фенилкетонурию. Скрининг широко распространился в мире. В рамках многих программ было начато тестирование и на другие наследственные дефекты. В настоящее время программы неонатального скрининга охватывают от 8 до 50 наследственных нарушений обмена.

В России массовое обследование новорожденных на ФКУ начало проводиться с 1985г., на врожденный гипотиреоз с 1993г. С 2006г. внедрен скрининг на муковисцидоз, адреногенитальный синдром и галактоземию.

В Краснодарском крае массовое обследование новорожденных на НБО (ФКУ) проводится с 1987г. С 1994г. новорожденные обследовались на два заболевания (ФКУ, врожденный гипотиреоз), с 2006г. - на 5 (ФКУ, ВГ, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, галактоземию). Уровень охвата скринингом новорожденных края с 1997г. стабильно превышает 99,0% (таблица 1).

Таблица 1 Результаты скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае за период с 1987-2007гг.
Наследственное заболевание обмена веществ	Обследовано новорожден-ных	Выявлено больных	Частота заболевания в КК	Частота заболевания в РФ (Новиков П.В., 2008)
фенилкетонурия	1 061 108 (92,4%)	111	1 : 8 376	1 : 7 697
врожденный гипотиреоз	680 786 (97,0%)	161	1 : 4 228	1 : 4 132
муковисцидоз	114 253 (99,7%)	10	1 : 11 425	1 : 11 585
адреногенитальный синдром	114 253 (99,7%)	15	1 : 7 617	1 : 8 662
галактоземия	116 041 (99,2%)	6	1 : 19 340	1 : 32 692

В организации неонатального скрининга в крае можно выделить несколько основных этапов, связанных с развитием медико-генетической службы:

1980 г.	Проведение селективного скрининга на фенилкетонурию среди контингентов повышенного риска с момента организации медико-генетической службы на Кубани.
1983 г.	Организация пилотного скрининга новорожденных на ФКУ в шести административных территориях края.
1987 г.	Организация неонатального скрининга на ФКУ на всей территории края.
1994 г.	Внедрение неонатального скрининга на врожденный гипотиреоз на базе существовавшего скрининга на ФКУ.
1997 г.	Разработка и внедрение компьютерной программы «Неонатальный скрининг».
2003 г.	Внедрение молекулярно-генетических методов диагностики фенилкетонурии.
2006 г.	Организация скрининга новорожденных на муковисцидоз, адреногенитальный синдром, галактоземию. Внедрение молекулярно-генетических методов диагностики муковисцидоза. Разработка и внедрение программного комплекса «Неоскрин».

По мере развития медико-генетической службы, внедрения новых технологий, более точных методов диагностики и лечения наследственной патологии, совершенствовались организация и алгоритмы проведения скрининга.

Расширение программы скрининга до пяти наследственных болезней обмена, необходимость диагностики адреногенитального синдрома и галактоземии до 10-12-го дней жизни детей обусловили разработку нового алгоритма (рис.1), в результате перехода на который мы добились стабильного забора крови на тест-бланки во всех родильных домах на 4-й день жизни, поступления бланков с кровью в МГК в среднем на 7-й день жизни, сообщения результатов первичного обследования новорожденных в ЛПУ края по электронной почте в среднем на 9-й день жизни.

Рис.1. Алгоритм проведения неонатального скрининга на наследственные болезни обмена

В течение работы было показано, что эффективное выполнение задач Программы массовой диагностики наследственных болезней среди новорожденных возможно только при соблюдении принципа централизации - объединения усилий в одном центре, оснащенном современным оборудованием и подготовленными кадрами. При этом на центр возлагается организационно-методическое руководство, обучение лиц и координация работы учреждений, принимающих участие в скрининге. Кроме того, задачей центра является разработка единого алгоритма скрининга и определение уровней пороговых концентраций определяемых метаболитов для обследуемой популяции. Постоянный анализ качества проведения скрининга, доведение его результатов до исполнителей, наличие тесной связи с руководителями ЛПУ позволяет оперативно контролировать процесс обследования новорожденных и принимать эффективные управленческие меры по его улучшению.

В результате анализа эффективности проводимой работы показано, что процесс организации скрининга невозможен без директивной поддержки региональных органов здравоохранения и без контроля качества проведения обследования новорожденных. За период 1983-2007гг. краевым департаментом здравоохранения издано 7 приказов по организации и совершенствованию неонатального скрининга на Кубани, в основу которых положены результаты данного исследования.

Важную роль в неонатальном скрининге играет минимизация ложноположительных и ложноотрицательных результатов путем контроля качества работы лабораторий массового скрининга. В КММГК внутренний контроль качества осуществляется в соответствии с отраслевым стандартом 91500.13.0001-2003, утвержденным приказом №220 МЗ РФ от 26.05.2003г. «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов». Внешний контроль качества осуществляется нашей лабораторией с 1997г. путем участия в международном контроле качества лабораторных исследований на НБО - Performance Evaluation and Quality Control, проводимом Center for Disease Control and Prevention (г.Атланта, США).

Организация и результаты неонатального скрининга на фенилкетонурию

Фенилкетонурия (ФКУ) - группа аутосомно-рецессивных заболеваний, характеризующихся нарушением обмена незаменимой аминокислоты фенилаланин, поступающей в организм человека с белковой пищей. Развернутая клиническая картина заболевания включает умственную отсталость, нарушение поведения, дефект пигментации, судорожный синдром и дерматиты. Частота заболевания значительно варьирует в зависимости от популяции: от 1:4370 в Турции (Ozalp Y. et al., 1986), до 1:80500 в Японии (Shigematsu Y.et al., 2002).

За период 1.01.87-31.12.07гг. в Краснодарском крае нами обследовано 1 061 108 новорожденных. Охват ретестом детей с первичной гиперфенилаланинемией составил 95%. Выявлено 111 больных ФКУ и 80 детей с доброкачественной гиперфенилаланинемией.

Частота заболевания флюктуировала по годам от 1:15148 в 2000 г. до 1:3888 в 1999г. Частота ФКУ по данным последних 16 лет (1992-2007гг.), когда скринингом было охвачено более 98% новорожденных, составляет 1:8376, что сопоставимо с частотой ФКУ в смешанной популяции Российской Федерации (1:7697) .

Были выявлены значительные по абсолютной величине, но недостоверные колебания частоты ФКУ (от 1:2399 в Тбилисском районе до 1:16834 в Темрюкском районе) и гетерозиготного носительства мутантных генов (4,1% и 1,5% соответственно) по отдельным территориям, что можно связать с низкими частотами заболевания и малым количеством обследованных. С целью получения более достоверных результатов административные территории края были объединены в несколько крупных регионов по территориально-историческому принципу.

Присоединение Прикубанья к России произошло в 1791г. после победы России в очередной русско-турецкой войне. Планомерное и целенаправленное освоение присоединенных территорий восточнославянским населением началось в 1792г. с переселения на северную (Северный регион) и западную (Приазовский регион) части правобережной Кубани Черноморского казачьего войска, до этого жившего между Бугом и Днестром. Почти одновременно с Черноморией стала заселяться и восточная часть (Восточный регион) правобережья Кубани, так называемая Старая линия. В отличие от украиноязычных черноморцев, линейные казаки в основном были русскоязычными (Трехбратов Б.А., 2000).

До начала 60-х годов XIX века постоянная оседлость невойскового населения на территории Черноморского казачьего войска запрещалась. Территория Кубани заселялась почти исключительно путем военно-казачьей колонизации.

После окончания Кавказской войны (1864г.) к России присоединилась территория левобережной Кубани. Причерноморье (Причерноморский регион) заселялось переселенцами с Северного Кавказа (грузинами, абхазцами, лезгинами, черкесами и другими) и христианами (греками и армянами) из Османской империи (Виноградов В.Б., 1994).

На южных территориях Кубанской области (Южный регион) стали селиться отставные солдаты войск Кавказской армии и крестьяне из Воронежской, Курской, Орловской, Полтавской, Харьковской и других губерний Российской империи (Трехбратов Б.А., 1997).

Популяция центрального региона края формировалась за счет всех перечисленных иммиграционных потоков.

Таким образом, в пределах края были выделены 6 регионов: Восточный, Приазовский, Причерноморский, Северный, Центральный и Южный.

Нами определены частоты ФКУ среди новорожденных и гетерозиготного носительства мутантного гена для каждого региона (таблица 2). Судя по частоте гетерозигот, все 6 регионов статистически достоверно различаются. Наибольшая частота гетерозигот по гену ФКУ отмечается в Северном регионе (2,7%), наименьшая - в Южном (1,8%).

Таблица 2 Частота гетерозиготного носительства гена фенилкетонурии в различных регионах Краснодарского края по данным неонатального скрининга 1992-2007 гг.
Регион	Обследовано новорожденных	Выявлено больных	Частота ФКУ	Частота гетерозиготных носителей (%)	Ранговый тест на достоверность различия частот
Северный	68 022	12	1:5 669	2,7	*
Приазовский	65 574	10	1:6 557	2,5	*
Восточный	166 702	24	1:6 946	2,4	*
Центральный	246 697	26	1:9 488	2,1	*
Причерноморский	153 297	15	1:10 220	2,0	*
Южный	95 418	8	1:11 927	1,8	*
Всего	795 710	95	1:8376	2,2

Примечание: Расположение * на разных вертикалях рангового теста указывает на достоверность различий. Значение t-критерия при сравнении частот гетерозигот по ФКУ в соседних в ранжированном ряду регионах варьировали в пределах 2,2 - 22,9, неизменно превышая t₀₅=1,96.

Нами проведено молекулярно-генетическое обследование 105 больных фенилкетонурией на восемь наиболее частых мутаций гена ФАГ: R408W, IVS12nt1, R261Q, R252W, R158Q, P281L, I65T, IVS10nt546.

Мажорная мутация R408W была идентифицирована в 51,9%. Второй по частоте встречаемости в исследуемой выборке (3,8%) была мутация R158Q. Частота мутации P281L составила 3,3%. Мутация IVS12nt1 выявлена в 2,4% случаев. Мутации R252W и R261Q выявлены с частотой 1,9% и 1,4% от всех ФКУ-аллелей. Частота мутации IVS10nt546 составила 1,0%. Не было выявлено ни одной хромосомы с мутацией 165Т.

Выявленная территориальная неравномерность носительства мутантных генов послужила поводом для анализа распределения мутаций гена ФАГ по регионам края (таблица 3).

Таблица 3 Распределение мутаций R408W, R158Q, IVS10nt546, IVS12nt1, P281L, R261Q, R252W, 165Т по регионам Краснодарского края
Регион	Количество больных	Количество хромосом	Мутация, %
			R408W	R158Q	P281L	IVS12nt1	R252W	R261Q	IVS10nt 546	Информативных хромосом
I	13	26	76,9	3,8	7,7	-	-	-	-	88,5
II	22	44	45,4	2,3	11,4	4,5	4,5	-	-	68,2
III	25	50	52,0	8,0	-	2,0	-	2,0	-	64,0
IV	18	36	52,8	2,8	-	2,8	-	2,8	-	61,1
V	13	26	42,3	-	-	3,8	7,7	-	3,8	57,7
VI	14	28	46,4	3,6	-	-	-	3,6	3,6	57,1
Всего	105	210	51,9	3,8	3,3	2,4	1,9	1,4	1,0	65,7

Примечание: регионы края I - Приазовский, II - Восточный, III - Центральный, IV - Северный, V - Южный, VI - Причерноморский.

Наиболее информативным оказался Приазовский регион, в котором идентифицировано 88,5% мутаций, наименее информативный - Причерноморский (идентифицировано 57,1%).

Отмечается предрасположенность к накоплению мутации R408W в Приазовском регионе (76,9%). Высокая частота ФКУ в этом регионе (1:6557), принадлежность большинства выявленных семей к славянской этнической группе (русские, украинцы), составляющей основную часть первых переселенцев, позволяет предположить, что носители мутаций гена ФКУ оказались среди ранних эмигрантов.

Продолжая дальнейшее исследование, нами проведен анализ распространенности исследуемых мутаций в семьях различных национальностей (таблица 4).

Таблица 4

Распределение мутаций гена фенилаланингидроксилазы в Краснодарском крае в зависимости от национальности и типа брака

Мутация	Национальность супругов	Межнациональные браки
	русские	армяне	турки
R408W	61,5%	-	-	38,9%
IVS12nt1	1,8%	10,5%	-	-
R261Q	0,6%	-	-	11,1%
R252W	0,6%	-	50,0%	16,7%
R158Q	3,6%	5,3%	-	5,6%
P281L	1,8%	21,0%	-	-
IVS10nt 546	-	10,5%	-	-
Неизвестная	30,1%	52,7%	50,0%	27,7%
Количество хромосом	169	19	4	18

Как показало наше исследование, в русской популяции мажорной является мутация R408W, встречающаяся с частотой 61,5%. Вторая по частоте мутация - R158Q (3,6%). Мутация IVS10nt546 в русских семьях не выявлена.

В армянских семьях мажорной оказалась мутация P281L (21,0%), в 10,5% случаев выявлены мутации IVS10nt546 и IVS12nt1.

В межнациональных семьях наиболее часто встречалась мутация R408W (38,9%), носителями которой во всех случаях являлись русские родители.

Таким образом, полученные результаты указывают на существенную молекулярную гетерогенность фенилкетонурии в Краснодарском крае. Идентифицировано 7 мутаций гена ФАГ, что позволило определить молекулярный дефект в 65,7% мутантных хромосом в общей выборке и 69,9% среди русского населения.

Эффективность лечения больных фенилкетонурией

С целью оценки эффективности неонатального скрининга на фенилкетонурию нами проведено исследование уровня интеллектуального развития у 57 больных детей в возрасте от 3 до 15 лет в зависимости от сроков начала лечения.

Нормальный уровень интеллектуального развития определен у 91,3% детей, получавших лечение с первых двух месяцев жизни (средний ОИП=87) и только у 63,7% детей, диетотерапия которым стала проводиться с 2 до 5 месяцев жизни (средний ОИП=78). У 8 детей диагностирована умственная отсталость: у 5 легкой степени (средний ОИП=61), у 3 - умеренная (средний ОИП=43).

Таким образом, раннее выявление больных фенилкетонурией при массовом обследовании новорожденных позволило сохранить нормальный интеллект у 86% и предотвратить развитие тяжелых форм умственной отсталости у 14% детей.

Проведено психологическое обследование 49 детей с ФКУ в возрасте от 2 до 15 лет (15 дошкольного возраста, 34 школьного), получавших лечение с раннего возраста. У 46,7% детей дошкольного возраста (2-6 лет) был определен высокий уровень тревожности, у 33,3% - гиперактивность и недостаточная концентрация внимания, у 13% - высокий уровень агрессивности. Были выявлены нарушения в развитии речи: у 26,7% испытуемых словарный состав снижен, у 20% активная речь не сформирована вообще. В 53,3% случаев выявлены отклонения концентрации внимания. У 20% детей определена моторная недостаточность.

Результаты обследования детей школьного возраста (7-15 лет) показали, что 61,8% имели высокий уровень тревожности, 17,6% страдали от гипердинамического синдрома, у 11,8% определен высокий уровень агрессивности. У каждого второго ребенка (17 детей) определена эмоциональная неустойчивость. Исследование психических процессов детей показало, что довольно часто наблюдаются отклонения в формировании психических функций: снижение уровня произвольного внимания - 26,5%, неустойчивость внимания - 26,5%, низкий уровень продуктивности процесса запоминания - 26,5%, нарушение динамичности процесса запоминания - 35,3%, нарушения операциональной стороны мышления - 29,4%. При исследовании интеллекта у большинства детей (47,2%) был определен средний уровень (3 степень) интеллектуального развития. Интеллект ниже среднего (4 степень) отмечался в 20,6% случаев, выше среднего (2 степень) - в 32,3%. Крайних результатов (1 и 5 степени интеллектуального развития) не выявлено.

Таким образом, несмотря на раннее начало лечения и нормальный уровень интеллектуального развития у 96% детей с фенилкетонурией определены различные отклонения в эмоциональной сфере, мешающие их полноценной социальной адаптации: снижение познавательных способностей 62%, высокий уровень тревожности 55%, эмоциональная неустойчивость 49%, гиперактивность 19%, агрессивность 17%. Наиболее частым сочетанием отклонений у детей с фенилкетонурией являются: низкий уровень концентрации внимания и гиперактивность - 33,3%, высокий уровень тревожности и нарушения динамичности процесса запоминания - 20,5%.

Организация и результаты неонатального скрининга на врожденный гипотиреоз

Врожденный гипотиреоз (ВГ) - заболевание щитовидной железы, при котором наблюдается снижение ее функции, вплоть до полного выпадения, что приводит в эмбриональном и постэмбриональном периодах онтогенеза к задержке развития и дифференцировки всех органов и систем человека, в первую очередь, центральной нервной системы. Частота ВГ среди новорожденных значительно варьирует в зависимости от популяции: от 1:1650 в Ливане до 1:4000 в Японии.

Массовое обследование новорожденных на ВГ в Краснодарском крае проводится с 1994г. на базе существовавшего скрининга на ФКУ. Обследовано 680 786 новорожденных, у 161 диагностирован врожденный гипотиреоз. Частота ВГ в крае составила 1:4228, что практически не отличается от среднероссийской частоты (1:4132) .

Установлена корреляция частоты ВГ с уровнем неонатального ТТГ (таблица 5). При повышении уровня ТТГ не более 50 мкМЕ/мл ВГ выявлен в 0,8% случаев, при ТТГ 50-100 мкМЕ/мл - в 15,5%, при ТТГ выше 100 мкМЕ/мл - в 77,5%.

Таблица 5 Выявляемость врожденного гипотиреоза в зависимости от уровня первичной гипертиротропинемии
Показатели	Уровень ТТГ (мкМЕ/мл)	Всего
	до 50	50-100	выше 100
Количество детей с первичной гипертиротропинемией	6409 (94,2%)	274 (4,0%)	122 (1,8%)	6805 (100%)
Охват ретестом	4598 (71,7%)	233 (85,0%)	111 (91,0%)	4944 (72,7%)
Выявлено детей с врожденным гипотиреозом	39 (0,8%)	36 (15,5%)	86 (77,5%)	161 (3,3%)

Создание краевого регистра больных врожденным гипотиреозом, наличие высокочувствительных методов биохимической диагностики заболевания и максимальный уровень обследования новорожденных при проведении скрининга (более 98%) позволили провести объективную оценку частоты заболевания в обследованной популяции. Частота ВГ до внедрения скрининга (1987-1993гг.) колебалась от 1:19064 в 1988г. до 1:7126 в 1989г., в среднем составляя 1:9958 новорожденных. В период неонатального скрининга (1994-2007гг.) частота ВГ составила 1:4228 новорожденных, при этом уровень частотного распределения врожденного гипотиреоза имел не столь резкие колебания по сравнению с доскрининговым периодом: от 1: 6208 в 1995г. до 1: 3295 в 1999г.

С целью оценки эффективности скрининга нами проанализированы сроки постановки диагноза и начала лечения у больных ВГ, выявленных до внедрения скрининга и в период его реализации (таблица 6).

Таблица 6 Средний возраст начала лечения больных врожденным гипотиреозом до скрининга и в период проведения скрининга
Период наблюдения	До скрининга (1987-1993гг.)	Скрининг на ВГ (1994-2007гг.)
Возраст начала лечения (дни жизни)	Количество больных
	n = 66	n = 161
	абс.	%	абс.	%
7 - 14	2	3,0	5	3,1
15 - 30	1	1,5	45	28,0
31 - 60	2	3,0	72	44,7
61 - 90	5	7,6	18	11,2
91 -120	7	10,6	5	3,1
121 - 150	7	10,6	7	4,3
151 - 180	2	3,0	1	0,6
181 - 360	13	19,7	5	3,1
больше 360	27	40,9	3	1,9

До внедрения скрининга 60,6% детей с ВГ выявлялись и начинали лечиться после 6 месяцев жизни, лишь 7,5% больных начинали лечение в первые 2 месяца жизни. В период проведения скрининга в первые 2 месяца жизни лечение начато у 75,8% детей.

С целью определения роли скрининга в ранней диагностике ВГ нами проведен ретроспективный анализ клинического обследования выявленных при скрининге больных по бальной системе. До внедрения биохимического скрининга, диагностика ВГ проводилась по проявлению наиболее характерных клинических признаков, каждому из которых соответствовало определенное количество баллов (пупочная грыжа, отечность, запоры - 2 балла, бледность кожных покровов, макроглоссия, мышечная гипотония, желтуха более 3 суток, сухая кожа, открытый малый родничок более 5 мм, масса тела при рождении более 3500 гр. - 1 балл). Сумма баллов более 5 служила критерием отбора для гормональной верификации диагноза.

...